BTK抑制剂的制作方法

btk抑制剂
发明领域
1.本技术涉及布鲁顿酪氨酸激酶(bruton's tyrosine kinase，btk)(包含突变型btk)的恶烷取代的咪唑并吡嗪和咪唑并三嗪抑制剂，其适用于治疗与btk激酶相关的疾病或病症。这些化合物在治疗免疫病症、癌症、心血管疾病、病毒感染、炎症、代谢/内分泌功能障碍和神经障碍方面具有潜在效用。
2.具体地说，本技术涉及抑制btk的化合物和其组合物、治疗与btk相关的疾病或病症的方法和合成这些化合物的方法。


背景技术：

3.布鲁顿酪氨酸激酶(btk)(亦称为酪氨酸蛋白激酶btk)是酪氨酸激酶tec家族的成员且在调节早期b细胞发育和成熟b细胞活化和存活中起重要作用(hunter,《细胞(cell)》,87,50,823-829)。btk酶由btk基因编码，且已显示引发许多细胞过程，包含细胞增殖、存活、分化、运动、血管生成、细胞因子产生和抗原呈递。
4.btk缺陷型小鼠模型显示btk在过敏性病症和/或自身免疫疾病和/或发炎疾病中起作用；且btk抑制在治疗如系统性红斑狼疮(sle)、荨麻疹/舍格伦综合征(sjogren's syndrome)、类风湿性关节炎、血管炎、特发性血小板减少性紫癜(itp)、重症肌无力、过敏性鼻炎和哮喘的疾病中具有潜在效用。
5.btk在细胞凋亡中的作用也证实抑制btk活性对于治疗癌症，例如b细胞淋巴瘤、白血病和其它血液恶性肿瘤的效用。另外，btk在破骨细胞功能中具有作用，因此抑制btk活性在治疗骨骼病症，如骨质疏松症中具有潜在效用。
6.批准的抑制btk的化合物包含依鲁替尼(ibrutinib)(b细胞恶性肿瘤，例如套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia))；阿卡替尼(acalabrutinib)(套细胞淋巴瘤和cll)；和泽布替尼(zanubrutinib)(套细胞淋巴瘤)。另外，临床试验中存在若干btk抑制剂，包含吴茱萸替尼(evobrutinib)(多发性硬化症)；abbv-105(系统性红斑狼疮(sle))；ono-4059/gs-4059(非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma)和cll)；斯佩布鲁替尼(spebrutinib)(复发或难治性b细胞非霍奇金淋巴瘤、cll和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)；和hm71224(自身免疫疾病)。
7.尽管在使用btk抑制剂治疗b细胞恶性肿瘤方面取得重大治疗进展，但出现预后不良且治疗选择有限的原发性和继发性耐药的病例。
8.共价(不可逆)btk抑制剂(如依鲁替尼和阿卡替尼)与btk的c481位点结合，从而使其激酶失活。这种结合是永久性的，直到btk蛋白质降解。这些不可逆抑制剂的优点是其为强效的且通常只有短时间的暴露才会有效。然而，其的临床益处受到脱靶毒性(off-target toxicity)的限制，从而产生高停药率，且由于破坏与btk的共价结合的btk c481突变而获得耐药性，从而降低化合物的结合亲和力且减弱其抑制btk酶活性的能力(《白血病(leukaemia)》2015年4月；29(4):895-900)。由于c481s突变的发展，大多数(＞50％)进行共价btk抑制剂疗法的cll患者对治疗产生耐药性(《新英格兰医学杂志(n.engl.j.med.)》
370；24,2014；《美国医学会杂志：肿瘤学(jama oncol.)》2015；1(1):80-87；《临床肿瘤学杂志(j.clin.oncol.)》35:1437-1443,2017)。
9.原发性中枢神经系统淋巴瘤(pcnsl)是一种在大脑和/或脊髓的淋巴组织中形成恶性(癌症)细胞的疾病，且其占所有淋巴瘤的约1％和所有原发性大脑肿瘤的2％到5％。绝大多数(约95％)的pcnsl是弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。cd79b和myd88基因中的突变通常(约30-80％)与pcnsl一致(《神经病理性应用神经生物学(neuropathol.appl.neurobiol.)》2016年4月；42(3):279-90)。尽管到目前为止，btk抑制剂尚未批准用于治疗dlbcl，但数据表明具有cd79b和myd88突变的dlbcl对btk抑制更加敏感(《自然医学(nat.med.)》2015年8月；21(8):922-6)。
10.继发性cns淋巴瘤(scnsl)是指起源于其它地方的淋巴瘤的中枢神经系统扩散(与原发性cns淋巴瘤相反)。其通常为非霍奇金淋巴瘤，且可以是孤立的复发或在出现时可以是系统性疾病的部分。与原发性cns淋巴瘤不同，其更通常涉及软脑膜(leptomeninge)。
11.prn2246(sar442168)(一种血脑屏障(bbb)可穿透的共价btk抑制剂)在多发性硬化症(ms)的i期试验中良好耐受。另外，一些试验(grommes c等人,《癌症发现(cancer discov.)》2017年9月；7(9):1018-1029；grommes c等人,《血液(blood.)》2019；133(5):436-445；lionakis等人,2017,《癌细胞(cancer cell)》31,833-843和soussain c等人,《欧洲癌症杂志(eur j cancer.)》2019年8月；117:121-130)表明，高剂量的依鲁替尼(840mg)在cns淋巴瘤(pcnsl和继发性神经系统淋巴瘤(scnsl))中有效，但到目前为止，尚未批准靶向btk-c481突变或在pcnsl中具有活性的btk抑制剂。这些都未满足医疗需求。
12.wo 2009/143051公开了某些被取代的咪唑并吡嗪和咪唑并三嗪，包含某些被己烷取代的咪唑并吡嗪和咪唑并三嗪，作为活化的p21cdc42hs相关激酶(ack1)抑制剂。然而，wo 2009/143051的化合物展现出高的人类肝细胞清除率，意指即使在最大可吸收剂量下，化合物有可能不能达到足够的持续药物覆盖率(使化合物无效)；且/或需要极高的剂量来抑制靶标，从而产生高的最大药物浓度(可能产生次要的药理(即，不良)作用和毒性问题)。
13.wo2017111787a1公开了调节btk活性的四氢吡喃基氨基-吡咯并嘧啶酮；wo2018039310a1公开了氨基-吡咯并嘧啶酮化合物和其使用方法；wo2017103611a1公开了用作btk抑制剂的化合物；且wo2011152351公开了具有btk选择性抑制活性的嘌呤酮衍生物。然而，这些化合物中没有一种具有本发明化合物所具有的所需特性的组合。
14.本文公开了某些新颖的被恶烷取代的咪唑并吡嗪和咪唑并三嗪，其为具有c481突变(例如，c481s、c481y、c481r或c481f突变)的btk、野生型btk和btk两者的强效、选择性抑制剂。这些化合物是非共价可逆抑制剂，展现出低的人类肝细胞清除率且具有血脑屏障(bbb)渗透特性。


