趋化因子受体4在促进hUC-MSCs增殖中的应用的制作方法

趋化因子受体4在促进huc-mscs增殖中的应用
技术领域
1.本发明属于干细胞领域，具体涉及趋化因子受体4在促进huc-mscs增殖中的应用。


背景技术：

2.间充质干细胞存在于人体的许多器官和组织中，它们具有再生和分化潜能，在修复体内受损组织方面起着重要作用，目前已经成为人体组织器官修复的重要研究方向。从脐带中提取出的具有增殖和多向分化潜能的人脐带间充质干细胞(huc-mscs)具有来源充足、取材方便、培养简单等特点，也不存在伦理学问题，因而得到广泛研究开发和应用。
3.huc-mscs用作组织工程种子细胞首要解决的问题是在体外获得较高数量的huc-mscs，因此，如何促进huc-mscs体外增殖是huc-mscs研究的一个重要内容。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供趋化因子受体4在促进huc-mscs增殖中的应用。
5.本发明目的通过如下技术方案实现：
6.麦珠子酸通过提高趋化因子受体4表达水平在促进huc-mscs体外增殖中的应用，且获得的种子细胞维持多向分化能力。
7.麦珠子酸用于制备促进huc-mscs体外增殖的培养基的用途。
8.技术效果：
9.本领域技术人员知道，huc-mscs用作组织工程种子细胞首要解决的问题是在体外获得较高数量的huc-mscs。本发明通过研究发现麦珠子酸可以通过提高趋化因子受体4表达水平促进huc-mscs体外增殖，且获得的种子细胞维持多向分化能力。
附图说明
10.图1为huc-mscs表面标志物表达情况；
11.图2为细胞周期分布；
12.图3为多向分化图；
13.图4为westernblot检测各组huc-mscs中cxcr4蛋白表达。
具体实施方式
14.下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
15.一、实验材料
16.胎牛血清、dmem/f12培养基购自gibco公司，双抗、pbs和胰蛋白酶购自碧云天生物。fitc或pe标记的鼠抗人cd90、cd105、cd73、cd14、cd34和cd45抗体及各相关同型对照购自美国ebioscince公司。麦珠子酸(alphitolic acid，cas no：19533-92-7)购自上海源叶生物科技有限公司，hplc≥97％。人脐带间充质干细胞成软骨、成骨、成脂分化试剂盒购自
麒盟(上海)生物医学有限公司，分别带阿尔新蓝、茜红素和油红o染液。
17.二、实验方法
18.1、huc-mscs培养和鉴定
19.无菌条件下取健康足月顺产新生儿脐带组织，用含1％双抗的pbs洗涤去除残血，并剔除脐动静脉，留下wharton胶样组织，剪碎形成约1mm3的小块，于37℃、5％co2、饱和湿度条件下用含10％胎牛血清和1％双抗的dmem/f12培养基培养，每3～4d换液1次。待细胞长到80％左右时，胰酶消化传代。
20.取第3代huc-mscs，流式检测huc-mscs表面标志物表达情况。
21.2、mtt法测定细胞增殖活性
22.取生长状态良好的第3代huc-mscs，调整细胞浓度至5
×
104个/ml，混匀后接种于96孔板中，每孔100μl，每组设5个复孔。12h后，实验组更换为含有不同浓度麦珠子酸(低浓度为8μm、高浓度为16μm)的完全培养基培养，空白对照组的培养基中不含有麦珠子酸。继续培养48h后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，培养4h，去上清液，加入150μl dmso轻轻震荡，用酶标仪检测其在490nm处的吸光度(od值)，通过od值按照如下公式计算实验组增殖活性，空白对照组增殖活性计为100％：实验组增殖活性＝实验组od值/空白对照组od值
×
100％。吸光度越高代表增殖活性越强。
23.3、细胞周期分布检测试验
24.取生长状态良好的第3代huc-mscs，调整细胞浓度至2
×
104个/ml，混匀后接种于6孔板中，每孔2.5ml，每组设2个复孔。12h后，实验组更换为含有不同浓度麦珠子酸(低浓度为8μm、高浓度为16μm)的完全培养基培养，空白对照组的培养基中不含有麦珠子酸。继续培养24h后，消化收集细胞，pbs洗涤，用-20℃预冷的75％酒精吹打混匀，固定。根据细胞周期检测试剂盒说明书，使用流式细胞仪完成细胞周期检测。
25.4、多向诱导分化试验
26.使用人脐带间充质干细胞成软骨、成骨、成脂分化试剂盒，根据说明书，分别对16μm麦珠子酸干预培养48h的第3代huc-mscs行成软骨、成骨、成脂诱导分化，分别进行阿尔新蓝、茜红素和油红o染色，以正常培养的第3代huc-mscs作为对照。
27.5、western blot试验
28.分别收集0、16μm麦珠子酸干预培养48h的huc-mscs，提取细胞总蛋白，用bca法测定蛋白浓度，稀释分装成同一浓度，加入5
×
蛋白上样缓冲液混合，100℃煮沸10min，冷却后放入-80℃保存。将40μg提取的蛋白样品在10％sds-page分离凝胶上电泳，将分离后的蛋白条带转移至pvdf膜，5％脱脂奶粉室温封闭2h，加入cxcr4、gapdh一抗，4℃孵育过夜。tbst反复洗膜后，hrp标记二抗孵育1h，洗膜后化学发光试剂显色，于凝胶成像仪中检测蛋白条带。
29.6、统计学分析
30.采用graphpad prism 5软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析，p《0.05认定为差异显著。
31.三、实验结果
32.1、huc-mscs培养和鉴定
33.huc-mscs表面标志物表达情况如图1所示，huc-mscs表面阳性表达cd73、cd90、cd105，阴性表达cd14、cd34和cd45，符合huc-mscs表面标志物的特点。
34.2、细胞增殖活性和细胞周期分布
35.各组细胞增殖活性如表1所示，细胞周期分布如图2和表1所示，实验组huc-mscs的增殖活性显著强于对照组，这可能与麦珠子酸可以促进huc-mscs细胞周期从g1期向s期过渡。实验组处于s期huc-mscs的比例明显多于对照组。
36.表1细胞增殖活性和细胞周期分布
37.组别增殖活性(％)g1期比例(％)s期比例(％)对照组100.0
±
3.975.3
±
4.114.6
±
2.3实验组8μm161.8
±
5.262.8
±
3.524.9
±
2.0实验组16μm255.3
±
4.855.4
±
3.733.5
±
2.7
38.*代表与对照组相比差异显著。
39.3、多向分化能力
40.染色结果如图3所示，麦珠子酸干预培养48h的huc-mscs与常规培养的huc-mscs均维持良好的多向分化能力，均出现明显的成软骨、成骨和成脂分化。
41.4、cxcr4蛋白表达水平
42.凝胶成像仪中检测的蛋白条带如图4，麦珠子酸干预培养的huc-mscs中cxcr4蛋白表达水平明显高于常规培养的huc-mscs。
43.上述试验证明，麦珠子酸可以通过提高趋化因子受体4表达水平促进huc-mscs体外增殖，且获得的种子细胞维持多向分化能力。
44.上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。