检测新型冠状病毒的肽段探针及其制备方法和应用与流程

检测新型冠状病毒的肽段探针及其制备方法和应用
发明领域
2.本发明涉及冠状病毒检测技术领域，具体说，本发明具体涉及一种能够检测识别新型冠状病毒蛋白的肽探针技术领域。


背景技术：

3.sars-cov-2 的rna基因组大小约为30 kb，编码4种结构蛋白、16 种非结构蛋白和6 种辅助蛋白，这四种结构蛋白由刺突糖蛋白 (s)、核衣壳蛋白 (n)、膜蛋白 (m) 和包膜蛋白 (e) 组成，这四种蛋白对于sars-cov-2病毒的装配和对外侵袭感染有着至关重要的作用。刺突表面糖蛋白在其与宿主细胞的附着中起着至关重要的作用，并且可以被宿主蛋白酶进一步切割成n端s1亚基和具有膜结合性的c端s2区域，核衣壳蛋白(n)是最丰富的病毒结构蛋白之一，在病毒颗粒、宿主细胞环境中具有多种功能。
4.靶向液相色谱-质谱 (lc-ms) 的技术在广泛的样品基质中具有卓越的特异性和灵敏度，并且可以在蛋白质分析中提供显著的优势，近年来，已应用lc-ms技术流程以解决疫苗开发中不断扩展的一系列属性，其中包括候选蛋白质抗原的识别和定量。蛋白质质谱法是指将质谱法应用于蛋白质的研究，其中蛋白质可以被完整地分析，蛋白质质谱仪对于蛋白质检出量要求极低，可以灵敏的分析出fmol级别的蛋白质。
5.目前新型冠状病毒物体残留检测手段主要依赖于病毒核酸检测，但病毒核酸检测灵敏度与样本中病毒丰度紧密相关，rna在环境样本中不如蛋白质稳定，因此利用肽段序列为标准检测可以提高检出效率及灵敏度。


技术实现要素：

6.本发明提供一种检测新型冠状病毒的肽段探针及其制备方法和应用，主要用于解决针对现有技术中检测新型冠状病毒的方法较少、灵敏度较低的技术问题，从而提高了对疑似且核酸检测阴性样本的检出效率。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明提供的一种新型冠状病毒的肽段探针，包括新型冠状病毒s蛋白检测探针和新型冠状病毒n蛋白检测探针，新型冠状病毒s 蛋白检测探针的序列为fasvyawnr和qiapgqtgk，新型冠状病毒n蛋白检测探针序列为npannaaivlqlpqgttlpk和gpeqtqgnfgdqelir。
8.本发明提供的一种新型冠状病毒的肽段探针的制备方法，包括：筛选或分离重组新型冠状病毒蛋白，从重组新型冠状病毒蛋白中筛选新冠肽段探针，对新型冠状病毒蛋白质谱进行检测分析。
9.具体步骤如下：s1、新冠肽段探针的筛选：将新冠蛋白悬浮在含有 50 mm nh4hco
3 的 0.1% w/vrapigest sf 溶液中，并在56
°
c下在 5 mm 1,4-二硫苏糖醇中还原30分钟；冷却后，通过与 10 mm 碘化乙酰胺在暗室中孵育30分钟来进行烷基化，之后，加入终浓度 5 mm dtt 并
在室温下孵育15分钟；将标记肽与未标记肽按4:1的比例加入溶液中，然后加胰蛋白酶：蛋白质入量比为1:50的测序级修饰胰蛋白酶，胰蛋白酶消化液在37℃孵育过夜消化，消化后，溶液用三氟乙酸酸化并在37
°
c孵育1小时以分解rapigest sf，以13000 g离心10分钟后，将溶液转移到另一管中，真空干燥；s2、nanolc
−
质谱/质谱分析：使用 q-exactive hf 质谱仪与 ultimate 3000 rslcnano 系统进行 dda 实验，将每个样品加载到具有 a 相，0.1% fa 水溶液的捕集柱100 μm
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2 cm，填充 reprosil-pur c18-aq，3 μm，在 c18 柱（75 μm
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12 cm，填充 reprosil-pur c18-aq，3 μm）上以 300 nl/min 的流速和 4% 至 40% b 相，即0.1% fa 的 80% 乙腈溶液9 分钟，40% 至 90% b 相 5 分钟，90% b 相 5 分钟，质谱仪在正离子化模式下运行，母体 ms 扫描分辨率为 30000，agc 目标为 3
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106，最大进样时间为 100 ms；前 20 种方法用于在 ms 和 ms/ms 扫描之间自动切换，dda原始文件通过 proteome discoverer 2.2分析：选择胰蛋白酶作为消化酶，最大遗漏裂解位点为 2，前体质量耐受性为 10 ppm，片段质量耐受性为 0.02 da，氨基甲酰甲基化半胱氨酸处设置为静态修饰，蛋氨酸处的氧化设置为动态修饰，使用基于过滤器的过滤结果为fdr 《 1%。