技术实现要素：

15.本文公开了式(i)化合物：
[0016][0017][0018]
和其药学上可接受的盐，和其作为btk抑制剂的用途，特别是在疗法中的用途。
具体实施方式
[0019]
本发明的许多实施例在整个本说明书中得以详述且为所属领域的技术读者显而易见。本发明不应解释为限制于所载明的实施例中的任一个，且权利要求书为实施例。应了解，为清楚起见而在单独实施例的上下文中所描述的本公开的某些特征也可组合提供于单一实施例中。相反地，为简洁起见而描述于单个实施例的上下文中的本公开的各种特征还可分开地或以任何合适的子组合形式提供。
[0020]
本文公开了一种式(i)化合物：
[0021]
[0022]
其中：
[0023]
r1选自氢、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、n-c
1-6
烷基氨基、n,n-(c
1-6
烷基)2氨基、碳环基和杂环基；其中r1可任选地由一个或多个r5取代；
[0024]
r2选自卤基、c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、碳环基和杂环基；或在相同原子或相邻原子上的两个r2可与其所连接的原子一起形成3-7元环；
[0025]
k是0-4；
[0026]
r3选自卤基、c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基；
[0027]
n是0-4；
[0028]
r4选自卤基、c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基；
[0029]
m是0-5；
[0030]
a是＝n-或＝c(r6)-；
[0031]
r5选自卤基、羟基、c
1-6
烷氧基、氨基、n-c
1-6
烷基氨基、n,n-(c
1-6
烷基)2氨基、碳环基和杂环基；其中r5可独立地任选地由一个或多个r7取代；
[0032]
r6选自氢和卤基；
[0033]
r7选自卤基、羟基、氨基、c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基；
[0034]
或其药学上可接受的盐。
[0035]
在一个实施例中，r1选自氢和c
1-6
烷基；其中r1可任选地由一个r5取代；其中r5选自羟基、c
1-6
烷氧基、n,n-(c
1-6
烷基)2氨基和杂环基。
[0036]
在一个实施例中，r1选自氢和c
1-3
烷基；其中r1可任选地由一个r5取代；其中r5选自羟基、c
1-3
烷氧基、n,n-(c
1-2
烷基)2氨基和氮杂环丁烷基。
[0037]
在一个实施例中，r1选自氢、甲基、羟基甲基、甲氧基甲基、n,n-二甲基氨基甲基和氮杂环丁烷-1-基甲基。
[0038]
在一个实施例中，r1是羟基甲基。
[0039]
在一个实施例中，r2选自卤基或c
1-3
烷氧基。
[0040]
在一个实施例中，r2选自氟或甲氧基。
[0041]
在一个实施例中，或在相同原子或相邻原子上的两个r2可与其所连接的原子一起形成3-7元环。
[0042]
在一个实施例中，或在相同原子上的两个r2可与其所连接的原子一起形成3-7元环。
[0043]
在一个实施例中，或在相邻原子上的两个r2可与其所连接的原子一起形成3-7元环。
[0044]
在一个实施例中，k是0。
[0045]
在一个实施例中，k是1。
[0046]
在一个实施例中，k是2。
[0047]
在一个实施例中，k是3。
[0048]
在一个实施例中，k是4。
[0049]
在一个实施例中，r3是卤基。
[0050]
在一个实施例中，r3是氟。
[0051]
在一个实施例中，n是0-2。
[0052]
在一个实施例中，n是0。
[0053]
在一个实施例中，n是1。
[0054]
在一个实施例中，n是2。
[0055]
在一个实施例中，n是3。
[0056]
在一个实施例中，n是4。
[0057]
在一个实施例中，r4是卤基。
[0058]
在一个实施例中，r4是氟。
[0059]
在一个实施例中，m是0-2。
[0060]
在一个实施例中，m是0。
[0061]
在一个实施例中，m是1。
[0062]
在一个实施例中，m是2。
[0063]
在一个实施例中，m是3。
[0064]
在一个实施例中，m是4。
[0065]
在一个实施例中，m是5。
[0066]
在一个实施例中，a是＝n-或＝c(h)-。
[0067]
在一个实施例中，a是＝n-。
[0068]
在一个实施例中，a是＝c(r6)-。
[0069]
在一个实施例中，a是＝c(h)-。
[0070]
式(i)化合物(当r1≠氢时)含有两个手性中心(标记有“*”)：
[0071][0072]
这些手性中心可以“反式”构型形式存在(意指恶烷环上的两个取代基指向恶烷环的相对面)；且以“顺式”构型形式存在(意指恶烷环上的两个取代基指向恶烷环的同一面)。下文中的结构(ia)和(ib)显示式(i)化合物的顺式异构体，下文中的结构(ic)和(id)显示式(i)化合物的反式异构体。
[0073]
在本发明的一个方面中，式(i)化合物是式(i)的反式化合物。
[0074]
在本发明的一个方面中，式(i)化合物是式(i)的顺式化合物。
[0075]
在本发明的一个方面中，式(i)化合物是式(ia)化合物：
[0076][0077]
在本发明的一个方面中，式(i)化合物是式(ib)化合物：
[0078][0079]
在本发明的一个方面中，式(i)化合物是式(ic)化合物：
[0080][0081]
在本发明的一个方面中，式(i)化合物是式(id)化合物：
[0082][0083]
在本发明的一个方面中，式(i)化合物选自：
[0084]
(5-(8-氨基-1-(4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0085]
(5-(8-氨基-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0086]
(5-(8-氨基-1-(2,3-二氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0087]
(5-(8-氨基-1-(4-(2,3-二氟苯氧基)苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0088]
(5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0089]
(5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0090]
(5-(4-氨基-5-(2,3-二氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0091]
(5-(4-氨基-5-(4-(2,3-二氟苯氧基)苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0092]
3-(6-((二甲基氨基)甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-8-胺；
[0093]
7-(6-((二甲基氨基)甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0094]
7-(6-(氮杂环丁烷-1-基甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0095]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-(6-(甲氧基甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0096]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-(四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；和
[0097]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-(6-甲基四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺。
[0098]
在本发明的一个方面中，式(i)化合物选自：
[0099]
(5-(8-氨基-1-(4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0100]
(5-(8-氨基-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0101]
(5-(8-氨基-1-(2,3-二氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0102]
(5-(8-氨基-1-(4-(2,3-二氟苯氧基)苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0103]
(5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0104]
(5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0105]
(5-(4-氨基-5-(2,3-二氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0106]
(5-(4-氨基-5-(4-(2,3-二氟苯氧基)苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0107]
3-(6-((二甲基氨基)甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-8-胺；
[0108]
7-(6-((二甲基氨基)甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0109]
7-(6-(氮杂环丁烷-1-基甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0110]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-(6-(甲氧基甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0111]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-(四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；和
[0112]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-(6-甲基四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0113]
或其药学上可接受的盐。
[0114]
在本发明的一个方面中，式(i)化合物选自：
[0115]
((2r,5r)-5-(8-氨基-1-(4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0116]
((2r,5r)-5-(8-氨基-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0117]
((2r,5r)-5-(8-氨基-1-(2,3-二氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0118]
((2r,5r)-5-(8-氨基-1-(4-(2,3-二氟苯氧基)苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0119]
((2r,5r)-5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0120]
((2r,5r)-5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0121]
((2r,5r)-5-(4-氨基-5-(2,3-二氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0122]
((2r,5r)-5-(4-氨基-5-(4-(2,3-二氟苯氧基)苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0123]
3-((3r,6r)-6-((二甲基氨基)甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-8-胺；
[0124]
7-((3r,6r)-6-((二甲基氨基)甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0125]
7-((3r,6r)-6-(氮杂环丁烷-1-基甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0126]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-((3r,6r)-6-(甲氧基甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0127]
(r)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-(四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三
嗪-4-胺；和
[0128]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-((3r,6r)-6-甲基四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0129]
或其药学上可接受的盐。
[0130]
在本发明的一个方面中，式(i)化合物选自：
[0131]
((2s,5s)-5-(8-氨基-1-(4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0132]
((2s,5s)-5-(8-氨基-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0133]
((2s,5s)-5-(8-氨基-1-(2,3-二氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0134]
((2s,5s)-5-(8-氨基-1-(4-(2,3-二氟苯氧基)苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0135]
((2s,5s)-5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0136]
((2s,5s)-5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0137]
((2s,5s)-5-(4-氨基-5-(2,3-二氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0138]
((2s,5s)-5-(4-氨基-5-(4-(2,3-二氟苯氧基)苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0139]
3-((3s,6s)-6-((二甲基氨基)甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-8-胺；
[0140]
7-((3s,6s)-6-((二甲基氨基)甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0141]
7-((3s,6s)-6-(氮杂环丁烷-1-基甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0142]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-((3s,6s)-6-(甲氧基甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0143]
(s)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-(四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；和
[0144]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-((3s,6s)-6-甲基四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0145]
或其药学上可接受的盐。
[0146]
在本发明的一个方面中，式(i)化合物选自：
[0147]
((2s,5r)-5-(8-氨基-1-(4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0148]
((2s,5r)-5-(8-氨基-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇；
[0170]
3-((3r,6s)-6-((二甲基氨基)甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-8-胺；
[0171]
7-((3r,6s)-6-((二甲基氨基)甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0172]
7-((3r,6s)-6-(氮杂环丁烷-1-基甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0173]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-((3r,6s)-6-(甲氧基甲基)四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；和
[0174]
5-(2-氟-4-苯氧基苯基)-7-((3r,6s)-6-甲基四氢-2h-吡喃-3-基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-胺；
[0175]
或其药学上可接受的盐。
[0176]
在本发明的一个方面中，提供本文所公开的任何式(i)化合物。
[0177]
在本发明的一个方面中，提供本文所公开的任何式(i)化合物或其药学上可接受的盐。
[0178]
在本发明的一个方面中，提供用于制备如本文所公开的式(i)化合物的合成中间物。
[0179]
在本发明的一个方面中，提供用于制备如本文所公开的式(i)化合物或其药学上可接受的盐的合成中间物。
[0180]
在本公开的多处，描述了连接取代基。在结构明确需要连接基团的情况下，关于该基团所列举的马库什变量(markush variable)应理解为连接基团。举例来说，如果结构需要连接基团且该变量的马库什基团定义列举“烷基”，那么应理解，所述“烷基”表示连接亚烷基。
[0181]
如本文所使用，当提到化学基团时，术语“被取代”意指所述化学基团具有一个或多个被去除且由取代基置换的氢原子。如本文所使用，术语“取代基”具有所属领域中已知的普通含义且是指共价连接到母体基团或在适当时与所述母体基团稠合的化学部分。如本文所使用，术语“任选地被取代”或“任选地被
…
取代”意指化学基团可不具有取代基(即，未被取代)或可具有一个或多个取代基(即，被取代)。应理解，在给定原子处的取代受价数限制。
[0182]
如本文所使用，术语“c
i-j”表示碳原子数的范围，其中i和j为整数，且碳原子数的范围包含端点(即i和j)和介于其间的每个整数点，且其中j大于i。举例来说，c
1-6
表示一到六个碳原子的范围，包含一个碳原子、两个碳原子、三个碳原子、四个碳原子、五个碳原子和六个碳原子。在一些实施例中，术语“c
1-6”表示1到6个、特别是1到5个、特别是1到4个、特别是1到3个或特别是1到2个碳原子。
[0183]
如本文所使用，无论作为另一术语的部分或独立地使用，术语“烷基”是指饱和烃链。上文所提及的烃链可以是直链或分支链。术语“c
i-j
烷基”是指具有i到j个碳原子的烷基。c
1-6
烷基的实例包含(但不限于)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基；高级同系物，如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丁基等。“c
1-3
烷基”的实例为甲基、乙基、丙基和异丙基。
[0184]
