用于核酸递送的烷基化核苷及其组合物和方法与流程

用于核酸递送的烷基化核苷及其组合物和方法
优先权和相关专利申请
1.本技术要求2020年1月8日提交的美国临时申请(no.62/958，328)的优先权，该申请的全部内容通过引用结合在本技术中。
技术领域
2.本发明涉及化合物和药物组合物及其制备方法以及诊断或治疗方面的应用。更具体地，本发明涉及脂质体、微泡和/或纳米液滴及其乳液的新型化合物、组合物和制剂，其可用于递送各种核酸和基因(例如，单链rna、dna、si-rna和crispr构建体)，及其制备和使用方法，包括使用超声激活的成像和基因递送方法。


背景技术：

3.基因治疗是一个新兴的医学领域，其重点在于使用核酸作为治疗或预防疾病的药物治疗性地递送到患者细胞中。基因疗法包括基于寡核苷酸的药物，如dna、rna、crispr及其组合。目前最受关注的领域是crispr(成簇的有规律间隔的短回文重复序列)，例如crispr-cas9，crispr相关蛋白9，其中rna与cas9酶结合。在crispr-cas9中，修饰的rna用于识别dna序列，cas9酶在目标位置切割dna。双链rna可用作si-rna，si-rna可用作抑制靶基因表达的催化性rna。目前有几种基于反义寡核苷酸(aso)的获批产品。aso通常包括单链rna的构建体，其可以根据靶位阻断或增强基因表达和蛋白质转译。迄今为止，所有获批的aso均采用局部给药的方式。
4.目前人们对新型、改进的递送技术仍有持续性的需求，该递送技术能够系统性和/或局部递送各种基于基因的治疗剂，包括aso。


技术实现要素：

5.本技术描述了包括一种或多种核苷类似物(同时包括脱氧核糖核苷和核糖核苷)的烷基化化合物，其能够产生胶束、脂质体、纳米颗粒、微球、乳剂、氟碳乳剂和微泡。本技术公开的烷基化核苷结合遗传物质(“有效载荷”)上相应的互补核苷，从而将遗传物质整合到相应的结构中。优选带中性电荷的烷基化的核苷(“载体”)，稳定遗传物质并保存遗传物质，直到载体将有效载荷递送至目标细胞。进一步，可选地，本发明包括一种或多种靶向配体，以帮助递送至选定的所需细胞。可选地，超声或其它能量源用于监测遗传有效载荷的递送，并在靶位点“激活”载体以释放遗传有效载荷。激活是指能量介导的与载体的相互作用，促进遗传有效载荷的释放、细胞和亚细胞递送。
6.在一方面，本发明总体上涉及一种化合物，包括一个或多个核苷或其衍生物或类似物，与一个或多个烷基共价连接，每个烷基具有至少9个(例如，至少12个，至少18个)碳原子，或其药学上可接受的形式。
7.在一些实施例中，所述一个或多个核苷或其衍生物或类似物通过连接基团与所述一个或多个烷基共价连接，所述连接基团包括二磷酸部分。
8.在一些实施例中，所述一种或多种核苷或其衍生物或类似物包括一种或多种选自胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶的部分。在一些实施例中，所述一种或多种核苷或其衍生物或类似物包括两种或多种选自胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶的部分。在一些实施例中，所述一种或多种核苷或其衍生物或类似物包括四种部分，选自胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
9.在一些实施例中，所述一种或多种核苷或其衍生物或类似物包括一种或多种选自胞苷、腺苷、5-甲基尿苷、尿苷和鸟苷的部分。
10.在一些实施例中，所述一种或多种核苷或其衍生物或类似物包括两种或多种选自胞苷、腺苷、5-甲基尿苷、尿苷和鸟苷的部分。
11.在一些实施例中，所述一种或多种核苷为中性电荷核苷。
12.在一些实施例中，所述一个或多个烷基各自具有约12至24个(例如，12-16个、16-18个、18-24个)碳原子。在一些实施例中，所述化合物具有两个烷基，每个烷基具有约12至24个碳原子。
13.在一些实施例中，所述一种或多种核苷包括脱氧核糖核酸。在一些实施例中，所述一种或多种核苷包括核糖核酸。
14.在一些实施例中，所述化合物还包括靶向配体。
15.在另一方面，本发明总体上涉及一种复合物，包括本发明公开的化合物，与核酸分子非共价复合。在一些实施例中，所述核酸分子包含基因、rna或crispr序列。
16.在又一方面，本发明总体上涉及一种组合物，包括本发明公开的化合物或其与核酸缀合的复合物。
17.在又一方面，本发明总体上涉及胶束或脂质体，包括本发明公开的化合物或其与核酸缀合的复合物。
18.在又一方面，本发明总体上涉及微泡，包括本发明公开的化合物或其与核酸缀合的复合物。
19.在又一方面，本发明总体上涉及纳米液滴，包括本发明公开的化合物或其与核酸缀合的复合物。
20.在又一方面，本发明总体上涉及一种组合物，包括本发明公开的胶束或脂质体。
21.在又一方面，本发明总体上涉及一种组合物，包括本发明公开的微泡。
22.在又一方面，本发明总体上涉及一种组合物，包括本发明公开的纳米液滴。
23.在一些实施例中，微泡或纳米滴是使用碳氟化合物形成的。在一些实施例中，该碳氟化合物选自全氟丙烷、全氟丁烷和全氟戊烷。
24.在又一方面，本发明总体上涉及一种药物组合物，包括本发明公开的化合物或其与核酸缀合的复合物，或包括这种化合物或复合物的胶束、脂质体、微泡或纳米液滴，以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
25.在又一方面，本发明总体上涉及一种用于治疗疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用一种药物组合物，该药物组合物包括本发明公开的化合物或其与核酸缀合的复合物，或包括这种化合物或复合物的胶束、脂质体、微泡或纳米液滴，以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
