表达荧光报告基因的芽孢杆菌属质粒的制作方法

表达荧光报告基因的芽孢杆菌属质粒
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技术领域
3.本发明涉及用于使芽孢杆菌属菌株发出荧光的荧光报告基因质粒系统，以及用于对芽孢杆菌属菌株的状态进行可视化的方法。


背景技术：

4.论文“molecular kinetics of reviving bacterial spores[复苏细菌孢子的分子动力学]”(segev e.等人,2013.j bacteriol[细菌学杂志]195:1875-82)利用两种不同的菌株，这两种不同的菌株含有绿色荧光蛋白(gfp)与枯草芽孢杆菌中的rpla或sspa的翻译融合物。同一研究组在先前工作中详细说明了对这些菌株的原始构建(rosenberg a,sinai l,smith y,ben-yehuda s.2012.dynamic expression of the translational machinery during bacillus subtilis life cycle at a single cell level.[枯草芽孢杆菌生命周期中翻译机制在单细胞水平上的动态表达]plos one[公共科学图书馆综合]7:e41921)，并且类似的融合物已用于跟踪芽孢杆菌属菌落形态(mamou g,malli mohan gb,rouvinski a,rosenberg a,ben-yehuda s.2016.early developmental program shapes colony morphology in bacteria.[早期发育程序塑造细菌的菌落形态]cell rep[细胞报告]14:1850-7)。在这些先前的研究中，目的菌株含有单个遗传回路以允许仅一种类型的荧光；开发了多种菌株以从多于一个基因引发荧光。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供了荧光报告基因质粒系统，该荧光报告基因质粒系统用于使芽孢杆菌属菌株发出荧光，其中该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态和/或在其代谢活性营养状态下发出荧光，并且其中将该质粒系统设计为在染色体外发挥功能。在一方面，将质粒转化至芽孢杆菌属细胞中后，质粒系统使芽孢杆菌属菌株发出荧光，其中该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态和/或在其代谢活性营养状态下发出荧光。在另一方面或另外的方面，该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态时发出第一荧光颜色的荧光，并且在其代谢活性营养状态时发出第二荧光颜色的荧光，并且其中该第一荧光颜色不同于该第二荧光颜色。
[0006]
本发明进一步提供了对芽孢杆菌属菌株在动物、植物或植物种子中的状态进行可视化的方法，该方法包括
[0007]
a.将芽孢杆菌属菌株和包含单或双报告基因质粒系统的细胞组合，用于使芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时发出一种荧光颜色的荧光，和/或在代谢活性营养状态时发出另一种荧光颜色的荧光，
[0008]
b.用步骤(a)的芽孢杆菌属菌株处理动物或植物种子，
[0009]
c.从步骤(b)的经处理的动物或植物种子中收集样品，
[0010]
d.任选地用dna染料染色步骤(c)的样品，以及
[0011]
e.将步骤(c)或(d)的样品成像以对芽孢杆菌属菌株的状态进行可视化。
[0012]
本文还包括对芽孢杆菌属菌株在体外或体内的状态进行可视化的方法，其中使用质粒系统使这些芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态和/或代谢活性营养状态下发出荧光，其中这些芽孢杆菌属菌株的荧光表明该菌株的状态。
附图说明
[0013]
图1示出了双报告基因质粒pjdh20(seq id no:5)的质粒图谱。
[0014]
图2示出了在含有5ug/ml红霉素和25ug/ml林可霉素的lb培养基中孵育后，保藏为dsm 29870的枯草芽孢杆菌菌株(描述于wo2016/118864中)的双报告基因荧光菌株的荧光显微镜检查。所示出的为0h(顶行)和24h(底行)后样品的代表性图像。使用相差(左列)、gfp滤光片(中间列)、以及dsred滤光片(右列)，捕获每个样品图像。
[0015]
图3示出了在含有5ug/ml红霉素和25ug/ml林可霉素的lb培养基中孵育后，保藏为dsm 29870的枯草芽孢杆菌菌株的野生型菌株的荧光显微镜检查。所示出的为0小时(顶行)和24小时(底行)后样品的代表性图像。使用相差(左列)、gfp滤光片(中间列)、以及dsred滤光片(右列)，捕获每个样品图像。
[0016]
图4示出了在含有5ug/ml红霉素和25ug/ml林可霉素的lb培养基中孵育后，保藏为dsm 29870的枯草芽孢杆菌菌株的在野生型(
◇
)和荧光( )孢子萌发期间的绿色荧光事件的百分比的流式细胞术。不含孢子的空白样品(
○
)也显示为阴性对照。所示数据是三个重复实验的散点图。还示出了空白(实线)、野生型(短划线)和荧光(点划线)菌株的带阴影的线性回归，该线性回归表明95％的置信区间。
[0017]
图5示出了在含有5ug/ml红霉素和25ug/ml林可霉素的lb培养基中孵育后，保藏为dsm 29870的枯草芽孢杆菌菌株的在野生型(
◇
)和荧光( )孢子萌发期间的红色荧光事件的百分比的流式细胞术。不含孢子的空白样品(
○
)也显示为阴性对照。所示数据是三个重复实验的散点图。还示出了空白(实线)、野生型(短划线)和荧光(点划线)菌株的带阴影的线性回归，该线性回归表明95％的置信区间。
[0018]
图6示出了来自实例3的胃肠(gi)内容物样品的图像实例。上四张图像分别显示来自十二指肠、回肠、盲肠和用sytoxgreen dna染色的作为参考菌株的纯枯草芽孢杆菌菌株培养物的样品，并且下四张图片分别显示来自十二指肠、回肠、盲肠和用cy3-dsred染色的参考菌株的样品。与总细胞dna染色相比，纯菌株培养物证明异质表达rfp群体。
[0019]
图7.在从所有收集的图像中检测到单个对象后，小图示出了整个数据集，其中x轴上为作为对象标识符的dna，并且y轴上为所测量的rfp强度。用于此比较的所有数据均来自样品稀释物。观察到一簇rfp明亮对象(bright object)。
[0020]
图8示出了基于高rfp强度水平选择的单个对象的亚组。在所有含有纯的表达rfp的菌株样品的孔中，检测到大量cy3明亮对象。还有，在喂食表达rfp的枯草芽孢杆菌菌株的鸟类的回肠样品中检测到rfp明亮对象，但未在喂食不同饮食的对照鸟类的回肠样品中检测到。
[0021]
图9.与来自对照鸟类的回肠内容物样品相比，来自喂食表达rfp的枯草芽孢杆菌菌株和选择抗生素的鸟类的示例性回肠内容物样品图像。
[0022]