10.s3、平行反应监测：使用配备 ultimate 3000 lc 系统的 q-exactive hf 质谱仪分析 prm，将每个样品加载到具有 a 相0.1% fa 水溶液的捕集柱上，捕集柱为100 μm
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2 cm、填充 reprosil-pur c18-aq、3 μm，肽分离在 c18 柱上进行，流速为 300 nl/min，梯度为 4% 至 40% b 相，即0.1% fa 乙腈溶液9 分钟，40% 至 90% b 相 5 分钟，90% b 相 5 分钟，以 30000 的分辨率、3
×
10
6 的 agc 目标和 100 ms 的最大进样时间执行全扫描， prm 扫描的分辨率为 30,000，隔离宽度为 1.0 m/z，agc 目标为 5
×
105，最大注入时间为 500 ms，hcd单元中的归一化碰撞能量为 27%，并记录， prm 数据每天使用 skyline（64位）进行分析，根据保留时间、离子对和 ms/ms 谱图手动检查峰值，每个肽段至少要经历5次转换，最终得到含有4种 13c标记的肽标准品。
11.本发明s1步骤中使用的重组新冠蛋白可以通过如下步骤分离获得，或者购买商品化的重组蛋白：s1、选择大肠杆菌，将大肠杆菌细胞在luria-bertani肉汤培养基中于 37
°
c 下稳定生长，同时将终浓度为50
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g/ml的卡那霉素添加到细菌培养基中，培养的大肠杆菌dh5a和bl21-gold 分别用制备质粒dna和蛋白质生产的宿主细胞，得到携带有pet28a-sars-cov-2-s1-his6和pet28a-sars-cov-2-n-his6的大肠杆菌 bl21-gold；s2、sars-cov-2-s1-his
6 和 sars-cov-2-n-his
6 蛋白的分离：携带有pet28a-sars-cov-2-s1-his6和pet28a-sars-cov-2-n-his6的大肠杆菌 bl21-gold 在 37
°
c 振荡下在500 ml lb培养基稳定生长至od600 值为0.5；然后加入iptg，终浓度为0.5 mm，将细菌培养2小时；收获细胞后，用 pbs 洗涤一次，重新悬浮在10 ml pbs 中，并通过超声破碎处理；通过与his-select ni-nta-sefinose柱混合，将全细胞裂解物用sars-cov-2-s1-his
6 和 sars-cov-2-n-his
6 纯化，用洗脱缓冲液洗脱柱，10%分离凝胶中进行sds-page分析以排除分子量，得到纯化的sars-cov-2-s1-his6和 sars-cov-2-n-his
6 蛋白样品，重组新型冠状病毒蛋白。
12.本发明提供的上述新型冠状病毒的肽段探针用于检测环境中新型冠状病毒的方法，具体步骤为：
s1、采集环境样品：将 500 μl 环境样品溶液加入 nh4hco
3 和 1,4-二硫苏糖醇至终浓度分别为 50 mm 和 5 mm，并加热至 95℃，5 分钟，冷却后，通过与 10 mm 碘化乙酰胺 (iaa) 在暗室中孵育30分钟来进行烷基化，然后，加入终浓度 5 mm dtt 并在室温下孵育15分钟，添加测序级修饰胰蛋白酶至终浓度为0.01 μg/μl，胰蛋白酶消化液在 37℃孵育过夜，消化后，溶液用三氟乙酸酸化并真空干燥，将干粉溶解在 250 μl 的 h2o、0.1% fa 中，然后与等体积的靶向病毒肽混合。
13.s2、环境样本的检测：将含有4种 13c标记肽标准品，即序列为fasvyawnr和qiapgqtgk的新型冠状病毒s 蛋白检测探针，序列为npannaaivlqlpqgttlpk和gpeqtqgnfgdqelir的新型冠状病毒n蛋白检测探针加入环境样品中，目标肽鉴定的质量标准是标记和未标记肽之间的保留时间差异以及skyline中的点积分数，保留时间差异≤0.1 min，阳性结果的标准设置为点积分数值≥0.9，最终模拟病毒在消化后加入肽反应，从 0.1 fmol 到 100 fmol 柱上评估，在不同环境样品中一式三份地分析样品，一次包含预柱与柱平衡、进样、肽段分离的运作在30分钟内完成，采集窗口为20分钟，用于快速检测和后续定量。