26.在一些实施例中，所述疾病或病症选自眼病(葡萄膜炎、视网膜炎和视网膜营养不
良)、血管和心脏病、癌症(急性成淋巴细胞白血病、b细胞淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌和多种肿瘤性病症)、肺病、阿尔茨海默氏病和其他神经退行性病症以及脂蛋白脂肪酶缺乏症。
27.在又一方面，本发明总体上涉及一种将核酸递送至靶侧的方法，该方法包括向受试者施用一种组合物，该组合物包括本发明公开的化合物或其与核酸缀合的复合物，或包括这种化合物或复合物的胶束、脂质体、微泡或纳米液滴，以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
附图说明
28.结合附图阅读以下详细描述，可更好地理解本发明。附图中，相同的附图标记指相同的元素/特征。
29.图1示出了二棕榈酰磷脂酰胞苷(磷脂酰胞苷)的化学结构图。
30.图2示出了用于制备烷基化核苷部分的核糖核苷的示意图。
31.图3a为荧光聚鸟苷(poly-g)与脂质16:0cdp dp的结合图。用16:0cdp dp脂质包被96孔板，并干燥过夜。将浓度增加的poly-g(荧光)dna序列加入孔板中，孵育一小时，观察该序列是否与脂质结合。对照组脂质(dppc)用于判断该序列是否结合。孵育1小时后，用酶标仪测量荧光强度(ex＝488nm，em＝525nm)。
32.图3b为不同浓度的荧光聚鸟苷(poly-g)与含有磷脂酰胞苷的微泡的结合图。
33.图4a示出了结合到微泡上的荧光poly-g的量，该微泡含有脂质16:0cdp dp(1，2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-(胞苷二磷酸)(铵盐))。用cdp dp脂质配制的微泡被活化，然后与来自先前测定的相同稀释物一起孵育1小时。洗涤微泡(mbs)三次，以去除未结合的荧光序列。将部分mbs铺在96孔板中(图4a),孵育1小时后，用酶标仪测量荧光强度(ex＝488nm，em＝525nm)。另一部分在荧光显微镜下观察(图4b)。
34.图4b为含有磷脂酰胞苷结合荧光poly-g的微泡的显微照片。
35.图5为细胞的显微照片，其中含有磷脂酰胞苷结合poly-g的微泡显示在靶细胞上。
36.图6示出了制备二烷基二磷酸核苷部分的合成方案。在叔胺碱中，通过二环己基碳二亚胺(dcc)介导的偶联进行核苷二磷酸与二酰基甘油的游离-oh的结合，得到二烷基二磷酸核苷酸产物。粗物质的纯化通过硅胶色谱实现。
37.图7a示出了制备中性二烷基核苷部分的合成方案。在叔胺碱中，通过dcc介导的偶联进行二酰基甘油与丙酸-peg4-丙酸连接体的结合，以及核苷部分与丙酸-peg4-丙酸连接体的结合。连接体的对称性使得二酰基甘油-连接体或核苷-连接体产物能被独立地制备和分离，用于随后与适当的部分结合，或者在适当的化学计量控制下二烷基核苷的一锅合成。将丙酸-peg4-丙酸(50mg)溶解在1ml乙醚中，加入55μl的socl2(5eq)，并搅拌40分钟。加入吡啶(1.5eq)和溶解在2ml乙醚中的84mg 1，2-二棕榈酰甘油(1eq)。烟雾消失后，加入溶解在1mldmso中的50mg鸟苷(1eq),并搅拌该反应1小时。用各5ml的dmso和乙醚稀释反应物，然后用5ml水除去未反应的亚硫酰氯。分离水层，用乙酸乙酯洗涤，合并两个有机层，用水洗涤。蒸发溶剂，得到58.7mg白色粉末(产率34％)。
38.图7b为使用图7a中的化学方案获得的核苷产物的质谱图。
39.图8示出了防止核糖部分发生副反应的合成方案。两种核苷缀合的合成方法中，均可能与核糖的游离羟基和核碱基的胺发生不良反应。用2，2-二甲氧基丙烷(丙酮二甲缩醛)
保护碳水化合物部分，得到主要产物，为带有游离的5-oh的2，3-异亚丙基，用于随后的缀合反应。这种保护方式可能会得到核碱基胺的亚胺衍生物，也阻碍了这些位点上的副反应。被保护部分的缀合可以如所述进行，然后在弱酸性水溶液条件下水解保护基团，得到产物。
具体实施方式
40.下面将参照附图，结合优选实施例描述本发明，其中相同的数字代表相同或相似的元素/特征。在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”或类似语言的引用表示结合该实施例描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施例中。因此，本说明书中的用语“在一个实施例中”、“在实施例中”和类似的语言可以但不一定都指同一实施例。在一个或多个实施例中，本发明描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合。以下描述中，列举了许多具体细节以便于全面理解本发明的实施例。然而，相关领域的技术人员将认识到，本发明可以在缺少一个或多个具体细节的情况下实施，或用其他方法、成分、材料等来实施。在其他示例里，未详细示出或描述公知的结构、材料或操作步骤，避免模糊本公开的各个方面。在一些实施例中，本技术包括一种或多种烷基化核苷类似物，与一种或多种基因构建体混合。
41.在一些实施例中，该烷基化的核苷材料可单独制备，或者与一种或多种其他烷基化部分一起制备。优选地，该烷基化部分包括脂肪酸、胆固醇及其衍生物、磷脂和含氟表面活性剂。一般来说，一种或多种烷基化核苷类似物与基因构建体一起制备以形成相应的结构，通常尺寸范围为纳米级到微观尺寸，例如从约5纳米到5微米。在一个实施例中，将氟化材料掺入到包含具有基因物质的烷基化核苷部分的组合物中，以形成乳剂、纳米液滴(nd)和微泡(mb)。本技术中，乳剂可以指液体结构中的液体，其在对受试者给药后通常保持原样。nd可以指一种液体材料，但在温度变化时或者在用能量例如光、磁、电能或超声波活化时可以转化成气体或其它状态。mb指结构内的气体。优选的气体包括氟碳气体。