图10.荧光报告基因菌株表明，芽孢杆菌属对萌发的玉米种子的根定殖是菌株依赖性的。示出了巨大芽孢杆菌o83an1(a)、巨大芽孢杆菌o8337c(b)、解淀粉芽孢杆菌o44eay(c)和苏云金芽孢杆菌o84yvj(d)，在种子萌发4-5天后，胚根顶部、中部和底部(参见插图标记)切片的荧光显微镜检查。所示出的为每种菌株至少10个重复样品的代表性图像，并且每个图像示出了带有绿色和红色滤光片两者的切片的荧光叠加。有活力的细菌细胞发出红色荧光(图中为浅色杆状)，并且植物细胞自然地发出绿色荧光(图中为浅色矩形细胞)。所有图像为400x放大率。
[0023]
定义
[0024]
以下包括可以在整个披露内容和权利要求中使用的所选术语的定义。这些定义包括落入术语范围内并且可用于实施的各种实例和/或组分形式。这些实例并非旨在为限制性的。术语的单数和复数形式均落入定义内。
[0025]
能够萌发：就细菌孢子而言，术语“能够萌发”意指当提供足够的萌发剂时，群体中的至少一些孢子将萌发。
[0026]
约：该术语意指对于所述值或特性
±
10％。
[0027]
质粒：小的双链dna分子，保留在细胞内，但与较大的染色体dna分子在物理上分离。它们独立复制并且是环状的。
[0028]
质粒的骨架：“质粒的骨架”或“质粒骨架”是指设计为模板的基因工程化质粒，用于容易地进行另外的遗传操作。骨架至少包含用于在细菌宿主中选择质粒的一种或多种选择性标记、用于将外源dna整合到质粒中的一种或多种多克隆位点区域、在分子的潜在宿主中复制所需的任何复制起点。为了将质粒从一个细菌宿主转移到另一个细菌宿主中，它也可能含有一个转移起点(orit)。
[0029]
转化：将外源dna(如质粒)引入细胞的过程。
[0030]
细菌：意指原核生物体，这些原核生物体在其细胞壁中具有肽聚糖，并且在其细胞膜中具有含有脂肪酸的脂质。
[0031]
细菌孢子：是指某些细菌在称为孢子形成的过程中形成的结构。通常，细菌孢子对环境条件具有抗性，代谢无活性，并且不能繁殖。细菌孢子通常能够萌发成营养细胞。
[0032]
定制：术语“定制”的质粒用于描述针对特定受体细菌物种设计的质粒。因此，非定制的质粒系统是针对细菌属而非物种的受体设计的质粒系统。
[0033]
休眠芽孢状态：产生芽孢的细菌的生命周期中的状态，在该状态中这些产生芽孢的细菌处于稳定的静止、非生殖和酶惰性(称为“休眠”)形式。
[0034]
芽孢：意指在细菌内部发育的孢子类型，并且处于细菌营养细胞的休眠、非生殖和酶惰性形式。
[0035]
荧光报告基因质粒系统：基于质粒的系统，其包含一种或多种报告基因，这些报告基因基于生物体(质粒的宿主)的状态发出不同颜色的荧光。
[0036]
萌发：指细菌孢子变成营养细胞的过程。
[0037]
革兰氏阳性：指在革兰氏染色过程中染为紫色的细菌。通常，与革兰氏阴性细菌相比，革兰氏阳性细菌细胞膜和细胞壁的结构和/或排列不同。特别地，处于细胞状态的革兰氏阳性生物体含有一层厚厚的肽聚糖，包围着一层细胞膜。
[0038]
代谢活性营养状态：产生芽孢的细菌的生命周期中的活性状态，在该状态中这些
产生芽孢的细菌通过二分裂进行生长和分裂。
[0039]
受体菌株：在本文中与“靶菌株”相同，并且是指将接受并保持本发明质粒上的遗传元件的细菌物种或亚种。
[0040]
报告基因：本文指的是例如编码荧光蛋白的报告基因。可以将一种或多种报告基因引入至质粒系统；因此，术语“单报告基因质粒系统”是指包含一种报告基因的质粒系统，“双报告基因质粒系统”是指包含两种报告基因的质粒系统等。
[0041]
营养细胞：是指具有代谢活性和/或主动生长/分裂的细菌细胞。营养细菌细胞不是孢子细胞。
[0042]
用于对菌株状态进行可视化的方法：该术语是指用于显示产生芽孢的细菌菌株的生命周期的状态的方法，其中该状态可以是，例如该细菌菌株的休眠芽孢状态、代谢活性营养状态和/或萌发状态。在一方面，该方法用于对菌株的萌发进行可视化。
具体实施方式
[0043]
根据本发明，诸位发明人已经开发了有利的质粒系统，该质粒系统适合用于对芽孢杆菌属菌株的状态，如芽孢杆菌属菌株的萌发进行可视化。本发明的质粒系统使芽孢杆菌属菌株发出荧光，这取决于这些菌株的细胞状态。在本发明的一方面，质粒系统用于对处于其休眠芽孢状态的芽孢杆菌属菌株进行可视化。在本发明的一方面，质粒系统用于对处于其代谢活性营养状态的芽孢杆菌属菌株进行可视化。在本发明的一方面，质粒系统用于对处于其休眠芽孢状态和其代谢活性营养状态的芽孢杆菌属菌株进行可视化。在本发明的一方面，质粒系统用于对芽孢杆菌属菌株从休眠芽孢状态至代谢活性营养状态的转变进行可视化。
[0044]
质粒系统可以在染色体内或染色体外使用。已经发现，当在染色体外使用时，质粒系统出人意料地稳定。本发明人已经确定了优于遗传修饰的传统染色体内方法的几个另外的优点。例如，质粒系统并非必须为受体菌株定制，并且如果受体生物体可以保持芽孢杆菌属复制起点并使用存在于芽孢杆菌属中的σ因子，则不一定要知晓基因组序列。与染色体内遗传修饰相比，可以更快改变菌株中的表型，因为转化后不需要整合步骤，并且因此不需要另外的选择和筛选步骤。本发明的质粒拷贝数目高于导致荧光基因表达的质粒拷贝数目，这些荧光基因有可能大于染色体上基因的单个拷贝。如果需要去除质粒，可以将质粒从菌株中清除。例如，去除抗生素选择并且重复继代培养许多代(实验室中的简单任务)，可以恢复野生型基因型和表型。
[0045]
在本发明的一方面，质粒系统被设计为在染色体外发挥功能。在另外的方面，质粒系统不是针对受体菌株所定制的。在又另外的方面，基因组序列未知，条件是受体生物体可以保持芽孢杆菌属复制起点，并且使用存在于芽孢杆菌属中的σ因子。本发明的质粒系统可以在转化后保持在大多芽孢杆菌属菌株中。可以使用质粒系统用于分析，例如胃肠或植物种子样品。在一方面，质粒系统用于胃肠样品，如来自动物的胃肠样品。在另一方面或另外的方面，质粒系统用于植物种子样品。
[0046]
质粒系统
[0047]
与本发明一起，提供了荧光报告基因质粒系统，该荧光报告基因质粒系统用于使芽孢杆菌属菌株发出荧光，其中该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态和/或在其代谢活性
营养状态下发出荧光。
[0048]
本发明质粒系统的控制水平取决于荧光标记基因的启动子结构上游。例如，本发明的质粒系统可以包含与孢子特异性基因融合的荧光蛋白基因，从而导致在休眠芽孢状态下产生荧光，和/或另一种荧光蛋白基因，该另一种荧光蛋白基因表达于在营养细胞生长期间具有强表达的启动子区域，从而导致在代谢活性营养状态下产生荧光。
[0049]
在本发明的一方面，将质粒转化至芽孢杆菌属细胞中后，荧光报告基因质粒系统使芽孢杆菌属菌株发出荧光，其中该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态和/或在其代谢活性营养状态下发出荧光。在一方面，芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时，该菌株发出一种荧光颜色的荧光，并且该菌株在代谢活性营养状态时，发出另一种荧光颜色的荧光。在本发明的一方面，芽孢杆菌属菌株发出两种不同荧光颜色的荧光，这两种颜色选自由以下组成的组：绿色、红色、黄色、青色、蓝色、远红色以及橙色。
[0050]
