circSTX6在制备鼻咽癌诊断和/或预后、治疗制剂中的应用和诊断、治疗制剂

circstx6在制备鼻咽癌诊断和/或预后、治疗制剂中的应用和诊断、治疗制剂
技术领域
1.本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种circstx6在制备鼻咽癌诊断和/或预后、治疗制剂中的应用和诊断、治疗制剂。


背景技术：

2.鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，npc)是我国南方常见的头颈部恶性肿瘤，有明显的区域聚集性和人种好发性。鼻咽癌的发病因素主要包括遗传因素、eb病毒感染和环境因素等。鼻咽癌多为非角化型鳞癌，恶性程度较高，早期即可出现颈部淋巴结转移。目前，鼻咽癌的治疗方法主要是放疗、联合化疗和手术治疗等，虽然早期npc患者的5年总生存率高达95％，但鼻咽和颈淋巴结复发率为8.6％～23.7％。这是由于npc的发生和发展涉及复杂的基因调控和多阶段过程，其分子机制尚不清楚，加之肿瘤异质性和放疗抵抗引起的个体差异，传统放疗的治疗效果不是非常的理想。因此，研究治疗鼻咽癌的治疗靶标和诊断分子标记物至关重要。
3.环状rna(circular rna,circrna)主要来源于蛋白质编码基因的外显子区，也可以由内含子区、utr区、基因间区、非编码rna位点及已知转录物的反义位点形成。circrna是由前体(mrna precursor messenger rna,pre-mrna)反向拼接而形成的一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(a)尾巴并以共价键形成环状套索结构的非编码rna分子。
4.circrna形成过程可以分为两大类，即外显子环化(exon circularization)和内含子环化(intron circularization)两大机制。jeck等提出外显子来源的circrna(exonic circrna,ecircrna)可以分为套索驱动环化(lariat-driven circularization)和内含子配对驱动环化(intron-pairing-driven circularization)两种形成方式，套索驱动环化是外显子3'端作为剪接供体(splice donor)攻击5'端剪接受体(splice receptor)，alu区共价结合而形成套索结构，套索结构进行内部拼接后切除内含子形成circrna；内含子配对驱动环化是两个内含子碱基互补配对形成环状结构后，剪除内含子形成circrna。其实内含子本身也可以环化，可以形成内含子来源circrna(circular intronic rna，cirna)。circrna是由前体mrna反向拼接而形成的一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(a)尾巴并以共价键形式形成的封闭环形结构的非编码rna分子。有着高度的稳定性、保守性、特异性，并且含量高的特点。
5.circrna最早在1976年于rna病毒中首次发现，随后hsu mt等人使用电子显微镜技术在猴的肾细胞质中发现了circrna的存在。近年来越来越多的circrna被发现，目前为止已知的circrna数目已经达到三万多个。circrna也不再被认为是错误的rna转录本，而是作为非编码rna研究中的耀眼之星冉冉升起。发现更多的新型circrna作为肿瘤诊断和预后的生物标志物及其应用，并能尽早在专利领域得到好的保护，能显著提升我国在该技术领域的国际竞争力。
6.本发明检测到一个长度为391bp的环状rna circstx6。通过实验发现该环状rna在
鼻咽癌中高表达且能促进鼻咽癌的侵袭转移，有可能作为鼻咽癌诊断或预后标记物及治疗靶点。


技术实现要素：

7.本发明发现了一个大小391bp的环状rnacircstx6，并发现了它与鼻咽癌之间存在的关系，有可能作为鼻咽癌诊断或预后标记物和治疗靶点。
8.本发明的第一个目的是提供circstx6在制备鼻咽癌诊断和/或预后制剂中的应用，所述的circstx6序列如seq id no.1所示。
9.进一步地，所述的鼻咽癌诊断和/或预后制剂包括pcr或者原位杂交检测circstx6表达量的试剂。
10.更进一步地，所述的pcr或原位杂交检测circstx6表达量的试剂中包含：
11.环状rna circstx6实时定量pcr引物
12.上游引物：5'-ggctggacaatgtgatgaag-3'，如seq id no.2所示；
13.下游引物：5'-agttctggctgccactgtct-3'，如seq id no.3所示；
14.或者扩增circstx6全长引物
15.上游引物：5'-ccatcgatgacatgaaagatcagatgtcaacttcat-3'，如seq id no.4所示；
16.下游引物：5'-tccccgcggcactggtcatatgagatacttttgcaag-3'，如seq id no.5所示。
