一种检测啤酒发酵过程中常见污染菌的方法及试剂盒

bioelectron,2020.165:p.112430]。crispr-cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,crisprs)是细菌中一种适应性免疫系统，cas蛋白通过rna引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，crispr-cas12属于cas酶第二家族，用来引导rna指导双链dna裂解单个ruvc催化结构域[j.s.chen,et al.,crispr-cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded dnase activity.science,2018.360(6387):p.436-439]。cas12酶识别富含胸腺嘧啶(thymine，t)核苷酸的间隔区相邻基序(pam)，催化它们自身的指导crispr rna(crrna)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链dna(dsdna)。当crispr/cas12蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链dna时，能诱导强大的非特异性单链dna(ssdna)反式切割活性[j.s.chen,et al.,crispr-cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded dnase activity.science,2018.360(6387):p.436-439]。
[0005]
在检测靶位点的选择方面，16s rdna基因序列作为细菌鉴定和分类中最常用的标记分子由可变区和保守区组成，而且16s rdna基因序列分析已成为鉴定菌株的常用标准。16s rdna基因长度约为1500bp，提供了足够的遗传信息可供利用。16s rdna基因序列在同一菌种的不同菌株中高度保守，在不同菌种之间又存在差异，因此需在16s rdna基因序列中选取特异的靶向位点用于细菌检测技术的开发。


技术实现要素：

[0006]
为解决现有技术中缺乏快速准确检测啤酒发酵污染菌，尤其是三种最常见啤酒污染菌lactobacillus brevis(缩写为l.brevis)、lactobacillus lindneri(缩写为l.lindneri)和pediococcus damnosus(缩写为p.damnosus)的缺陷，提供一种灵敏度高、特异性强、快速可视化的检测啤酒发酵过程中常见污染菌的方法及试剂盒。
[0007]
为了解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种crrna组合，其包括来自短乳杆菌(lactobacillus brevis)、有害片球菌(pediococcus damnosus)和/或林氏乳杆菌(lactobacillus lindneri)的crrna；其中，
[0008]
(i)检测短乳杆菌(lactobacillus brevis)的crrna选自seq id no:1和seq id no:3；
[0009]
(ii)检测有害片球菌(pediococcus damnosus)的crrna选自seq id no:6和seq id no:8；
[0010]
(iii)检测林氏乳杆菌(lactobacillus lindneri)的crrna选自seq id no:11和seq id no:12。
[0011]
上述crrna组合中每一个单独的crrna也可用于各自来源的细菌的检测，因此在本发明中术语“crrna组合”可仅含一个crrna。由此，本发明提供了(i)来自短乳杆菌(l.brevis)的crrna，其核苷酸序列选自seq id no:1和seq id no:3。本发明提供了(ii)来自有害片球菌(p.damnosus)的crrna，其核苷酸序列选自seq id no:6和seq id no:8。本发明提供了(iii)来自林氏乳杆菌(l.lindneri)的crrna，其核苷酸序列选自seq id no:11和seq id no:12。同时，本发明还提供了检测短乳杆菌(l.brevis)、有害片球菌(p.damnosus)、林氏乳杆菌(l.lindneri)其中两种菌例如短乳杆菌(.brevis)、有害片球菌(p.damnosus)，或短乳杆菌(l.brevis)、林氏乳杆菌(l.lindneri)，或有害片球菌
(p.damnosus)、林氏乳杆菌(l.lindneri)的crrna组合，以及检测所有三种菌的crrna组合。
[0012]
为了解决上述技术问题，本发明的第二方面提供了一种检测细菌的试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的crrna组合。
[0013]
优选地，所述试剂盒还包括ssdna报告系统和/或cas12蛋白，所述cas12蛋白例如为cas12a。
[0014]