在本发明的一方面，质粒系统被设计为在染色体外发挥功能。
[0051]
质粒系统的骨架可以衍生自本领域技术人员已知的任何合适的骨架。
[0052]
本发明的质粒系统的骨架可以包含本领域技术人员已知的任何合适的组分，这些组分包括但不限于一种或多种载体(例如像质粒)、一个或多个复制起点(ori)、一个或多个转移起点(orit)、一种或多种抗生素抗性标记、一种或多种启动子区域、一种或多种报告基因、以及一个或多个多克隆位点。在本发明的一方面，质粒系统包含复制起点、使用红霉素抗性的选择性标记、转移起点以及在取决于宿主细胞内转录事件的特定启动子控制下的两个标记基因(gfp和dsred)。
[0053]
在本发明的一方面，质粒系统的骨架包含在芽孢杆菌属菌株中发挥功能的复制起点。在本发明的一方面，质粒系统的骨架包含转移起点。在本发明的一方面，质粒系统的骨架包含抗生素抗性盒。在本发明的另一方面或另外的方面，质粒系统衍生自包含复制起点和任选地抗生素抗性标记的骨架。在本发明的另外的方面，质粒系统衍生自包含复制起点和抗生素抗性标记的骨架。可以使用本领域技术人员已知的多个复制起点和/或抗生素抗性标记，以使得在克隆过程使质粒寄宿于多种生物体。在本发明的另外的方面，质粒的骨架衍生自pbm317(seq id no:1)或pbg2(seq id no:2)。
[0054]
在本发明的一方面，质粒系统包含选自由以下组成的组的一种或多种质粒：pe194、puc、pbad、及其任何组合。在本发明的另外的方面，质粒系统包含转移起点(orit)。在又另外的方面，orit衍生自pub110。
[0055]
质粒系统可以通过任何合适的手段转化，例如但不限于接合、天然感受态、电穿孔或化学感受态。在一方面，质粒系统通过接合或天然感受态进行转化。
[0056]
本发明的质粒系统包含编码荧光蛋白的一种或多种报告基因。在一方面，质粒系统包含两种或多种报告基因，其中这些报告基因各自编码荧光蛋白。在另外的方面，由一种或多种报告基因编码的一种或多种荧光蛋白选自由以下组成的组：绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)、dsredexpress2、mcherry、morange、mplum黄色荧光蛋白(eyfp)、青色荧光蛋白(ecfp)、以及sapphire。在另外的方面，由一种或多种报告基因编码的一种或多种荧光蛋白是绿色荧光蛋白(gfp)或红色荧光蛋白(rfp)，如dsredexpress2蛋白或dsred蛋白。在优选的方面，质粒系统包含第一报告基因和第二报告基因。在另外的优选的方面，质粒系统包含编码荧光蛋白的第一报告基因和编码与由该第
no:11)、pjdh29(seq id no:12)、以及pbg3(seq id no:13)。
[0060]
可以使用质粒系统用于使芽孢杆菌属菌株发出荧光。在本发明的一方面，芽孢杆菌属菌株是任何芽孢杆菌属物种菌株。在本发明的另一方面，芽孢杆菌属菌株选自由以下组成的组：巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、单纯芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌。在本发明的又另一方面，芽孢杆菌属菌株选自由以下组成的组：巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。
[0061]
可以通过使用针对最终芽孢杆菌属宿主所定制的同源性的区域，将质粒系统添加至能够整合到染色体中的质粒中，例如pmutin。
[0062]
对芽孢杆菌属菌株状态进行可视化的方法
[0063]
本发明还涵盖对芽孢杆菌属菌株在体外或体内的状态进行可视化的方法。在一方面，可以使用该方法以对芽孢杆菌属菌株的萌发进行可视化。在一方面，提供了用于对芽孢杆菌属菌株在动物、植物或植物种子中的状态进行可视化的方法。在另外的方面，提供了用于对芽孢杆菌属菌株在动物、植物或植物种子中的萌发进行可视化的方法。在又另外的方面，提供了用于对芽孢杆菌属菌株在动物中的状态进行可视化的方法。在仍另外的方面，提供了用于对芽孢杆菌属菌株在动物中的萌发进行可视化的方法。在另一方面，提供了用于对芽孢杆菌属菌株在植物或植物种子中的状态进行可视化的方法。在另外的方面，提供了用于对芽孢杆菌属菌株在植物或植物种子中的萌发进行可视化的方法。
[0064]
在本发明的一方面，对芽孢杆菌属菌株在动物、植物或植物种子中的状态(如萌发)进行可视化的方法包括以下步骤：
[0065]
a)将芽孢杆菌属菌株和包含单或双报告基因质粒系统的细胞组合，用于使芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时发出一种荧光颜色的荧光，和/或在代谢活性营养状态时发出另一种荧光颜色的荧光，
[0066]
b)用步骤(a)的芽孢杆菌属菌株处理动物或植物种子，
[0067]
c)从步骤(b)的经处理的动物或植物种子中收集样品，
[0068]
d)任选地用dna染料染色步骤(c)的样品，以及
[0069]
e)将步骤(c)或(d)的经染色的样品成像以对萌发进行可视化。
[0070]
在本发明的另一方面，对芽孢杆菌属菌株在动物中的状态(如萌发)进行可视化的方法包括以下步骤：
[0071]
a)将芽孢杆菌属菌株和包含单或双报告基因质粒系统的细胞组合，用于使芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时发出一种荧光颜色的荧光，和/或在代谢活性营养状态时发出另一种荧光颜色的荧光，
[0072]
b)将步骤(a)的芽孢杆菌属菌株喂食给动物，
[0073]
c)从动物的十二指肠、回肠和/或盲肠组织中收集样品，并且准备这些样品用于分析，
[0074]
d)任选地用dna染料染色步骤(c)的样品，以及
[0075]
e)将步骤(c)或(d)的经染色的样品成像以对萌发进行可视化。
[0076]
在本发明的又另一方面，对芽孢杆菌属菌株在植物或植物种子中的状态(如萌发)进行可视化的方法包括以下步骤：
[0077]
a)将芽孢杆菌属菌株和包含单或双报告基因质粒系统的细胞组合，用于使芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时发出一种荧光颜色的荧光，并且在代谢活性营养状态时发出另一种荧光颜色的荧光，
[0078]
b)用步骤(a)的芽孢杆菌属菌株处理植物种子，
[0079]
c)任选地种植步骤(b)的经处理的植物种子以使植物生长，
[0080]
d)通过洗涤已允许萌发的步骤(b)的经处理的植物种子，或步骤(c)的植物或其级分，收集样品用于分析，
[0081]
e)准备步骤(d)的这些样品用于分析，
[0082]
f)任选地用dna染料染色步骤(e)的样品，以及
[0083]
g)将步骤(e)或(f)的经染色的样品成像。
[0084]
在该方法的一方面，步骤(a)的细胞包含单报告基因质粒系统，用于使芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时或在代谢活性营养状态时发出一种荧光颜色的荧光。在该方法的另一方面，步骤(a)的细胞包含双报告基因质粒系统，用于使芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时发出一种荧光颜色的荧光，并且在代谢活性营养状态时发出另一种荧光颜色的荧光。