如本文所使用，术语“卤基”和“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。
[0185]
如本文所使用，无论作为另一术语的部分或独立地使用，术语“烷氧基”是指式-o-烷基的基团。术语“c
i-j
烷氧基”意指烷氧基基团的烷基部分具有i到j个碳原子。烷氧基基团的实例包含(但不限于)甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如，正丙氧基和异丙氧基)、叔丁氧基等。“c
1-6
烷氧基”的实例为甲氧基、乙氧基和丙氧基。“c
1-3
烷氧基”的实例为甲氧基、乙氧基和丙氧基。
[0186]“n-(c
1-6
烷基)氨基”的实例为甲氨基和乙氨基。“n,n-(c
1-6
烷基)2氨基”的实例为n,n-二甲基氨基、n,n-二乙基氨基和n-乙基-n-甲基氨基。
[0187]
如本文所使用，无论作为另一术语的部分或独立地使用，术语“碳环基”是指其中所有环原子是碳且其含有至少三个成环碳原子的饱和单环。在一些实施例中，碳环基可含有3到7个成环碳原子或3到6个成环碳原子。在一些实施例中，环-ch
2-基团可由环-c(o)-基团置换。碳环基的实例包含(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
[0188]
如本文所使用，术语“杂环基”是指单环、饱和碳环基基团，其中一个或多个(例如，1、2或3个)环原子由杂原子置换，所述杂原子包含(但不限于)氧、硫、氮、磷等。在一些实施例中，环-ch
2-基团可由环-c(o)-基团置换。在一些实施例中，环硫原子可任选地被氧化以形成s-氧化物。在一些实施例中，杂环基是碳连接的。在一些实施例中，杂环基是氮连接的。示例性杂环基基团包含(但不限于)氮杂环丁烷基、哌啶基(piperidyl)、吡咯烷基、四氢呋喃基、哌啶基(piperidinyl)、哌嗪基、吗啉基等。
[0189]
在一个实施例中，在相同原子上的两个r2与其所连接的原子一起形成3-7元环。生成物“螺环”具有通过一个单一的共有原子连接的两个环(其中的一个是式(i)的恶烷)。非恶烷环可以是3-7元碳环基环或3-7元杂环环。在相同原子上的两个r2与其所连接的原子一起形成3-7元环(用式(i)的恶烷描绘)的实例包含：
[0190][0191]
(其中描绘与分子的其余部分的连接)。
[0192]
在一个实施例中，在相邻原子上的两个r2与其所连接的原子一起形成3-7元环。生成物“稠环”具有共享两个相邻原子的两个环(其中的一个是式(i)的恶烷)。非恶烷环可以是3-7元碳环基环或3-7元杂环环。或在相邻原子上的两个r2一起形成3-7元环(用式(i)的恶烷描绘)的实例包含：
[0193][0194]
(其中描绘与分子的其余部分的连接)。
[0195]
除非另外说明，否则本公开的“化合物”意图涵盖所描绘的结构的所有立体异构体、几何异构体和互变异构体。
[0196]
术语“立体异构体”是指不对称化合物(例如，具有一个或多个不对称取代的碳原子或“不对称中心”的那些化合物)的各种立体异构构型(例如，对映异构体、非对映异构体和外消旋体)中的任一种。含有不对称中心的本公开化合物可以光学活性(对映异构体或非对映异构体)或光学失活(外消旋)形式分离。术语“对映异构体”包含不互为可重叠镜像的立体异构体对。一对对映异构体的1:1混合物是“外消旋混合物”。术语“非对映异构体(diastereomer/diastereoisomer)包含具有至少两个不对称原子但不互为镜像的立体异构体。含有一个或多个不对称中心的某些化合物可产生对映异构体、非对映异构体或其它立体异构形式，其可根据卡恩-英格尔-普雷洛格(cahn-ingold-prelog)r-s系统根据绝对构型在每个不对称中心处定义为(r)-或(s)-。绝对构型未知的拆分的化合物可在不对称中心处使用术语“或”来指定。关于如何自外消旋混合物制备光学活性形式的方法是所属领域中已知的，如通过hplc拆分或立体选择性合成。
[0197]
术语“几何异构体”或“顺式和反式异构体”是指具有相同式，但其官能团在三维空间中旋转到不同定向的化合物。
[0198]
术语“互变异构体”包含处于具有相同式和总电荷的化合物的异构质子化状态的质子转移互变异构体。质子转移互变异构体的实例包含(但不限于)酮-烯醇对、酰胺-亚胺酸对、内酰胺-内酰亚胺对、烯胺-亚胺对以及环状形式，在环状形式中，质子可占用杂环系统的两个或更多个位置，例如1h-咪唑和3h-咪唑、1h-1,2,4-三唑、2h-1,2,4-三唑和4h-1,2,4-三唑、1h-异吲哚和2h-异吲哚，以及1h-吡唑和2h-吡唑。互变异构体可处于平衡状态或通过适当取代而空间锁定成一种形式。除非另外说明，否则通过名称或结构识别为一种特定互变异构形式的本公开化合物意图包含其它互变异构形式。
[0199]
本公开的“化合物”还意图涵盖化合物中原子的所有同位素。原子的同位素包含具有相同原子数但质量数不同的原子。举例来说，除非另外说明，否则本公开的“化合物”中的氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴或碘意指还包含其同位素，如(但不限于)：1h、2h、3h、
11
c、
12
c、
13
c、
14
c、
14
n、
15
n、
16
o、
17
o、
18
o、
31
p、
32
p、
32
s、
33
s、
34
s、
36
s、
17
f、
19
f、
35
cl、
37
cl、
79
br、
81
br、
127
i和
131
i。在一些实施例中，氢包含氕、氘和氚。在一些实施例中，氢是指氕。在一些实施例中，氢是指氘。在一些实施例中，氢是指氚。在一些实施例中，术语“由氘取代”或“氘取代的”是指用氘置换化学基团中的氢的其它同功异型物(例如，氕)。在一些实施例中，碳包含
12
c和
13
c。
[0200]
还应理解，本公开的“化合物”可呈溶剂化形式以及非溶剂化形式(例如水合形式、固体形式)存在，且本公开意图涵盖所有这类溶剂化和非溶剂化形式。
[0201]
应进一步理解，本公开的“化合物”可以药学上可接受的盐形式存在。
[0202]
如本文所使用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在一些实施例中，药学上可接受的化合物、材料、组合物和/或剂型是指由管理机构(如美国食品和药物管理局(u.s.food and drug administration)、中国国家食品药品监督管理总局(china food and drug administration)或欧洲药物管理局(european medicines agency))批准或公认药典(如美国药典(u.s.pharmacopoeia)、中国药典(china pharmacopoeia)或欧洲药典(european pharmacopoeia))中所列出的用于动物且特别是人类的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0203]
如本文所使用，“药学上可接受的盐”是指本公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有酸性部分(例如，羧基等)或碱性部分(例如，胺、碱金属等)转化为其盐形式而改性。在许多情况下，本公开化合物能够凭借氨基和/或羧基基团或其类似基团的存在而形成酸和/或碱盐。且药学上可接受的盐为保留母体化合物的生物有效性和特性，通常不会在生物学上或其它方面不合需要的酸和/或碱盐。合适的本公开化合物的药学上可接受的盐包含例如酸加成盐，其可衍生自例如无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)或有机酸(例如，甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、顺丁烯二酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、酒石酸、苯均三酸、柠檬酸、乳酸、苯乙酸、苯甲酸、扁桃酸、甲烷磺酸、萘二磺酸、乙烷磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸、水杨酸、磺基水杨酸等)。
[0204]
合适的本公开化合物的药学上可接受的盐还包含例如碱加成盐，其可以衍生自例如无机碱(例如，周期表的第i列到第xii列的金属(如钙、镁、铁、银、锌、铜等)的钠盐、钾盐、铵盐和氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐)或有机碱(例如伯胺、仲胺和叔胺、被取代的胺(包含天然存在的被取代的胺)、环胺、碱性离子交换树脂等)。某些有机胺包含(但不限于)异丙胺、苯乍生(benzathine)、胆酸盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和缓血酸胺。熟练的技术人员应了解，除了实例中所示以外，添加用于形成酸/碱加成盐的酸或碱也是可能的。其它合适的盐的列表可见于例如《雷明顿氏药物科学(remington's pharmaceutical sciences)》,第20版,马克出版公司(mack publishing company),宾夕法尼亚州伊斯顿(easton,pa.),(1985)；和stahl和wermuth的《药用盐手册：特性、选择和使用(handbook of pharmaceutical salts:properties,selection,and use)》(德国魏因海姆的威立德国化学学会出版社(wiley-vch,weinheim,germany),2002)中。
[0205]
我们已发现，本发明中所定义的化合物或其药学上可接受的盐是有效的btk抑制剂，且可用于在需要这类治疗的温血动物中产生btk抑制作用。因此，预期本发明的化合物适用于治疗单独或部分地由btk介导的疾病或医学病况。
[0206]
因此，预期本发明的化合物适用于治疗免疫病症、癌症、心血管疾病、病毒感染、代谢/内分泌功能障碍和神经障碍、过敏性病症、自身免疫疾病和发炎性疾病，包含荨麻疹/舍格伦综合征、类风湿性关节炎、骨质疏松症、血管炎、特发性血小板减少性紫癜(itp)、重症肌无力、过敏性鼻炎、哮喘、多发性硬化症和系统性红斑狼疮。
[0207]
由于其的btk抑制剂特性，预期本发明的化合物具有广泛范围的抗癌特性，已在人类癌症(包含(但不限于)b细胞恶性肿瘤)中观察到btk介导的生长。具体来说，预期本发明的这类化合物适用于治疗淋巴瘤和白血病。更具体地说，预期本发明的这类化合物或其药学上可接受的盐适用于治疗小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、滤泡性淋巴瘤、里希特氏转化(richter's transformation)、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、继发性中枢神经系统淋巴瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。具体来说，本发明的化合物适用于治疗已转移到大脑的弥漫性大b细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤或继发性中枢神经系统淋巴瘤。具体来说，本发明的化合物适用于治疗慢性淋巴细胞性白血病。具体来说，本发明的化合物适用于慢性淋巴细胞性白血病的第二线治疗。具体来说，本发明的化合物适用于慢性淋巴细胞性白血病的第一线治疗。具体来说，本发明的化合物适用于治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤。具体来说，本发明的化合物适用于治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤。
[0208]
在一些实施例中，本公开的化合物或其药学上可接受的盐在早期阶段、积极进展、转移性和/或耐药性癌症中具有抗癌活性。在提到癌症的一些实施例中，癌症是局部晚期癌症。在提到癌症的一些实施例中，癌症是局部晚期和/或转移性癌症。在提到癌症的一些实施例中，癌症是转移性癌症。在提到癌症的一些实施例中，癌症是侵入性癌症。在提到癌症的一些实施例中，癌症是依鲁替尼抗性癌症(ibrutinib resistant cancer)。
[0209]
在提及btk抑制的本发明的一个实施例中，这是指野生型btk和具有c481突变(例如，c481s、c481y、c481r或c481f突变)的btk。
[0210]
在提及btk抑制的本发明的一个实施例中，这是指野生型btk。
[0211]
在提及btk抑制的本发明的一个实施例中，这是指具有c481突变的btk。
[0212]
在提及btk抑制的本发明的一个实施例中，这是指具有c481s突变的btk。
[0213]
在提及btk抑制的本发明的一个实施例中，这是指具有c481y突变的btk。
[0214]
在提及btk抑制的本发明的一个实施例中，这是指具有c481r突变的btk。
[0215]
在提及btk抑制的本发明的一个实施例中，这是指具有c481f突变的btk。
[0216]
药物组合物、剂量和投药
[0217]
本公开提供药物组合物，其包括至少一种本公开化合物，或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，药物组合物包括超过一种本公开化合物，或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，药物组合物包括一种或多种本公开化合物，或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载剂。
[0218]
一般来说，药学上可接受的载剂是所属领域中的常规药用载剂，其可以药学领域中众所周知的方式制备。在一些实施例中，本公开的化合物或其药学上可接受的盐可与药学上可接受的载剂混合以制备药物组合物。
[0219]
药物组合物的形式取决于多种标准，包含(但不限于)投药途径、疾病程度或待投予的剂量。药物组合物可配制成口服、鼻用、经直肠、经皮、静脉内或肌肉内投药。根据所需的投药途径，药物组合物可以配制成片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、药囊、扁囊剂、口含片、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气雾剂(呈固体形式或在液体介质中)、喷雾剂、软膏、糊浆、乳膏、洗剂、凝胶、贴片、吸入剂或栓剂形式
[0220]
在某些实施例中，药物组合物包括约1mg到约500mg的本公开化合物或其药学上可
接受的盐，具体来说1mg到约200mg。也可一天一次、一天两次、一天三次或甚至一天四次投予药物组合物。然而，日剂量将必须根据所治疗宿主、特定投药途径和所治疗疾病的严重程度而变化。因此，最优剂量可由治疗任何特定患者的医师来确定。
[0221]
如本文所提供的化合物或其药学上可接受的盐的治疗有效量将取决于所属领域中已知的各种因素，如体重、年龄、既往病史、当前药物、个体的健康状态和交叉反应、过敏、敏感和不良副作用的可能性，以及投药途径和疾病发展程度。如由这些和其它情况或要求所指示，所属领域的一般技术人员(例如，医生或兽医)可按比例减少或增加剂量。
[0222]
在本发明的另一方面中，提供一种药物组合物，其包括如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的稀释剂或载剂。
[0223]
在本发明的另一方面中，提供一种药物组合物，其包括如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的稀释剂或载剂，以用于在如人的温血动物中产生btk抑制作用。
[0224]
在本发明的另一方面中，提供一种药物组合物，其包括如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的稀释剂或载剂，以用于在如人的温血动物中产生抗癌作用。
[0225]
在本发明的另一方面中，提供一种药物组合物，其包括如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的稀释剂或载剂，以用于治疗如人的温血动物中的小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、滤泡性淋巴瘤、里希特氏转化、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、继发性中枢神经系统淋巴瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。
[0226]
在本发明的另一方面中，提供一种药物组合物，其包括如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的稀释剂或载剂，以用于治疗已转移到大脑的弥漫性大b细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤或继发性中枢神经系统淋巴瘤。
[0227]
组合
[0228]
在一些实施例中，药物组合物包括一种或多种本公开化合物或其药学上可接受的盐作为第一活性成分，且进一步包括第二活性成分。第二活性成分可以是所属领域中已知的任何抗肿瘤剂，例如pi3k抑制剂、抗cd20抗体、抗pd-1/l1抗体和用于非霍奇金淋巴瘤的其它批准的药物或药物组合。第二活性成分抗肿瘤剂的代表性实例包含(但不限于)艾德昔布(idelalisib)、杜韦利昔布(duvelisib)、奥必珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、博莱霉素(bleomycin)、本妥昔单抗(brentuximab)、维多汀(vedotin)、卡莫司汀(carmustine)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达卡巴嗪(dacarbazine)、地塞米松(dexamethasone)、多柔比星(doxorubicin)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、丙卡巴肼(procarbazine)、强的松(prednisone)、苯达莫司汀(bendamustine)、维奈妥拉(venetoclax)、强的松、cvp(c-化疗药物环磷酰胺、v-化疗药物长春新碱(vincristine)和p-类固醇泼尼松龙(prednisolone)的组合治疗)、米哚妥林(midostaurin)和长春碱(vinblastine)。
[0229]
在此，当使用术语“组合”时，应理解，这是指同时、分开或依序投药。在本公开的一个方面中，“组合”是指同时投药。在本公开的另一方面中，“组合”是指分开投药。在本公开
的又一方面中，“组合”是指依序投药。当依续或分开投药时，延迟投予第二组分不应使得失去组合的有益作用。
[0230]
因此，在本公开的另一方面中，提供一种如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及选自本文上文所列举的抗肿瘤剂的抗肿瘤剂。
[0231]
因此，在本公开的另一方面中，提供一种如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及选自本文上文所列举的抗肿瘤剂的抗肿瘤剂，以用于产生抗癌作用。
[0232]
因此，在本公开的另一方面中，提供一种如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及选自本文上文所列举的抗肿瘤剂的抗肿瘤剂，以用于治疗小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、滤泡性淋巴瘤、里希特氏转化、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、继发性中枢神经系统淋巴瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。
[0233]
因此，在本公开的另一方面中，提供一种如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及选自本文上文所列举的抗肿瘤剂的抗肿瘤剂，以用于治疗已转移到大脑的弥漫性大b细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤或继发性中枢神经系统淋巴瘤。
[0234]
根据本公开的这个方面，提供一种适合用于治疗癌症的组合，其包括如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，和上文所列举的抗肿瘤剂中的任一种。
[0235]
根据本公开的另一方面，提供一种药物组合物，其包括如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及选自本文上文所列举的抗肿瘤剂的抗肿瘤剂，以及药学上可接受的稀释剂或载剂。
[0236]
