一种生产交替糖-寡糖的方法与流程

1.本发明涉及一种生产交替糖-寡糖的方法。


背景技术：

2.交替糖-寡糖被称为益生元成分。美国专利7,182,954公开了由交替糖蔗糖酶催化的蔗糖与各种受体糖的反应产生的寡糖可以作为益生元来有效控制肠道细菌病原体。通过用包含有效促进有益细菌(例如乳杆菌、双歧杆菌)生长的量的一种或多种这些寡糖的组合物处理动物，可以显着减少或抑制肠道致病菌的数量。
3.wo0047727a2提供了编码交替糖蔗糖酶的核酸分子。此外，提供了由所述核酸分子转化的载体、宿主细胞和植物细胞以及含有它们的植物。此外，因为插入了编码交替糖蔗糖酶的核酸分子，因此描述了用于制备合成碳水化合物交替糖的转基因植物的方法。此外，提供了制备交替糖的方法和由该方法生产的产品。
4.wo2009095278a2涉及交替糖多糖和交替糖寡糖作为酸性食品成分的用途，以及包含交替糖作为成分的酸性食品。该公开还涉及交替糖作为食品制剂中的热稳定成分的用途，以及包含交替糖作为成分的食品，其中该食品在其制造过程中经受加热步骤。
5.wo0047727a2和wo2009095278a2建议通过一种方法生产交替糖-寡糖，其中
6.a)在允许蔗糖转化为交替糖-寡糖和果糖的条件下，使含有蔗糖的溶液与催化有效量的交替糖蔗糖酶和受体分子接触；以及
7.b)从溶液中分离出交替糖-寡糖和果糖。
8.该反应在包含所有离析物的间歇式反应器中进行并且可以在室温至37℃之间以及在ph约4.7至7之间进行，并且反应可以进行直到蔗糖被基本消耗。产品通常以浆料形式获得，可以进一步纯化(即通过膜过滤)和/或干燥。
9.这种方法存在的一个问题是副产物的积累。此外，在制备长链麦芽糖交替糖寡糖时，不能使用目前的方法，因为使用目前的方法不能或几乎不能达到所需的平均链长。
10.发明目的
11.本发明的目的是提供一种生产交替糖-寡糖的替代方法。优选地，该方法最大程度地减少副产物和/或允许更好地去除副产物。


技术实现要素：

12.本发明提供权利要求1所述的方法。
13.本发明提供了一种生产交替糖-寡糖的方法，包括
14.在反应器中使蔗糖与催化有效量的交替糖蔗糖酶和受体分子接触，其中
15.所述交替糖蔗糖酶和受体分子在水性液体中存在于所述反应器中，所述蔗糖连续地或半连续地进料到所述反应器中，并且
16.所述蔗糖和所述受体分子转化为交替糖-寡糖，果糖作为副产物形成；
17.通过膜过滤从所述反应器中连续地或半连续地去除至少一部分的所述果糖。
18.通过本发明，以其一般形式或在特定实施例中，可以达到以下一项或多项益处。
19.可以一直达到低果糖浓度。
20.可以减少或最大限度地减少其他不想要的副产物的形成，例如交替糖聚合物或明串珠菌二糖。
21.果糖不一定是唯一的副产物。其他可能的副产物是交替糖聚合物或明串珠菌二糖，它们也可以被去除，如下文进一步描述。
22.与以前的方法相比，可以生产更长链的交替糖-寡糖。可以通过添加的蔗糖的量来调节链长。
23.本发明提供了一种通过该方法获得的交替糖-寡糖。
24.在说明书中的具体实施例中描述了进一步的益处。
25.详细说明
26.交替糖-寡糖：
27.聚合度(dp)或平均聚合度(即重均聚合度dpw)通过gpc-ri(具有折射率检测的凝胶渗透色谱法)测定或通过替代方法hpaec-pad(高性能阴离子交换具有脉冲安培检测的色谱法)测定。
28.交替糖是由葡萄糖单元组成的糖类，或基本上由葡萄糖单元组成的糖类(在存在包含除葡萄糖或葡萄糖单元以外的结构的受体分子的情况下)。葡萄糖单元通过α-1-3-和α-1-6-糖苷键相互连接，并且这两种类型的键主要交替出现。如果存在包含葡萄糖(一个或多个单元)的受体分子，例如麦芽糖，则这些可以以其他方式连接。交替糖可以包含分支(seymour et al.,carbohydrate research 74,(1979),41-62)。交替糖-多糖和交替糖-寡糖是交替糖的类型，其区别在于它们的聚合度。交替糖-多糖分子可以包含或不包含受体分子，优选地包含受体分子。