17.circstx6原位杂交探针序列：5'-tgatctttcatgtccactggtcatatgag-3'，如seq id no.6所示。
18.本发明诊断和/或预后试剂包括但不限于上述引物和探针序列。
19.本发明第二个目的是提供一种鼻咽癌诊断和/或预后制剂，包含pcr或者原位杂交检测circstx6表达量的试剂，所述的circstx6序列如seq id no.1所示。
20.进一步地，所述的鼻咽癌诊断制剂，包含上述的引物或者原位杂交探针。
21.本发明通过qrt-rcr检测鼻咽癌临床组织中circstx6的表达水平，发现其在鼻咽癌组织中相较于非肿瘤鼻咽上皮组织显著上调，且与患者预后生存期相关，结果具有统计学意义，可见circstx6可以作为鼻咽癌辅助诊断或者预后的标记物，为鼻咽癌诊断、预后提供了新的检测途径。
22.本发明的第三个目的是提供抑制circstx6表达的试剂在制备治疗鼻咽癌制剂中的应用，所述的circstx6序列如seq id no.1所示。
23.进一步地，所述的抑制circstx6表达的试剂包括反义寡核苷酸。
24.更进一步地，所述的反义寡核苷酸aso(antisense oligonucleotide)：
25.正义链(5'-3')cauaugaccaguggacaugatt，如seq id no.7所示；
26.反义链(5'-3')ucauguccacuggucauaugtt，如seq id no.8所示。
27.本发明的第四个目的是提供一种治疗鼻咽癌的制剂，包括抑制circstx6表达的试剂，所述的circstx6序列如seq id no.1所示。
28.进一步地，所述的抑制circstx6表达的试剂包括反义寡核苷酸，优选所述的反义寡核苷酸：
29.正义链(5'-3')cauaugaccaguggacaugatt
30.反义链(5'-3')ucauguccacuggucauaugtt。
31.本发明不限于上述具体的aso。
32.进一步的，所述的抑制circstx6表达的试剂还包括阴性对照：
33.正义链(5'-3')gagaacgggauagcaucgactt，如seq id no.9所示；
34.反义链(5'-3')gucgaugcuaucccguucuctt，如seq id no.10所示；
35.但不限于上述具体的阴性对照。
36.目前，aso已发展成为基因功能研究的重要工具。为了探究circstx6在肿瘤发生发展中的作用，本发明根据circstx6的拼接位点设计了一对aso，利用hiperfect试剂将aso和sinc(对照)瞬时转染到hne2、cne2和hone1细胞系中沉默circstx6的表达。转染后继续培养36小时收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circstx6的表达水平以检测aso的转染效率，发现设计的aso能显著抑制circstx6的表达水平。
37.本发明通过大量的试验证实上述结论：即抑制circstx6表达的试剂能够用于制备鼻咽癌治疗制剂。这些试验包括：体外过表达circstx6试验发现能促进鼻咽癌细胞侵袭和迁移，体外沉默circstx6则抑制鼻咽癌细胞的侵袭和迁移。
38.由于aso具有良好的沉默效果，本发明采用针对环状rna头尾相接处的拼接位点设计aso对circstx6进行干扰(只沉默circrna，对线性的rna无影响)，在鼻咽癌细胞系hne2、cne2和hone1中进行划痕愈合实验、基质胶侵袭实验，相对于nc(对照)组，aso组细胞的侵袭和迁移能力明显减弱，即沉默circstx6抑制了鼻咽癌细胞的侵袭转移。即抑制circstx6能治疗鼻咽癌，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
附图说明
39.图1.circstx6的筛选鉴定及qrt-rcr检测鼻咽癌临床组织中circstx6的表达水平；a.生信分析geo数据库中gse68799的鼻咽癌组织测序数据发现circstx6在鼻咽癌组织中的表达显著上调；b.n为非肿瘤鼻咽上皮组织，样本数为16例；t为鼻咽癌组织，样本数为26例，n为样本数量，均采用t检验，p《0.05具有统计学意义。
40.图2.通过数据库比对和sanger测序法验证circstx6是由stx6基因第4-7号外显子反向拼接形成，大小391nt；a.circstx6由stx6的4-7号外显子首尾拼接形成，e表示exon(外显子)，下划线序列表示首尾的接头序列；b.circstx6形成的示意图；c.测序结果的峰图，黑色箭头表示从此处头尾相接；
41.图3.检测circstx6在鼻咽癌细胞系中的表达。np69是永生化的正常鼻咽上皮细胞，作为参照，其余均为鼻咽癌细胞系。
42.图4.检测circstx6对rnase r的耐受性。rnase r处理后，利用qrt-pcr检测鼻咽癌细胞内circstx6和stx6的相对rna水平。