根据本公开的另一方面，提供一种药物组合物，其包括如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及选自本文上文所列举的抗肿瘤剂的抗肿瘤剂，以及药学上可接受的稀释剂或载剂，用于产生抗癌作用。
[0237]
根据本公开的另一方面，提供一种药物组合物，其包括如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及选自本文上文所列举的抗肿瘤剂的抗肿瘤剂，以及药学上可接受的稀释剂或载剂，以用于治疗小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、滤泡性淋巴瘤、里希特氏转化、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、继发性中枢神经系统淋巴瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。
[0238]
根据本公开的另一方面，提供一种药物组合物，其包括如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及选自本文上文所列举的抗肿瘤剂的抗肿瘤剂，以及药学上可接受的稀释剂或载剂，以用于治疗已转移到大脑的弥漫性大b细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤或继发性中枢神经系统淋巴瘤。
[0239]
根据本公开的另一方面，提供一种试剂盒，其包括如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及选自本文上文所列举的抗肿瘤剂的抗肿瘤剂。
[0240]
根据本公开的另一方面，提供一种试剂盒，其包括：
[0241]
a)如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其呈第一单位剂型；
[0242]
b)选自本文上文所列举的抗肿瘤剂的抗肿瘤剂；其呈第二单位剂型；和
[0243]
c)容器装置，其用于容纳所述第一和第二剂型。
[0244]
药理学工具
[0245]
除了其在治疗医学中之用途以外，式(i)化合物或其药学上可接受的盐还适用作开发和标准化体外和体内测试系统的药理学工具，以用于评估btk抑制在如猫、狗、兔、猴、大鼠和小鼠的实验动物中的作用，作为寻找新治疗剂的部分。
[0246]
治疗方法
[0247]
根据本发明的另一个方面，提供一种如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其用于通过疗法对人体或动物体进行治疗的方法中。
[0248]
根据本发明的这一方面的另一特征，提供一种在如人的温血动物中产生btk抑制作用的方法，其包括向所述动物投予有效量的如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐。
[0249]
根据本发明的这一方面的另一特征，提供一种治疗如人的温血动物的癌症的方法，其包括向所述动物投予有效量的如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐。
[0250]
根据本发明的这一方面的额外特征，提供一种治疗如人的温血动物的小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、滤泡性淋巴瘤、里希特氏转化、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、继发性中枢神经系统淋巴瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括向所述动物投予有效量的如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐。
[0251]
根据本发明的这一方面的额外特征，提供一种治疗如人的温血动物的已转移到大脑的弥漫性大b细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤或继发性中枢神经系统淋巴瘤的方法，所述方法包括向所述动物投予有效量的如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐。
[0252]
如本文所使用，术语“治疗(treatment/treat)”是指逆转、减轻如本文所描述的疾病或病症或其一种或多种症状，延迟其发作，或抑制其进展。在一些实施例中，治疗可在已出现一种或多种症状之后进行。在其它实施例中，治疗可在不存在症状的情况下进行。举例来说，可在症状发作之前对易感个体进行治疗(例如，依据症状病史和/或依据遗传学或其它易感性因素)。治疗还可在症状已消退之后继续，例如以存在或延迟其复发。
[0253]
本公开还提供一种筛选适合于用如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐治疗患者的方法。方法包含对来自患者的肿瘤样本进行测序且检测btk的积累或btk突变的存在。
[0254]
根据本公开的这一方面的另一特征，提供一种治疗如人类的温血动物的癌症的方法，其包括(1)确定温血动物是否患有易于接受btk抑制的癌症，和(2)如果是，那么向所述动物投予有效量的如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐。
[0255]
化合物的用途
[0256]
在某些实施例中，本公开提供本公开的化合物、其药学上可接受的盐或药物组合物的用途，其用于制造用于治疗btk介导的或依赖性疾病或病况的药物。
[0257]
因此，根据本发明的这一方面，提供一种如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其用作药物。
[0258]
因此，根据本发明的这一方面，提供如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐作为药物的用途。
[0259]
因此，根据本发明的这一方面，提供一种如本文所定义的式(i)化合物或其药学上
可接受的盐，其用于疗法中。
[0260]
根据本发明的另一方面，提供如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐的用途，其用于制造用于在如人的温血动物中产生btk抑制作用的药物。
[0261]
根据本发明的这一方面，提供如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐的用途，其用于制造用于在如人的温血动物中产生抗癌作用的药物。
[0262]
根据本发明的另一特征，提供如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐的用途，其用于制造用于治疗以下疾病的药物：小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、滤泡性淋巴瘤、里希特氏转化、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、继发性中枢神经系统淋巴瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。
[0263]
根据本发明的另一特征，提供如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐的用途，其用于制造用于治疗以下疾病的药物：已转移到大脑的弥漫性大b细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤或继发性中枢神经系统淋巴瘤。
[0264]
根据本发明的另一方面，提供如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐的用途，其用于在如人的温血动物中产生btk抑制作用。
[0265]
根据本发明的这一方面，提供如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐的用途，其用于在如人的温血动物中产生抗癌作用。
[0266]
根据本发明的另一特征，提供一种如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、滤泡性淋巴瘤、里希特氏转化、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、继发性中枢神经系统淋巴瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。
[0267]
根据本发明的另一特征，提供一种如本文所定义的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗已转移到大脑的弥漫性大b细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤或继发性中枢神经系统淋巴瘤。
[0268]
在上文药物组合物、方法、用途和药物制造特征中，本文所描述的本公开化合物的替代和优选实施例也适用。
[0269]
实例
[0270]
通用实验
[0271]
缩写
[0272][0273]
在实例中的合成流程中说明本文所提供的化合物(包含其药学上可接受的盐)的
合成。本文所提供的化合物可使用任何已知的有机合成技术制备且可根据多种可能的合成途径中的任一种合成，且因此，这些流程只是说明性的且不打算限制可用于制备本文所提供的化合物的其它可能的方法。另外，方法中的步骤是为了更好地说明且可在适当时改变。出于研究和可能提交给管理机构的目的来合成实例中的化合物的实施例。
[0274]
用于制备本公开化合物的反应可在合适的溶剂中进行，所述溶剂可由有机合成领域的技术人员容易地选择。合适的溶剂可在进行反应的温度下，例如可在范围介于溶剂的冷冻温度到溶剂的沸腾温度的温度下基本上对起始材料(反应物)、中间物或产物不具有反应性。指定反应可在一种溶剂或超过一种溶剂的混合物中进行。取决于特定反应步骤，用于特定反应步骤的合适溶剂可由熟练技术人员选择。
[0275]
本公开的化合物的制备可涉及各种化学基团的保护和脱保护。对于保护和脱保护的需求，和适当保护基的选择可由所属领域的技术人员容易地确定。保护基的化学性质可见于例如t.w.greene和p.g.m.wuts,《有机合成中的保护基(protective groups in organic synthesis)》,第3版,威利父子公司(wiley&sons,inc.),纽约(new york)(1999)，其以全文引用的方式并入本文中。
[0276]
可根据所属领域中已知的任何合适方法监测反应。举例来说，可通过光谱手段，如核磁共振光谱(例如，1h或
13
c)、红外光谱、分光光度法(例如，uv-可见光)、质谱，或通过色谱法，如高压液相色谱(hplc)、液相色谱-质谱(lcms)或薄层色谱(tlc)来监测产物形成。所属领域的技术人员可通过多种方法来纯化化合物，包含高效液相色谱(hplc)(“《制备型lc-ms纯化：改善的化合物特异性方法优化(preparative lc-ms purification：improved compound specific method optimization)》”,karl f.blom,brian glass,richard sparks,andrew p.combs,《组合化学杂志(j.combi.chem.)》,2004,6(6),874-883，其以全文引用的方式并入本文中)、超临界流体色谱(sfc)和正相二氧化硅色谱。
[0277]
通过核磁共振(nmr)或/和液相色谱-质谱(lc-ms)来表征实例中的化合物的结构。nmr化学位移(δ)以10-6
(ppm)为单位给出。在bruker avance nmr(400mhz)分光仪上使用icon-nmr(在topspin程序控制下)，或在varian 400mr nmr或varian vnmr400 nmr(400mhz)分光仪上(在vnmrj程序控制下)使用四甲基硅烷作为内标在二甲亚砜-d6(dmso-d6)或cdcl3或cd3od或d2o或丙酮-d6或cd3cn(来自奥德里奇(aldrich)或剑桥同位素实验室公司(cambridge isotope lab.,inc.))中记录1h-nmr光谱。
[0278]
使用shimadzu 2010质谱仪或agilent 6110a msd或1969a tof质谱仪，使用电喷雾、化学和电子碰撞电离方法由一系列仪器进行ms测量。用于本发明中的详细方法包含：
[0279]
lc-ms方法a：10-80ab_7min_220&254_shimadzu.lcm
[0280]
流动相：1.5ml/4l tfa/水(溶剂a)和0.75ml/4l tfa/乙腈(溶剂b)，历经6分钟使用10％-80％(溶剂b)洗脱梯度且以0.8ml/min的流速在80％下保持0.5分钟；
[0281]
柱：xtimate c18 2.1*30mm，3μm；
[0282]
波长：uv 220nm，254nm；
[0283]
柱温：50℃；
[0284]
ms电离：esi
[0285]
lc-ms方法b：10-80ab_4min_220&254_shimadzu.lcm
[0286]
流动相：1.5ml/4l tfa/水(溶剂a)和0.75ml/4l tfa/乙腈(溶剂b)，历经3分钟使
用10％-80％(溶剂b)洗脱梯度且以0.8ml/min的流速在80％下保持0.5分钟；
[0287]
柱：xtimate c18 2.1*30mm，3μm；
[0288]
波长：uv 220nm，254nm；
[0289]
柱温：50℃；
[0290]
ms电离：esi
[0291]
lc-ms方法c：10-80cd_7min_220&254_agilent.lcm
[0292]
流动相：0.2ml/1l nh3.h2o/水(溶剂a)和乙腈(溶剂b)，历经6分钟使用10％-80％(溶剂b)洗脱梯度且以0.8ml/min的流速在80％下保持0.5分钟；
[0293]
柱：xbrige shield rp-18，5μm，2.1*50mm；
[0294]
波长：uv 220nm和254nm；
[0295]
柱温：30℃；
[0296]
ms电离：esi
[0297]
在shimadzu lc-20a系统或shimadzu lc-2010ht系列，或agilent 1200lc或agilent 1100系列上，使用ultimate xb-c18柱(3.0*50mm，3μm或3.0*150mm，3μm)，或xbridge shieldrp18柱(5μm，50mm*2.1mm)，或xtimate c18柱(3μm，2.1*30mm)，或merck rp18 2.5-2mm等进行高效液相色谱(hplc)测量。用于本发明中的详细方法包含：
[0298]
hplc方法a：10-80ab_8min.met
[0299]
流动相：2.75ml/4l tfa/水(溶剂a)和2.5ml/4l tfa/乙腈(溶剂b)，历经6分钟使用10％-80％(溶剂b)洗脱梯度且以1.2ml/min的流速在80％下保持2分钟；
[0300]
柱：ultimate c18 3.0*50mm，3μm
[0301]
波长：uv220nm，215nm，254nm；
[0302]
柱温：40℃；
[0303]
hplc方法b：10-80cd_8min.met
[0304]
流动相：2.0ml/4l nh3h2o/水(溶剂a)和乙腈(溶剂b)，历经4分钟使用10％-80％(溶剂b)洗脱梯度且以1.2ml/min的流速在80％下保持2分钟；
[0305]
柱：xbrige shield rp-18，2.1*50mm，5μm；
[0306]
波长：uv 220nm，215nm，254nm；
[0307]
柱温：40℃；
[0308]
在agilent 1260系列或waters upcc系列，或shimadzu lc-20ab系列上，使用chiralpak ad-3柱(3μm，150
×
4.6mm)，或chiralcel oj-3柱(3μm，150
×
4.6mm)，或chiralpak ig-3柱(3μm，50mm*4.6mm)等进行超临界流体色谱(sfc)测量。用于本发明中的详细方法包含：
[0309]
sfc方法a：流动相：a：co2，b：乙醇(0.05％dea)，梯度：在5.5min内5％到40％的b且保持40％持续3min，接着5％的b持续1.5min，流速：2.5ml/min；
[0310]
柱：chiralpak ad-3 150
×
4.6mm i.d.，3μm；
[0311]
柱温：40℃；
[0312]
背压：100巴。
[0313]
sfc方法b：流动相：a：co2，b：甲醇(0.05％dea)，梯度：在5min内5％到40％的b和在0.5min内40％到5％的b，保持5％的b持续1.5min，流速：2.5ml/min
[0314]
柱：chiralcel oj-3 150
×
4.6mm i.d.，3μm；
[0315]
柱温：35℃；
[0316]
abpr：1500psi。
[0317]
sfc方法c：流动相：a：co2，b：甲醇(0.05％dea)，等度：40％b，流速：4ml/min；
[0318]
柱：chiralpak ig-3 50mm
×
4.6mm i.d.，3μm；
[0319]
柱温：35℃；
[0320]
abpr：1500psi。
[0321]
使用yantai huanghai hsgf254硅胶或anhui liang chen gui yuan板进行薄层色谱。用于薄层色谱(tlc)的硅胶板是0.15mm～0.2mm。通过tlc分离且纯化产物所使用的硅胶板是0.4mm～0.5mm。
[0322]
纯化色谱柱使用硅胶作为载体(100～200、200～300或300～400目，由烟台黄海公司(yantai huanghai co.)或安徽梁晨归元公司(anhui liang chen gui yuan co.)等制造)，或快速柱(二氧化硅-cs快速柱40-60μm，或反相c18柱20-35μm，由艾杰尔科技公司(agela technologies)等制造)或teledyne isco combi-flash或biotage快速系统中的艾杰尔科技公司的快速柱二氧化硅-cs(40-60μm)或c18柱(20-40μm)。柱的大小根据化合物的量进行调整。
[0323]
本公开的已知起始材料可通过使用或根据所属领域中已知的方法合成，或可购自阿法埃莎公司(alfa aesar)、梯希爱(tci)、奥德里奇、上海毕得医药科技有限公司(bepharm)和上海思阔化学科技有限公司(scochem)(或南京药石科技股份有限公司(pharmablock)、毕得医药(bide)、阿美特克(amatek)、倍达医药科技有限公司(stru chem)、福斯特医药公司(firster pharmaceutical)、泰坦科技(titan)(阿达玛斯(adamas))等)。
[0324]
除非另外说明，否则反应都在氩气或氮气气氛下进行。氩气或氮气气氛是指反应烧瓶连接到体积为约1l的氩气或氮气气球。氢化通常在压力下进行。除非另外说明，否则实例中的反应温度为环境温度，其为10℃～30℃。
[0325]
通过tlc或/和lc-ms监测反应进展。用于反应的洗脱剂系统包含二氯甲烷-甲醇系统和石油醚-乙酸乙酯系统。根据化合物的不同极性调整溶剂的体积比。
[0326]
用于纯化化合物的柱色谱的洗脱系统和tlc的洗脱剂系统包含二氯甲烷-甲醇系统和石油醚-乙酸乙酯系统。根据化合物的不同极性调整溶剂的体积比。可添加少量碱性或酸性药剂(0.1％～1％)，如甲酸、或乙酸、或tfa或氨水以进行调节。
[0327]
本发明的化合物
[0328]
[0329]
[0330]
[0331]
[0332]
[0333]
[0334]
[0335][0336]
表1：本发明的化合物
[0337]
合成方法
[0338]
可根据以下两种合成方法来制备本发明的化合物。
[0339]
方法a
[0340][0341]
方法b
[0342][0343]
方法a
[0344]
化合物2a：5-(((3-氯吡嗪-2-基)甲基)氨基甲酰基)四氢-2h-吡喃-2-甲酸乙酯
[0345][0346]
向6-(乙氧基羰基)四氢-2h-吡喃-3-甲酸(参见wo2019001420a1)(5.90g，29.17mmol)和化合物1a(5.25g，29.17mmol)于二氯甲烷(150ml)中的混合物中添加hatu(16.64g，43.76mmol)和diea(11.31g，87.51mmol)。将混合物在室温(18-22℃)下搅拌12小时。将反应物浓缩且用水(100ml)稀释，用乙酸乙酯(200ml*3)萃取。将合并的有机层用盐水(200ml*4)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤且浓缩以得到粗产物。通过硅胶柱色谱(2.5-3.5％甲醇/二氯甲烷)来纯化粗产物以得到呈黄色油状物的化合物2a(9.0g，产率94.0％)。
[0347]
lcms:tr＝在5-95ab_1.5min_220&254_shimadzu.lcm色谱(agilent pursult 5 c18 20*2.0mm)中为0.689min,ms(esi)m/z＝328.2[m h]