29.本发明中的交替糖，特别是交替糖-寡糖，可以定义为基于葡萄糖的糖，其中这种糖具有还原末端和通过交替的α-1-6和α-1-3糖苷键连接的d-葡萄糖单体，其中受体分子(也称为“受体分子单元”，特别是麦芽糖单元)存在于还原末端，或换言之与还原末端连接。
30.交替糖-寡糖分子优选包含一个受体分子。
31.通过本发明的方法生产的本发明的交替糖-寡糖的重均聚合度dpw优选5-30，优选5-25，更优选10-30，或10-20，还更优选10-18或12-18。更优选的dpw范围是18-30或20-30。这些值是通过gpc-ri测量的。实施例部分给出了详细的方法描述。
32.通过本发明的方法生产的本发明的交替糖-寡糖用hpaec-pad测量的平均聚合度dpw优选7-32、12-30、12-20或12-18。实施例部分给出了详细的方法描述。平均聚合度可以大于13、14、15或16(hpaec-pad)。在一些实施方案中，平均聚合度大于17(hpaec-pad)。平均聚合度可以小于20、19或18(hpaec-pad)。
33.上面提到的gpc-ri值和hpaec-pad值是相互独立的。这意味着在比较不同的方法时，上面给出的值和范围不会相互分配。可以生产具有不同dpw的产品，也可以控制dpw，可以用不同的方法测量不同产品的dpw。
34.在本发明中，单数术语“交替糖-寡糖”表示具有仅一种聚合度(dp)的分子的单分散交替糖-寡糖以及具有不同聚合度的分子的多分散交替糖-寡糖。
35.本发明的交替糖-寡糖优选由聚合度(dp)在3-30范围内的交替糖分子组成，或交
寡糖。受体分子可以接受来自蔗糖的葡萄糖单元。
47.可以添加到反应混合物中的受体分子优选是碳水化合物或碳水化合物衍生物。外部受体的使用导致低分子交替糖-寡糖的产生。受体分子可以选自糖或糖醇，其在可以接受来自蔗糖的葡萄糖单元的2、3和6位的碳中的一个或多个处具有自由羟基。碳水化合物受体优选是选自麦芽糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、(异)麦芽三糖和甲基-α-d-葡聚糖的糖类。其他优选的受体分子是葡萄糖、龙胆二糖、棉子糖、蜜二糖、异麦芽糖醇、异麦芽低聚糖、特安德糖(theanderose)、曲二糖、葡糖基海藻糖、纤维二糖、麦芽四糖、黑糖、乳糖、潘糖或它们的混合物。受体分子优选是麦芽糖。
48.取决于所选的特定受体，葡糖基单元通常通过α(1,6)键添加，或者如果α(1,6)键已经存在则通过α(1,3)键添加。该反应通常会产生具有不同聚合度(dp)的低聚糖混合物。
49.在一个实施方案中，术语“受体分子在水性液体中存在于反应器中”是指受体分子溶解、乳化或悬浮在水性液体中，优选溶解。
50.水性液体：
51.本发明中的术语“水性液体”是指包含至少80％体积的水的液体，优选至少90％体积，或至少95％体积。上限为100％体积。优选地，水性液体是水。
52.反应器：
53.反应器可以是罐式反应器。
54.该反应可以在搅拌下进行，例如搅动。在一个实施方案中，反应器是搅拌釜反应器。在另一个实施方案中，可以与前述结合，搅拌是通过移动反应器中的内容物来完成的，优选地通过泵送，优选地通过如本说明书别处所述的泵通过泵循环反应器中的内容物。
55.当进行搅拌(特别是搅动)时：
[0056]-在反应器中使蔗糖与催化有效量的交替糖蔗糖酶和受体分子接触，其中所述交替糖蔗糖酶和受体分子在水性液体中存在于所述反应器中，所述蔗糖连续地或半连续地进料到所述反应器中，
[0057]
在搅拌(特别是搅动)下进行。
[0058]
在另一个实施方案中，去除果糖和/或添加蔗糖会在反应器中引起湍流，从而引起组分的混合。
[0059]
连续地或半连续地添加蔗糖(底物)。
[0060]
关于蔗糖进料的术语“半连续”是指蔗糖进料被中断一次或多次，优选中断一次以上。换言之，“半连续”是指有至少两个进料时间段，优选至少三个进料时间段，或至少四个进料时间段，其中每个进料时间段与随后的进料时间段通过进料中断时间段隔开。蔗糖的进料时间段可以是恒定时间段或非恒定时间段(即时间段的长度可能彼此不同)。进料中断时间段可以是恒定时间段或非恒定时间段。蔗糖的进料时间段和进料中断时间段可以是相同长度的时间段或不同长度的时间段。