14.s3、数据分析：将prm 结果导入 skyline 以进行靶向提取离子色谱图分析，对于每个目标肽，根据碎片离子强度、信噪比的视觉测定以及天然和重标记肽信号的共洗脱，选择了五个碎片离子跃迁，在优化的 prm 方法中，每个蛋白质的一个肽序列用于绝对定量，第二个用于确认身份和特异性。
15.本发明中，洗脱缓冲液为50 mm nah2po4，ph 8.0、300 mm nacl 和 100 mm咪唑。
16.本发明中，sars-cov-2-s1-his
6 和 sars-cov-2-n-his
6 蛋白的分离步骤中，使用 (cbb)r-250染色 sars-cov-2-s1-his6和 sars-cov-2-n-his6 sds-page胶电泳样品，并根据预染色蛋白质标准进行比较分子量鉴定。
17.采集环境样品步骤中，采集样品的环境包括电梯按钮、门把手、电脑鼠标按键、水龙头、水槽，用湿的无菌聚酯棉签擦拭环境表面，然后将拭子浸入 1 ml pbs 溶液中，得到环境样品。
18.本发明中，ms/ms 谱是在归一化碰撞能量为 27、分辨率为 15, 000、agc 目标为 1
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105、最大进样时间为 100 ms、隔离宽度为 1.6 m 的高能碰撞解离 (hcd) 后获得的/z。
19.本发明中，c18 柱为75 μm
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12 cm，填充 reprosil-pur c18-aq，3 μm。
20.本发明中，参考 ms/ms 光谱的光谱库是从 dda 采集生成的数据集中获得的。
21.进一步的，本发明提供上述一种新型冠状病毒的肽段检测探针在新型冠状病毒蛋白的识别、筛选、检测中应用。
22.通过实施本发明提供的技术方案可以达到以下有益效果：(1)本发明通过从新型冠状病毒蛋白中筛选新冠肽段探针，对新型冠状病毒蛋白质谱进行检测分析，得到序列为fasvyawnr和qiapgqtgk的新型冠状病毒s 蛋白检测探针、序列为npannaaivlqlpqgttlpk和gpeqtqgnfgdqelir的新型冠状病毒n蛋白检测探针，并将其应用到检测环境中新型冠状病毒的方法中，解决了现有技术中检测新型冠状病毒的方法较少、rna稳定性差、发挥了蛋白质相对稳定等特点。
23.(2)本发明提供的一种新型冠状病毒的肽段探针及其制备方法和应用，对于现行
2-n-his
6 蛋白样品，即新型冠状病毒蛋白。其次，从新型冠状病毒蛋白中筛选新冠肽段探针，具体步骤如下：s1、新冠肽段探针的筛选：将上述步骤得到的新冠蛋白悬浮在含有 50 mm nh4hco
3 的 0.1% w/vrapigest sf 溶液中，并在56
°
c下在 5 mm 1,4-二硫苏糖醇中还原30分钟；冷却后，通过与 10 mm 碘化乙酰胺在暗室中孵育30分钟来进行烷基化，之后，加入终浓度 5 mm dtt 并在室温下孵育15分钟；将标记肽与未标记肽按4:1的比例加入溶液中，然后加胰蛋白酶：蛋白质入量比为1:50的测序级修饰胰蛋白酶，胰蛋白酶消化液在37℃孵育过夜消化，消化后，溶液用三氟乙酸酸化并在37
°
c孵育1小时以分解rapigest sf，以13000 g离心10分钟后，将溶液转移到另一管中，真空干燥；s2、nanolc
−
质谱/质谱分析：使用 q-exactive hf 质谱仪与 ultimate 3000 rslcnano 系统（thermo fisher scientific，美国）进行 dda 实验。将每个样品加载到具有 a 相（0.1% fa 水溶液）的捕集柱（100 μm
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2 cm，填充 reprosil-pur c18-aq，3 μm）上。在 c18 柱（75 μm
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12 cm，填充 reprosil-pur c18-aq，3 μm）上以 300 nl/min 的流速和 4% 至 40% b 相（0.1% fa 的 80% 乙腈溶液）9 分钟，40% 至 90% b 相 5 分钟，90% b 相 5 分钟。质谱仪在正离子化模式下运行，母体 ms 扫描分辨率为 30, 000，agc 目标为 3