[0348]
化合物3a：5-(8-氯咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-甲酸乙酯
[0349][0350]
向化合物2a(9.0g，27.46mmol)和dmf(600μl)于mecn(150ml)中的混合物中添加pocl3(21.05g，137.30mmol)。将混合物在70℃下搅拌1小时。将反应物浓缩且用水(50ml)和饱和nahco3(50ml)洗涤，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取。将合并的有机层用盐水(200ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤且浓缩以得到粗产物。通过硅胶柱色谱(52～62％乙酸乙酯/石油醚)来纯化粗产物以得到呈黄色油状物的化合物3a(3.5g，产率41.2％)。
[0351]
lcms:tr＝在5-95ab_1.5min_220&254_shimadzu.lcm色谱(agilent pursult 5 c18 20*2.0mm)中为0.742min,ms(esi)m/z＝310.2[m h]

[0352]1h nmr(400mhz,cdcl3):δ＝7.80(d,j＝0.4hz,1h),7.70-7.64(m,1h),7.37(d,j＝4.8hz,0.3h),7.35(d,j＝4.8hz,0.7h),4.44(t,j＝4.4hz,0.7h),4.30-4.25(m,2h),4.23-4.14(m,1h),4.00(dd,j＝3.2,12.0hz,1h),3.79(t,j＝11.2hz,0.4h),3.42-3.19(m,1h),2.47-2.37(m,0.8h),2.29-2.06(m,3h),1.91-1.77(m,0.4h),1.35-1.31(m,3h)。
[0353]
化合物4a：(5-(8-氯咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0354][0355]
在0℃下，向lialh4(860mg，22.60mmol)于thf(20ml)中的混合物中添加含化合物3a(3.5g，11.30mmol)的thf(20ml)。将混合物在0℃下搅拌1小时。将反应物用水(860μl)、15％naoh(860μl)和水(2580μl)淬灭。将混合物用无水硫酸钠干燥且在室温下搅拌0.5小时，过滤且浓缩以得到呈黄色固体状的化合物4a(2.7g，产率89.4％)。
[0356]
lcms:tr＝在5-95ab_1.5min_220&254_shimadzu.lcm色谱(agilent pursult 5 c18 20*2.0mm)中为0.635min,ms(esi)m/z＝267.8[m h]

[0357]
化合物5a：(5-(1-溴-8-氯咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0358][0359]
向化合物4a(2.7g，10.11mmol)于mecn(100ml)中的混合物中添加nbs(2.34g，13.14mmol)。将混合物在室温(16-20℃)下搅拌1小时。将反应物浓缩以得到粗产物，所述粗产物通过硅胶柱色谱纯化(2.2％甲醇/二氯甲烷)以得到呈黄色固体状的化合物5a(2.5g，产率71.63％)。
[0360]
lcms:tr＝在5-95ab_1.5min_220&254_shimadzu.lcm色谱(agilent pursult 5 c18 20*2.0mm)中为0.717min,ms(esi)m/z＝347.8[m h]

[0361]
化合物6a：(5-(8-氨基-1-溴咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0362][0363]
向化合物5a(2.5g，7.21mmol)于ipa(15ml)中的混合物中添加nh3·
h2o(15ml)。在100ml密封试管中将混合物在100℃下搅拌12小时。将反应物浓缩以得到呈黄色油状物的化合物6a(2.4g，纯度98.0％)。
[0364]
lcms:tr＝在10-80ab_3min_220&254_shimadzu.lcm色谱(xtimate c18 2.1*30mm)中为0.436min,ms(esi)m/z＝327.1[m h]