更优选地，所述单链dna(ssdna)报告系统包括用于荧光检测的ssdna fq reporter；其中，所述ssdna fq reporter为利用6-羧基荧光素(6-fam)和荧光淬灭剂(bhq1)标记的ssdna，标记产物如下：6fam-tttattt-bhq1(5
’→3’
)，命名为ssdna fq reporter：6fam-tttattt-bhq1(5
’→3’
)。
[0015]
在一些较佳的实施例中，所述试剂盒还包括用于扩增短乳杆菌(lactobacillus brevis)、有害片球菌(pediococcus damnosus)和/或林氏乳杆菌(lactobacillus lindneri)的引物。
[0016]
更佳地，所述引物包括：
[0017]
(a)扩增短乳杆菌(lactobacillus brevis)的引物对l.brevis-rpa-f和l.brevis-rpa-r，其核苷酸序列分别如seq id no:24和seq id no:25所示；
[0018]
(b)扩增有害片球菌(pediococcus damnosus)的引物对p.damnosus-rpa-f和p.damnosus-rpa-r，其核苷酸序列分别如seq id no:26和seq id no:27所示；
[0019]
(c)扩增林氏乳杆菌(lactobacillus lindneri)的引物对l.lindneri-rpa-f和l.lindneri-rpa-r，其核苷酸序列分别如seq id no:28和seq id no:29所示；
[0020]
进一步更佳地，所述扩增为等温扩增。
[0021]
在一些较佳的实施例中，所述的试剂盒还包括rnase抑制剂和缓冲液；所述缓冲液可用于完成所述扩增，包括但不限于nebuffer
tm
3.1。
[0022]
为了解决上述技术问题，本发明的第三方面提供了一种非诊断目的的检测方法，其中所述检测方法可检测短乳杆菌(lactobacillus brevis)、有害片球菌(pediococcus damnosus)和/或林氏乳杆菌(lactobacillus lindneri)；其包括以下步骤：
[0023]
(1)获得供检测的核酸；
[0024]
(2)利用如本发明第二方面所述的试剂盒，检测所述供检测的核酸，即将供检测的核酸、crrna组合、ssdna报告系统和cas12蛋白于35～40℃反应15min～2h，优选37℃反应15～30min。
[0025]
本发明获得供检测的核酸可通过培养富集，提取啤酒污染菌的基因组dna模版获得。
[0026]
较佳地，步骤(2)中，所述反应具有以下体系：
[0027][0028]
其中x为0～14的非0正数、1～10的非0正数，或1～5的非0正数，例如1、2、3、4、5。x值由所述供检测的核酸的浓度决定，当所述核酸的浓度越高，则x值相对较低；当所述核酸的浓度越低，则x值相对较高；具体地，本领域技术人员可通过检测所述核酸的浓度，决定用于反应体系的核酸的量。
[0029]
更佳地，所述检测方法还包括以下步骤：
[0030]
(3)利用酶标仪分析，或在荧光灯下肉眼判读核酸检测结果。
[0031]
本发明提供的基于cas12的啤酒污染菌核酸快速检测技术既可利用酶标仪荧光检测也可以利用荧光肉眼检测。本发明中ssdna fq reporter，当使用酶标仪荧光检测时，设定检测激发光为485nm-520nm；当使用肉眼直接检测时，选用可产生485nm波长光源的发光器进行检测。
[0032]
在使用荧光检测时，当cas12检测体系中存在特定的16s rdna核酸序列，会由在16s rdna特异性crrna介导下特异性激活cas12蛋白的核酸内切酶活性。激活后的cas12蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssdna fq reporter，从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数或经485nm激发光激发产生肉眼可见的绿色荧光。相对应的，待检测样品中不存在特定的16s rdna核酸序列时，不会有荧光读数或激发的绿色荧光。
[0033]
在一些优选的实施例中，步骤(1)中，所述供检测的核酸由以下步骤制备：
[0034]
(a)使用dna提取试剂盒提取待测样本的总dna；
[0035]
(b)使用如本发明第二方面所述试剂盒中的引物扩增获得供检测的核酸；所述扩增优选为等温扩增。
[0036]
较佳地，步骤(b)中，将所述引物、总dna加入等温扩增体系，在35～40℃反应15min以上，例如在37～39℃反应25min；
[0037]
更佳地，所述等温扩增体系为50μl体系，其包括nμl dna样品，(18.5-n)μl ddh2o、2μl rpa-f、2μl rpa-r、2.5μl乙酸镁和25μl反应缓冲液例如basic kit的反应缓冲液；其中n为0～18.5的非0正数，例如1、2、3、4、5。n值由所述dna样品的浓度决定，当所述dna样品的浓度越高，则n值相对较低；当所述dna样品的浓度越低，则n值相对较高；具体地，本领域技术人员可通过检测所述dna样品的浓度来决定用于反应体系的dna样品的量。
[0038]