42.在本发明的一个实施例中，所述核苷类似物包括单烷基，例如连接在核苷上的脂肪酸。在另一实施例中，包括胆固醇核苷类似物。在另一实施例中，本发明包括附着在核苷上的氟代烷基部分。在一优选实施例中，本发明包括与核苷首基结合的二烷基部分。
43.可选地，所述烷基化核苷与一种或多种额外的脂质一起制备。在一些实施例中，本技术的磷脂组合物包括一种或多种基本上为电荷中性的磷脂。在一些实施例中，本技术磷脂组合物包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(“dppc”)。dppc是两性离子化合物，且基本上为中性的磷脂。在一些实施例中，本技术的磷脂组合物包括第二磷脂，所述第二磷脂包括多羟基首基和/或大于350道尔顿的首基，其中m选自na

和k

、li

、nh
4
。磷脂可包括铵抗衡离子和与磷酰基部分结合的聚乙二醇(“peg”)首基。在一些实施例中，本技术的组合物包括聚乙二醇化脂质。在一些实施例中，peg基团的分子量mw为约1，000至10，000道尔顿。在一些实施例中，peg基团的分子量mw为约2，000至5，000道尔顿。在一些实施例中，peg基团的分子量mw为约5，000道尔顿。在一些实施例中，本技术的脂质组合物包括一种或多种以下列出的聚乙二醇化脂质:1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-1000(铵盐)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](铵
盐)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](铵盐)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)(铵盐)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](铵盐)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](铵盐)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)和1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000)(铵盐)。上述磷脂5代表二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)。pe，特别是本发明的优选脂质dppe，优选地与其它脂质在制剂中的浓度在5至20摩尔％之间，最优选地10摩尔％。在一些实施例中，本发明包括一种或多种锥形或六边形hii脂质。本发明使用的锥形包括单半乳糖二酰甘油(mgdg)、单半乳糖二酰甘油(mgdg)、双磷脂酰甘油(dpg)，也称为心磷脂、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰乙醇胺(pe)和二酰甘油。磷脂酸(pa)也是一种锥形脂质，但由于其较易水解且可能引起生物效应，不作为优选。最优选的锥形磷脂是磷脂酰乙醇胺(pe)。可用的锥形阳离子脂质的示例包括但不限于1,2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(氯化物盐)、1,2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(甲基硫酸盐)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲铵-丙烷(氯化物盐)、1,2-二棕榈酰基-3-三甲铵-丙烷(氯化物盐)、1,2-二硬脂酰基-3-三甲铵-丙烷(氯化物盐)、1,2-二油酰基-3-二甲铵-丙烷、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲铵-丙烷、1,2-二棕榈酰基-3-二甲铵-丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-二甲铵-丙烷、二甲基双十八烷基铵(钠盐或溴化物盐)、1,2-二-o-十八烯基-3-三甲铵丙烷(氯化物盐)、o,o-二-o-十八烯基-3-ta-三甲基铵乙酰-二乙醇胺。可用的其它阳离子脂质包括n1-[2-((1s)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3氨基丙基)氨基]丁基-甲酰胺基)乙基]-3，4-二[油酰氧基]-苯甲酰胺、1，2-二-o-十八烷基-3-三甲基-铵丙烷(氯化物盐)(dotma)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(氯化物盐)(可用于12-18个碳的不同长度的链、饱和、不饱和或混合链)。二甲基双十八烷基铵(溴化物盐)、n-(4-苄氧羰基)-n，n-二甲基-2，3-双(油酰氧基)丙-1-胺(可用于14-18个碳的不同长度的链、饱和、不饱和或混合链)、1，2-二棕榈酰-3-三甲铵-丙烷(氯化物盐)(可用于14-18个碳的不同长度的链、饱和、不饱和或混合链)、3β-[n-(n'，n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐，n
4-胆固醇基-精胺盐酸盐、1，2-二油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷。
[0044]
阳离子脂质可用于中和rna或dna构建体的电荷，该构建体通常是聚阴离子。人们认为，烷基化的核苷会与rna或dna构建体中的互补核苷形成碱基对，且碱基对的吸引力比阳离子脂质提供的静电相互作用更强。在这方面，使用阳离子脂质时，并非为了结合基因物质，而是为了调节得到的纳米结构的电荷。
