一种麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的引物探针组合物和检测试剂盒的制作方法

1.本发明涉及病毒核酸检测技术领域，特别是指一种麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的引物探针组合物和检测试剂盒。


背景技术：

2.急性脑膜炎/脑炎症候群(acute meningitis/encephalitis syndrome,ames)是一种主要由病毒、细菌、立克次体、螺旋体、真菌、寄生虫等病原体感染引起以中枢神经系统损害为主的疾病，多发于儿童，该病严重影响公共卫生安全。麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒是与病毒性脑炎密切相关的rna病毒。
3.针对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒感染的诊断主要采取酶联免疫吸附试验、血凝抑制试验、乳胶凝集试验和免疫荧光试验等血清学诊断方法。由于抗体在病毒感染后，需经过2周左右才能达到高峰，因而仅靠血清学检查难以实现对感染类型的早期临床诊断。研究表明，由于缺乏高灵敏度、特异性的诊断方法，麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒误诊率较高。我国很多地区已将麻疹-腮腺炎-风疹联合疫苗(mmr)纳入扩大国家免疫规划，病毒疫苗接种产生的免疫成功率较高，但病毒的感染率并未降低，在一些地区仍呈现上升趋势。这与病毒抗原基因变异导致疫苗对流行毒株保护性下降有关。
4.由于缺乏高灵敏度、特异性的诊断方法，导致麻疹、风疹及腮腺炎的预防诊断不及时，此外，由于风疹病毒感染的临床症状与麻疹十分相似，常常被误诊为麻疹，这在疾病暴发流行及应急接种时，影响传染病的控制。荧光定量pcr技术因其具有高灵敏度和高特异性，在遗传疾病的诊断、临床标本中病原体核酸的检测、激活癌基因中突变情况的分析、法医学上的遗传学鉴定以及分子克隆诸多方面得到越来越广泛的应用。
5.目前，国内已有多种基于荧光定量pcr技术的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的核酸检测试剂盒应用于临床检测中。获得国家药品监督管理局注册证的核酸诊断产品中，目前市场上仅有风疹、麻疹和风疹双检试剂等少数几家公司产品，而腮腺炎病毒核酸检测试剂盒以及麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒同时检测的三重检测试剂盒基本没有。因此，开发一款同时检测麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的三重检测试剂盒是目前急待解决的技术问题。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题，就是提出一种麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的引物探针组合物和检测试剂盒，各病原引物和探针对目标基因的检测特异性强，且检测灵敏度高。
7.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
8.一种麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的引物探针组合物，其特征在于，包括用于检测麻疹病毒和/或风疹病毒和/或腮腺炎病毒核酸的引物探针，其中，
9.(1)用于检测麻疹病毒的引物和探针为：
10.正向引物：5
’‑
cagggagtgtcttcaacgcaaa-3’(seq id no：1)
11.反向引物：5
’‑
gccactgcattgacygatct-3’(seq id no：2)
12.探针：5
’‑
荧光报告基团-acaacacggaacctctgcggggtatc(seq id no：3)-荧光淬灭基团-3’13.(2)用于检测风疹病毒的引物和探针为：
14.正向引物：5
’‑
aacacgccgcacggacaa-3’(seq id no：4)
15.反向引物：5
’‑
cgggactgytgrttgccggt-3’(seq id no：5)
16.探针：5
’‑
荧光报告基团-tccaggtcccgcccgacccc(seq id no：6)-荧光淬灭基团-3’17.(3)用于检测腮腺炎病毒的引物和探针为：
18.正向引物：5
’‑
tatggtcatctgggtgtgaaat-3’(seq id no：7)
19.反向引物：5
’‑
tccaggatacwccyttgtagttgg-3’(seq id no：8)
20.探针：5
’‑
荧光报告基团-caaggctgccagtgctatcctccagg(seq id no：9)-荧光淬灭基团-3’21.(4)用于检测内标gapdh基因的引物和探针为：
22.正向引物：5
’‑
caacggatttggtcgtat-3’(seq id no：10)
23.反向引物：5
’‑
gatggcaacaatatccact-3’(seq id no：11)
24.探针：5
’‑
荧光报告基团-accagggctgcttttaactct(seq id no：12)-荧光淬灭基团-3’。
25.上述用于检测4种不同靶基因的探针含有的荧光报告基团各不相同且互不干扰。在本发明中，“各不相同且互不干扰”是指组合物中所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用fam、rox、hex和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