[0365]
化合物7a：(5-(8-氨基-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0366][0367]
在氮气下，向化合物6a(500mg，1.31mmol，纯度97.99％)和(2-氟-4-苯氧基苯基)硼酸(450mg，1.95mmol)于1,4-二恶烷(15ml)/h2o(5ml)中的混合物中添加pd(dppf)cl2.ch2cl2(32mg，0.04mmol)和k2co3(375mg，2.62mmol)。将混合物在氮气下在100℃下搅拌12小时。将反应物用水(20ml)稀释，用乙酸乙酯(50ml*3)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤且浓缩以得到粗产物。通过硅胶柱色谱(2.2％甲醇/二氯甲烷)来纯化粗产物以得到呈黄色固体状的化合物7a(顺式/反式外消旋物的混合物)(150mg，产率26.4％)。
[0368]
lcms:tr＝在5-95ab_1.5min_220&254_shimadzu.lcm色谱(agilent pursult 5 c18 20*2.0mm)中为0.723min,ms(esi)m/z＝435.1[m h]

[0369]
2-氟-4-苯氧基苯基)硼酸：
[0370][0371]
在室温(25-30℃)下，添加化合物1a(10g，52.35mmol)于ch2cl2(480ml)、phb(oh)2(12.8g，104.71mmol)、cu(oac)2(9.5g，52.35mmol)、net3(21ml，151.05mmol)和ms(5g)中的混合物。将混合物在空气下在室温(25-30℃)下搅拌16小时。通过硅藻土垫过滤混合物。在真空中浓缩滤液以得到粗产物，所述粗产物通过硅胶柱色谱(石油醚)纯化以获得呈无色油状物的化合物2a(11.3g，产率80.8％)。
[0372]1h nmr(400mhz,cdcl3):δ＝7.47(t,j＝8.4hz,1h),7.42-7.36(m,2h),7.19(t,j＝8.4hz,1h),7.05(d,j＝8.0hz,2h),6.78(dd,j＝10.0,2.8hz,1h),6.71(dd,j＝8.8,2.0hz,1h)。
[0373]
在-65℃下，向-65℃下的化合物2a(11.3g，42.30mmol)于thf(150ml)中的溶液中添加n-buli(19ml，46.53mmol，2.5n于正己烷中)。将混合物在-65℃下搅拌0.5小时。接着在-65℃下添加b(oi-pr)3(9.5g，50.76mmol)。将混合物在-65℃下搅拌2小时。将混合物用饱和氯化铵溶液(50ml)淬灭，用乙酸乙酯(50ml*3)萃取，用盐水(100ml*2)洗涤。将合并的
有机层用无水硫酸钠干燥，过滤且浓缩以得到粗产物，将所述粗产物用石油醚(100ml)研磨，过滤且将滤饼浓缩以得到呈黄色油状物的2-氟-4-苯氧基苯基)硼酸(4.3g)。将滤液浓缩且通过硅胶柱色谱(0～20％乙酸乙酯/石油醚)纯化以得到呈黄色油状物的2-氟-4-苯氧基苯基)硼酸(3g)。
[0374]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ＝8.10(s,2h),7.58(t,j＝8.0hz,1h),7.47-7.41(m,2h),7.22(t,j＝7.6hz,1h),7.09(d,j＝7.6hz,2h),6.78-6.68(m,2h)。
[0375]
反式异构体1，化合物2：反式-(5-(8-氨基-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0376]
反式异构体2，化合物3：反式-(5-(8-氨基-1-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[1,5-a]吡嗪-3-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0377][0378]
将混合物7a(150mg，0.35mmol)通过手性sfc(柱：daicel chiralpak ad-h)(250mm*30mm，10μm)，条件：0.1％nh3.h2o/etoh，40％，流速80ml/min)来纯化。将含有所需化合物的级分浓缩，用h2o(10ml)和ch3cn(10ml)稀释，冻干以得到呈白色固体状的化合物2(34.8mg，产率23.2％)和呈白色固体状的化合物3(29.4mg，19.6％)。未收集到两种顺式对映异构体。
[0379]
化合物2的光谱：
[0380]
lcms tr＝在10-80ab_7min_220&254_shimadzu.lcm色谱(xtimate c18 2.1*30mm)中为2.037min,ms(esi)m/z＝435.3[m h]

。
[0381]
hplc tr＝在10-80ab_8min.met(hplc-bj ultimate 3.0*50mm 3μm)中为3.03min。
[0382]
sfc tr＝6.119min，光学纯度：96.3％。方法注释：柱：chiralpak ad-3 150
×
4.6mm i.d.，3μm，流动相：a：co2，b：乙醇(0.05％dea)，梯度：在5.5min内5％到40％的b且保持40％持续3min，接着5％的b持续1.5min，流速：2.5ml/min，柱温：40℃，背压：100巴。
[0383]1hnmr(400mhz,cd3od)δ＝7.63(d,j＝5.2hz,1h),7.54-7.36(m,3h),7.27-7.18(m,1h),7.14(dd,j＝8.8,0.8hz,2h),7.02(d,j＝4.8hz,1h),6.98-6.82(m,2h),4.23-4.07(m,1h),3.75(t,j＝11.2hz,1h),3.62-3.51(m,3h),3.46-3.36(m,1h),2.25-2.15(m,1h),2.13-1.96(m,1h),1.79(d,j＝13.6hz,1h),1.66-1.49(m,1h)。
[0384]
19
fnmr(cd3od)δ＝-112.240
[0385]
化合物3的光谱：
[0386]
lcms tr＝在10-80ab_7min_220&254_shimadzu.lcm色谱(xtimate c18 2.1*30mm)中为2.030min,ms(esi)m/z＝435.3[m h]

。
[0387]
hplc tr＝在10-80ab_8min.met(hplc-bj ultimate 3.0*50mm 3μm)中为3.02min。
[0388]
sfc tr＝7.334，光学纯度：92.7％。方法注释：柱：chiralpak ad-3 150
×
4.6mm i.d.，3μm，流动相：a：co2，b：乙醇(0.05％dea)，梯度：在5.5min内5％到40％的b且保持40％持续3min，接着5％的b持续1.5min，流速：2.5ml/min，柱温：40℃，背压：100巴。
[0389]1h nmr(400mhz,cd3od)δ＝7.65(d,j＝5.2hz,1h),7.52-7.37(m,3h),7.29-7.21(m,1h),7.20-7.11(m,2h),7.04(d,j＝4.8hz,1h),6.99-6.84(m,2h),4.24-4.13(m,1h),3.77(t,j＝11.2hz,1h),3.62-3.51(m,3h),3.48-3.77(m,1h),2.31-2.17(m,1h),2.15-2.01(m,1h),1.91-1.74(m,1h),1.69-1.51(m,1h)。
[0390]
19
f nmr(400mhz,cd3od)δ＝-112.258。
[0391]
根据方法a合成以下化合物：
[0392]
[0393][0394][0395]
方法b
[0396]
化合物2b：5-(((3-氨基-5-羟基-1,2,4-三嗪-6-基)甲基)氨基甲酰基)四氢-2h-吡喃-2-甲酸乙酯
[0397][0398]
向5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-乙基四氢-2h-吡喃-2,5-二甲酸酯(20g粗产物，60.88mmol)于乙腈(30ml)中的混合物中添加化合物1b(13g，60.88mmol)和三乙胺(25ml，182.6mmol)。将混合物在50℃下搅拌16小时。将混合物浓缩以得到呈棕色固体状的化合物2b(35g粗产物)。
[0399]
lcms:tr＝在5-95ab_1.5min_220&254_shimadzu.lcm色谱(merck rp18 25-3mm)中为0.582min,ms(esi)m/z＝325.9[m h]

[0400]
5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-乙基四氢-2h-吡喃-2,5-二甲酸酯：
[0401][0402]
向6-(乙氧基羰基)四氢-2h-吡喃-3-甲酸(1.4g，6.92mmol)于ch2cl2(30ml)中的溶液中添加1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(877mg，7.61mmol)和edci(1.6g，8.30mmol)。将混合物在22-26℃下搅拌1.5小时将混合物用二氯甲烷(30ml)稀释，用盐水(50ml
×
3)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤且浓缩以得到直接使用的呈无色油状物的5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-乙基四氢-2h-吡喃-2,5-二甲酸酯。
[0403]
化合物3b：5-(2-氨基-4-羟基咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-甲酸乙酯
[0404][0405]
向化合物2b(35g粗产物，60.88mmol)于乙腈(300ml)中的溶液中添加氧氯化磷(23ml，243.52mmol)。接着将混合物在70℃下搅拌16小时。浓缩混合物，将残余物用二氯甲
烷(150ml)稀释，倒入冷却的饱和碳酸氢钠溶液(300ml)中达ph＝8，用二氯甲烷/甲醇(10:1，200ml*4)萃取，随后用ipa/chcl3(150ml*4)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤且浓缩以得到呈黑色油状物的化合物3b(45g粗产物)。
[0406]
lcms:tr＝在5-95ab_1.5min_220&254_shimadzu.lcm色谱(merck rp18 25-3mm)中为0.13min,ms(esi)m/z＝308.0[m h]

[0407]
化合物4b：5-(2-氨基-5-溴-4-羟基咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-甲酸乙酯
[0408][0409]
向化合物3b(45g粗产物，60.88mmol)于n,n-二甲基甲酰胺(200ml)中的溶液中添加nbs(11.8g，66.96mmol)。将混合物在室温(16-21℃)下搅拌0.5小时。将混合物倒入水(300ml)中，用乙酸乙酯(300ml*4)萃取，用盐水(500ml*4)洗涤。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤且浓缩以得到呈黑色油状物的化合物4b(19g粗产物)。
[0410]
lcms:tr＝在5-95ab_1min_220&254_agilent色谱(agilent poroshell 120 ec-c18 2.7μm 3.0*30mm)中为0.602min,ms(esi)m/z＝388.0[m h 2]

(溴化物同位素)。
[0411]
化合物5b：5-(5-溴-4-羟基咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-甲酸乙酯
[0412][0413]
在0-5℃下，向化合物4b(19g不纯，49.19mmol)于四氢呋喃(300ml)中的溶液中添加亚硝酸叔丁酯(12ml，98.39mmol)，且将混合物在室温(16-21℃)下搅拌16小时。将混合物与另一批次(化合物4b的7.2g粗产物)合并，且浓缩得到粗物质，所述粗物质通过硅胶柱色谱(0～60％乙酸乙酯/石油醚)纯化以得到呈黄色固体状的化合物5b(14.3g，5个步骤的产率为44％)。
[0414]
lcms:tr＝在5-95ab_1.5min_220&254_shimadzu.lcm色谱(agilent pursult 5 c18 20*2.0mm)中为0.753min,ms(esi)m/z＝370.9[m h]

