温敏细胞培养微载体及其制备方法与流程

1.本发明涉及细胞培养材料技术领域，具体涉及一种温敏细胞培养微载体及其制备方法。


背景技术：

2.市场上已有商品化的温度敏感型细胞培养表面，主要通过将温敏材料接枝到培养装置的表面来实现。该种表面能够在细胞培养结束后，通过改变温度使细胞自动脱落下来，减小对细胞的损伤。
3.然，现有技术中的各类温敏型细胞培养表面存在各种各样的缺陷。例如，中国发明专利申请“201310250743.x温敏微载体及其制备工艺和使用方法”提供了一种微载体，当细胞从载体表面脱离时不使用胰酶或者化学试剂解离细胞，而仅仅通过改变温度来实现。培养温度为37℃时，细胞结合在微载体上，降低为常温时脱离，但是由于脱离温度和结合温度差异较小，操作起来难度大，细胞收获率仅为50～70％。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的问题，本技术提供了一种温敏细胞培养微载体，它具有和现有温敏细胞培养微载体不同的温敏温度，能够更好的分离细胞，且保留细胞的活性。
5.为了实现上述目的，本发明所提供的温敏细胞培养微载体，是以改性的纤维素，即羟丙基二乙氨基乙基纤维素为材料，制备成多孔结构的微球。
6.本发明还提供了一种上述温敏细胞培养微载体的制备方法，其步骤为：将100ml的2～4％wt浓度羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液，加入到300ml石蜡油中，羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液和石蜡油以1:3～5体积比混合，添加10～20ml乳化剂司班80，充分搅拌乳化，升温至50℃，羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液固化成球，固液分离后，充分洗涤去除杂质后，加入冷冻干燥器中，在真空冷冻干燥的条件下，得多孔羟丙基二乙氨基乙基纤维素固体微球。
7.上述方案中，所述羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液的制备方法为：将2～3g纤维素粉末溶解在含氢氧化钠和尿素的水溶液中，氢氧化钠和尿素/水重量比例为15:85，氢氧化钠与尿素的重量比例为2～4:1，于-18℃下充分搅拌溶解24小时，得到透明澄清的纤维素溶液，加入1～2g二乙氨基氯乙烷盐酸盐和1～2g环氧丙烷混合物，在5～25℃充分搅拌24小时，即得。
8.本发明的有益效果为：温敏微载体的好处是，在细胞培养完成后，通过控制温度，温敏微载体可以在凝胶态和溶液态相互转变，细胞培养5～37℃时，微载体溶胀后是凝胶态，在收获过程中，降低温度到0-5℃，微载体从凝胶态转变为溶液态，致使生长于微载体内和表面的细胞自动脱落，与微载体分离。与传统的胰蛋白酶消化细胞分离方法不同，新方法，能更好的保存细胞表面蛋白及标记，保证细胞高活力，是一种无损细胞收获方法。且针对现有温敏微载体的缺陷改良，其细胞收获率大幅提升。这种新型温敏微载体具有良好的
细胞贴附和脱附能力,将会是大规模培养贴附型细胞的良好材料。
附图说明
9.图1为用实施例1的微载体培养后收获的细胞形态图。
具体实施方式
10.下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详述，但不应理解为是对本发明保护范围的限制。
11.实施例1
12.一种温敏细胞培养微载体，具体制备过程如下：
13.1)将2g纤维素粉末溶解在含氢氧化钠和尿素的水溶液中，氢氧化钠/尿素/水重量比例为11/4/85，于-18℃下充分搅拌溶解24小时，得到透明澄清的纤维素溶液，加入1g二乙氨基氯乙烷盐酸盐和1g环氧丙烷混合物，在25℃充分搅拌24小时，得到羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液。
14.2)将上述100ml的2％wt浓度羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液，加入到300ml石蜡油中，羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液和石蜡油以1/3体积比混合，添加10ml乳化剂司班80，充分搅拌乳化，升温至50℃，羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液固化成球，固液分离后，用0.1m的盐酸和无水乙醇充分洗涤后，加入冷冻干燥器中，在真空冷冻干燥的条件下，得多孔羟丙基二乙氨基乙基纤维素固体微球。改性微球同时具有多孔结构和温敏特性，可以用于细胞培养和无损收获。
15.实施例2
16.1)将3g纤维素粉末溶解在100g含氢氧化钠和尿素的水溶液中，氢氧化钠/尿素/水重量比例为10/5/85，于-18℃下充分搅拌溶解24小时，得到透明澄清的纤维素溶液，加入2g二乙氨基氯乙烷盐酸盐和2g环氧丙烷混合物，在5℃充分搅拌24小时，得到羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液。
