一株异形根孢囊霉APS-1及其应用的制作方法

一株异形根孢囊霉aps-1及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及一株共生真菌根内根孢囊霉，具体涉及一种对多种花生品种具有促生效果的异形根孢囊霉aps-1的分离鉴定及其在促进花生生长和防治花生致病真菌上的应用。


背景技术：

2.花生作为我国重要的经济作物和油料作物，种植面积不断增加且经济效益好，但是病害严重影响花生的健康生产，造成严重的经济损失，其中由齐整小核菌(sclerotium rolfsii)引起的白绢病作为危害最严重的土传病害之一，造成花生产量损失50％以上。目前，常用化学杀菌剂以及采用与非寄主轮作或通过深耕覆盖受感染作物等农业措施来防治白绢病，但是，杀菌剂会造成农药残留、病原菌抗性增强、环境污染等问题，农业措施也只能预防病害，因此需要寻找一种既能有效控制白绢病又环保的方法。
3.生物防治就是一种对作物安全又环保的替代品，其中丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizalfungi，amf)是一类在生物防治植物病害和提高植物抗性/耐病性方面极具应用潜力的微生物资源。amf是土壤中常见的定居者，能与90％以上的陆生植物共生，是一类在生物防治土传病害和提高植物抗/耐病性方面极具应用潜力的微生物资源。本发明通过建立丛枝菌根真菌与花生的共生体系，借助互利共生关系，研究其对花生白绢病的防治效果。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一株异形根孢囊霉aps-1及其应用，在花生上接种异形根孢囊霉，通过建立异形根孢囊霉aps-1与花生的共生体系，借助互利共生关系，促进花生的生长，提高花生对白绢病的抗性。
5.本发明的技术方案是：
6.一株异形根孢囊霉(rhizophagus irregularis)aps-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.40116。
7.本发明还保护所述的异形根孢囊霉aps-1在防治花生致病真菌上的应用。
8.进一步的，所述花生致病真菌包括花生白绢病。
9.进一步的，所述应用形式为菌株aps-1的孢子悬浮液。
10.本发明还保护所述的异形根孢囊霉aps-1在促进花生生长中的应用。
11.进一步的，所述应用形式为菌株aps-1的孢子悬浮液。
12.本发明还保护一种防治花生白绢病的菌剂，其活性成分为所述的异形根孢囊霉aps-1。
13.生物材料样品保藏信息：
14.菌株aps-1为异形根孢囊霉(rhizophagus irregularis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中
国科学院微生物研究所，保藏日期：2022年03月22日，保藏编号为cgmcc no.40116。
15.本发明的有益效果：
16.本发明通过在花生生长过程中接种异形根孢囊霉aps-1，一方面，异形根孢囊霉aps-1可以通过与花生建立良好的共生关系，促进花生对矿质元素的吸收，促进花生生长，提高了花生对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力；另一方面，异形根孢囊霉aps-1能够提高花生对致病真菌如白绢病等的抗性。
17.本发明应用异形根孢囊霉aps-1促进花生生长以及防治花生致病真菌的方法，属于生物防治的范畴，安全、快速、有效，有利于花生的健康绿色生产，为花生病害的综合防治提供技术支撑。
附图说明
18.图1为菌株aps-1与花生毛状根共培养的示意图；
19.图2为菌株aps-1的形态特征；
20.图3为菌株aps-1基于ssu-its-lsu片段构建的系统发育树；
21.图4为未接种与接种菌株aps-1的花生根系特征的镜检示意图；
22.图5为菌株aps-1对花生生长的影响；
23.图6为花生对菌根的依存度计算结果示意图；
24.图7为菌株aps-1对花生白绢病发生情况的影响；
25.图8为菌株aps-1对花生白绢病的防治效果。
具体实施方式
26.为了进一步理解本发明，下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.若未特别指明，以下实施例中所用的材料、试剂等均可从商业途径获得；如无特殊说明，下述实施例中所使用的实验方法，均为常规方法。
28.实施例1
29.异形根孢囊霉aps-1的分离、快速扩繁与鉴定
30.1、丛枝菌根真菌的分离：
31.采集莱西市花生根际土壤，取距离地表5～20cm的土壤，置于阴凉处自然风干，之后通过湿筛倾析法分离土壤中的丛枝菌根真菌孢子。借助显微镜对孢子进行初步分类，其中优势菌命名为aps-1。菌株aps-1孢子为球形、近球形或不规则形状，棕色，长轴70～153μm，孢子内含油状物。
32.2、花生毛状根快速扩繁aps-1：
33.在无菌条件下培养花生品种花育45号的子叶，用发根农杆菌a4侵染花生子叶，诱导转基因花生毛状根的产生，经筛选、扩繁获得大量毛状根。将分离得到aps-1的孢子经表面消毒后与花生毛状根放到msr培养基上，25℃暗培养。待培养基上出现菌丝、孢子时，将花生根继代培养，获得含aps-1的花生毛状根，如图1所示，之后用双重无菌培养法培养菌根，