43.图5.检测circstx6的稳定性。放线菌素d处理后，利用qrt-pcr检测鼻咽癌细胞内circstx6和stx6在不同时间点的相对rna水平。
44.图6.rna-fish实验检测circstx6的亚细胞定位。circstx6大部分定位在细胞质中。
45.图7.circstx6过表达载体的重组质粒图谱。
46.图8.qrt-pcr技术检测鼻咽癌细胞系中circstx6过表达质粒的过表达效率和circstx6 aso的沉默效率。a.qrt-pcr检测在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中circstx6质粒的过表达效率,circstx6表达水平分析以β-actin作为参照；b.qrt-pcr检测在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中circstx6 aso的沉默效率,circstx6表达水平分析以β-actin作为参照。c.在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中转染aso后，检测线性rna stx6的表达，ns代表无意义，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。
47.图9.体外过表达/沉默circstx6对鼻咽癌细胞增殖的影响。a.在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2用neofect瞬时转染pcdna3.1( )circrna mini vector、circstx6过表达质粒，继续培养24小时后进行mtt实验检测细胞增殖能力，将pcdna3.1( )circrna mini vector组标准化为1，ns代表没有意义，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。b.在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2用hiperfect瞬时转染sinc、circstx6 aso，继续培养24小时后进行mtt实验检测细胞增殖能力，将sinc组标准化为1，ns代表没有意义，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。
48.图10.过表达/沉默circstx6对鼻咽癌细胞侵袭的影响。a.用基质胶侵袭实验模拟细胞穿过基质屏障，在hone1、hne2和cne2细胞中转染pcdna3.1( )circrna mini vector、circstx6过表达质粒24小时后，用基质胶侵袭实验检测过表达circstx6对鼻咽癌细胞侵袭的影响，其中下图为细胞个数的统计图(b)，将pcdna3.1( )circrna mini vector标化为1，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。c.用基质胶侵袭实验模拟细胞穿过基质屏障，在hone1、hne2和cne2细胞中转染sinc、circstx6 aso 24小时后，用基质胶侵袭实验检测沉默circstx6对鼻咽癌细胞侵袭的影响，其中右图为细胞个数的统计图(d)，将sinc标化为1，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。
49.图11.过表达/沉默circstx6对鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2划痕愈合能力的影响。a.在hone1、hne2和cne2细胞中转染pcdna3.1( )circrna mini vector、circstx6后，待细胞密度达到100％后划痕，根据细胞愈合速度在不同的时间点拍照，下方为划痕宽度的统计图(b)，将pcdna3.1( )circrna mini vector标化为1，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。a.在hone1、hne2和cne2细胞中转染sinc、circstx6 aso后，待细胞密度达到100％后划痕，根据细胞愈合速度在不同的时间点拍照，下方为划痕宽度的统计图(c)，将sinc标化为1，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
50.图12.circstx6在鼻咽癌组织中高表达并与患者的不良预后相关。a-b.circstx6表达在来自95名npc患者和25例正常组织(鼻咽上皮，npe)的石蜡包埋组织切片中通过原位杂交实验得到验证。b.circstx6高表达与鼻咽癌患者的总体生存期缩短相关。
具体实施方式
51.以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