17.2)将上述100ml的3％wt浓度羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液，加入到300ml石蜡油中，羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液和石蜡油以1/5体积比混合，添加20ml乳化剂司班80，充分搅拌乳化，升温至50℃，羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液固化成球，固液分离后，用0.1m的盐酸和无水乙醇充分洗涤后，加入冷冻干燥器中，在真空冷冻干燥的条件下，得多孔羟丙基二乙氨基乙基纤维素固体微球。改性微球同时具有多孔结构和温敏特性，可以用于细胞培养和无损收获。
18.实施例3
19.一种温敏细胞培养微载体，具体制备过程如下：
20.1)将2g纤维素粉末溶解在含氢氧化钠和尿素的水溶液中，氢氧化钠/尿素/水重量比例为12/3/85，于-18℃下充分搅拌溶解24小时，得到透明澄清的纤维素溶液，加入2g二乙氨基氯乙烷盐酸盐和2g环氧丙烷混合物，在20℃充分搅拌24小时，得到羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液。
21.2)将上述100ml的4％wt浓度羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液，加入到300ml石蜡油中，羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液和石蜡油以1/4体积比混合，添加15ml乳化剂司班
80，充分搅拌乳化，升温至50℃，羟丙基二乙氨基乙基纤维素溶液固化成球，固液分离后，用0.1m的盐酸和无水乙醇充分洗涤后，加入冷冻干燥器中，在真空冷冻干燥的条件下，得多孔羟丙基二乙氨基乙基纤维素固体微球。改性微球同时具有多孔结构和温敏特性，可以用于细胞培养和无损收获。
22.对比例1
23.现有温敏细胞培养微载体，具体制备过程如下：
24.1)25ml圆底烧瓶中加入葡聚糖微球(g50)1.0g，二甲基亚砜(dmso)10ml，加入2-氯丙酰氯1.0g,加入磁子搅拌1.5h，用甲醇洗3-5次后，得到表面含有大量氯原子的化学修饰的葡聚糖微球；
25.2)n-异丙基丙烯酰胺(nipaam)通过自由基atrp聚合接枝，方法如下：表面经过氯甲基化修饰含有大量氯原子的葡聚糖微球加入含有磁子的50ml圆底烧瓶，依次加入n异丙基丙烯酰胺(nipaam)2.0g，氯化铜(cucl2)0.34g，三-(n’n二甲氨基乙基胺)(me6tren)0.46g，25ml去离子水，无氧的环境下，加入抗坏血酸0.13g,室温反应24h，然后用水洗3-5次后干燥，即得到接枝n异丙基丙烯酰胺的聚合物的具有温敏性的葡聚糖微球。
26.实验例
27.将上述实施例和对比例中制备的温敏细胞培养微载体用于细胞培养。
28.培养的方法：
29.1)取3g上述制备而得的温敏微载体于100ml转瓶中，加入80ml pbs(磷酸缓冲液)，浸泡过夜，倒掉多余pbs，后加入新的pbs，静止20min左右，待微载体沉下来后再倒掉多余的pbs,如此三次，最后一次留下50ml左右的pbs进行灭菌预处理；
30.2)在超净台内弃去pbs，加入20ml完全培养基(10％fbs mem)，浸泡6h；
31.3)加入10ml细胞密度为1
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106cells/ml的hepg2细胞(来自中国典型培养物保藏中心)于转瓶中，添加完全培养基至100ml体积，按照50rpm搅拌速度接种细胞，待细胞加入后再降低速度为20rmp/min,8h之后再按照40rpm的搅拌转速进行培养，培养温度为37℃，每隔2天更换半体积培养液；
32.4)培养至第八天，细胞已经长满微载体，弃去培养液，加入预冷的pbs 100ml于转瓶内，使培养液温度由37℃改变为4℃，放置10min，微载体转变为液体状态，离心收集细胞。计算得，细胞收获率。
33.检测可得，细胞在显微镜下的二维培养的形态，放大倍数为40倍，显微镜下，hepg2细胞呈圆柱形或多边形贴附生长，细胞间紧密连接，细胞形态清晰，状态良好，如图1所示。
34.结果评价，各个实施例对比例中微载体培养细胞的收获率及细胞的形态健康程度如下表所示。
35.评价指标细胞收获率细胞活性实施例198％95％实施例299％97％实施例392％94％对比例68％90％
36.本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人
员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。