[0415]1h nmr(400mhz,cd3od):δ＝7.74(s,0.3h),7.72(s,0.5h),4.37(t,j＝4.8hz,0.7h),4.29-4.16(m,3h),4.12(dd,j＝11.6,2.0hz,0.3h),3.92(dd,j＝11.6,4.0hz,
0.7h),3.70(t,j＝11.2hz,0.4h),3.57-3.45(m,1h),2.35-1.92(m,4h),,1.33-1.27(m,3h)。
[0416]
化合物6b：5-(4-氨基-5-溴咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-甲酸乙酯
[0417][0418]
在低于10℃下，向1,2,4-三唑(28g，404.1mmol)于乙腈(200ml)中的溶液中添加pocl3(12.5ml，134.7mol)，随后添加三甲胺(56ml，404.1mmol)。将混合物在10℃下搅拌20min，添加化合物5b(5g，13.47mmol)，且将反应混合物在90℃下搅拌1.5小时。将混合物冷却到10℃，添加氨水(30ml，28％)，保持温度低于20℃，且在10℃下搅拌0.5小时。进行相同规模的另一批次。将混合物合并且用水(200ml)稀释并用乙酸乙酯(500ml*3)萃取，用盐水(500ml*3)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤且在真空中浓缩，所述混合物通过硅胶柱色谱(2～4％甲醇/二氯甲烷)纯化以得到呈黄色固体状的化合物6b(9g，产率90％)。
[0419]
lcms:tr＝在\5-95ab_1min_220&254_安捷伦色谱(agilent poroshell 120 ec-c18 2.7μm 3.0*30mm)中为0.614min,ms(esi)m/z＝372.0[m h 2]

(溴化物同位素)。
[0420]1h nmr(400mhz,cd3od):δ＝7.81(s,0.3h),7.79(s,0.6h),4.36(t,j＝5.2hz,0.6h),4.29-4.19(m,3h),4.12(dd,j＝11.6,2.0hz,0.3h),3.93(dd,j＝11.6,4.0hz,0.7h),3.71(t,j＝11.2hz,0.3h),3.63-3.48(m,1h),2.35-2.20(m,1h),2.17-1.94(m,2.7h),1.79-1.68(m,0.3h),1.34-1.26(m,3h)。
[0421]
化合物7b：(5-(4-氨基-5-溴咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0422][0423]
向在0-5℃下冷却的化合物6b(6.1g，16.48mmol)于四氢呋喃(120ml)中的溶液中添加lialh4(1.20g，32.95mmol)，保持温度低于10℃。将混合物在0-10℃下搅拌1.5小时。在0-5℃下，向混合物中添加25g的na2so4·
10h2o且搅拌2小时并过滤。用二氯甲烷/甲醇
(100ml的10:1混合物)使滤饼悬浮两次且过滤。将合并的滤液在真空中浓缩，通过二氧化硅柱色谱(0～10％甲醇/二氯甲烷)来纯化残余物以得到呈白色固体状化合物7b(3.9g，产率72％)和呈黄色固体状的0.6g脱溴副产物。
[0424]
lcms:tr＝在\0-60ab_7min_220&254_shimadzu.lcm色谱(xtimate c18 2.1*30mm,3μm)中为1.958和2.016min,ms(esi)m/z＝328.1[m h]

。
[0425]1h nmr(400mhz,甲醇-d4):δ＝7.80(s,0.3h),7.78(s,0.6h),4.47(dt,j＝10.0,2.0hz,0.6h),4.20-4.13(m,0.3h),3.84(dd,j＝11.6,3.2hz,0.6h),3.64(t,j＝10.8hz,0.4h),3.60-3.38(m,4h),2.45-2.36(m,0.6h),2.22-2.13(m,0.3h),2.09-1.96(m,1h),1.93-1.73(m,1h),1.62-1.45(m,1h)。
[0426]
化合物8b：(5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0427][0428]
将化合物7b(106mg，0.457mmol)、pd(dppf)cl2·
ch2cl2(25mg，0.0304mmol)和碳酸钾(84mg，0.608mmol)放置在反应管中并用氮气吹扫3次，且添加含(2-氟-4-苯氧基苯基)硼酸(100mg，0.304mmol)的1,4-二恶烷(3ml)和水(1ml)。将所得混合物在100℃下在氮气下搅拌2小时。浓缩混合物以获得粗产物，所述粗产物通过硅胶柱色谱(0～100％乙酸乙酯/石油醚)纯化以得到呈黄色油状物的化合物8b(80mg不纯，反式/顺式外消旋体的混合物)。
[0429]
lcms:tr＝在10-80ab_7min_220&254_shimadzu.lcm色谱(xtimate c18 2.1*30mm)中为2.274min&2.340min,ms(esi)m/z＝436.2[m h]

。
[0430]
sfc：tr＝4.171min、4.286min、4.454min和5.581min。方法：柱：chiralcel oj-3 150
×
4.6mm i.d.,3μm流动相：a：co2，b：甲醇，梯度：在5min内5％到40％的b和在0.5min内40％到5％的b，保持5％的b持续1.5min，流速：2.5ml/min，柱温：35℃，abpr：1500psi。
[0431]
顺式异构体1，化合物8：顺式-(5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0432]
顺式异构体2，化合物9：顺式-(5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0433]
反式异构体1，化合物10：反式-(5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0434]
反式异构体2，化合物11：反式-(5-(4-氨基-5-(2-氟-4-苯氧基苯基)咪唑[5,1-f]
[1,2,4]三嗪-7-基)四氢-2h-吡喃-2-基)甲醇
[0435][0436]
化合物8b(80mg)通过制备型sfc(柱：daicel chiralcel oj-h(250mm*30mm，5μm)；条件：30％meoh(0.1％nh3h2o)/co2；流速：60ml/min)进一步分离以得到6.8mg不纯的化合物11，其通过制备型hplc(柱：welch xtimate c18 100*40mm*3μm，条件：25-55％(a：水(0.225％fa)，b：ch3cn)，流速：25ml/min)进一步纯化以得到呈白色固体状的化合物11(1.7mg，2个步骤的产率为1％)。在sfc之后，其他三个峰的混合物(40mg)通过手性sfc(柱：daicel chiralpak ig(250mm*30mm，10μm)；条件：55％meoh(0.1％nh3h2o)/co2；流速：80ml/min)进一步纯化以得到呈白色固体状的化合物8(8.6mg，2个步骤的产率为6.4％)、呈白色固体状的化合物9(6.7mg，2个步骤的产率为5％)和呈白色固体状的化合物10(5.4mg，2个步骤的产率为4％)。
[0437]
化合物8的光谱：
[0438]
lcms:tr＝在10-80ab_7min_220&254_shimadzu.lcm色谱(xtimate c18 2.1*30mm)中为2.356min,ms(esi)m/z＝436.2[m h]

。
[0439]
hplc:tr＝在10-80cd_8min.met.色谱(xbridge shield rp 18 2.1*50mm 5μm)中为3.00min。
[0440]1h nmr(400mhz,cd3od):δ＝7.84(s,1h),7.54(t,j＝8.4hz,1h),7.47-7.41(m,2h),7.26-7.20(m,1h),7.17-7.12(m,2h),6.94(dd,j＝8.0,2.0hz,1h),6.88(dd,j＝10.8,2.4hz,1h),4.56-4.51(m,1h),3.89(dd,j＝11.6,3.6hz,1h),3.65-3.48(m,4h),2.51-2.42(m,1h),2.12-2.02(m,1h),1.99-1.85(m,1h),1.64-1.55(m,1h)。
[0441]
sfc:tr＝4.059min,光学纯度99.94％。
[0442]
方法：柱：chiralcel oj-3 150
×
4.6mm i.d.，3μm流动相：a：co2，b：甲醇(0.05％dea)，梯度：在5min内5％到40％的b和在0.5min内40％到5％的b，保持5％的b持续1.5min，流速：2.5ml/min，柱温：35℃，abpr：1500psi。
[0443]
化合物9的光谱：
[0444]
lcms:tr＝在10-80ab_7min_220&254_shimadzu.lcm色谱(xtimate c18 2.1*30mm)中为2.340min,ms(esi)m/z＝436.3[m h] 。
[0445]
hplc:tr＝在10-80cd_8min.met.色谱(xbridge shield rp 18 2.1*50mm 5μm)中为2.99min。
[0446]1h nmr(400mhz,cd3od):δ＝7.84(s,1h),7.53(t,j＝8.4hz,1h),7.47-7.41(m,2h),7.25-7.19(m,1h),7.17-7.12(m,2h),6.94(dd,j＝8.4,2.0hz,1h),6.87(dd,j＝11.2,2.4hz,1h),4.56-4.50(m,1h),3.88(dd,j＝12.0,3.6hz,1h),3.65-3.48(m,4h),2.50-2.41
(m,1h),2.12-2.02(m,1h),1.97-1.86(m,1h),1.64-1.55(m,1h)。
[0447]
sfc:tr＝4.161min,光学纯度100％。
[0448]
方法：柱：chiralcel oj-3 150
×
4.6mm i.d.，3μm流动相：a：co2，b：甲醇(0.05％dea)，梯度：在5min内5％到40％的b和在0.5min内40％到5％的b，保持5％的b持续1.5min，流速：2.5ml/min，柱温：35℃，abpr：1500psi。
[0449]
化合物10的光谱：
[0450]
lcms:tr＝在10-80ab_7min_220&254_shimadzu.lcm色谱(xtimate c18 2.1*30mm)中为2.410min,ms(esi)m/z＝436.3[m h]

。
[0451]
hplc:tr＝在10-80cd_8min.met.色谱(xbridge shield rp 18 2.1*50mm 5μm)中为2.98min。
[0452]1h nmr(400mhz,cd3od):δ＝7.86(s,1h),7.50(t,j＝8.4hz,1h),7.47-7.41(m,2h),7.26-7.20(m,1h),7.17-7.12(m,2h),6.94(dd,j＝8.4,2.4hz,1h),6.88(dd,j＝10.8,2.4hz,1h),4.24-4.18(m,1h),3.75(t,j＝11.2hz,1h),3.68-3.48(m,4h),2.27-2.19(m,1h),2.16-2.04(m,1h),1.84-1.76(m,1h),1.59-1.47(m,1h)。
[0453]
sfc:tr＝4.405min,光学纯度99.83％。
[0454]
方法：柱：chiralcel oj-3 150
×
4.6mm i.d.，3μm流动相：a：co2，b：甲醇(0.05％dea)，梯度：在5min内5％到40％的b和在0.5min内40％到5％的b，保持5％的b持续1.5min，流速：2.5ml/min，柱温：35℃，abpr：1500psi。
[0455]
化合物11的光谱：
[0456]
lcms:tr＝在10-80ab_7min_220&254_shimadzu.lcm色谱(xtimate c18 2.1*30mm)中为2.365min,ms(esi)m/z＝436.2[m h]