52.本发明所用hne2、cne2和hone1等鼻咽癌细胞系均为中南大学肿瘤研究所分子遗传实验室所保存。细胞培养条件为：10％胎牛血清(fbs)和1％双抗(青霉素、链霉素)的rpmi1640液体培养基，37℃、95％湿度、5％co2浓度的恒温培养箱内贴壁生长。
53.本发明环状rna的引物与线性rna引物的设计不同，其是根据拼接位点两侧设计，primer3.0网站上在线设计，最终的引物合成工作，委托擎科生物公司长沙合成部合成。
54.(1)β-actin
55.上游引物：5'-tcaccaactgggacgacatg-3'；如seq id no.11所示；
56.下游引物：5'-gtcaccggagtccatcacgat-3'；如seq id no.12所示；
57.(2)环状rna circstx6实时定量pcr引物
58.上游引物：5'-ggctggacaatgtgatgaag-3'
59.下游引物：5'-agttctggctgccactgtct-3'
60.(3)扩增circstx6全长引物
61.上游引物：5'-ccatcgatgacatgaaagatcagatgtcaacttcat-3'
62.下游引物：5'-tccccgcggcactggtcatatgagatacttttgcaag-3'
63.本发明为了特定的敲低环状rna而不影响它的线性基因表达，根据拼接位点设计aso，靶向沉默circstx6。
64.circstx6 aso序列：
65.正义链(5'-3')cauaugaccaguggacaugatt
66.反义链(5'-3')ucauguccacuggucauaugtt。
67.阴性对照：
68.正义链(5'-3')gagaacgggauagcaucgactt
69.反义链(5'-3')gucgaugcuaucccguucuctt。
70.本发明试验结果均采用统计学分析：t检验用来评价两组之间的差异。卡方检验用来评估基因表达或不表达在性别、年龄、肿瘤阶段、临床分期和转移情况等临床参数方面的差异。p《0.05用于表示统计学显著性，所有p值均使用双侧检验。统计分析采用spss 13.0和graphpad 7.0软件进行。
71.实施例1：circstx6的筛选鉴定
72.本发明从geo数据库中，下载了一套包含4个正常鼻咽组织样本和41个鼻咽癌组织样本，共计45个临床样本的rna-seq数据，编号为gse68799。通过对这套鼻咽癌组织rna-seq数据分析，鉴定出了8884个circrna，随后使用sam软件对数据进行差异分析，得到178个在正常鼻咽组织和鼻咽癌组织间存在显著差异的circrna分子，其中在鼻咽癌组织中上调的环状rna分子中发现了hsa_circ_23135(circstx6)(图1)。
73.实施例2：sanger测序证明形成的是环状rna
74.为了证明circstx6形成的是环状rna而非线性的，将图1b中的qrt-pcr产物回收，送公司进行sanger测序(擎科公司)。将公司返回的序列用dnastar软件进行比对，chromas软件看峰图，判断测序的质量。结果显示，circstx6确实是由母基因stx6的4-7号外显子头尾相接环化形成。a.circstx6由stx6的4-7号外显子首尾拼接形成，e表示exon(外显子)，下划线序列表示首尾的接头序列；b.circrna形成的示意图；c.测序结果的峰图，黑色箭头表示从此处头尾相接(见图2)。
75.实施例3：circstx6在鼻咽癌细胞中的表达
76.1、细胞总rna提取
77.准备工作：灭菌后的无rnase水、75％乙醇(无rnase配制)、氯仿、异丙醇、1
×
pbs、无酶tip头和ep管，高速低温离心机预冷至4℃，实验开始前先将实验台面及移液枪用75％酒精擦拭。
78.1)取待提取rna的细胞，用1
×
pbs或d-hanks清洗两次；
79.2)12孔板中每孔加500μl trizol裂解液，室温裂解1-2分钟，用移液枪轻轻吹下细胞，上下轻柔颠倒10次，室温静置5分钟；
80.3)加入100μl的氯仿(按1mltrizol:0.2ml氯仿:0.5ml异丙醇)，用力震荡15-30s，冰上放置5分钟；
81.4)4℃，12000rpm/20min；
82.5)取上层水相于预冷的tube管中，加入250μl异丙醇，用漩涡混合器或移液枪混匀(-20℃》1h)；
83.6)4℃，12000rpm/30min，弃上清；
84.7)加入75％乙醇(预冷)1ml，混匀；
85.8)4℃，7600rpm/5min；弃上清，重复步骤8,9；
86.9)闪离10s，尽量吸尽上清，倒置干燥10分钟；
87.10)加入20-30μl depc，测rna浓度和od值。
88.2、circrna逆转录pcr反应
89.(依据abm公司5
×
all-in-onertmastermix(withaccurtgenomicdnaremovalkit)(#g492)的实验说明手册操作)
90.配置如下反应体系：
[0091][0092]
逆转录pcr上机反应程序如下：