[0061]
关于果糖去除的术语“半连续”是指果糖的去除被中断一次或多次，优选多次(超过一次)。换言之，“半连续”是指至少有两个去除(或移除)时间段，优选至少三个去除时间段，或至少四个去除时间段，其中每个去除时间段与随后的去除时间段通过去除中断时间段隔开。果糖去除时间段可以是恒定时间段或非恒定时间段。果糖去除中断时间段可以是恒定时间段或非恒定时间段。果糖去除时间段和果糖去除中断时间段可以是相同长度的时
间段或不同长度的时间段。
[0062]
在半连续操作中，进料蔗糖的时间段和去除果糖的时间段可以相同、重叠或不重叠。在半连续操作的一个实施方案中，当果糖去除被中断时进行蔗糖进料，当进行果糖去除时蔗糖进料被中断。具体而言，这意味着蔗糖进料和果糖去除是交替进行的。
[0063]
蔗糖可以直接或间接进料至反应器。例如，进行直接进料时，蔗糖或蔗糖溶液通过直接终止于反应器或反应器中的进料管添加。例如，进行间接进料时，蔗糖或蔗糖溶液通过终止于与反应器流体连通的另一装置的进料管添加，例如另一管，或另一装置，例如包括在下文中提到的膜的装置，或者可以向包括反应器和包括在下文中提到的膜的装置的反应器系统进料。蔗糖的进料(或供应)不是通过膜进行的。即，在进料蔗糖时，蔗糖不会穿透细胞膜。如果将蔗糖进料到上述包括膜的装置，则蔗糖的进料不穿过装置的膜。即，蔗糖不会穿透装置的膜。所述膜用于膜过滤以去除果糖，让果糖和部分水性液体渗透，但不让蔗糖渗透。
[0064]
在添加蔗糖之前，催化有效量的交替糖蔗糖酶和受体分子存在于反应器中。蔗糖可以作为固体加入，或者优选作为溶液或悬浮液加入，优选在水性液体中加入。提供的蔗糖可以直接被交替糖蔗糖酶转化。
[0065]
在该过程中，生物转化，即交替糖-寡糖的酶促形成，在连续的或半连续的果糖去除下发生。在交替糖-寡糖开始形成之后以及当作为副产物的果糖产生时进行去除。
[0066]
在一个实施方案中，在将蔗糖进料到反应器的同时进行果糖的去除。同时意味着一个或多个蔗糖添加时间段和一个或多个果糖去除时间段至少部分重叠。优选地，至少在添加蔗糖的整个过程中去除果糖。在停止添加蔗糖后或当蔗糖添加结束时，可以继续去除果糖。
[0067]
去除至少一部分果糖与过程中形成的果糖总量(作为副产物)有关。去除至少一部分果糖优选是指等于或大于所生产的总果糖的70mol％，优选等于或大于80mol％，更优选等于或大于90mol％。去除的上限为100mol％。优选地，全部量的产生的果糖(100mol％)或基本上全部量被去除。基本上全部是指等于或大于95mol％。
[0068]
果糖的去除也称为损耗。
[0069]
在一个实施方案中，果糖的去除是通过渗滤进行的。即，膜过滤是渗滤或作为渗滤进行。
[0070]
在本发明的一个实施方案中，去除至少一部分果糖包括：使所述反应器中的内容物连续地或半连续地循环通过包括膜的装置，并且使所述反应器中的内容物与所述膜接触，其中至少一部分的所述果糖和一部分的所述水性液体穿过膜(作为渗透物)，并且将剩余部分(截留物)返回到所述反应器中。
[0071]
关于循环的术语“半连续”是指循环被中断一次或多次，优选多次(超过一次)。换言之，“半连续”是指至少有两个循环时间段，优选至少三个循环时间段，或至少四个循环时间段，其中每个循环时间段与随后的循环时间段通过循环中断时间段隔开。循环时间段可以是恒定时间段或非恒定时间段。循环中断时间段可以是恒定时间段或非恒定时间段。循环时间段和循环中断时间段可以是相同长度的时间段，也可以是不同长度的时间段。
[0072]
在一个具体实施方案中，反应器中的温度在30-45℃或30-40℃的范围内。
[0073]
包括膜的装置可以是膜池，或膜模块或包括膜的过滤池。
[0074]
包括膜的装置与反应器流体连通。反应器的内容物被引导至所述装置并从该装置返回至反应器。但是一部分果糖和一部分水性液体穿过膜(作为渗透物)并且不被引导回反应器。
[0075]