[0085]
在本发明的一方面，涵盖了对芽孢杆菌属菌株的状态(如，例如芽孢杆菌属孢子的萌发)进行可视化的方法，其中该方法包括使用质粒系统用于使芽孢杆菌属菌株发出荧光。在另外的方面，质粒系统是荧光报告基因质粒系统。在又另外的方面，芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态和/或在其代谢活性营养状态下发出荧光。
[0086]
在本发明的一方面，将质粒转化至芽孢杆菌属细胞中后，在该方法中使用的质粒系统使芽孢杆菌属菌株发出荧光，其中该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态和/或在其代谢活性营养状态下发出荧光。在一方面，芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时，该菌株发出一种荧光颜色的荧光，并且该菌株在代谢活性营养状态时，发出另一种荧光颜色的荧光。在本发明的一方面，芽孢杆菌属菌株发出两种不同荧光颜色的荧光，这两种颜色选自由以下组成的组：绿色、红色、黄色、青色、蓝色、远红外以及橙色。
[0087]
在本发明的一方面，在该方法中使用的质粒系统被设计为在染色体外发挥功能。
[0088]
在该方法中使用的质粒系统的骨架可以衍生自本领域技术人员已知的任何合适的骨架。
[0089]
在该方法中使用的质粒系统的骨架可以包含本领域技术人员已知的任何合适的组分，这些组分包括但不限于一种或多种载体(例如像质粒)、一个或多个复制起点(ori)、一个或多个转移起点(orit)、一种或多种抗生素抗性标记、一种或多种启动子区域、一种或多种报告基因、以及一个或多个多克隆位点。在本发明的一方面，在该方法中使用的质粒系统包含复制起点、使用红霉素抗性的选择性标记、转移起点以及在取决于宿主细胞内转录事件的特定启动子控制下的两个标记基因(gfp和dsred)。
[0090]
在本发明的一方面，在该方法中使用的质粒系统的骨架包含在芽孢杆菌属菌株中发挥功能的复制起点。在本发明的一方面，在该方法中使用的质粒系统的骨架包含转移起点。在本发明的一方面，在该方法中使用的质粒系统的骨架包含抗生素抗性盒。在本发明的另一方面或另外的方面，质粒系统衍生自包含复制起点和任选地抗生素抗性标记的骨架。在本发明的另外的方面，质粒系统衍生自包含复制起点和抗生素抗性标记的骨架。可以使用本领域技术人员已知的多个复制起点和/或抗生素抗性标记，以使得在克隆过程使质粒
寄宿于多种生物体。在本发明的另外的方面，质粒的骨架衍生自pbm317(seq id no:1)或pbg2(seq id no:2)。
[0091]
在本发明的一方面，在该方法中使用的质粒系统包含选自由以下组成的组的一种或多种质粒：pe194、puc、pbad、及其任何组合。在本发明的另外的方面，在该方法中使用的质粒系统包含转移起点(orit)。在又另外的方面，orit衍生自pub110。
[0092]
在该方法中使用的质粒系统可以通过任何合适的手段转化，例如但不限于接合、天然感受态、电穿孔或化学感受态。在一方面，在该方法中使用的质粒系统通过接合或天然感受态进行转化。
[0093]
在该方法中使用的质粒系统包含编码荧光蛋白的一种或多种报告基因。在一方面，在该方法中使用的质粒系统包含两种或多种报告基因，其中这些报告基因各自编码荧光蛋白。在另外的方面，由一种或多种报告基因编码的一种或多种荧光蛋白选自由以下组成的组：绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)、dsredexpress2、mcherry、morange、mplum黄色荧光蛋白(eyfp)、青色荧光蛋白(ecfp)、以及sapphire。在另外的方面，由一种或多种报告基因编码的一种或多种荧光蛋白是绿色荧光蛋白(gfp)或红色荧光蛋白(rfp)，如dsredexpress2蛋白或dsred蛋白。在优选的方面，在该方法中使用的质粒系统包含第一报告基因和第二报告基因。在另外的优选的方面，在该方法中使用的质粒系统包含编码荧光蛋白的第一报告基因和编码与由该第一报告基因编码的荧光蛋白不同的荧光蛋白的第二报告基因。在另外的方面，第一报告基因是编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因，或编码红色荧光蛋白(rfp)的基因，如编码dsredexpress2蛋白或dsred蛋白的基因。在可替代的或又另外的方面，第二报告基因是编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因，或编码红色荧光蛋白(rfp)的基因，如编码dsredexpress2蛋白或dsred蛋白的基因。在优选的方面，第一报告基因是编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因，并且第二报告基因是编码红色荧光蛋白(rfp)的基因，如编码dsredexpress2蛋白或dsred蛋白的基因。在另一个优选的方面，第一报告基因是编码红色荧光蛋白(rfp)的基因，如编码dsredexpress2蛋白或dsred蛋白的基因，并且第二报告基因是编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因。在又另外的方面，报告基因(如第一报告基因或第二报告基因)在休眠芽孢中表达。
[0094]
在本发明的优选的方面，将在该方法中使用的报告基因(如第一报告基因)翻译融合至编码小的酸溶性蛋白(sasp)的基因，例如sspa、sspb、sspc、sspd、sspe、sspf、sspg、ssph、sspi、sspj、sspk、sspl、sspm、sspn、sspo、或sspp，如，例如sspa、sspb或sspe。在另外的方面，报告基因(如第一报告基因)包括启动子区域和编码小的酸溶性蛋白(sasp)的区域。在该方法中使用的质粒系统的启动子区域可以包含本领域技术人员已知的任何合适的启动子。在本发明的一方面，启动子区域包含选自由以下组成的组的一种或多种启动子：amylp、amyqp以及cryp。在一方面，启动子区域是sspb。报告基因可以是任何合适的基因。在一方面，报告基因(如第一报告基因)选自由以下组成的组：sspa、sspb、sspc、sspd、sspe、sspf、sspg、ssph、sspi、sspj、sspk、sspl、sspm、sspn、sspo、以及sspp。在另外的方面，报告基因(如第一报告基因)选自由以下组成的组：sspa、sspb、以及sspe。在又另外的方面，报告基因(如第一报告基因)是sspb。在仍另外的方面，编码1至24个氨基酸，如编码6至20个氨基酸、8至20个氨基酸、8至16个氨基酸、9至15个氨基酸、10至14个氨基酸、或11至13个氨基酸的接头位于报告基因(如第一报告基因)和编码sasp的基因(例如，sspa、sspb、sspc、sspd、