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106，最大进样时间为 100 ms。前 20 种方法用于在 ms 和 ms/ms 扫描之间自动切换。 ms/ms 谱是在归一化碰撞能量为 27、分辨率为 15 000、agc 目标为 1
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105、最大进样时间为 100 ms、隔离宽度为 1.6 m 的高能碰撞解离 (hcd) 后获得的/z。 dda 原始文件通过 proteome discoverer (pd) 2.2 (thermo fisher scientific, usa) 分析：选择胰蛋白酶作为消化酶，最大遗漏裂解位点为 2，前体质量耐受性为 10 ppm，片段质量耐受性为 0.02 da，氨基甲酰甲基化半胱氨酸处设置为静态修饰，蛋氨酸处的氧化设置为动态修饰，使用基于过滤器的过滤结果为fdr 《 1%。
31.s3、平行反应监测：使用配备 ultimate 3000 lc 系统的 q-exactive hf 质谱仪（thermo fisher scientific，美国）分析 prm。将每个样品加载到具有 a 相（0.1% fa 水溶液）的捕集柱（100 μm
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2 cm，填充 reprosil-pur c18-aq，3 μm）上。肽分离在 c18 柱（75 μm
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12 cm，填充 reprosil-pur c18-aq，3 μm）上进行，流速为 300 nl/min，梯度为 4% 至 40% b 相（0.1% fa 乙腈溶液）9 分钟，40% 至 90% b 相 5 分钟，90% b 相 5 分钟。以 30000 的分辨率、3
×
10
6 的 agc 目标和 100 ms 的最大进样时间执行全扫描。 prm 扫描的分辨率为 30000，隔离宽度为 1.0 m/z，agc 目标为 5
×
105，最大注入时间为 500 ms，hcd单元中的归一化碰撞能量为 27%，并记录。 prm 数据每天使用 skyline（64 位）19.1.9.350 进行分析。参考 ms/ms 光谱的光谱库是从 dda 采集生成的数据集中获得的。根据保留时间、离子对和 ms/ms 谱图手动检查峰值。每个肽段至少要经历5次转换，最终得到含有两种 13c 15n 标记残留物的肽标准品。
32.本发明采用标准驱动策略来识别候选序列，作为靶向 nanolc-ms/ms 分析的替代肽，理想情况下，目标肽（通常为 5-25 个氨基酸）对于sars-cov-2 蛋白应该是独一无二的，并且应选自研究蛋白段的不同区域，为了选择 prm 定量的最佳候选肽，重组 sars-cov-2 s1 蛋白和 sars-cov-2-n 蛋白用胰蛋白酶消化，并在 orbitrap 仪器（q exactive hf-x 混合）使用 dda，对于s1蛋白，检测到覆盖78.04%蛋白的肽段，对于n蛋白，经胰蛋白酶消化后，达到64.99%的覆盖率。
33.根据 s1 和 n 蛋白的靶向序列合成重标记， c 端的赖氨酸和精氨酸分别被 d8-赖氨酸和 d10-精氨酸取代，由于未标记肽和标记肽之间几乎没有化学差异，因此它们在反相 lc 系统中的色谱行为表现出高度的一致性，添加过量的标记肽以获得用于检测未标记肽的强而稳定的内部标准。
34.s1 蛋白的靶向肽 fasvyawnr 和 qiapgqtgk 以及 n 蛋白的npannaaivlqlpqgttlpk 和 gpeqtqgnfgdqelir 选择遵循以下标准： (1) 高强度； (2) 特异性； (3) 无修改； (4) 没有遗漏的切割位点。
35.基于这种广泛的序列覆盖和肽反应，我们研发了一系列用于后续 prm 分析的胰蛋白酶肽靶点，并且通过 ncbi blast 分析获得的肽以选择对 sars-cov-2 具有特异性的肽。经过大量实验筛选并进行优化，本实施例获得了一种新型冠状病毒的肽段探针，包括新型冠状病毒s蛋白检测探针和新型冠状病毒n蛋白检测探针，新型冠状病毒s 蛋白检测探针的序列为fasvyawnr和qiapgqtgk，新型冠状病毒n蛋白检测探针序列为npannaaivlqlpqgttlpk和gpeqtqgnfgdqelir，表1 碎片离子在s1和n多肽分析应用中的nanolc-ms/ms (prm)转移参数（加粗的字母表示含有重型同位素标记的氨基酸）。