26.在一个具体的实施方案中，分别选用fam、rox、cy5荧光报告基团检测麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒，选用vic荧光报告基团检测内标gapdh基因。各探针中含有的荧光淬灭基团为bhq-1或bhq-2或bhq3。上述组合物中上下游引物的用量为300～600nm；所述组合物中探针的用量为120～240nm。
27.本发明还提供了上述麻疹、风疹、腮腺炎病毒和内标gapdh核酸联合检测引物与探针组合在制备多种病毒核酸联合检测试剂盒中的应用。经过测试，本试剂盒对用于检测靶基因的引物和探针使用浓度和用量进行了优化调整，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为300～600nm，用于检测靶基因的探针使用浓度为120～240nm。
28.所述联合检测试剂盒还包括pcr缓冲液、酶混合液、阴性对照和阳性对照。所述pcr缓冲液组成为：28mol/l ph8.0 tris-hcl，20mmol/l(nh4)2so4，30mmol/l kc1，4.0mmol/lmgcl2，0.2mol/l dntps。所述酶混合液包括热启动taq酶、逆转录酶，其中热启动taq酶的用量为3～8u/人份，逆转录酶的用量为2～5u/人份。所述阳性对照：麻疹、风疹、腮腺炎病毒和内标gapdh重组质粒，浓度为1.0
×
105copies/ml。所述阴性对照为生理盐水。
29.本发明提供的试剂盒检测灵敏度高、特异性强、重复性好，可以对临床样本实现快速鉴别诊断，使得不同患者得到及时针对性治疗。
30.本发明利用多重实时荧光pcr检测技术，针对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒基因高度保守区域分别设计特异性引物和荧光探针，通过组合筛选搭配，筛选出最佳组合并进行体系优化，实现对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的同时检测。在检测中设置了内对照(内标)，内标选用的是人gapdh蛋白基因作为内源性内标，通过检测内标是否正常来监测监控样本采集，提取及检测整个实验流程，避免假阴性出现。本发明针对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒同时进行多重实时荧光pcr检测分析，对麻疹、风疹及流行性腮腺炎的临床检测及预防诊断有积极作用。本发明可以对临床样本实现快速鉴别诊断，使得不同患者得到及时针对性预防和治疗。
附图说明
31.图1：麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒特异性检测结果；
32.图2：不同浓度麻疹病毒质控品检测结果；
33.图3：不同浓度风疹病毒质控品检测结果；
34.图4：不同浓度腮腺炎病毒质控品检测结果；
35.图5：不同浓度内标基因质控品检测结果；
36.图6：麻疹病毒精密度参考品检测结果；
37.图7：风疹病毒精密度参考品检测结果；
38.图8：腮腺炎病毒精密度参考品检测结果；
39.图9：内标基因精密度参考品检测结果；
40.图10：麻疹病毒临床样本检测结果；
41.图11：风疹病毒临床样本检测结果；
42.图12：腮腺炎病毒临床样本检测结果；
43.图13：临床样本内标基因检测结果；
44.图14：麻疹病毒引物探针组合3单重检测不同样本扩增结果；
45.图15：风疹病毒引物探针组合2多重检测空白测试扩增结果；
46.图16：腮腺炎病毒引物探针组合2单重检测不同样本扩增结果。
具体实施方式
47.为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。
48.本发明的实施例中，麻疹病毒引物和探针、风疹病毒引物和探针、腮腺炎病毒引物和探针、内标gapdh引物和探针、麻疹病毒质粒质控品、风疹病毒质粒质控品、腮腺炎病毒质粒质控品及内源性内标gapdh基因质粒质控品均由湖州河马生物科技有限公司合成。
49.实施例1
50.本实施例为麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测引物探针组合和试剂盒制备及操作方法。
51.病毒核酸多重检测的引物与探针组合物：
52.表1引物和探针组合表
[0053][0054]
分别选用fam、rox、cy5、vic荧光报告基团检测麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒和内标gapdh基因。各探针中含有的荧光淬灭基团为bhq-1或bhq-2或bhq3。
[0055]
本实施例中，内标选用的是人gapdh基因作为内源性内标，监控样本采集，提取及检测整个实验流程，避免假阴性出现。
[0056]
检测试剂盒的制备：
[0057]
麻疹、风疹、腮腺炎病毒核酸检测的多重rt-qpcr试剂盒，该试剂盒中包含有rt-qpcr反应液、rt-qpcr酶系、阳性对照以及阴性对照，试剂盒主要组成成分见表2。其中rt-qpcr反应液的试剂组成如表3所示。
[0058]
表2试剂盒主要组成成分
[0059][0060]
表3 rt-qpcr反应液的试剂组成
[0061]
名称每一个反应中体积/浓度pcr缓冲液12.5μlseq id no：1300nmseq id no：2300nmseq id no：360nmseq id no：4600nmseq id no：5600nmseq id no：650nm