包括膜的装置可以通过适合于输送液体的连接件(例如导管、管道或管线)与反应器连接。反应器出口和装置入口之间可以存在第一连接。装置的出口和反应器入口之间可以存在第二连接。可以存在用于循环反应器内容物的泵。循环反应器的内容物是通过反应器本身和膜装置来完成的。这两者也被称为“反应器系统”——系统包括反应器和包括膜的装置。反应器内容物的循环流动可能导致液相中(特别是在湍流中)的成分混合。
[0076]
在一个实施方案中，从反应器中连续地或半连续地去除至少一部分果糖是通过纳米过滤来完成的。该膜优选为纳米过滤膜。
[0077]
连续地或半连续地循环通过包括膜的装置，使得果糖和水性液体被连续地或半连续地去除。
[0078]
在一个实施方案中，在进行膜过滤去除果糖时施加的压力是5-30巴。温度可以是30-40℃。
[0079]
在另一实施方案中，该方法包括将另外的水性液体连续地或半连续地进料到反应器或包括反应器和包括膜的装置的反应器系统。通过这种措施，可以替换作为渗透物的一部分离开反应器或反应器系统的水性液体。“另外的水性液体”是指在工艺过程中添加到反应器中的水性液体。换言之，另外的水性液体是指除了权利要求1中提到的水性液体之外添加的水性液体。关于进料另外的水性液体的术语“半连续地”是指另外的水性液体进料被中断一次或多次，优选多次(超过一次)。换言之，“半连续”是指至少有两个进料时间段，优选至少三个进料时间段，或至少四个进料时间段，其中每个进料时间段与随后的进料时间段通过进料中断时间段隔开。另外的水性液体的进料时间段可以是恒定的时间段或非恒定的时间段。另外的水性液体的进料中断时间段可以是恒定时间段或非恒定时间段。另外的水性液体的进料时间段和另外的水性液体的进料中断时间段可以是相同长度的时间段或不同长度的时间段。
[0080]
在一个实施方案中，该方法还包括去除作为副产物形成的至少一部分交替糖-多糖和至少一部分交替糖蔗糖酶，这优选通过另外的膜过滤来完成。除了果糖(也是该过程的副产物)之外，交替糖-多糖作为另外的副产物形成。该步骤可选地进行以分离副产物。在膜过滤的情况下，在渗透液中获得交替糖-寡糖。交替糖-多糖和交替糖蔗糖酶包含在渗余物中。在一个实施方案中，这种膜过滤是超滤。该膜优选为超滤膜。在一个实施方案中，在这种膜过滤特别是超滤时施加的压力是2-15巴。该另外的膜过滤时的温度可以是30-60℃。
[0081]
另外的膜过滤(用于去除至少一部分交替糖-多糖和至少一部分交替糖蔗糖酶)可以用另外的包括膜的装置来完成，该膜是另外的膜。
[0082]
在一个实施方案中，该方法还包括：浓缩在去除至少一部分交替糖-多糖之后和在去除至少一部分交替糖蔗糖酶之后获得的产物，其中该产物包含交替糖-寡糖。具体而言，该方法可以还包括浓缩交替糖-寡糖，优选在通过所述另外的膜过滤获得的渗透物中浓缩。
[0083]
在用于去除果糖的膜过滤中，或在任选的另外的膜过滤中(用于去除至少一部分交替糖-多糖和至少一部分交替糖蔗糖酶)，可以使用任何已知或常用材料的膜。非限制性实例是聚酰胺、聚醚砜或聚偏二氟乙烯。
[0084]
在一个实施方案中，该方法还包括干燥所获得的产物。如前所述，浓缩意指产品仍处于液相中。干燥意味着获得固体产品。
[0085]
优选地，干燥在去除作为副产物形成的至少一部分交替糖-多糖和至少一部分交替糖蔗糖酶之后获得的产物。上述浓缩和干燥可以连续进行。
[0086]
经干燥的产品可包含至少65％(w/w)、或至少70％(w/w)、或至少75％(w/w)或至少80％(w/w)的交替糖-寡糖(以干重计)，更具体而言，至少85％(w/w)或至少95％(w/w)。可以与每个下限组合的优选上限是99.0％或99.9％(w/w)。
[0087]
经干燥的产品可包含0.1至15％(w/w)，或0.1至10％(w/w)，或0.1至9％(w/w)，或0.1至8％(w/w)，或0.1至7％(w/w)，或0.1至6％(w/w)，或0.1至5％(w/w)或0.1至3％(w/w)，或0.1至2％(w/w)，或0.1至1％(w/w)，或0.1至0.5％(w/w)的果糖等同物(以干重计)。在一些实施方案中，经干燥的产品包含小于10％(w/w)的果糖等同物(以干重计)。优选地，所述组合物包含少于9％(w/w)、少于8％(w/w)、少于7％(w/w)、少于6％(w/w)、少于5％(w/w)、少于3％(w/w)、少于2％(w/w)、少于1％(w/w)或少于0.5％(w/w)的果糖等同物(以干重计)。