。
[0457]
hplc:tr＝在10-80cd_8min.met.色谱(xbridge shield rp 18 2.1*50mm 5μm)中为3.05min。
[0458]1h nmr(400mhz,cd3od):δ＝7.86(s,1h),7.50(t,j＝8.4hz,1h),7.47-7.41(m,2h),7.26-7.21(m,1h),7.17-7.12(m,2h),6.94(dd,j＝8.4,2.4hz,1h),6.88(dd,j＝10.8,2.4hz,1h),4.24-4.18(m,1h),3.75(t,j＝10.8hz,1h),3.68-3.47(m,4h),2.26-2.18(m,1h),2.16-2.04(m,1h),1.84-1.76(m,1h),1.59-1.47(m,1h)。
[0459]
sfc:tr＝5.802min,光学纯度100％。
[0460]
方法：柱：chiralcel oj-3 150
×
4.6mm i.d.，3μm流动相：a：co2，b：甲醇(0.05％dea)，梯度：在5min内5％到40％的b和在0.5min内40％到5％的b，保持5％的b持续1.5min，流速：2.5ml/min，柱温：35℃，abpr：1500psi。
[0461]
根据方法b合成以下化合物：
[0462][0463]
[0464]
btk(tyr223)夹心elisa试剂盒(#23843)的程序检测p-btk信号。在设定为450nm波长的multiscan光谱读取器上读取板。在graphpad prism软件中处理这些数据。
[0473]
化合物编号p-btk ic
50
(nm)最大抑制水平(％)伊鲁替尼3.0100118.997.9229.198.4378.496.2430.797.4548.795.8626.298.87137.597.9842.1100.99123.5107.71029.098.51134.799.31223.297.01424.398.0
[0474]
hek293-btk(wt)和hek293-btk(c481s)
[0475]
通过使用quikchange ii xl定点突变诱发试剂盒进行突变诱发来产生含有c481s突变的btk的全长cdna。通过测序证实突变的btk cdna。接着将btk(wt)、btk-c481s的cdna克隆到plvx-puro慢病毒载体中。通过用慢病毒载体转染和封装混合物来将慢病毒封装在293t细胞中。将btk(wt)、btk-c481s慢病毒转染到hek293细胞中。在2μg/ml的嘌呤霉素中选择转染的细胞。稳定的多克隆细胞系通过wb证实且用于进一步研究。将hek293-btk(wt)、hek293-btk(c481s)细胞在具有10％fbs(gibco；10099)和1μg/ml嘌呤霉素的dmem(gibco；12430)中培养。使所有细胞保持在37℃的具有5％co2的含湿气培育箱中。
[0476]
将hek293-btk(wt)和hek293-btk(c481s)细胞以5000个细胞/孔的密度接种在具有含有1.5％胎牛血清的rpmi1640培养基的96孔板中。将测试化合物添加到细胞中且将细胞在37℃，5％co2下培育1.5小时。在化合物处理之后，细胞裂解且按照准确遵循phospho-btk(tyr223)夹心elisa试剂盒(#23843)的程序检测p-btk信号。在设定为450nm波长的multiscan光谱读取器上读取板。在graphpad prism软件中处理数据。
[0477]
化合物编号hek293 wt ic
50
(nm)hek293 c481s ic
50
(nm)伊鲁替尼18.1770.4227.370.6418.884.2633.475.41060.0170.01217.646.81416.036.3
[0478]
tmd-8抗增殖分析
[0479]
tmd-8细胞在含有10％胎牛血清的rpmi1640培养基中制备，且以每孔1500个细胞接种在384孔板中。将细胞在37℃，5％co2下培育整夜。在培育之后，将具有不同浓度的化合物添加到分析板中且在37℃，5％co2下将细胞培育另外72小时。在72小时培育之后，将15μl的celltiteraqueous单溶液试剂添加到每个孔中且将板在室温下培育30min。使用celltiter-glo(promega，usa)测定细胞成活力。根据制造商的说明书进行celltiter-glo分析，且在多标签读取器(envision，perkinelmer，usa)中测定荧光。在xlfit软件中处理数据。
[0480]
化合物编号抗增殖ic50(nm)伊鲁替尼1.9124.2222.73106.4416.25102.0627.47219.1877.09160.51032.21170.9
[0481]
体外大鼠/人类肝细胞清除率分析
[0482]
雄性大鼠肝细胞和混合性别的人类肝细胞获自商业供应商(例如，bioreclamationivt)且在使用前存储在-150℃下。在dmso中制备测试化合物的10mm储备溶液。将解冻培养基和补充培育培养基(无血清)放置于37℃水浴中，在使用前持续至少15分钟。通过合并198μl乙腈和2μl的10mm储备溶液将储备溶液稀释到100μm。
[0483]
从存储中去除冷冻保存的肝细胞的小瓶，确保所述小瓶保持处于低温温度。将小瓶在平缓振荡下在37℃水浴中解冻。将小瓶保持在水浴中，直到所有冰晶都溶解且不再可见。将小瓶用70％乙醇喷洒，随后将其转移到生物安全柜中。且接着将内容物倒入到50ml解冻培养基锥形管中。将小瓶在室温下以100g离心10分钟。抽吸出解冻培养基且将肝细胞再悬浮于无血清培育培养基中，以得到约1.5
×
106个细胞/毫升。
[0484]
使用锥虫蓝拒染法(trypan blue exclusion)对细胞成活力和密度进行计数，且接着用无血清培育培养基稀释细胞以达到1
×
106个活细胞/毫升的工作细胞密度。将1
×
106个活细胞/毫升的一部分肝细胞煮沸10min，随后添加到板中作为阴性对照以消除酶活性，使得应当观察到极少或未观察到底物转换。使用失活的肝细胞以制备阴性样本，其用于排除由化学物质本身的不稳定性引起的误导因素。
[0485]
将247.5μl肝细胞的等分试样分配到96孔未涂布板的每个孔中。将板放置于定轨振荡器上的培育箱中持续约10分钟。将2.5μl的100μm测试化合物的等分试样添加到未涂布的96孔板的相应孔中以起始反应。一式两份地进行这种分析。在定轨振荡器上的培育箱中
培育板，持续设计的时间点。在5、15、30、45、60、80和100分钟的时间点处，转移20μl的内容物且与6体积(120μl)的含内标的冷乙腈混合以终止反应。将样本以4000g离心20分钟且100μl的上清液的等分试样用于lc-ms/ms分析以测量测试化合物。
[0486]
基于从其初始浓度测定化合物消失的消除半衰期(t1/2)来估计体外肝细胞清除率。计算每种化合物(测试或对照)与is的峰面积比。绘制ln(对照％)相对于培育时间(min)的曲线，且计算线性拟合线的斜率。药物消除速率常数k(min-1
)、t1/2(min)和体外固有清除率cl
int
(μl/min/e6)是根据以下等式计算：
[0487]
k＝-斜率
[0488]
t
1/2
＝0.693/k
[0489]
cl
int
＝k/chep
[0490]
其中chep(细胞
×
μl-1
)是培育系统中的细胞浓度。
[0491]
用于log d测定的程序
[0492]
将10μl的每个盒的工作溶液依序放置于相应的96孔搁架位置(log d板)中。将500μl的饱和辛醇添加到以上无盖log d板的每个小瓶中，接着添加500μl的饱和磷酸盐缓冲液。用模制的ptfe/sil 96孔板盖密封。
[0493]
将log d板转移到eppendorf thermomixer comfort板振荡仪且在25℃，2,000rpm下振荡2小时。
[0494]
将样本在25℃下以4,000rpm离心30分钟以分离各相。移液器和注射器分别用于从辛醇和缓冲液相吸取约100μl到新的96孔板。
[0495]
将5μl的辛醇样本转移到新96孔板，随后添加495μl的h2o和含内标的乙腈的混合物(1:1)作为100倍辛醇样本。以1,000rpm涡旋5分钟。
[0496]
将50μl的100倍样本转移到新96孔板，随后添加450μl的h2o和含内标的乙腈的混合物(1:1)作为1,000倍辛醇样本。以1,000rpm涡旋5分钟。
[0497]
用h2o和含内标的乙腈的混合物(1:1)将1,000倍辛醇样本连续稀释为10,000、100,000和1,000,000倍。
[0498]
将50μl的缓冲液样本转移到新96孔板，随后添加450μl的h2o和含内标的乙腈的混合物(1:1)作为10倍缓冲液样本。以1,000rpm涡旋5分钟。
[0499]
用h2o和含内标的乙腈的混合物(1:1)将10倍缓冲液样本连续稀释为100、1,000和10,000倍。通过lc/ms/ms分析评估样本。一式一份地测试所有化合物。
[0500]
使用microsoft excel进行所有计算。通过lc/ms/ms评估测试化合物在辛醇/缓冲溶液中的浓度。如下计算测试化合物的log d值：
[0501][0502]
df意指稀释系数。
[0503]
通过使用平衡透析在人类血浆中进行蛋白质结合测量的程序
[0504]
通过添加3μl的每个盒的工作溶液而将597μl空白血浆添加到新塑料板或独立塑料管的每个小瓶中，以1,000rpm涡旋5分钟。有机溶剂的最终体积％为0.5％且测试化合物的最终浓度为5μm。紧接着将50μl的加标血浆悬浮液转移到96孔板以充当t＝0对照样本。与培育之后的样本相同地处理所述样本。将所有其余的加标血浆在研究的持续时间内放置于
培育箱中。
[0505]
将插入物开口端朝上地放置于底板的孔中。将500μl的磷酸盐缓冲液(ph 7.4)添加到缓冲液室中，其由白色圆圈指示。将300μl的加标血浆样本添加到样本室中，其由红色圆圈指示。用透气盖覆盖单元且在37℃下在co2培育箱中的定轨振荡器上以300rpm与5％co2一起培育18小时。在培育结束时，去除盖且分别将50μl的透析后样本从缓冲液室和血浆室吸取到独立的96孔板中以用于分析。
[0506]
同时，将塑料板或独立塑料管中其余的加标血浆样本在37℃下在co2培育箱中与5％co2一起培育18小时。在t＝18小时处，将50μl的原始加标血浆悬浮液转移到96孔板中以用于分析。
[0507]
将50μl的人类血浆添加到缓冲液样本中，且将相等体积的pbs添加到收集的血浆样本中。将板以1,000rpm涡旋2分钟且添加400μl的含有适当内标(is)的乙腈以使蛋白质沉淀且释放化合物。以1,000rpm涡旋10分钟。以4,000rpm离心30分钟。将250μl的上清液转移到新的96孔板中且再次离心(4,000rpm，30分钟)。接着将100μl的上清液转移到新的96孔板中以用于分析。将100μl的蒸馏水添加到每个样本中且以1,000rpm涡旋5分钟以通过lc-ms/ms进行分析。所有化合物在人类血浆中以5μm一式一份地测试。
[0508]
使用microsoft excel进行所有计算。
[0509]
如下计算测试化合物的未结合百分比、结合百分比和回收百分比：
[0510]
未结合％＝(conc.
缓冲液室
/conc.
血浆室
)
×
100％
[0511]
结合％＝100％-游离％
[0512]
回收％＝(500
×
conc.
缓冲液室
300
×
conc.
血浆室
)/(300
×
conc.
总样本
)
×
100
[0513][0514]
剩余％＝conc.
18hr
/conc.
0hr
×
100％
[0515]
结果
[0516][0517]
大鼠中的短期口服吸收(soa)分析。
[0518]
短期口服吸收(short oral absorption；soa)模型是用于鉴定化合物的脑渗透的体内筛选模型。为评估化合物穿过大鼠的血脑屏障的可能性，通过auc
大脑
/auc
血浆
测量总大脑与血浆比(k
p,大脑
)。分别通过口服投药后可用时间点处的auc
csf
/auc
血浆
或csf与血浆比的平均值来确定csf与血浆比(k
p,csf
)。在单独的研究中，通过体外血浆和大脑结合分析来测定生物基质中的游离部分。k
p,uu,大脑
和k
p,uu,csf
通过以下等式计算：(1)k
p,uu,大脑
＝k
p,大脑
×fu
,
大脑
/f
u,血浆
；(2)k
p,uu,csf
＝k
p,csf
/f
u,血浆
。
[0519]
化合物编号大鼠f
u,br
(％)/f
u,pl
(％)k
p,大脑kp,uu
大脑k
p,uu csf
23.3/3.81.351.190.86102.2/3.70.380.230.56141.5/2.00.320.230.59