一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌培养基的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌培养基。


背景技术：

2.烟酰胺单核苷酸(nmn)作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad ，也称辅酶i)的前体物质，在抗衰老的应用中表现出非常好的前景。目前，烟酰胺单核苷酸多使用微生物发酵法和体外酶法转化来进行生产。体外酶法转化需要收集纯化所需的酶制剂，且需要使用酶转化反应的各种底物，底物成本较高；微生物发酵法只需使用烟酰胺作为反应底物，成本低，但目前所报道的大肠杆菌发酵法和和酵母发酵法获得的产品得率较低，只有不到16mg/l发酵液，达不到商业化生产要求。枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，不产内毒素和致热致敏蛋白质，是一种食品级的安全微生物，已被广泛应用于酶制剂等生物制品的生产。
3.通过酶基因克隆及改造、代谢通路优化等手段改造枯草芽孢杆菌作为细胞工厂，得到能够高效转化生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽孢杆菌菌株。研究中发现，培养基的组分及培养条件对烟酰胺单核苷酸的产量影响非常大.传统的高密度表达虽然能够提高发酵液中的菌体含量，但烟酰胺单核苷酸的表达量不一定理想。本发明通过优化发酵培养基的组分和培养条件，提高重组枯草芽孢杆菌发酵生产烟酰胺单核苷酸的产量。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌培养基，解决了上述背景技术中所提出的问题。
6.(二)技术方案
7.本发明提供如下技术方案：一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌培养基，其包括如下组分：
8.碳源20-50g/l，酵母浸膏5-20g/l，钠盐0.2-2g/l，钾盐1-10g/l，镁盐2-20g/l，磷酸盐5-20g/l，铵盐1-5g/l。
9.进一步的，所述碳源包括葡萄糖，甘油，山梨糖醇中的一种或者至少两种的组合，优选为甘油；
10.所述的钠盐优选为柠檬酸钠；
11.所述的钾盐和磷酸盐优选为磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾；
12.所述的镁盐优选为硫酸镁；
13.所述的铵盐优选为硫酸铵。
14.进一步的，所述其由以下组分组成：
15.甘油30-40g/l，酵母浸膏15-20g/l，磷酸氢二钾6-8g/l，磷酸二氢钾1-3g/l，柠檬
酸钠1-2g/l，硫酸镁5-10g/l，硫酸铵1-3g/l。
16.进一步的，所述播种前再次翻耕松土，稻田应在不影响水稻生长的情况下提前排水，作物收割后应及时翻耕疏松土壤。
17.进一步的，所述工艺步骤如下：
18.s1:一级种的制备：从含新霉素20ug/ml的lb平板上挑选含烟酰胺磷酸核糖转移酶表达元件的重组枯草芽孢杆菌株单菌落，接入4ml lb液体培养基中，于37℃、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种；
19.s2；二级种的制备：将一级种接种于800ml lb液体培养基，于37℃，220rpm培养至od600为0.6左右，时间为4～5小时；
20.s3:三级种的制备：将二级种接种到80l权利要求书1-3所述的发酵培养基中，在37℃条件下，以柠檬酸、naoh控ph 7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，培养至od600为0.6左右，时间为5～6小时；
21.s4:生产罐发酵：将三级种接种到3t权利要求书1-3所述的发酵培养基中中，加入0.1％-1％烟酰胺，在36～38℃条件下，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，以柠檬酸、naoh控ph 6～8,培养24-48小时,破胞后分离纯化可得烟酰胺单核苷酸产品。
22.与现有技术相比，本发明提供了一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌培养基，具备以下有益效果：
23.该高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌培养基，提供组分优化的发酵培养基，以用于利用重组枯草芽孢杆菌高效发酵生产烟酰胺单核苷酸，通常培养基优化的目的是利用高密度培养以获得更多的菌体，从而得到更高的表达产物，然而，这个办法对于利用重组枯草芽孢杆菌发酵转化烟酰胺得到烟酰胺单核苷酸并不适用，因此，本发明调整发酵培养的成分，减少或剔除不利于烟酰胺单核苷酸生成的组分，提高或优化有利于烟酰胺单核苷酸生成的组分，从而获得一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌培养基。
具体实施方式
24.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌培养基，其包括如下组分：
26.碳源20-50g/l，酵母浸膏5-20g/l，钠盐0.2-2g/l，钾盐1-10g/l，镁盐2-20g/l，磷酸盐5-20g/l，铵盐1-5g/l。
27.进一步的，所述碳源包括葡萄糖，甘油，山梨糖醇中的一种或者至少两种的组合，优选为甘油；
28.所述的钠盐优选为柠檬酸钠；
29.所述的钾盐和磷酸盐优选为磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾；
30.所述的镁盐优选为硫酸镁；
31.所述的铵盐优选为硫酸铵。
32.进一步的，所述其由以下组分组成：
33.甘油30-40g/l，酵母浸膏15-20g/l，磷酸氢二钾6-8g/l，磷酸二氢钾1-3g/l，柠檬酸钠1-2g/l，硫酸镁5-10g/l，硫酸铵1-3g/l。
34.进一步的，所述播种前再次翻耕松土，稻田应在不影响水稻生长的情况下提前排水，作物收割后应及时翻耕疏松土壤。
35.进一步的，所述工艺步骤如下：
36.s1:一级种的制备：从含新霉素20ug/ml的lb平板上挑选含烟酰胺磷酸核糖转移酶表达元件的重组枯草芽孢杆菌株单菌落，接入4ml lb液体培养基中，于37℃、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种；
37.s2；二级种的制备：将一级种接种于800ml lb液体培养基，于37℃，220rpm培养至od600为0.6左右，时间为4～5小时；
38.s3:三级种的制备：将二级种接种到80l权利要求书1-3所述的发酵培养基中，在37℃条件下，以柠檬酸、naoh控ph 7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，培养至od600为0.6左右，时间为5～6小时；
39.s4:生产罐发酵：将三级种接种到3t权利要求书1-3所述的发酵培养基中中，加入0.1％-1％烟酰胺，在36～38℃条件下，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，以柠檬酸、naoh控ph 6～8,培养24-48小时,破胞后分离纯化可得烟酰胺单核苷酸产品。
40.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。