[0088]
在一些实施方案中，所述果糖等同物是明串珠菌二糖、果糖和/或蔗糖。在一些实施方案中，所述果糖等同物是明串珠菌二糖。在一些实施方案中，所述果糖等同物是果糖。在一些实施方案中，所述果糖等同物是蔗糖。在一些实施方案中，所述果糖等同物是明串珠菌二糖和果糖。在一些实施方案中，所述果糖等同物是明串珠菌二糖和蔗糖。在一些实施方案中，所述果糖等同物是果糖和蔗糖。在一些实施方案中，所述果糖等同物是明串珠菌二糖、果糖和蔗糖。
[0089]
作为该方法的副产物的果糖等同物可以在该方法中去除。这已经在上面针对果糖进行了描述。在一个实施方案中，该方法包括通过膜过滤从反应器中连续地或半连续地去除作为副产物形成的至少一部分明串珠菌二糖。膜过滤优选与用于去除果糖的相同。因此，果糖和明串珠菌二糖可以在相同的膜过滤步骤中去除。
[0090]
属于该方法的离析物的果糖等同物可以在该方法中去除。在一个实施方案中，该方法包括通过膜过滤从反应器中连续地或半连续地去除作为未反应的离析物的至少一部分蔗糖。膜过滤可以与用于去除果糖的相同。因此，果糖和蔗糖可以在相同的膜过滤步骤中去除。
[0091]
在该方法的一个实施方案中，交替糖-寡糖的平均聚合度dpw或dpn由进料到反应器的蔗糖的量调节。
[0092]
在另一个实施方案中，当达到交替糖-寡糖的期望平均聚合度dpw或dpn时，停止进料蔗糖。
[0093]
在停止添加蔗糖后，可以继续去除果糖，直到达到或已经达到期望的果糖浓度。
[0094]
可以通过添加的蔗糖的量来调节产生的链长。聚合度可随蔗糖和受体分子的浓度和相对比例而变化。反应产物通常由具有不同聚合度的交替糖寡糖的混合物组成。在相对高的蔗糖：受体比的情况下，更多的葡糖基单元被转移到葡聚糖中并获得具有更高聚合度的产物(即产物中高dp寡糖的相对量将增加)。相反，在低蔗糖：受体比的情况下，主要的反应产物是由单个葡糖基单元转移至受体产生的产物。
[0095]
因此，可以通过改变蔗糖：受体比(也称为蔗糖与受体比)来优化具有期望的聚合度的寡糖的产率。
[0096]
蔗糖：受体分子比是指在该方法中添加的蔗糖总量与该方法中使用的受体分子总量的关系。该比例可以以质量比或摩尔比表示。
[0097]
反应器中的实际比例低于上述比例，因为蔗糖是通过连续地或半连续地进料而不是一次进料，而且进料的蔗糖被消耗。
[0098]
以质量比表示的蔗糖：受体分子比(例如，kg蔗糖：kg受体分子)优选为10:1-30:1，更优选15:1-23:1。优选地，受体分子是麦芽糖，但也可以在该范围内应用其他受体。
[0099]
以摩尔比表示的蔗糖：受体分子比(例如mol蔗糖分子：mol受体分子)优选为10:1-30:1，更优选15:1-23:1，其中受体分子优选是麦芽糖，但也可以在该范围内应用其他受体。
[0100]
优选地，选择蔗糖的进料速率或进料方式(例如连续地或半连续地)使得反应器中的果糖浓度在该方法中不增加或使得果糖不积累。
[0101]
优选地，选择蔗糖的进料速率使得反应器中的蔗糖浓度在该方法中不增加或使得蔗糖不积累。优选地，选择进料速率使得进料的蔗糖在反应中直接消耗。
[0102]
蔗糖的优选进料速率为50-1500g/h，或50-1000g/h，或50-800g/h，或50-500g/h，或50-250g/h h，或50g/h-200g/h，或以mol/h表示的相应速率(蔗糖的摩尔质量342.30g/mol)。蔗糖在溶液或悬浮液中加入时，此比例仅指蔗糖的重量，而不是整个溶液或悬浮液的重量。
[0103]
在该方法的一个实施方案中，将另外的交替糖蔗糖酶进料至反应器，优选连续地或半连续地进料。因此，向反应器中之前存在的交替糖蔗糖酶(权利要求1中提到的交替糖蔗糖酶)添加另外的交替糖蔗糖酶。通过这种措施，可以达到更高的交替糖蔗糖酶总酶活力单位，并且可以减少反应时间。优选地，通过也增加蔗糖量，使蔗糖量适应更高的总酶单位。