[0045]
通常，当烷基化核苷与脂质一起使用时，烷基化核苷的浓度占制剂中总脂质的约1至95摩尔％。更优选地，在制剂中，烷基化核苷占总脂质的约5-50摩尔％；更优选地，烷基化核苷占总脂质的约10摩尔％。如本领域技术人员所知，烷基化核苷部分中的烷基链可以是饱和或不饱和的，使用二烷基核苷时，也可以是混合的，例如，包括饱和和不饱和烷基链。同样，除了烷基化核苷之外，制剂中使用的脂质可以是饱和的或不饱和的，使用二烷基化脂质(例如磷酸胆碱)时，也可以是混合的，例如，包括饱和和不饱和烷基链。在一实施例中，该烷基化核苷类似物通常以约5摩尔％至50摩尔％的摩尔比掺入脂质体。如本领域已知的，该实施例可使用多种脂质。
[0046]
在另一实施例中，核苷脂质用于乳剂中，且可包括高达100％的脂质，但通常小于总脂质的90％、80％或优选约70-75％。
[0047]
在其他实施例中，如示例，该烷基化核苷类似物用于微泡或纳米液滴中。
[0048]
本发明提供了用于各种应用的不同的构建体。给药方式取决于待治疗的病症。本发明的物质可通过静脉、肺部(例如吸入)、口服、皮下注射、经皮、吸入、经鼻、腹膜、阴道、脑池内和直肠给药。
[0049]
用核苷脂质制备的微泡和脂质体可用来治疗肺部疾病。因为微泡充满气体，所以具有非常低的有效流体动力学直径，和利于肺部输送的特性。该构建体可通过吸入给药到肺部。对于吸入，可使用喷雾器。可用的喷雾器包括：喷射喷雾器，使用压缩气体产生气溶胶(空气中药物的微小颗粒)；超声波喷雾器，通过高频振动产生气溶胶；以及筛网喷雾器，液体通过非常细的筛网形成气溶胶。此外，吸入器可用于将产品给药到肺部。示例性吸入器包括氢氟烷烃吸入器或hfa吸入器(以前称为计量吸入器或mdi)、干粉吸入器(dpi)和软雾吸入器(smi)。对于与干粉吸入器一起使用的，其制剂可制为干粉。
[0050]
可使用一种或多种双功能聚乙二醇化脂质。双功能聚乙二醇化脂质包括但不限于dspe-peg(2000)、琥珀酰1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[琥珀酰(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(2000)、pdp 1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[pdp(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(2000)马来酰亚胺1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(2000)生物素1，2-二硬脂酰sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](铵盐)，dspe-peg(2000)氰尿酸1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺n-[氰尿酸(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(2000)胺1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-2000](铵盐)，dppe-peg(5000)-马来酰亚胺，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[二苯并环辛基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[叠氮基(聚乙二醇)-2000](铵盐)，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[琥珀酰(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[琥珀酰(聚乙二醇)-2000)(铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[羧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[pdp(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-2000](铵盐)，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[生物素(聚乙二醇)-2000](铵盐)，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氰尿酸(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[叶酸(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1，2-二硬
脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[叶酸(聚乙二醇)-5000](铵盐)、n-棕榈酰-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)2000、n-棕榈酰-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)5000]}。
[0051]