36.实施例二：一种新型冠状病毒的肽段探针的应用本发明获得的新型冠状病毒的肽段探针可应用在识别、筛选、检测新型冠状病毒和制备药物载体以及在药物分离纯化中，本实施例提供新型冠状病毒的肽段探针用于检测环境中新型冠状病毒的方法，具体步骤为：s1、环境样品的收集和制备：从五个环境站点采集样品：1）电梯按钮；2）门把手；3）电脑鼠标按键；4) 水龙头；5) 水槽。被测试表面用湿的无菌聚酯棉签擦拭。然后将拭子浸入 1 ml pbs 溶液中。将 500 μl 环境样品溶液加入 nh4hco
3 和 1,4-二硫苏糖醇 (dtt) 至终浓度分别为 50 mm 和 5 mm，并加热至 95℃ 5 min。冷却后，通过与 10 mm 碘化乙酰胺 (iaa) 在暗室中孵育30分钟来进行烷基化。然后，加入终浓度 5 mm dtt 并在室温下孵育15分钟。添加测序级修
饰胰蛋白酶至终浓度为0.01 μg/μl。胰蛋白酶消化液在 37℃孵育过夜。消化后，溶液用三氟乙酸酸化并真空干燥。将干粉溶解在 250 μl 的 h2o、0.1% fa 中，然后与等体积的靶向病毒肽混合。
37.s2、环境样本的检测：应用优化的 prm 方法，使用模拟病毒和肽标准来评估不同环境样品中病毒污染的检测限。将含有两种 13c 15n 标记残留物的肽标准品，即序列为fasvyawnr和qiapgqtgk的新型冠状病毒s 蛋白检测探针，序列为npannaaivlqlpqgttlpk和gpeqtqgnfgdqelir的新型冠状病毒n蛋白检测探针加入环境样品中，目标肽鉴定的质量标准是标记和未标记肽之间的保留时间差异以及skyline中的点积分数 (dopt)。保留时间差异≤0.1 min，这在保留时间变化明显时很重要。 dopt 的值提供了测量的生产峰面积与库光谱中的峰面积之间的相关性分数。在我们的实验中，阳性结果的标准设置为dopt值≥0.9，这对质量分析是非常严谨的。这两个标准可以验证方法的准确性并避免出现误报。最终模拟病毒在消化后加入肽反应，从 0.1 fmol 到 100 fmol 柱上评估。在不同环境样品中一式三份地分析样品。一次包含预柱与柱平衡、进样、肽段分离的运作在30分钟内完成，采集窗口为20分钟，用于快速检测和后续定量。
38.s3、数据分析：将prm 结果导入 skyline (v4.1) 以进行靶向提取离子色谱图 (xic) 分析。对于每个目标肽，根据碎片离子强度、信噪比的视觉测定以及天然和重标记肽信号的共洗脱，选择了五个碎片离子跃迁。在优化的 prm 方法中，每个蛋白质的一个肽序列用于绝对定量，第二个用于确认身份和特异性。
39.本实施例提供的用于检测环境中新型冠状病毒的方法，具有高特异性、实施例三：效果验证试验本发明应用优化的 prm 方法，重肽标准品用于评估模拟病毒污染在不同环境样品中的检测限值，用于测量五种不同环境样品中的病毒水平以优化 nanolc-prm 方法，将模拟病毒肽组与背景基质混合至终浓度为 0.1 fmol/μl、1 fmol/μl、10 fmol/μl 和 100 fmol/μl。然后使用 prm 方法将五组 15 个样品中的 5 μl 输送到 lc-ms/ms 系统。
40.表2 使用s1蛋白和n蛋白的标准多肽检测sars cov-2在环境中的残留。
41. 检测阳性 ,
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检测阴性 .由表2可知，对于s1，经fasvyawnr 和 qiapgqtgk 用于确认， fasvyawnr 在浓度为 1 fmol/μl 的五个环境样品中的其中两个测得最低，而 qiapgqtgk 在浓度为 1 fmol/μl 的所有的五个环境样品中均测得的最低。对于n，则使用npannaaivlqlpqgttlpk和gpeqtqgnfgdqelir 来进行确认。 npannaaivlqlpqgttlpk 在浓度为 10 fmol/μl 的五个环境样品中的其中三个测得最低，而 gpeqtqgnfgdqelir 在浓度为 10 fmol/μl 时在所有
五个环境样品中均测得的最低。
42.综上所述，本发明应用蛋白质质谱技术高效检测环境样本中新型冠状病毒，主要检测出新冠状病毒肺炎低含量特异性毒蛋白，为核酸检测可能因为标本含量过少而漏检者提高检测灵敏度。
43.如上所述，即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。