为了解决上述技术问题，本发明的第四方面提供了如本发明的第一方面所述crrna组合或本发明的第二方面所述试剂盒在制备检测细菌的诊断剂中的应用，其中，所述细菌为短乳杆菌(lactobacillus brevis)、有害片球菌(pediococcus damnosus)和/或林
氏乳杆菌(lactobacillus lindneri)。
[0039]
优选地，所述细菌来自啤酒发酵过程。
[0040]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0041]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0042]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0043]
(1)本发明通过利用cas12特异识别核酸荧光检测技术，实现对三种常见啤酒污染菌的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。相较于灵敏度不高、特异性不强、耗时耗力的传统培养检测方法，本发明可以特异的区分三种最常见的啤酒污染菌，而且获得细菌组的dna后检测时间可缩短到45min。
[0044]
(2)本发明利用cas12特异识别核酸荧光检测技术，所需要的设备非常简单，不需要其他基于pcr检测技术的pcr仪。本发明使检测成本大大降低，操作简便，为基层实验和工业一线提供了一个准确、快速、简便的检测方法。
[0045]
(3)本发明公开了一系列用于啤酒最常见污染菌l.brevis、l.lindneri、p.damnosus核酸检测的crrna组合与含其的试剂盒，crrna的序列如表2所示。本发明系首次采用cas12荧光法检测啤酒污染菌，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势。这些优势使得本发明开发的基于cas12的检测方法便于基层实验和工业一线对啤酒污染菌的快速检测和鉴定诊断。
附图说明
[0046]
图1为基于cas12快速检测啤酒发酵污染菌的方法示意图；
[0047]
图2为l.brevis crrna靶向序列在种内的保守性以及种间差异性分析；
[0048]
图3为p.damnosus crrna靶向序列在种内的保守性以及种间差异性分析；
[0049]
图4为l.lindneri crrna靶向序列在种内的保守性以及种间差异性分析；
[0050]
图5为基于cas12快速检测啤酒发酵污染菌的工作效率；
[0051]
图6为基于cas12快速检测啤酒发酵污染菌的特异性；
[0052]
图7为基于cas12快速检测啤酒发酵污染菌的灵敏性；
[0053]
图8为基于cas12可视荧光法高特异性检出啤酒污染菌；
[0054]
图9为基于cas12可视荧光法从多种细菌混合物中高特异性检出啤酒污染菌。
具体实施方式
[0055]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
[0056]
本发明中：rpa扩增试剂盒basic kit购自twistamp公司；crrna体外转录盒子megashortscript t7 transcription kit和纯化盒子megaclear kit购自ambion公司；常规试剂如tris-base、nacl、tris-hcl、mgcl2、bsa和甘油等购自thermo fisher；检测用核酸片段、ssdna探针和rna合成由南京金斯瑞公司完成；本发明使用购自诺唯赞公司
的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。
[0057]
本发明的总体技术示意图如图1所示，包括以下3大部分：待检测核酸样品制备、cas12检测成分设计制备和体系构建和荧光检测。
[0058]
实施例1：啤酒污染菌16s rdna基因片段快速灵敏检测
[0059]
1.1核酸制备
[0060]
本实施例中三种常见啤酒污染菌l.brevis、l.lindneri、p.damnosus的16s rdna基因中被靶向选择的序列部分由南京金斯瑞公司合成，命名为p.damnosu-16s、l.brevis-16s、l.lindneri-16s，对应序列分别为seq id no:15～17。
[0061]
合成的16s rdna通过pcr扩增纯化后测量基因序列的质量和浓度，并保存在-80℃直至使用。扩增所需的引物对应序列分别为seq id no:18～23，如表1所示。
[0062]
表1合成的16s rdna扩增所用引物
[0063][0064]
1.2针对三种细菌特异性crrna的设计制备
[0065]
针对三种细菌特异性crrna制备按照如下方案进行，针对三种啤酒污染菌的16s rdna第一和第二可变区基因序列，寻找包含cas12识别序列(pam)tttn的靶向序列，设计23bp长度的crrna。crrna靶向位点的选择需要满足含有pam识别序列，靶向识别信号较强，且还要满足此序列在种内不同菌株之间尽量保守以便更广泛的识别此种细菌的不同菌株，同时，此序列与其他两种细菌相比要有足够的差异以便更好的区分不同细菌种类。序列的设计和分析分别如图2、图3和图4所示。设计完成后，制备crrna。crrna的制备，交于南京金斯瑞公司合成oligo，构建到载体puc57-t7-crrna，通过体外转录获得目的crrna；或交由南京金斯瑞公司直接合成crrna序列对应的rna。