该双功能脂质可用于将抗体、肽、维生素、糖肽和其他靶向配体连接到含有烷基化核苷的结构上。一个或多个靶向配体可以被整合到相应的结构中。peg链分子量mw的范围可为约1，000道尔顿至10，000道尔顿。在一些实施例中，peg链分子量mw为约2，000至5，000道尔顿。本发明中使用的脂质的脂质链长度可为约12至24个碳。最优选地，链长为约16至18个碳。链可以是饱和的或不饱和的，但优选是饱和的。胆固醇和胆固醇衍生物也可用于本发明，前提是它们是中性的，或者如果带电荷，含有与电荷并置的首基(约大于350mw)，以保护电荷免受生物环境的影响。
[0052]
当双功能脂质用于生成靶向配体(也称为生物缀合物)时，这些靶向部分通常以总脂质的约0.25至10摩尔％掺和到结构中，更优选约0.5至5摩尔％，最优选约1摩尔％。
[0053]
各种实施例中，该烷基化核苷被配制成mb或nd。结构的核心可包括气体或气态前体。代表性气体和气态前体包括氮气、氧气、六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷或其混合物。为了实现成像和基因/aso/si-rna/crispr递送，理想的mb/气态前体包括核心气体，该核心气体具有低的水溶解度以及低于体温的沸点。从而mb/nd具有长循环时间、长使用寿命，以及用于超声显像和用于超声激活的高回声质量，以促进基因递送。本技术的气态前体包括例如氟化碳、全氟化碳、六氟化硫、全氟乙醚及其组合。本领域技术人员可以理解，首次制备组合物时，特定的氟化化合物，如六氟化硫、全氟化碳或全氟乙醚，可以液态存在，因此用作气态前体。该氟化化合物是否为液体通常取决于其液/气相变温度或沸点。例如，优选的全氟化碳、全氟戊烷，具有29.5℃的液/气相变温度(沸点)。这意味着全氟戊烷在室温(约25℃)下通常是液体，但可以在人体内转化为气体，人体正常温度为约37℃，高于全氟戊烷的相变温度。因此，正常情况下，全氟戊烷是一种气态前体。如本领域技术人员所知，物质的有效沸点可能与该物质所受的压力有关。理想气体定律可说明这种关系:pv＝nrt，其中p是压力，v是体积，n是物质的摩尔数，r是气体常数，t是以
°
k为单位的温度。理想气体定律表明，随着压力的增加，有效沸点也增加。反之，随着压力降低，有效沸点降低。用作本发明组合物中气态前体的碳氟化合物包括部分或全部氟化的碳，优选饱和、不饱和或环状的全氟化碳。优选的全氟化碳包括例如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟环丙烷、全氟丁烷、全氟环丁烷、全氟戊烷、全氟环戊烷、全氟己烷、全氟环己烷及其混合物。更优选地，全氟化碳为全氟己烷、全氟戊烷、全氟丙烷或全氟丁烷。
[0054]
优选的醚包括部分或完全氟化的醚，优选沸点为约36℃至60℃的全氟化醚。氟化醚是其中一个或多个氢原子被氟原子取代的醚。本发明中用作气态前体的优选的全氟化醚包括，例如，全氟四氢吡喃、全氟甲基四氢呋喃、全氟丁基甲醚(例如，全氟叔丁基甲醚、全氟异丁基甲醚、全氟正丁基甲醚)、全氟丙基乙醚(例如，全氟异丙基乙醚、全氟正丙基乙醚)、全氟环丁基甲醚、全氟环丙基乙醚、全氟丙基甲醚(例如，全氟异丙基甲醚，全氟正丙基甲醚)、全氟乙醚、全氟环丙基甲醚、全氟甲基乙醚和全氟甲醚等。
[0055]
其他优选的全氟醚类似物含有4-6个碳原子，可选地，含有一个卤离子，优选br-。例如，具有结构cn fy hx obr的化合物可用作气态前体，其中，n为1至约40的整数，y为0到约13的整数，x为0至约13的整数。本发明中用作气态前体的其他优选的氟化化合物为六氟
化硫和八氟丙烷。
[0056]
可使用不同类型化合物的混合物，如氟化化合物(例如，全氟化碳或全氟醚)和另一种气体如氮气的混合物。
[0057]
通常，优选的气态前体在以下温度下进行相变成为气体：高达约57℃、优选地约20℃-52℃、优选地约37℃-50℃、更优选地约38℃-48℃、更优选地约38℃-46℃、更优选地约38℃-44℃、更优选地约38℃-40℃的。如本领域技术人员所知，用于特定应用的气态前体的最佳相变温度取决于下列考量因素，例如：待治疗的具体患者、目标组织、导致温度升高的生理应激状态(例如癌症、感染或炎症等)的性质、所使用的稳定性材料和/或待递送的遗传因子等。
[0058]
此外，如本领域技术人员所知，化合物的相变温度可能会受组织内局部状况的影响，如局部压力(例如，区域内的间质、界面或其他压力)。举例来说，如果组织内的压力高于环境压力，预计会提高相变温度。可采用标准气体定律预测来估计这种影响的程度，如查尔斯定律和波义耳定律。近似地说，压力每增加25毫米汞柱hg，液体至气体相变温度在约30℃至约50℃之间的化合物的相变温度预计将增加约1℃。例如，在约760毫米汞柱的标准大气压下，全氟戊烷液体至气体的相变温度(沸点)为29.5℃，但在795毫米汞柱的间质压力下，其沸点为约30.5℃。
[0059]
本发明的一实施例中，将烷基化核苷掺入脂质混合物中，并用碳氟化合物气体搅拌形成mb。然后，得到的mb经过温度降低和压力增加，将气体核心冷凝成nd。对于本技术，优选的气体是全氟丙烷、全氟丁烷和全氟戊烷。例如，为形成nd的全氟丙烷，可将微泡悬浮液冷却至约-17℃，然后加压至约50psi(例如，通过将氮气或空气注入瓶中)。当nd形成时，mb的乳白色悬浮液变成半透明的蓝色。由全氟丁烷mb形成nd所需的温度和压力要求不高，全氟戊烷mb甚至更低。静脉注射后，nd保持凝聚状态(由于拉普拉斯压力),但在超声作用下又被激活成mb。将mb活化成nd所需的声压对全氟丙烷来说最低，全氟丁烷居中，全氟戊烷nd最高。通过混合这些不同浓度的气体，可将结构调整到给定的声压，在该声压下nd将转化为mb。对于生物医学成像超声应用，功率水平受到限制，以避免生物效应。包含携带遗传药物有效载荷的全氟丙烷核的烷基化核苷可以在安全的声压下活化，例如超声的机械指数小于约1.0。nd的优势在于它具有比mb的微米尺寸更小的直径(例如纳米尺寸)。对于遗传物质有效载荷的递送，物质进入细胞内空间为宜。较小的颗粒有利于细胞递送。在这方面，靶向配体将颗粒结合到细胞靶标上为宜。产生细胞内递送的靶向方案是优选的。例如，e-选择素靶向颗粒被细胞内化。通过掺入第二配体，例如维生素，可实现叶酸或转铁蛋白胞内递送。颗粒被内化后可进入内体并被水解。然而，超声激活会将颗粒的内容物(例如基因有效载荷)从内涵体释放到细胞内。然后该基因有效载荷可进入必需的细胞内间隙，例如crispr的细胞核或aso的核糖体等。