[0104]
关于交替糖蔗糖酶进料的术语“半连续”是指酶进料被中断一次或多次，优选中断一次以上。换言之，“半连续”是指有至少两个进料时间段，优选至少三个进料时间段，或至少四个进料时间段，其中每个进料时间段与随后的进料时间段通过进料中断时间段隔开。酶的进料时间段可以是恒定时间段或非恒定时间段(即时间段的长度可以彼此不同)。进料中断时间段可以是恒定时间段或非恒定时间段。酶的进料时间段和进料中断时间段可以是相同长度的时间段或不同长度的时间段。
[0105]
交替糖蔗糖酶：蔗糖(进料蔗糖的总量)的优选比例是1000-10000单位(酶活力)：1000克蔗糖，或1000-7000单位(酶活力)：1000克蔗糖，或1000-5000单位(酶活力)：1000克蔗糖，或1000-2500单位(酶活力)：1000克蔗糖，优选1200-2300单位(酶活力)：1000克蔗糖，更优选1500-2000单位(酶活力)：1000克蔗糖。这些比例与交替糖蔗糖酶的总酶活力单位有关。单位(酶活力)是指该方法中使用的交替糖蔗糖酶的总单位。例如，如果将另外的交替糖蔗糖酶进料至反应器，则(i)开始时存在的交替糖蔗糖酶和(ii)进一步进料至反应器的所有交替糖蔗糖酶的总和是指总单位。
[0106]
采用本文提到的参数，特别有可能达到寡糖优选的dpw或dpn，其中一些在说明书中被提及。
[0107]
与权利要求1的方法相关的反应时间可以取决于所选的蔗糖：受体比、所选的蔗糖进料速率、所选的酶活力和/或所选的蔗糖总量。典型的时间范围是10-150小时，或10-30小时，或10-24小时，或10-20小时。不包括在本文别处提到的另外的工艺步骤，例如通过另外的膜过滤去除作为副产物形成的交替糖-多糖和交替糖蔗糖酶，或浓缩在另外的膜过滤中
获得的截留物。
[0108]
与权利要求1的方法相关的反应温度优选在30-60℃的范围内。在不同的工艺阶段或步骤中可以应用特定的温度范围或不同的温度。
[0109]
在一个实施方案中，连续进料蔗糖，并且蔗糖的进料速率(以每次蔗糖的摩尔量计)等于或基本等于果糖的连续去除速率(以每次果糖的摩尔量计)，或蔗糖的进料速率与果糖的去除速率之比在1.2:1至1:1的范围内。在交替糖-寡糖形成中消耗的每摩尔量的蔗糖产生相同摩尔量的果糖，优选连续地去除所述摩尔量。
[0110]
在下文中，通过实施例来举例说明本发明，这些实施例不应被解释为对如前所述和权利要求中规定的本发明的总体思想的限制。
附图说明
[0111]
图1a示出根据现有技术的方法的示意图；
[0112]
图1b示出本发明方法的示意图；
[0113]
图2a示出现有技术方法的工艺设计；
[0114]
图2b示出本发明方法的工艺设计；
[0115]
图3示出当蔗糖恒定进料时分子量随处理时间增加的走势图。
实施例
[0116]
方法
[0117]
用hpaec-pad测定dp
[0118]
在还原和水解基于葡萄糖的糖后，通过hpaec-pad测量dp值。在40℃下，用在0.5m氨水中的0.2ml的nabh4溶液(40mg/ml)处理2ml含有6g/ml可消化碳水化合物组合物的溶液30分钟。随后还原的样品用0.5ml 2m三氟乙酸水解，在121℃加热1小时以释放单体。对释放的单体进行量化，将样品溶液注入配备carbopac
tm ma1的thermo scientific
tm dionex
tm ics-6000离子色谱系统，并以0.4ml/min加入洗脱液(水和naoh 1000mm)。dp值使用以下公式计算：
[0119][0120]
用gpc-ri测定dp
[0121]
dp值也由gpc-ri测量。用水稀释样品并使用串联连接的2 x tosoh tsk gel g2500pwxl柱在水中进行凝胶渗透色谱分析(0.5ml/min)。寡糖在渗透过程中通过其相对分子量进行分离，并使用折光检测进行量化。分子量定量基于外标法使用342至5000da范围内的标准品(pss-聚合物标准品)。根据dionex说明使用chromeleon extension pack v2.0进行校准和计算。
[0122]