sspe、sspf、sspg、ssph、sspi、sspj、sspk、sspl、sspm、sspn、sspo、或sspp，如，例如sspa、sspb或sspe)之间。在又另外的方面，编码约12个氨基酸的接头位于报告基因(如第一报告基因)和编码sasp的基因(例如，sspa、sspb、sspc、sspd、sspe、sspf、sspg、ssph、sspi、sspj、sspk、sspl、sspm、sspn、sspo、或sspp，如，例如sspa、sspb或sspe)之间。在可替代的方面，3至72个碱基对，如18至60个碱基对、24至60个碱基对、24至48个碱基对、27至45个碱基对、30至42个碱基对、或33至39个碱基对的接头位于报告基因(如第一报告基因)和编码sasp的基因(例如，sspa、sspb、sspc、sspd、sspe、sspf、sspg、ssph、sspi、sspj、sspk、sspl、sspm、sspn、sspo、或sspp，如，例如，sspa、sspb或sspe)之间。在另外的可替代的方面，约36个碱基对的接头位于报告基因(如第一报告基因)和编码sasp的基因(例如，sspa、sspb、sspc、sspd、sspe、sspf、sspg、ssph、sspi、sspj、sspk、sspl、sspm、sspn、sspo、或sspp，如，例如sspa、sspb或sspe)之间。
[0095]
在本发明的一方面，在该方法中使用的质粒系统可以通过接合或天然感受态、电穿孔或化学感受态进行转化。在本发明的另外的方面，质粒系统可以通过接合或天然感受态进行转化。在本发明的一方面，在该方法中使用的质粒系统的启动子区域包含在营养生长期间表达的一种或多种启动子。
[0096]
在本发明的一方面，将在该方法中使用的质粒系统翻译为sasp蛋白和荧光蛋白融合物。
[0097]
在本发明的一方面，在该方法中使用的质粒系统选自由以下组成的组：pjdh11(seq id no:3)、pjdh14(seq id no:4)、pjdh20(seq id no:5)、pjdh21(seq id no:6)、pjdh22(seq id no:7)、pjdh23(seq id no:8)、pjdh24(seq id no:9)、pjdh25(seq id no:10)、pjdh26(seq id no:11)、pjdh29(seq id no:12)、以及pbg3(seq id no:13)。
[0098]
可以使用对芽孢杆菌属菌株在体外或体内的状态(如萌发)进行可视化的方法以对任何芽孢杆菌属物种菌株的萌发进行可视化。在本发明的一方面，芽孢杆菌属菌株选自由以下组成的组：巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、单纯芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌。在本发明的另一方面，芽孢杆菌属菌株选自由以下组成的组：巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。
[0099]
可以通过使用针对最终芽孢杆菌属宿主所定制的同源性的区域，将在该方法中使用的质粒系统添加至能够整合到染色体中的质粒中，例如pmutin。
[0100]
优选的实施例
[0101]
以下是本发明的优选的实施例的列表：
[0102]
1.一种荧光报告基因质粒系统，该荧光报告基因质粒系统用于使芽孢杆菌属菌株发出荧光，其中该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态和/或在其代谢活性营养状态下发出荧光，并且其中将该质粒系统设计为在染色体外发挥功能。
[0103]
2.如实施例1所述的质粒系统，将该质粒转化至芽孢杆菌属细胞中后，该质粒系统使芽孢杆菌属菌株发出荧光，其中该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态和/或在其代谢活性营养状态下发出荧光。
[0104]
3.如实施例1至2中任一项所述的质粒系统，其中该芽孢杆菌属菌株在其休眠芽孢状态时发出第一荧光颜色的荧光，并且在其代谢活性营养状态时发出第二荧光颜色的荧
光，并且其中该第一荧光颜色不同于该第二荧光颜色。
[0105]
4.如实施例1至3中任一项所述的质粒系统，其中该一种或多种荧光颜色选自由以下组成的组：绿色、红色、黄色、青色、蓝色、远红外以及橙色。
[0106]
5.如实施例1至4中任一项所述的质粒系统，其中该骨架包含在芽孢杆菌属菌株中发挥功能的复制起点。
[0107]
6.如实施例5中所述的质粒系统，其中该骨架进一步包含抗生素抗性标记。
[0108]
7.如实施例1至6中任一项所述的质粒系统，其中该骨架包含转移起点。
[0109]
8.如实施例1至7中任一项所述的质粒系统，其中该骨架包含抗生素抗性盒。
[0110]
9.如实施例1至8中任一项所述的质粒系统，该质粒系统包含编码荧光蛋白的一种或多种报告基因。
[0111]
10.如实施例9所述的质粒系统，其中由该报告基因编码的荧光蛋白选自由以下组成的组：绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)、dsredexpress2、mcherry、morange、mplum黄色荧光蛋白(eyfp)、青色荧光蛋白(ecfp)、以及sapphire。
[0112]
11.如实施例1至10中任一项所述的质粒系统，其中该报告基因是编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因，或编码红色荧光蛋白(rfp)的基因，如编码dsredexpress2蛋白或dsred蛋白的基因。
[0113]
12.如实施例1至11中任一项所述的质粒系统，其中该报告基因在休眠芽孢中表达。
[0114]
13.如实施例1至12中任一项所述的质粒系统，其中该报告基因翻译融合至编码小的酸溶性蛋白(sasp)的基因。
[0115]
14.如实施例1至13中任一项所述的质粒系统，其中该报告基因包括启动子区域和编码小的酸溶性蛋白(sasp)的区域。
[0116]
15.如实施例14所述的质粒系统，其中该启动子区域是sspb。
[0117]
16.如实施例1至15中任一项所述的质粒系统，其中该报告基因选自由以下组成的组：sspa、sspb、以及sspe。
[0118]
17.如实施例1至16中任一项所述的质粒系统，其中该报告基因是具有seq id no:14的sspb。
[0119]
18.如实施例1至17中任一项所述的质粒系统，其中编码1至24个氨基酸，如编码6至20个氨基酸、8至20个氨基酸、8至16个氨基酸、9至15个氨基酸、10至14个氨基酸、或11至13个氨基酸的接头位于第一报告基因和编码sasp的基因之间。
[0120]
19.如实施例1至18中任一项所述的质粒系统，其中编码约12个氨基酸的接头位于第一报告基因和编码sasp的基因之间。
[0121]
20.如实施例1至19中任一项所述的质粒系统，其中3至72个碱基对，如18至60个碱基对、24至60个碱基对、24至48个碱基对、27至45个碱基对、30至42个碱基对、或33至39个碱基对的接头位于第一报告基因和编码sasp的基因之间。