[0066]
本发明提供的针对三种细菌的16s rdna基因第一和第二可变区的crrna包括seq id no:1～14，具体信息如表2所示：
[0067]
表2针对三种常见啤酒污染菌16s rdna核酸特异性crrna
[0068][0069]
1.3等温扩增反应
[0070]
本发明中，利用等温扩增(rpa)对三种细菌的16s rdna核酸片段分别进行预扩增，以便进行cas12检测反应。按照等温扩增反应要求，针对三种细菌分别设计并合成rpa扩增引物rpa-f(正向引物)和rpa-r(反向引物)，序列为seq id no:24～29。参考rpa等温扩增操作步骤，扩增获得待检测样品。具体操作如下：等温扩增在50μl反应体系进行。将nμl dna样品，(18.5-n)μl ddh2o，2μl rpa-f，2μl rpa-r(浓度为10μm)和25μl反应缓冲液(basic kit，购自twistamp公司)混匀，加入反应管溶解混匀。最后，加入2.5μl乙酸镁(basic kit，浓度为280mm)，混匀后在39℃下孵育25分钟。rpa产物进行下一步检测。
[0071]
表3针对三种细菌的16s rdna核酸片段特异性rpa引物序列
[0072][0073]
1.4本实施例中，啤酒污染菌检测采用20μl体系如表4所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
[0074]
表4啤酒污染菌cas12检测体系
[0075][0076]
1.5全波长酶标仪荧光检测
[0077]
酶标仪荧光检测中，cas12对目的基因检测体系依次加入2μl buffer、1μl rnase抑制剂、1μl cas12、1μl ssdna fq reporter、5μl rpa产物(即上表4中供检测的核酸)、1μl crrna和9μl h2o。各组分混合均匀后于37℃反应25min。其中，上述反应体系中rnase抑制剂浓度为40u/μl，cas12为200ng/μl，ssdna fq reporter浓度为25pm/μl，crrna浓度为1nm/μl。
[0078]
首先，依次检测针对三种啤酒污染菌16s rdna核酸片段的crrna工作效率。在cas12检测体系中，各加入1μl crrna，其它各组分维持一致，混合均匀，37℃反应30min，对上述反应产物进行后续结果检测判定。
[0079]
利用荧光检测判定cas12检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测30min荧光数值为反应值。其反应检测结果如图5。结果显示：在l.brevis模拟检测中l.brevis-crrna-1，2，3检测信号明显强于l.brevis-crrna4，5；在p.damnosus模拟检测中p.damnosus-crrna1，2，3检测信号明显强于p.damnosus-crrna4，5；在l.lindneri模拟检测中l.lindneri-crrna1，2，3检测信号明显强于l.lindneri-crrna4，5；因此选择检测检测信号较强的crrna用于以下的实验。
[0080]
本发明检测体系中，选择可高效检测对应细菌的16s rdna基因片段的crrna。
crrnamix对5个检测样品分别进行检测。
[0092]
在荧光检测中，在cas12检测体系中，依次加入2μl buffer、1μlrnase抑制剂、1μl cas12、1μl ssdna fq reporter、1μl crrna和10μl检测样品。各组分混合均匀，在37℃反应15min。本检测体系中，rnase抑制剂浓度为40u/μl，cas12浓度为200ng/μl，ssdna fq reporter浓度为25pm/μl，crrna浓度为1μm。
[0093]
本实施例中，在cas12检测体系在37℃反应开始后，每隔5min可以在485nm激光灯下，用肉眼对检测产物荧光反应进行判读。检测结果如图8所示，图中显示了15min的荧光照片以及30min内荧光变化趋势。本实施例中l.brevis-crrnamix和p.damnosus-crrnamix在cas12荧光法中可高特异地分别检出l.brevis(图8的a)和p.damnosus(图8的b)，而对其他种属的细菌没有交叉反应。
[0094]
实施例4：cas12荧光法从多种细菌混合物中快速特异地检出啤酒污染菌
[0095]
本实施例的实验方案和结果如图9所示，首先如9c中的方案将实施例3中的细菌基因组核酸进行多种组合形式的混合。
[0096]
首先，每个待检测的混合样品取5μl进行rpa预扩增，步骤与实施例1中相同，获得cas12检测样品。
[0097]
在cas12检测体系中，依次加入2μl buffer、1μl rnase抑制剂、1μl cas12、1μl ssdna fq reporter、10μl rpa产物、1μl crrna。各组分混合均匀，在37℃反应30min，每5min拍照记录一次荧光照片。
[0098]
本实施例中，荧光灯下肉眼可有特异检出混合样品中的l.brevis(图9的a)和p.damnosus(图9的b)。