[0093]
25℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10min，
[0094]
42℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15min，
[0095]
85℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5min。
[0096]
待反应结束后，-20℃保存产物备用。
[0097]
3、实时荧光定量pcr
[0098]
先将逆转录反应产物稀释5倍，然后依据abm公司evagreen qpcr mastermix(mastermix-r)的实验说明手册操作，配置如下反应体系：
[0099][0100]
实时荧光定量pcr机上反应程序如下：(cycle
×
39)
[0101][0102]
bio-radiq5实时荧光定量pcr仪进行上述反应完成后，与内参基因β-actin标化，以2
‑△△
ct值显示目标基因的相对表达量，判定基因的表达差异。采用unpaired t-test检验计算p值。
[0103]
结果：鼻咽癌细胞中circstx6的表达明显高于正常鼻咽上皮细胞np69(图3)。因此，circstx6在鼻咽癌细胞系中高表达，circstx6对鼻咽癌的发生发展可能具有重要的生物学功能，可以据此使用反义寡核苷酸对进行鼻咽癌治疗。
[0104]
实施例4：rnase r消化实验
[0105]
1反应体系
[0106]
rnase r消化反应体系
[0107][0108]
2反应条件
[0109]
37℃，10-30min。
[0110]
注：1)可随rna增加适当延长消化时间，一般10-30min即可消化掉大部分的线性rna，pcr检测线性rna丰度有几百倍的降低。消化1h以上是非必要的，因为时间过长可能导致少数耐受力弱的circrna被消化。2)孵育后可先纯化回收，或者70℃10min使酶灭活后直接进行下游实验。
[0111]
3纯化回收
[0112]
消化后的rna可使用苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1,v:v)溶液抽提，再使用乙醇沉淀回收；或者使用rna纯化柱和磁珠进行纯化回收。qrt-pcr检测circstx6和线性mrna stx6(见图4)。
[0113]
注：苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1,v:v)溶液最好现配现用，没有试剂也可以trizol reagent代替。
[0114]
实施例5：放线菌素d处理实验
[0115]
为了检测circrna与线性rna的稳定性，将鼻咽癌细胞以50％左右密度接种至12孔板中，待细胞贴壁后加入终浓度为1μg/ml的放线菌素d，分别处理0，8，16，24小时，抽提细胞的rna，逆转录成cdna，并用qrt-pcr检测circstx6和stx6 mrna的表达，以18s为内参(图5)。
[0116]
实施例6：rna-fish实验检测circstx6在细胞内的定位
[0117]
由于aso发挥作用主要是在细胞质中，因此检测circstx6的定位可判断能否很好地干扰circstx6的表达。利用rna-fish检测circstx6在核、质中表达所占的比重，发现circstx6主要定位于细胞质。(见图6)。
[0118]
rna-fish步骤：
[0119]
1)爬片：按1000个细胞/孔将贴壁细胞接种于24孔板(孔内提前防置玻片)，放置于培养箱中培养过夜；
[0120]
2)吸弃培养基，37℃预热pbs洗两次，每次5min；
[0121]
3)固定：每孔加入200μl 4％多聚甲醛，室温固定15min；
[0122]
4)破膜：吸弃固定液，每孔加入200μl 0.25％tritonx-100(现配现用，溶于pbs)，室温处理15min；
[0123]
5)pbs洗两次，每次5min；
[0124]
6)预杂交：湿盒准备，杂交盒底部加20％甘油20ml以保持温度，按每张切片20μl加入预杂交液，恒温箱37℃孵育2-4h，吸取多余液体，不洗；
[0125]
7)用杂交液稀释地高辛标记的circstx6 rna探针，按每张切片20μl加入杂交液(浓度一般为4μm/8μm，体积15-20μl)，恒温箱37℃孵育过夜(大于16h)；
[0126]
8)杂交片洗涤：30-37℃左右水温的2xssc洗涤两次，每次5min；0.5xssc洗涤一次，5min；0.2xssc洗涤一次，5min，必要时可用0.2xssc复洗一次，5min；
[0127]
9)滴加封闭液:37℃30min，吸取多余液体，不洗；
[0128]
10)滴加生物素化鼠抗地高辛抗体，37℃60min或室温2h，0.5mx pbs洗四次，每次5min；
[0129]
11)滴加荧光二抗(1:200),37℃60min，0.5m x pbs洗三次，每次5min；
[0130]