以便获得大量aps-1的孢子和菌丝，孢子和菌丝形态见图2。
34.3、菌种的鉴定：
35.收集丛枝菌根真菌aps-1的孢子和菌丝，提取基因组，分别利用18s rdna通用引物ssu-glom1(5’attacgtccctgccctttgtaca 3’)(seq id no：1)和28s rdna通用引物ndl22(5’tggtccgtgtttcaagacg 3’)(seq id no：2)进行pcr扩增ssu-its-lsu片段。pcr产物送北京擎科生物科技有限公司测序。28s rdna序列全长为1377bp，序列如seq id no：3所示。
36.所获得的序列进行blast分析比对，ssu-its-lsu片段用mega7软件构建系统发育树，如图3所示。结果表明菌株aps-1与丛枝菌根真菌异形根孢囊霉rhizophagus irregularis mucl43205在同一分支上，说明菌株aps-1为异形根孢囊霉。菌株aps-1保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.40116。
37.实施例2
38.菌株aps-1孢子悬浮液对花生生长的影响
39.收集菌株aps-1的孢子和菌丝，制备成孢子悬浮液备用。花盆中装入湿润的大田土壤，在花盆高度的2/3处接种约900个菌株aps-1的孢子悬浮液，之后用土填满花盆，以接种等体积的水作为对照。
40.花生品种鲁花8号(lh8)、中花24号(zh24)、白沙1016(bs1016)、豫花9620(yh9620)、花育917(hy917)和花育33号(hy33)播种于花盆中，每盆播种4粒种子，待出苗后留3株花生。对照和处理各6盆，重复3次，所有花生放置在塑料大棚中，定期浇水。4周后取3盆，收集根系进行台盼蓝染色，通过显微镜观察根系的侵染情况。花生培养8周后，称量植物总鲜重，烘干后称量植株总干重。菌根依存度按下式计算：菌根依存度(％)＝(接种处理干重－不接种处理干重)/接种处理干重
×
100。花生根系镜检结果如图4所示，图4a为未接种的花生根系特征，图4b和图4c为接种菌株aps-1的花生根系特征；花生根系镜检发现6种花生均能与菌株aps-1共生。
41.如图5所示(图中，**表示在p《0.01水平下，差异极显著)，统计发现，同对照相比，菌株aps-1能够极显著增加6个花生品种的主茎长、侧枝长、总鲜重和总干质量。
42.其中由图5可看出，鲁花8号、中花24号、白沙1016、豫花9620、花育917和花育33号的主茎长，处理比对照分别增加12.00％、21.80％、22.20％、23.60％、30.57％和23.37％；侧枝长，处理比对照分别增加12.30％、22.71％、11.25％、14.31％、16.00％和19.38％；总鲜质量，处理比对照分别增加17.11％、13.42％、13.27％、21.63％、16.91％和16.69％；总干质量，处理比对照分别增加34.59％、47.90％、12.30％、34.79％、26.95％和11.24％。
43.鲁花8号、中花24号、白沙1016、豫花9620、花育917和花育33号的菌根依存度如图6所示，分别为25.70％、32.29％、10.95％、25.20％、20.89％和10.08％。
44.实施例3
45.菌株aps-1孢子悬浮液对花生白绢病抗性的影响
46.花盆中装入湿润的大田土壤，在花盆高度的2/3处接种约900个菌株aps-1的孢子悬浮液，之后用土填满花盆，以接种等体积的水作为对照。
47.花生品种鲁花8号、中花24号、白沙1016、豫花9620、花育917和花育33号播种于花盆中，每盆播种4粒种子，待出苗后留3株花生。对照和处理各4盆，重复3次，所有花生放置在塑料大棚中，定期浇水。6周后，花生茎基部接种布满白绢病菌菌丝的燕麦粒，2周后调查白
绢病发生情况，计算防治效果。白绢病的分级调查标准：1级：仅茎上有病斑，2级：全株1/4以下萎蔫和死亡，3级：全株1/4～1/2萎蔫和死亡，4级：全株1/2以上萎蔫和死亡。病情指数＝∑(各级级值
×
各级病株数)/(最高级数
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调查总株数)
×
100，发病率(％)＝发病株数/调查总株数
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100％，防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
×
100％。
48.统计发现，如图7和图8所示，同对照相比，菌株aps-1能够极显著增加6个花生品种对白绢病的抗性。其中，鲁花8号、中花24号、白沙1016、豫花9620、花育917和花育33号白绢病的病情指数，处理比对照分别降低63.21％、31.65％、61.64％、85.35％、74.61％和43.76％(图7，其中，**表示在p《0.01水平下，差异极显著)；白绢病的发病率，处理比对照分别降低63.04％、30.12％、58.82％、78.19％、54.89％和53.34％(图7)；防治效果，分别为89.14％、48.81％、65.50％、55.23％、58.24％和43.76％(图8)。
49.上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。