[0060]
在本发明的一实施例中，该烷基化核苷(可选地与一种或多种其它脂质一起配制)可包含括高沸点碳氟化合物材料，例如全氟萘烷、液态氟碳、全氟三丙胺以及本领域技术人员已知的其它此类碳氟化合物。注意，当治疗性基因物质被添加到该烷基化核苷中时，这些结构可能会改变位置形成“筏”。这样，烷基化核苷可重新定向，与待递送的构建体中的rna或dna形成碱基对。在这点上，碳氟化合物可作为界面，降低表面张力、利于热动力学，从而允许烷基化核苷移动位置，得到最有效的碱基配对。
[0061]
在另一实施例中，使用了喷雾干燥和/或冻干法以干燥粉末的形式提供该烷基化核苷和相关的基因药物。可采用本领域已知的多种抗冻剂和稳定剂，包括但不限于海藻糖、甲酰胺、二甲亚砜、以及甲酰胺与dmso、丙二醇、甘油、乙二醇、苏糖醇和2-甲基-2，4-戊二醇的混合物。如本领域技术人员所知的，上述抗冻剂可单独使用或混合使用或与本领域已知的其他抗冻剂联合使用。可选地，通过使用溶剂如甘油和丙二醇，本发明可以以基本无水的形式提供，在使用前用水或盐水再水化。
[0062]
本技术的发明可用于递送多种基于rna和dna的治疗剂。反义寡核苷酸是dna或rna的小片段，与rna的特定分子结合。这通常会影响rna制造特定蛋白质的能力。反义寡核苷酸(aso)之所以被称为反义寡核苷酸，是因为其碱基序列与基因的信使rna互补，信使rna被称为“有义”序列(信使rna“5
’‑
aagguc-3
’”
的有义片段将被反义信使rna片段“3
’‑
uuccag-5
’”
阻断)。历史上，在到达靶位之前，未修饰的磷酸二酯rna aso在静脉注射后被降解。本技术的发明将有助于稳定aso，能够达到期望的目标。其它dna和rna衍生物也可用于本发明，包括吗啉代寡聚体，例如连接到通过磷酰二胺基连接的亚甲基吗啉环骨架上的dna或rna碱基。aso(修饰的或未修饰的)可通过阻止小核核糖核蛋白复合物在前mrna链上的内含子边缘结合，并通过其他机制阻断核糖体活性来干扰前mrna。肽核酸(肽核酸骨架由通过肽键连接的重复n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成)也可用于本发明。本发明中也可以使用锁核酸、修饰的rna核苷酸，其中核糖部分被连接2’氧和4’碳的额外桥修饰。在锁核酸中，该桥将核糖锁定在3
’‑
内构象。锁核酸可与寡核苷酸中的dna或rna残基混合，以增强杂交特性。本技术的发明也有利于rna干扰，其中两种类型的小核糖核酸分子—微rna和小干扰rna(sirna)被用于rna干扰。sirna通常是双链的，包括过客链和引导链。过客链被降解，引导链被整合到rna诱导的沉默复合物中。本技术中的碱基配对，使得采用无过客链的指导链进行rna干扰成为可能。质粒，双链dna的环状结构，通常大小在1到超过1，000千碱基对的范围内，也可以用于本技术的发明。可选地，质粒dna可被加热或经化学手段将两条链部分分开，从而可优化本技术的烷基化核苷和dna之间的碱基配对。此外，crispr(例如crispr-cas9)也可用于本发明，其中系统的单个指导rna识别其在基因组中的靶序列，并且cas9核酸酶作为剪刀切割dna的双链。指导rna将与本发明的烷基化核苷形成碱基对，且当crispr-cas9复合物进入细胞时，可用来释放指导rna。阳离子脂质可与本技术的烷基化核苷一起掺入制剂中，以改善双链dna、rna和crispr构建体的结合。同样，细胞穿透肽和核定位基序也可以整合到本技术的发明中。
[0063]
本领域技术人员将认识到，本技术的发明可用于治疗多种疾病，采用相应的基因构建体来实现治疗。不限定地，本发明可用于治疗眼病(葡萄膜炎、视网膜炎和视网膜营养不良)、血管和心脏病、癌症(急性成淋巴细胞白血病、b细胞淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌和多种肿瘤性病症)、肺病、阿尔茨海默氏病和其他神经退行性病症以及脂蛋白脂肪酶缺乏症。本技术的发明也可以离体使用，例如，将一种或多种基因或其他基因构建体引入细胞，比如car t细胞，以对患者给药治疗。举个例子，使用本技术的发明以靶向car t细胞来治疗p53阳性癌症。本发明可用作体内和体外研究的临床前发现工具。
[0064]
以下实施例旨在说明本发明的实际操作，而非以任何方式进行限制。实施例实施例1磷脂酰胆碱涂层全氟丙烷微泡(mb)的制备，称为mvt-100
[0065]
制备含有二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-5000(dppe mpeg-5000)的脂质混合物。将悬浮在丙二醇中的脂质加热至70
±
5℃,直至溶解。然后将该脂质溶液加入到含有氯化钠、磷酸盐缓冲液和甘油的水溶液中，通过搅拌使其完全混匀。每毫升所得脂质混合物含有0.75毫克总脂质(由0.400毫克dppc、0.046毫克dppe和0.32毫克mpeg-5000-dppe组成)。每毫升脂质混合物还含有注射用水中的103.5毫克丙二醇、126.2毫克甘油、2.34毫克磷酸二氢钠一水合物、2.16毫克磷酸二氢钠七水合物和4.87毫克氯化钠。ph值为6.2-6.8。将该物质装在密封的小瓶中，顶部空间含有八氟丙烷(ofp)气体(》80％)，其余为空气。
[0066]
即使悬浮在生理盐水中，由mvt-100制剂制备的微泡在浓度和粒径大小分布方面仍保持稳定。这种脂质混合物(称为mvt-100)作为制备nd和结合aso的碱基mb。为结合aso，加入了不同摩尔比的核苷磷脂，比如磷脂酰胞苷。实施例2含有mb并负载aso的磷脂酰胞苷的制备