12)加入dapi工作液，避光染色10min；
[0131]
13)0.5m x pbs洗三次，每次5min；
[0132]
14)封片，拍摄。
[0133]
实施例7：在鼻咽癌细胞系中circstx6过表达效果检测
[0134]
首先我们选择酶切位点，将circstx6全长序列放入neb cutter 2.0在线网站分析，显示clai和sacii酶切位点为circstx6全长序列中不存在的位点，同时在pcdna3.1( )circrna mini vector质粒载体(购于生工生物工程公司)中单一存在的dna限制性内切酶。将circstx6全长序列克隆进pcdna3.1( )circrna mini vector质粒空载，图7为绘制的过
表达载体图谱。
[0135]
为了检测circstx6的成环效率，首先我们将构建的pcdna3.1( )circrna mini vector/circstx6真核过表达载体在鼻咽癌细胞中进行过表达。把生长状况良好的第三、四代鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2种到12孔板中，待细胞融合度达到60％-80％时，用neofect把无内毒素质粒pcdna3.1( )circrna mini vector空载体和circstx6过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2，继续培养至36h收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circstx6的表达水平及成环效率。qpcr结果显示，与pcdna3.1( )circrna mini vector空质粒组细胞相比，转染circstx6过表达质粒组的细胞中circstx6的表达水平显著升高，结果具有统计学意义(见图8a)。
[0136]
实施例8：在鼻咽癌细胞系中沉默circstx6表达的效果检测
[0137]
反义寡核苷酸(aso)是一类通过序列特异地与靶基因dna或mrna结合而抑制该基因表达的分子。aso是单链dna和rna的杂合体，通过rnase-h起作用，这个酶在核内也有，因此可以同时干扰核内和胞质中的基因。aso针对拼接位点设计和靶序列互补的序列，从而避免干扰线性rna的表达。目前，aso已发展成为基因功能研究的重要工具。为了探究circstx6在肿瘤发生发展中的作用，我们根据circstx6的拼接位点设计了aso，利用hiperfect试剂将aso和sinc(空白对照)瞬时转染到hone1、hne2和cne2细胞系中沉默circstx6的表达。转染后继续培养36小时收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circstx6的表达水平以检测aso的转染效率，确认circstx6敲低效果(见图8b)。然而以circstx6的序列设计线性引物时，实时荧光定量pcr检测发现aso并未敲低线性rna的表达，说明aso是特异性沉默circstx6的表达(见图8c)。
[0138]
本实施例中反义寡核苷酸：
[0139]
正义链(5'-3')cauaugaccaguggacaugatt
[0140]
反义链(5'-3')ucauguccacuggucauaugtt。
[0141]
空白对照：
[0142]
正义链(5'-3')gagaacgggauagcaucgactt
[0143]
反义链(5'-3')gucgaugcuaucccguucuctt。
[0144]
实施例9：mtt实验检测细胞增殖
[0145]
我们首先用hiperfect转染sinc、aso circstx6，或相应的用neofect把无内毒素质粒pcdna3.1( )circrna mini vector和circstx6过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2，继续培养24h后，进行mtt实验，验证其对细胞增殖的影响。结果发现aso circstx6能显著抑制三株细胞系的增殖，而过表达circstx6显著促进三株细胞系的增殖(图9)
[0146]
1)准备：tip头、高温高压灭菌的d-hanks；移液枪、marker笔、15ml离心管等酒精消毒后再放置在生物安全柜内紫外照射30min，通风10min。
[0147]
2)种板和转染：前一天将25cm2细胞瓶中的状态良好的细胞消化下来种入6孔板，待细胞密度长至70％左右转染aso circstx6，或者待细胞长至80～90％左右转染过表达载体。
[0148]
3)转染12小时后，吸弃细胞上清，d-hanks洗3遍，6孔板每孔加入100μl胰酶，消化细胞呈圆形后，将细胞吹打下来转移至15ml离心管，1000rpm离心5min，弃上清，加入1～2ml
培基，混匀，取10μl加入细胞计数板进行细胞计数。根据细胞计数结果，将细胞稀释至5000个细胞/ml。
[0149]