[0122]
21.如实施例1至20中任一项所述的质粒系统，其中约36个碱基对的接头位于第一报告基因和编码sasp的基因之间。
[0123]
22.如实施例18至21中任一项所述的质粒系统，将该质粒系统翻译为sasp蛋白和荧光蛋白融合物。
[0124]
23.如实施例1至22中任一项所述的质粒系统，其中该报告基因是第一报告基因，并且该质粒系统进一步包含第二报告基因，其中该第二报告基因编码荧光蛋白，该荧光蛋白不同于由该第一报告基因编码的荧光蛋白。
[0125]
24.如实施例23所述的质粒系统，其中该第一报告基因编码荧光蛋白，将该荧光蛋白设计为在其休眠芽孢状态下发出荧光，并且该第二报告基因编码荧光蛋白，将该荧光蛋白设计为在其代谢活性营养状态下发出荧光。
[0126]
25.如实施例23或24所述的质粒系统，其中由第二报告基因编码的荧光蛋白选自由以下组成的组：绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)、dsredexpress2、mcherry、morange、mplum黄色荧光蛋白(eyfp)、青色荧光蛋白(ecfp)、以及sapphire。
[0127]
26.如实施例1至25中任一项所述的质粒系统，其中该第二报告基因是编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因，或编码红色荧光蛋白(rfp)的基因，如编码dsredexpress2蛋白或dsred蛋白的基因。
[0128]
27.如实施例26所述的质粒系统，其中该第一报告基因是编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因，并且第二报告基因是编码红色荧光蛋白(rfp)的基因，如编码dsredexpress2蛋白或dsred蛋白的基因。
[0129]
28.如实施例26所述的质粒系统，其中该第一报告基因是编码红色荧光蛋白(rfp)的基因，如编码dsredexpress2蛋白或dsred蛋白的基因，并且第二报告基因是编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因。
[0130]
29.如实施例1至28中任一项所述的质粒系统，其中该质粒的骨架衍生自pbm317(seq id no:1)或pbg2(seq id no:2)。
[0131]
30.如实施例1至29中任一项所述的质粒系统，该质粒系统包含载体pe194、puc或pbad，以及来自pub110的转移起点(orit)。
[0132]
31.如实施例1至30中任一项所述的质粒系统，该质粒系统可以通过接合、天然感受态、电穿孔或化学感受态进行转化。
[0133]
32.如实施例1至31中任一项所述的质粒系统，该质粒系统可以通过接合或天然感受态进行转化。
[0134]
33.如实施例1至32中任一项所述的质粒系统，其中该启动子区域包含在营养生长期间表达的一种或多种启动子。
[0135]
34.如实施例1至33中任一项所述的质粒系统，其中该启动子区域包含选自由以下组成的组的一种或多种启动子：amylp、amyqp以及cryp。
[0136]
35.如实施例1至34中任一项所述的质粒系统，其中芽孢杆菌属菌株选自由以下组成的组：巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、单纯芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌。
[0137]
36.如实施例1至35中任一项所述的质粒系统，其中该质粒系统不是针对受体菌株所定制的。
[0138]
37.如实施例1至36中任一项所述的质粒系统，其中基因组序列未知，条件是受体生物体可以保持芽孢杆菌属复制起点，并且使用存在于芽孢杆菌属中的σ因子。
[0139]
38.如实施例1至37中任一项所述的质粒系统，该质粒系统可以在转化后保持在大
多数芽孢杆菌属菌株中。
[0140]
39.如实施例1至38中任一项所述的质粒系统用于分析胃肠样品或植物种子样品的用途。
[0141]
40.如实施例1至38中任一项所述的质粒系统用于分析胃肠样品，如动物的胃肠样品的用途。
[0142]
41.如实施例1至38中任一项所述的质粒系统用于分析植物样品或植物种子样品的用途。
[0143]
42.一种细胞，该细胞包含如实施例1至38中任一项所述的质粒系统。
[0144]
43.如实施例37所述的细胞，其中该质粒系统被稳定地整合至该细胞的基因组中。
[0145]
44.一种对芽孢杆菌属菌株在动物、植物或植物种子中的状态进行可视化的方法，该方法包括：
[0146]
a)将芽孢杆菌属菌株和包含单或双报告基因质粒系统的细胞组合，用于使芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时发出一种荧光颜色的荧光，和/或在代谢活性营养状态时发出另一种荧光颜色的荧光，
[0147]
b)用步骤(a)的芽孢杆菌属菌株处理动物或植物种子，
[0148]
c)从步骤(b)的经处理的动物或植物种子中收集样品，
[0149]
d)任选地用dna染料染色步骤(c)的样品，以及
[0150]
e)将步骤(c)或(d)的样品成像以对芽孢杆菌属菌株的状态进行可视化。
[0151]
45.一种对芽孢杆菌属菌株在动物中的状态进行可视化的方法，该方法包括以下步骤：
[0152]
a)将芽孢杆菌属菌株和包含单或双报告基因质粒系统的细胞组合，用于使芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时发出一种荧光颜色的荧光，和/或在代谢活性营养状态时发出另一种荧光颜色的荧光。
[0153]
b)将步骤(a)的芽孢杆菌属菌株喂食给动物，
[0154]
c)从动物的十二指肠、回肠和/或盲肠组织中收集样品，并且准备这些样品用于分析，
[0155]
d)任选地用dna染料染色步骤(c)的样品，以及
[0156]
e)将步骤(c)或(d)的样品成像以对芽孢杆菌属菌株的状态进行可视化。
[0157]
46.一种对芽孢杆菌属菌株在植物或植物种子中的状态进行可视化的方法，该方法包括以下步骤：
[0158]
a)将芽孢杆菌属菌株和包含单或双报告基因质粒系统的细胞组合，用于使芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时发出一种荧光颜色的荧光，并且在代谢活性营养状态时发出另一种荧光颜色的荧光，
[0159]
b)用步骤(a)的芽孢杆菌属菌株处理植物种子，
[0160]
c)任选地种植步骤(b)的经处理的植物种子以使植物生长，
[0161]
d)通过洗涤已允许萌发的步骤(b)的经处理的植物种子，或步骤(c)的植物或其级分，收集样品用于分析，
[0162]
e)准备步骤(d)的这些样品用于分析，
[0163]
f)任选地用dna染料染色步骤(e)的样品，以及
[0164]
g)将步骤(e)或(f)的样品成像以对芽孢杆菌属菌株的状态进行可视化。
[0165]