[0067]
采用integrated dna technologies(idt)技术得到荧光标记的poly-g(alexa fluor488)，并加到脂质混合物(0.75mg/ml，73.8摩尔％dppc、9摩尔％dppe、6.3摩尔％dppe-peg5000、10摩尔％16:0cdp dg(胞苷二磷酸))中。搅拌制得mb。将10μlmb与不同稀释度的荧光标记的poly-g一起孵育1小时。孵育一小时后，在eppendorf管中通过离心(1500rpm，3分钟)除去未结合的荧光poly-g。用注射器抽出底部透明液体，顶部乳白色mb层重新悬浮在新鲜pbs中。这样操作3次。实施例3aso与mb的结合(有、无磷脂酰胞苷的情况)
[0068]
将与aso结合的mb的等分试样接种在96黑孔板中，并使用酶标仪(molecular devices，spectramax m3)在下测量荧光强度。将与aso结合的mb的等分试样接种到多聚赖氨酸涂覆的玻璃底皿(mat tek，ashland，ma)上，让它们附着在表面上。使用徕卡dmi6000多功能电动倒置显微镜观察荧光mb。实施例4纳米液滴的制备(有、无磷脂酰胞苷的情况)
[0069]
通过在-17℃和50psi的乙二醇浴中孵育5分钟，低温浓缩了基于mvt-100的全氟丙烷(pfp)mb和专有非关键赋形剂。mb呈白色泡沫状，但缩合处理后，nd呈淡蓝色半透明乳液状。与母体mvt-100mb相比，得到的nd的平均粒度为600nm，pfp浓度为90％，母体-100mb的平均粒度为830nm，顶部空间的pfp浓度为90％。实施例5磷脂酰胞苷mb与细胞的孵育
[0070]
将与aso结合的mb的等分试样加入到人上皮性结肠直肠腺癌细胞(caco2)中。使用补充有20％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的atcc配制的eagle培养基(emem),在t25烧瓶中培养细胞。在37℃下、5％二氧化碳的潮湿空气中℃孵育细胞。融合后，用胰蛋白酶分离细胞，并转移到多聚赖氨酸涂覆的玻璃底皿上，接着孵育,再经过24小时以确保粘附。加入mb并与细胞一起孵育2小时。2小时后，洗涤细胞以去除未结合的荧光mb。使用徕卡dmi6000多功能电动倒置显微镜观察细胞。预测性实施例1含有四种不同核苷脂质的mb的制备
[0071]
mb由实施例1中描述的脂质制备，不同的是：10摩尔％的脂质被四种不同的核苷脂质替代。按照图6所示的合成方案，制备了磷脂酰胞苷、腺嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤。通过hplc纯化每种相应的磷脂酰核苷。每个磷脂酰核苷部分以2.5摩尔％加入到制剂中，这样总
磷脂酰核苷的总摩尔百分比为10摩尔％。得到的mb表现出与aso的强烈亲和力。血清稳定性分析表明，与不含mb的aso相比，含有磷脂酰核苷的mb在稳定性方面有显著的提高。预测性实施例2含有四种不同核苷脂质的nd的制备
[0072]
mb的制备同预测性实施例1。如实施例4中那样，将得到的mb暴露于降低的温度和升高的压力中。然后将nd与aso一起孵育。预测性实施例3制备靶向e-选择素的nd(tnd)，用于aso给药
[0073]
用dspe-peg-马来酰亚胺和dk12-oh肽来制备e-选择素结合肽的生物缀合物。经hplc纯化该生物缀合物，并经质谱仪确认其结构。制备tnd，通常是将1摩尔％的生物缀合物与76摩尔％的dppc、7摩尔％的dppe-mpeg(5000)、7摩尔％的dppe、以及10摩尔％的核苷磷脂酰胆碱脂质(如预测性实施例1所描述的)混合。将脂质溶解在摩尔比为76/7/7/10的缓冲生理盐水、丙二醇和甘油的稀释剂中。将透明混合物脂质置于充满八氟丙烷气体的密封小瓶中。分别使用粒径检测仪accusizer
tm
780(particle sizing systems,port richey,fl)和粒度分析仪nanobrook 90plus(brookhaven)对nd制剂的粒子尺寸和浓度进行表征，以确保nd制剂的均匀性。使用拉曼光谱仪(dxr2 smart raman，thermoscientific)测量不同制剂中的八氟丙烷的浓度。e-选择素和icam-1的aso，作为硫代磷酸酯类似物与nd一起孵育，并透析掉未结合的aso。得到的nd靶向e-选择素，可用于减轻炎性病症，如葡萄膜炎、关节炎或其他相关病症。预测性实施例4缀合aso的脂质体的制备
[0074]
预测性实施例4中描述的脂质用于制作脂质体。本技术不使用氟碳气体。脂质被再水化后，通过冷冻-融化然后挤压得到脂质体。将aso加入到该脂质体中，通过透析除去未结合的aso。得到的脂质体靶向e-选择素，用于针对炎性病症，递送aso。实施例5用于结合aso的乳液的制备
[0075]
图7a-7b中的中性脂质是用胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤头基制备的。该脂质的配制中无添加额外脂质，并形成胶束。将aso加入所得的胶束中形成复合物。预测性实施例6制备核苷脂质，以消除核糖副反应
[0076]
图8所示的核苷脂质被制得并经hplc纯化。得到的核苷脂质用于结合aso。预测性实施例7葡萄膜炎患者的成像和治疗
[0077]
nd的制备如上所述，含10摩尔％的核苷脂质，有胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤头基。将e-选择素和icam-1的aso加到nd并与之缀合。该nd含有微量的荧光团dio。将含有约10
10