4)将稀释好的细胞悬液加入96孔板，每孔加入细胞悬液200μl，96孔板最外一圈孔中加200μl dank’s缓冲液，放入培养箱继续培养。
[0150]
5)待6～8h左右细胞贴壁后，每孔加入20μl mtt，继续培养4小时，小心吸弃孔内的培养上清液，每孔加入200μl dmso，置于摇床上摇晃10min，在酶联免疫检测仪上选择490nm波长检测dmso加样孔的吸光值，记录结果。之后每天在相同的时间点加mtt和dmso进行吸光值检测，连续检测6天后进行统计学分析。
[0151]
实施例10：细胞transwell侵袭实验：
[0152]
1)基质胶准备：提前一天把冻存于-20℃的bd matrigel胶置于4℃冰箱融化成液态，把稀释胶用的tip头、ep管置于-20℃过夜，这样第二天操作时matrigel胶在铺胶时不会过快凝固；
[0153]
2)基质胶稀释：bd matrigel胶：无血清培基＝1:8，即20μl基质胶加160μl 1640培基轻吹混匀；
[0154]
3)将稀释好的基质胶加入transwell小室100μl，再沿边吸出80μl，依次铺好放入37℃培养箱里孵育2-3小时，当看到铺胶层为白色时，表明液体matrigel胶已呈固态；
[0155]
4)消化转染24h后的细胞，用无血清培基洗2遍，然后使用无血清的培基重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为每200μl中2万个细胞；
[0156]
5)向下层小室添加800μl含有20％fbs的1640培养基，放入小室时将24孔板倾斜45
°
角，以避免放入小室过程中在小室和液面之间产生气泡；
[0157]
6)每室加200μl计好数的细胞悬液到transwell上室内，将24孔板放回37℃培养箱中，根据细胞状态和细胞侵袭速度，孵育约24～48h。
[0158]
7)取出24孔板，用pbs或者d-hanks洗两遍，4％多聚甲醛浸洗10min，用清水洗3遍。
[0159]
8)染色：用0.1％的结晶紫滴加到transwell小室的底部，室温静置5-10min，用pbs清洗2-3遍，用棉签小心擦掉小室上面的基质胶；
[0160]
9)在24孔板中加入蒸馏水800μl，transwell上室中加入蒸馏水约200μl，然后在倒置显微镜下，任选5个不同的视野拍照，用image j软件进行计数和统计学分析差异的显著性。
[0161]
体外沉默circstx6的表达抑制鼻咽癌的侵袭
[0162]
为了探究沉默circstx6后是否能够影响鼻咽癌的侵袭，我们又在三株细胞系中进行了transwell小室基质胶侵袭实验，利用hiperfect试剂将circstx6 aso和sinc瞬时转染到hone1、hne2和cne2细胞系中沉默circstx6的表达。在沉默了circstx6的鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中进行transwell小室基质胶侵袭实验，结果显示，aso组可在transwell小室下表面观察到的肿瘤细胞数目明显少于nc组，且三株细胞系结果的趋势一致。随机拍摄5张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义。以上结果表明，沉默鼻咽癌细胞系中circstx6的表达，能够抑制鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2在体外的侵袭能力(图10)。
[0163]
体外过表达circstx6促进鼻咽癌细胞的侵袭
[0164]
我们在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2进行了transwell小室基质胶侵袭实验，
已观察沉默circstx6对细胞侵袭能力的影响。我们同样利用neofect把无内毒素质粒pcdna3.1( )circrna mini vector和circstx6过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2，继续培养到48小时后。收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circstx6的表达水平及成环效率。在确定了circstx6过表达质粒的过表达良好效果后，我们将细胞接种到铺基质胶的transwell小室中，发现过表达质粒组的细胞侵袭到小室下表面的数目明显比空载组多，且三株细胞系结果的趋势一致。随机拍摄3张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义(结果见图10)。以上结果表明，过表达鼻咽癌细胞系中circstx6促进鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2在体外的侵袭能力。通过正反两个方向证明，环状rna circstx6能够促进鼻咽癌细胞的侵袭(结果见图10)。