47.如实施例44至46中任一项所述的方法，其中步骤(a)的细胞包含单报告基因质粒系统，该单报告基因质粒系统用于使该芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时或在代谢活性营养状态时发出一种荧光颜色的荧光。
[0166]
48.如实施例44至47中任一项所述的方法，其中步骤(a)的细胞包含双报告基因质粒系统，该双报告基因质粒系统用于使芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时发出一种荧光颜色的荧光，并且在代谢活性营养状态时发出另一种荧光颜色的荧光。
[0167]
49.一种对芽孢杆菌属菌株在体外或体内的状态进行可视化的方法，其中使用如实施例1至38中任一项所述的质粒系统使这些芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态和/或代谢活性营养状态下发出荧光，其中这些芽孢杆菌属菌株的荧光表明该菌株的状态。
[0168]
50.如实施例49所述的方法，其中该芽孢杆菌属菌株在休眠芽孢状态时发出一种荧光颜色的荧光，并且在代谢活性营养状态时发出另一种荧光颜色的荧光。
[0169]
51.如实施例38至50中任一项所述的方法，使用该方法以对芽孢杆菌属菌株的萌发进行可视化。
[0170]
实例
[0171]
本发明的质粒系统已经在本文中用于转化六种枯草芽孢杆菌菌株、四种解淀粉芽孢杆菌菌株、两种巨大芽孢杆菌菌株、两种短小芽孢杆菌菌株、一种苏云金芽孢杆菌菌株、以及甚至一种如下所例示的我们不知道其物种命名的芽孢杆菌属菌株。
[0172]
实例1-质粒设计和功能
[0173]
一种或多种质粒的骨架来自pbm317(seq id no:1)。该骨架由pe194和puc加上来自pub110的orit构成。因此，该载体可以在大肠杆菌以及大多数芽孢杆菌属中保持，而不需要整合至其染色体中。此外，它可以通过多种手段转化，这些手段包括接合、天然感受态、电穿孔和化学感受态。已经证实前两种方法在我们的工作中最有效。对于这种包括绿色和/或红色荧光系统的质粒，我们的版本是pjdh11(seq id no:3)、pjdh14(seq id no:4)、pjdh20(seq id no:5)、pjdh21(seq id no:6)、pjdh22(seq id no:7)、pjdh23(seq id no:8)、pjdh24(seq id no:9)、pjdh25(seq id no:10)、pjdh26(seq id no:11)、pjdh29(seq id no:12)、以及pbg3(seq id no:13)。
[0174]
在大多数这些构建体中，gfp基因用作孢子存在的报告基因。将基因翻译融合至编码小的酸溶性蛋白(sasp)的基因。特别地，该基因是来自解淀粉芽孢杆菌的sspb(seq id no:14)。sasp和gfp基因之间有一个小区域，该区域编码短的氨基酸接头，该接头应在这些蛋白质之间形成一个小环。接头确保蛋白质保持相互连接，但这些蛋白质的折叠在很大程度上保持独立，不受融合的影响。将最后一项视为关键的，因为我们需要这种融合物的两个结构域保持功能性。sasp以高亲和力与dna结合，并且sasp对于休眠孢子是独特的。因此，我们的sasp-gfp融合物将孢子化的dna包裹在绿色荧光中，并且我们的工作证明了只要这些孢子稳定，荧光就会持续存在。萌发被触发后不久，称为萌发蛋白酶(gpr)的蛋白酶会快速降解sasp。gpr还将降解融合至sspb的gfp。这使得在孢子萌发期间或萌发后不久，从绿色荧光孢子平稳转变为红色荧光细胞。
[0175]
在大多数这些质粒构建体中，存在第二报告基因序列，该序列编码dsredexpress2(dsred)蛋白。在大多数情况下，该蛋白受多部分启动子控制。整个启动子导致营养状态期
间任何紧邻下游的基因的高表达。完整的启动子区域由以下中的一个或多个组成：amylp、amyqp以及cryp。此外，一些构建体使用来自解淀粉芽孢杆菌(o7skr)的rplkp。使用这些启动子的多种组合以向上微调或向下微调dsred的表达，这取决于该质粒的最终受体菌株的需要。
[0176]
最终，我们使用上述质粒骨架和两个遗传回路以产生多种质粒，我们称之为“报告基因质粒”，因为它们倾向于在其宿主上赋予荧光；这种特性使转化的细胞报告其细胞状态和代谢状态。孢子特异性报告基因系统在孢子形成期间被激活，并且导致休眠和稳定的孢子均匀地发出绿色荧光。绿色荧光由于其翻译融合的性质，在孢子萌发期间被快速降解，并且随着生物体变成营养状态而显著降低。在营养状态期间，这些驱动红色荧光的启动子变得非常活跃。此外，我们可以确定生物体的状态为孢子状态或营养状态，并且当后者为真时，则我们可以实现对它们的生长水平和蛋白质合成的相对了解。这些质粒的一个主要优点是它们在染色体外发挥作用，即它们不需要整合到宿主染色体中发挥功能。此外，它们的复制起点允许它们在大多数芽孢杆菌属物种中稳定保持。因此，一个质粒可以在短时间框架内快速转化并且在新菌株中进行评估。
[0177]
实例2-双报告基因菌株操作的体外检查
[0178]
为了确保质粒按设计发挥功能，使用体外分析来观察携带pjdh20的枯草芽孢杆菌菌株，如图1所示。这种新的报告基因菌株是从保藏为dsm 29870并描述于wo 2016/118864的枯草芽孢杆菌菌株(是用于家禽的商业益生菌)产生的。我们使用荧光显微镜检查和流式细胞术来跟踪孢子群体，因为它从具有绿色荧光的休眠孢子(gfp)转变为具有红色荧光的营养生长细胞(dsred)。本发明可以通过能够检测绿色和红色波长的荧光的任何仪器来测量。
[0179]
保藏为dsm 29870(wt)的野生型枯草芽孢杆菌菌株和保藏为dsm 29870(fluor)的荧光枯草芽孢杆菌菌株(后者中具有双报告基因质粒pjdh20)的经纯化的孢子用于此检查。将孢子加热引发萌发，然后等分至透明96孔板(康宁公司(costar)3595)的孔中，该板还含有具有5ug/ml红霉素和25ug/ml林可霉素的miller lb培养基(飞世尔公司(fisher)bp1426)。将每种菌株等分到总共12个孔中，以允许在限定的时间点进行破坏性测试，并且进行三次重复。这些时间点为培养基和孢子组合后0、5、18和24小时。在孢子和培养基组合后，立即将板在35℃下孵育，并且在实验期间持续搅拌。检查中还包括不含孢子的对照。孵育0、5、18和24小时后从96孔板中取出样品，并且使用荧光显微镜检查和流式细胞术(bd accuri c6)进行测定。
[0180]
为了观察gfp和dsred是否均在fluor菌株中表达，我们使用了荧光显微镜检查。显微镜检查清楚地显示出，wt菌株和fluor菌株在检查开始时含有相亮(phase-bright)的休眠孢子，并且在孵育期间萌发成为营养细胞(图2和图3左列)。此外，fluor菌株的孢子和细胞为具有荧光的(图2)。这些孢子明显为绿色(图2中间列)，而这些细胞为红色(图2右列)。通常使用其他滤光片组检测一种颜色的荧光，并且这里也是如此，但在孵育24小时后，从孢子中观察到最强烈的绿色，从细胞中观察到最强烈的红色。在中间时间点，长大成熟的孢子和年轻细胞展示出不同水平的绿色和红色荧光两者(数据未显示)。尽管wt孢子和细胞明显地存在、萌发并生长，但他们从未展示发出任何荧光(图3)。不含孢子的对照不含有孢子或细胞，并且未产生荧光(数据未显示)。