的nd和约2毫克e-选择素和icam-1的aso的溶液(约2.5毫升)通过静脉注射到葡萄膜炎患者体内。眼底镜检查显示，发炎的视网膜中有nd的摄入。20mhz换能器的超声成像显示眼睛的发炎区域摄入了nd。然后使用功率水平为720毫瓦的1.0mhz换能器来空化nd/mb，将aso从发炎的内皮细胞和巨噬细胞的内体中释放出来。两周后e-选择素靶向mb的随访成像显示摄入少很多，反映炎症减轻。预测性实施例8肺部给药和肺部疾病治疗
[0078]
核苷脂质制备的微泡和脂质体可用于治疗肺部疾病。
[0079]
a.中性核苷脂质与脂质二棕榈酰磷脂酰胆碱(ddpc)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)和dppe-peg(5000)混合。脂质的最终浓度为约10-20摩尔％的核苷脂质和80-90摩尔％的dppc、dppe和dppe-peg。非核苷类脂的比例为约82摩尔％的dppc、10摩尔％的dppe和
8摩尔％的dppe-peg。脂质悬浮在含有约80w/vol％的生理盐水、10v/vol％的丙二醇和10w/vol％的甘油的液体中。总脂质＝约2mg/ml，置于wheaton玻璃小瓶中，体积1.5ml，顶部空间为全氟丁烷，将小瓶密封。在混合装置上以约4，500rpm的速度摇动小瓶，产生含有约10-20摩尔％核苷脂质的微泡。然后将微泡与大约1∶1重量/体积的脂质和w/vol的靶向tgf-βmrna的反义寡核苷酸混合，并轻轻搅动，然后使用超声喷雾器为患有特发性肺纤维化的患者给药。患者吸入携带反义寡核苷酸的雾化微泡。几个月内经过多次治疗，病症得到改善。
[0080]
b.大致重复以上操作，不同的是，将反义寡核苷酸(aso)加入到小瓶中的脂质水悬浮液中，并再次搅拌，使微泡在形成时结合aso。
[0081]
c.大致重复上述a的操作，不同的是，将脂质溶解在丙二醇中，用aso加热至55℃，并通过0.2微米过滤器过滤。然后将该物质装入小瓶，并用全氟丁烷气体密封。得到的产品基本上是无水的。将小瓶以约4，500rpm的速度摇动45秒，然后向小瓶中注射约80％w/vol的盐水和约10％w/vol的甘油，使得微泡再水合。在小瓶中轻轻搅动该物质，使用注射器抽取，装入超声喷雾器中，用于对患者给药。
[0082]
申请人在此公开的内容已通过参照附图在优选实施例中描述，其中相同的附图标记表示相同或相似的元素或特征。在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”或类似语言的引用表示结合该实施例描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施例中。因此，本说明书中的用语“在一个实施例中”、“在实施例中”和类似的语言可以但不一定都指同一实施例。
[0083]
本技术所公开的特征、结构或特性可以以任何合适的方式结合在一个或多个实施例中。在本文的描述中，列举了许多具体细节以便于全面理解本发明的实施例。然而，相关领域的技术人员将认识到，本技术的组合物和/或方法可以在缺少一个或多个具体细节的情况下，或用其他方法、成分、材料等来实施。在其他示例里，未详细示出或描述公知的结构、材料或操作步骤，避免模糊本公开的各个方面。
[0084]
在本说明书和所附权利要求中，单数形式“一”、“一个”、“该”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。
[0085]
除非特别说明或文中显而易见，本技术的用语“约”应理解为“在本领域中的正常公差范围内”，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内。除非文中另有说明，本技术中的所有数值均可用“约”描述.
[0086]
除非特别说明或文中显而易见，本技术的用语“或”应理解为包含性的。
[0087]
用于定义组合物和方法时，用语“包括”是指组合物和方法包括所述的要素，但不排除其它成分。定义组合物和方法时，用语“基本上由
……
组成”是指所述组合物和方法包括所列举要素，且排除对所述组合物和方法具有实质影响的其它要素。例如，“基本上由
……
组成”是指明确列举的药理学活性剂的施用，不包括未明确列举的药理学活性剂。用语“基本上由”不排除药理学上无活性或惰性的试剂，例如,药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。定义组合物和方法时，“由
……
组成”是指排除了其它微量的成分要素和实质方法步骤。由这些过渡语所定义的实施例均被包括在本发明的范围内.
[0088]
除非另外定义，本技术所使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义。虽然与本文所述的方法和材料相似或等同的其他方法和材料也可用于本技术
的实际操作或测试，但这里仅描述了优选的方法和材料。除了所公开的特定顺序之外，本技术所述的方法可以逻辑上可能的任何顺序来操作。通过引用并入
[0089]
本公开中，参考和引用了其他文献，例如专利、专利申请、专利出版物、期刊、书籍、论文、网络内容。本文所述所有文件通过引用整合于本技术中。任何材料或其某部分，即通过引用并入本文的，但与本文明确阐述的现有定义、陈述或其他公开材料相冲突的，仅在该并入的材料和本公开材料之间不发生冲突的情况下并入。在发生冲突的情况下，从有利于本技术的角度来解决冲突，将该有利于本技术的公开作为优选实施方式。等同物
[0090]
代表性实施例旨在帮助说明本发明，并非限制本发明的范围，也不应将其解释为限制本发明的范围。实际上，除了在此示出的和描述的之外，本技术的全部内容，包括申请中包含的例子和对科学和专利文献的引用，使得本发明的各种修改及其多种进一步的实施例对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些实施例包含重要的附加信息、范例和指导，这些信息、范例和指导可适用于本发明的各种实施例及其等同物的实际操作。