[0165]
实施例11：细胞划痕愈合迁移实验
[0166]
1)照细胞台：1000μl/10μl tip头、高温高压灭菌的d-hank’s，直尺、1000μl/10μl移液枪、marker笔等，用酒精消毒后再放置在超净台内紫外照射30分钟；
[0167]
2)待细胞长至50％～70％左右分别转染aso和nc组或者转染质粒；
[0168]
3)待细胞长满平铺板底后第二天开始划痕：将10μl枪头比着直尺垂直于6孔板底部干脆快速进行十字或井字划痕，不要倾斜，力度大小一致，以确保划痕宽度尽可能一致；
[0169]
4)吸弃培养液，用d-hanks轻轻洗涤3次，尽可能洗掉由于划痕引起的碎片细胞；
[0170]
5)加入1％双抗2％胎牛血清的1640培养基；
[0171]
6)拍照记录此时的十字旁边划痕宽度，记为0h；
[0172]
7)将6孔板放回培养箱培养，间隔12h拍摄同一位置，记为12h；
[0173]
8)间隔24h时再拍相同位置，直到划痕愈合，整理所有的图片，并进行统计分析。
[0174]
体外沉默circstx6抑制鼻咽癌细胞的迁移
[0175]
利用hiperfect试剂将aso和sinc瞬时转染到hone1、hne2和cne2细胞系中沉默circstx6的表达。在沉默了circstx6的鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中进行划痕实验，验证其对细胞迁移的影响。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点均证实：相对于nc组，aso组细胞的迁移能力明显减弱。划痕宽度差异明显,且具有统计学意义。以上结果显示，沉默鼻咽癌细胞系中circstx6的表达，能够抑制鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2在体外的迁移能力(图11)。
[0176]
体外过表达circstx6促进鼻咽癌细胞的迁移
[0177]
利用neofect把无内毒素质粒pcdna3.1( )circrna mini vector和circstx6过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2。在确定了circstx6过表达质粒的过表达良好效果后，我们在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2进行了细胞划痕愈合实验。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点均证实：相对于空载pcdna3.1( )circrna mini vector质粒组，circstx6过表达质粒组细胞的迁移能力明显增强。划痕宽度差异较大，且具有统计学意义。以上结果显示，过表达鼻咽癌细胞系中circstx6的表达，能够促进鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2在体外的迁移能力。通过正反两个方向验证证明，circstx6可以促进鼻咽癌细胞的迁移(图11)。
[0178]
实施例12：原位杂交实验
[0179]
本发明中收集了95例鼻咽癌临床组织样本，npe(癌旁组织)＝25，npc(鼻咽癌组织)＝95。利用原位杂交试剂盒(boster，武汉，中国)检测石蜡包埋的鼻咽癌组织和癌旁组
织中circstx6的表达。探针序列(5'-tgatctttcatgtccactggtcatatgag-3')设计为跨越circstx6剪接位点(～30nt)。使用半定量评分标准评估染色密度和深度。双盲评分是由两位经验丰富的病理学家打分。(1)染色强度：0，未染色；1，浅褐色；2，棕色无底色或深棕色带光棕色背景(中度阳性)；3，深棕色无非特定背景(强阳性)。(2)基于比例的分数阳性信号占总细胞数：0，无阳性细胞；1,0
–
25％；2，阳性率25-50％；3，50-70％阳性率；4，阳性率70-100％。本发明用原位杂交的方法检测鼻咽癌组织和癌旁非肿瘤组织中circstx6的表达，发现circstx6在鼻咽癌组织中高表达(图12a)。在同时分析npe(癌旁组织)和npc(鼻咽癌组织)中circstx6高低表达时，circstx6的阳性率大于25％定义为高表达，得到circstx6在npe和npc中的高低表达的分布情况(图12b)。此外，用kaplan-meier生存分析生成了总体生存(os)曲线，发现鼻咽组织中circstx6水平较高的患者总体生存期显著缩短(图12c)。在分析统计鼻咽癌患者总体生存率时，本发明中把鼻咽癌中circstx6阳性率低于50％的定义为circstx6低表达，大于50％的定义为circstx6高表达。在circstx6低表达组中，死亡41例，存活22例，鼻咽癌患者总体生存率为35％。在circstx6高表达组中，死亡28例，存活4例，鼻咽癌患者的总体生存率为12.5％(图12c)。