工作实施例
[0123]
实施例1
[0124]
现有技术方法例如从wo 0047727 a2和wo 2009095278 a2已知，并且包括图1a的以下四个步骤p1-p4：
[0125]
在步骤p1中，蔗糖和麦芽糖的生物转化2在间歇式反应器1中在t＝37℃下进行约20小时。蔗糖：麦芽糖比例选择为7:1(w/w或mol/mol)。步骤p1在用于生物转化2的间歇反应器1中完成，如图2a所示。
[0126]
p2是用于去除交替糖聚合物(交替糖多糖)和交替糖蔗糖酶(alsu)的超滤步骤3。该步骤在图2a所示的超滤装置3'中完成。
[0127]
在p3中，通过纳米过滤5去除果糖。该步骤在图2a所示的纳米过滤装置5'中完成。在这里，加入水4'并去除水4”和果糖6的混合物。
[0128]
在最后的步骤p4中，来自p3的产物通过蒸发7进行浓缩。这在图2a中的蒸发装置7'中完成，并获得麦芽糖-交替糖寡糖(maos)8。
[0129]
在一个具体实施方案中，本发明的方法包括三个步骤s1-s3，如图1b所示：
[0130]
与图1a的现有技术方法相比，步骤s1中的生物转化2包括蔗糖9的连续进料10和果糖6的连续去除。半连续进料和去除是可能的。蔗糖9(添加总量)与麦芽糖12的质量比为19:1(每1kg麦芽糖19kg蔗糖)，持续时间约为72小时。现有技术的步骤p3可以省略，因为果糖6在步骤s1中已经被去除。去除果糖6使得可以使用更高的蔗糖9与麦芽糖12之比并达到麦芽糖-交替糖-寡糖8的更高聚合度。
[0131]
步骤s1，生物转化在图2b中的反应器11中进行，其中麦芽糖12和交替糖蔗糖酶(alsu)13存在于水4中。如上所述，生物转化通过蔗糖9的连续进料10、连续去除果糖6来进行，持续约72小时(可变)，t＝37℃，蔗糖：麦芽糖比例为19:1(w/w或mol/mol)。添加蔗糖9作为进料10(溶解在水中)并且搅拌反应器11中的内容物。在反应器11中的生物转化中，包含受体分子麦芽糖的交替糖-寡糖(也称为麦芽糖交替糖寡糖8(maos))，作为主要产物形成，并且交替糖聚合物14、果糖6和明串珠菌二糖15作为副产物形成。来自反应器11的内容物连续循环通过膜池16(渗滤池)，其中在膜过滤17中去除水4”、果糖6和明串珠菌二糖15，在该示例中膜过滤17是纳米过滤，作为定容渗滤进行。与现有技术相比，明串珠菌二糖15的含量从约30％减少到小于10％。去除的水4”由水4'进料流所替代。
[0132]
反应器11和膜池16形成生物转化和纳米过滤装置组合(也称为反应器系统)。
[0133]
本实施例的处理步骤s2对应于现有技术的步骤p2。在此，通过装置3'中的超滤3去除作为副产物的交替糖多糖14(交替糖聚合物)和交替糖蔗糖酶13(alsu)。该步骤在已形成所需的更多交替糖聚合物14的情况下是有益的，或者对于控制剩余的交替糖物质的期望dpw是有益的。
[0134]
本实施例的处理步骤s3对应于现有技术的步骤p4。在此，产物通过装置7'中的蒸发7进行浓缩。
[0135]
生产过程中所用反应溶液的组成如表1所示。2.1l溶液与系统中的水(死体积)共产生约5.6l。该过程在第一个小时内没有损耗地运行，以最大限度地减少麦芽糖跨膜的潜在损失。随后，果糖通过纳米过滤膜filmtec nf270-2540(dow)不断损耗。完成扩链后，将纳米过滤模块替换为trisep 2540-ue50-qxf超滤模块(microdyn nadir)。这将麦芽糖-交替糖寡糖(maos)部分与较长的老化链和酶分开。工艺过程中使用的膜和使用的工艺参数总结在表2中。最终将滤液浓缩至干物质含量》72％。
[0136]
表1：反应溶液的组成
[0137]
成分量进料速率麦芽糖451g分批量蔗糖8500g～100g/h醋酸钠57g分批量交替糖蔗糖酶1900u分批量水ad 2,1l分批量
[0138]
表2：膜和参数
[0139][0140]
图3显示了整个过程中链长的增加。通过gpc-ri测量记录这些值。图3的由mw值计算dpw的关系如下：dpw＝mw/(162da)。因此可以看出，在该过程结束时，达到的dpw大约为15.4(2500/162)。