[0181]
尽管在美学上令人愉悦，但单独使用显微镜检查很难准确地确定孢子或细胞群体的荧光强度。因此，我们使用流式细胞术以定量在上述相同的96孔板检查中发出绿色或红色荧光的每个样品中孢子相关和细胞相关事件的数量。不含孢子的空白样品对于确定背景荧光的水平至关重要，该背景荧光是由于培养基或测定中的其他颗粒，而这些微粒不是保藏为dsm 29870的枯草芽孢杆菌菌株。随着孵育进行，wt孢子和后来发育的细胞并没有产生比空白样品显著更多数量的荧光绿色(图4)或红色(图5)事件。这些fluor孢子确实明显地产生了绿色和红色的荧光事件(图4和图5)。此外，荧光事件的百分比随着孵育的孢子和产生的营养细胞而变化。在0h孵育而孢子仍处于休眠状态时，绿色荧光在fluor菌株中为最高，并且随着孵育继续以及孢子萌发成营养细胞，绿色荧光稳定下降(图4)。绿色荧光从未降低至背景水平，这表明休眠孢子在24h后仍然存在；这与显微镜检查结果一致，显微镜检查结果清楚地显示出24h样品中的休眠孢子(图2)。0h时的红色荧光并未显著高于背景，但稳定增加在孵育5h时超过背景，并且在孵育18和24h后继续增加(图5)。流式细胞术期间检测到的红色荧光与显微镜检查一致，显微镜检查示出在0h时无红色荧光细胞，并且在稍后的时间点出现许多红细胞，24小时后最多(图3)。
[0182]
在这项体外实验中，清楚地表明pjdh20对保藏为dsm 29870的枯草芽孢杆菌菌株所赋予的新的荧光特性。由于sasp基因与gfp基因的翻译融合，孢子发出绿色荧光。正如预期的那样，随着孢子群体萌发，绿色荧光减弱，并且sasp蛋白通过孢子正常生长过程降解。也正如预期的那样，随着时间的推移，所得的营养细胞从由组成型营养细胞启动子驱动的dsred基因产生红色荧光。该质粒从未需要整合到宿主菌株的染色体上。最终，保藏为dsm 29870的枯草芽孢杆菌菌株的荧光菌株通过使用双报告基因系统作为孢子休眠、萌发和营养生长的体外指标。
[0183]
实例3-从喂食双报告基因菌株的鸡中收获的胃肠样品的检查
[0184]
将实例1的质粒转化至枯草芽孢杆菌中，从而使其工程化以在孢子生命阶段期间表达绿色荧光蛋白(gfp)，并且在营养生命阶段期间使用红色荧光蛋白(rfp)以对向鸡喂食的孢子转变为在胃肠样品中的营养物进行可视化。
[0185]
向鸡喂食用枯草芽孢杆菌处理的饲料样品，随后将这些鸡处死并且收获十二指肠、回肠以及盲肠组织。将每个组织的内容物收集在单独的试管中并冷冻。将这些组织固定在10％缓冲的福尔马林中。接收样品后，通过解冻并将这些内容物样品重悬在含有0.01％吐温20和0.25％triton-x 100的磷酸盐缓冲盐水中，对gi内容物样品进行处理用于可视化。然后通过低速离心分离主要固体，随后将上清液样品在缓冲的福尔马林中固定1小时。固定后，用dna染料sytoxgreen和dapi对样品进行染色，随后进行最后的25μm过滤，然后用incell2200高含量成像系统进行成像。在不同的最终稀释度下，针对每个样品收集三张彩色dapi/fitc/cy3图像。从fitc图像收集sytoxgreen dna染色数据，从dapi通道收集dapi dna染色，从cy3图像收集rfp数据。作为对照，使用纯的表达rfp的枯草芽孢杆菌菌株(图6)。
[0186]
在从所有收集的图像中检测到单个对象后，使用dna作为对象标识符(x轴)和y轴上所测量的rfp强度绘制了整个数据集(图7)。用于此比较的所有数据均来自样品稀释物。观察到一簇rfp明亮对象，并且将这组对象数据分离出来用于进一步分析(图8)。在所有含有纯的表达rfp的菌株样品的孔中，检测到大量cy3明亮对象。此外，我们还能够在回肠样品中检测到rfp明亮对象，这些回肠样品仅来自喂食表达rfp的芽孢杆菌属物种菌株的鸟类，
而不是来自喂食不同饮食的对照鸟类(图9)。
[0187]
结论
[0188]
胃肠(gi)内容物样品的分析表明鸟类的回肠中存在表达rfp的枯草芽孢杆菌细胞。
[0189]
实例4-用报告基因菌株处理的萌发的玉米种子的检查
[0190]
用实例1中所述的报告基因质粒转化以下四种菌株：解淀粉芽孢杆菌(o44eay)、巨大芽孢杆菌(o83an1)、巨大芽孢杆菌(o8337c)、以及苏云金芽孢杆菌(o84yvj)。这些生物体的荧光性质揭示了每种菌株在萌发的玉米种子的根上具有不同的定殖行为。这些结果表明在使用荧光显微镜检查的情况下可以使用报告基因质粒来检测受体生物体的存在。此外，报告基因系统揭示了生物体在环境中的相对量、生物体作为细胞或孢子的状态以及生物体在被测环境中的位置。
[0191]
用o44eay、o83an1、o8337c或o84yvj的休眠孢子的液体悬浮液来处理玉米种子(维京公司(viking))。此外，也使用这些菌株的非荧光版本进行处理，用作对照。单个的处理由50个种子组成，这些种子与100μl浓度为1e8 cfu/ml的孢子混合，估计的施用率为5e5 cfu/ml。处理后，将这些种子放在育苗纸(锚固纸业有限公司(anchor paper co.))上萌发，浸泡在水中，并且在22℃下、在黑暗中孵育4-5天。在孵育过程中，这些种子萌发并且产生胚根和根系的初始物。孵育后，将胚根分为三部分：顶部部分是最靠近冠部的胚根的三分之一，中部是胚根的中心的三分之一，底部是包括尖端的胚根的三分之一。使用手术刀，将每个胚根的顶部、中部和底部制成薄的切片，适合用于荧光显微镜检查。对于每种处理，观察到至少10个种子。
[0192]
在种子萌发后，在玉米根部的一些区域观察到每种菌株(图10)。生物体的荧光性质对于在根材料的切片上定位这些生物体必不可少。使用绿色滤光片，植物组织的细胞壁清晰可见，并且红色滤光片表明存在具有强红色荧光特性的营养细胞。未接受生物体处理的对照种子未产生具有任何可检测红色荧光的根部分(数据未显示)。
[0193]
这些结果表明，在种子萌发过程中，这些孢子可以在种子和/或根上萌发，在某些情况下，这些孢子能够在离应用它们的位置明显较远的区域定殖，并且一些菌株比其他菌株更适合萌发并且可能在根上生长。因为用休眠孢子处理后会出现红细胞，因此在种子上萌发得到支持(图10)。因为即使o83an1和o8337c作为休眠孢子直接应用于种子，它们也能在靠近根尖的部分清楚地观察到，因此沿着整个根部定殖得到支持(图10左和图10中)。菌株特异性性能得到支持，因为我们在根部切片上始终观察到o8337c比o83an1更多的荧光营养细胞，很少观察到o44eay的细胞，观察到o84yvj的许多细胞，但仅在根的最顶端区域。(图10)。同样，即使在种子处理期间所有菌株的孢子剂量相同，也出现了这些差异。值得注意的是，对于o44eay，我们从未在根的中间和底部部分观察到细胞。这些结果表明，o44eay不像o83an1、o8337c或o84yvj那样作为种子接种剂的候选者，因为它在这种环境下难以萌发或保持活力。
[0194]
荧光报告基因系统可以插入到四种不同的芽孢杆菌属菌株中，而不需要对质粒进行定制修饰，然后产生可以在萌发之前施加到种子上的孢子，这清楚地指示孢子是否萌发、随后这些孢子是否存活、这些孢子的位置以及这些孢子在新形成的玉米根上的相对丰度。