[0141]
为了达到约15的平均链长dpw，每1kg麦芽糖使用19kg蔗糖(总共)。
[0142]
对比实施例：
[0143]
根据图1a所示的方法制备交替糖-寡糖。使用21:1(kg蔗糖：kg麦芽糖)的比例，得到的dpw为9.9。对于dpw的测量，使用了gpc-ri，但不完全按照上述方法部分中提到的方法方案。然而，与图3的结果相比，表明通过本发明可以获得具有更高dpw的交替糖。
[0144]
通过本发明的方法获得的用hpaec-pad方法分析的两个样品的dpw值总结在下表3中：
[0145]
表3：
[0146][0147]
样品dcc-2和dcc-3是通过本发明的方法生产的。
[0148]
通过gc-ms用部分甲基化的糖醇乙酸酯测量基于葡萄糖的寡糖的糖苷键。简而言之，将样品溶解在无水dmso中，通过添加正丁基锂(sigma 230707)去质子化并用甲基碘(sigma289566)甲基化。随后用2n tfa水解甲基化样品(在121℃下60分钟)。水解样品在氮气气流下蒸发，重新溶解在1m氢氧化铵中，并用含有硼氘化钠(20mg/ml)的dmso溶液还原醛基。逐滴加入冰醋酸以终止反应，并通过加入1-甲基咪唑和乙酸酐进行乙酰化。通过gc-ms(7890a-5975c msd，agilent technologies,inc.，santa clara，ca，usa)定量分析丙酮中部分甲基化的糖醇乙酸酯，使用supelco 24111-u sp-2380毛细管柱(进样器体积0.5μl；进样器温度250℃；检测器温度250℃；载气，氦气：30ml/min；分流比，40:1；温度程序，100℃3
分钟，4℃/min至270℃20分钟)。电子碰撞光谱在50-550da质量范围内以69.9ev获得。
[0149][0150]
1,6-糖苷键的较高值可以通过可消化碳水化合物组合物中的明串珠菌二糖含量来解释，其影响了观察到的1,5,6-三-o-乙酰基-1-氘-2,3,4-三-o-甲基-d-葡萄糖醇的量。此外，明串珠菌二糖以及单体葡萄糖影响了可消化碳水化合物组合物中末端-glc的量。
[0151]
实施例2：
[0152]
在该实施例中，改变参数如下表所示，并将交替糖蔗糖酶分4等份加入反应器，第一部分在蔗糖进料至反应器之前存在。
[0153]
参数1.实验-72h工艺2.实验-24h工艺蔗糖量15.5kg16.5kg进料速率250g/h775g/h酶活力56ku79.2ku温度37℃43℃时间72h27h
[0154]
可以通过增加蔗糖量、增加蔗糖进料速率、提高酶活力和提高温度来减少本发明方法的反应时间(此处不包括另外的工艺步骤，例如通过另外的膜过滤去除交替糖-多糖和交替糖蔗糖酶，或浓缩在另外的膜过滤中获得的截留物)。
[0155]
参考标记列表：
[0156]
p1 批量生物转化
[0157]
p2 超滤
[0158]
p3 纳米过滤
[0159]
p4 浓缩
[0160]
s1 生物转化
[0161]
s2 超滤
[0162]
s3 浓缩
[0163]
1 间歇反应器
[0164]
2 生物转化
[0165]
3 膜过滤，在实施例中：超滤
[0166]3’ꢀ
膜过滤装置，在实施例中：超滤装置
[0167]
4 水性液体，在实施例中：水
[0168]4’ꢀ
水性液体，在实施例中：水
[0169]4”ꢀ
水性液体，在实施例中：水
[0170]
5 纳米过滤
[0171]5’ꢀ
纳米过滤装置
[0172]
6 果糖
[0173]
7 蒸发
[0174]
7' 蒸发装置
[0175]
8 交替糖-寡糖，在实施例中：麦芽糖交替糖寡糖(maos)
[0176]
9 蔗糖
[0177]
10 进料
[0178]
11 反应器
[0179]
12 受体分子，在实施例中：麦芽糖
[0180]
13 交替糖蔗糖酶(alsu)
[0181]
14 交替糖聚合物(交替糖多糖)
[0182]
15 明串珠菌二糖
[0183]
16 包括膜的装置，在实施例中：膜池
[0184]
17 膜过滤；在实施例中：生物转化和纳米过滤(恒体积渗滤)