seq id no：7300nmseq id no：8300nmseq id no：960nmseq id no：10600nmseq id no：11600nmseq id no：1260nmrnase free h2o6.5μl
[0062]
经过相应的检测体系优化探索，建立了如下检测体系：每管pcr加入20μl rt-pcr反应液，0.2μl rt-pcr酶系，并加入5μl模板rna，即总体积25μl，rt-pcr检测体系具体包括：
[0063]
(1)20μl rt-pcr反应液，扩增液包括pcr缓冲液12.5μl、引物探针组合物1μl、rnase-free h2o 6.5μl；pcr缓冲液的组成为：28mol/l ph8.0 tris-hcl，20mmol/l(nh4)2so4，30mmol/l kc1，4.0mmol/l mgcl2，0.2mol/l dntps；
[0064]
(2)0.2μl rt-pcr酶系，包括热启动taq酶5u、逆转录酶5u；
[0065]
(3)5μl模板核酸rna。
[0066]
检测试剂盒的操作方法：
[0067]
1.核酸提取：
[0068]
可使用商业化试剂盒提取rna，提取的rna于-20℃下保存，长期保存最好于-80℃条件下保存。
[0069]
注：阴性对照需要进行核酸提取，阳性对照不需要进行核酸提取。
[0070]
2.试剂配制
[0071]
(1)将试剂取出，室温融化，使用前漩涡混匀15s，手掌离心机离心15s。
[0072]
(2)确定反应数n，n＝阴性对照(1) 阳性对照(1) 待检样本数 1，按rt-qpcr反应液20μl
×
n，反转录酶0.2μl
×
n，用量计算加到反应体系中的各个试剂的量。
[0073]
(3)取1.5ml无rnase的离心管配制反应体系，试剂全部加入后吹打5～10次混匀，手掌离心机离心15s。
[0074]
(4)将上述混合液20μl每管分装至pcr反应管。
[0075]
3.加样
[0076]
取待检样本、阴性对照抽提物和阳性对照各5μl分别加入pcr反应管中，手掌离心机离心15s将管。
[0077]
壁上的液体甩到管底，如有气泡轻弹管壁消除气泡，再次离心，然后进行pcr反应。
[0078]
4.rt-pcr扩增：
[0079]
将反应管置于全自动荧光pcr检测仪中，参照仪器操作说明设定阴性对照、阳性对照、待检样本参数。
[0080]
进行pcr反应，记录好样本摆放顺序。
[0081]
rt-qpcr扩增程序和荧光检测通道的设定如表4所示。
[0082]
表4 rt-qpcr扩增程序
[0083][0084]
在步骤4中55℃时收集荧光，检测通道为fam(该通道指示麻疹病毒检测情况)、rox(该通道指示风疹病毒检测情况)、cy5(该通道指示腮腺炎病毒检测情况)和vic(该通道指示内标基因检测情况)。
[0085]
5.结果分析
[0086]
综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(threshold)和基线(baseline)，使仪器给出正确的结果。
[0087]
6.质量控制
[0088]
阴性对照：fam、rox、cy5以及vic检测通道均无明显扩增曲线。
[0089]
阳性对照：fam、rox、cy5以及vic检测通道均有明显扩增曲线，ct值≤30.00。
[0090]
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新进行。
[0091]
检验结果的解释：
[0092]
通过参考值的研究确定本试剂盒fam、rox以及cy5检测通道的ct阳性判断值均为38.00。vic检测通道ct阳性判断值为40.00。
[0093]
在经过多重rt-qpcr扩增后，若fam检测通道样本检测结果ct值≤38.00，且扩增曲线呈典型s型，则判定该样本检测结果为麻疹病毒阳性。若样本检测结果ct值》38.00或无ct值，则判定该样本为麻疹病毒阴性。
[0094]
若rox检测通道样本检测结果ct值≤38.00，且扩增曲线呈典型s型，则判定该样本检测结果为风疹病毒阳性。若样本检测结果ct值》38.00或无ct值，则判定该样本为风疹病毒阴性。
[0095]
若cy5检测通道样本检测结果ct值≤38.00，且扩增曲线呈典型s型，则判定该样本检测结果为腮腺炎病毒阳性。若样本检测结果ct值》38.0或无ct值，则判定该样本为腮腺炎病毒阴性。
[0096]
对于以上各通道为阳性的样本，vic检测通道内标gapdh检测结果不作要求；对于以上各通道为阴性的样本，其内标检测应为阳性(ct值≤40.00)，若其内标ct值》40.00或无显示，则该样本的检测结果无效，须进行重复实验。
[0097]
实施例2
[0098]
本实施例为麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒特异性测试
[0099]
按照实施例1中的试剂盒制备与操作方法进行测试，分别对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒a16型、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体等病原体样本进行交叉反应验证。经测试，结果中仅有麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒阳性对照正常检出，其他病原体检测结果均为阴性(结果参见图1)。表明本发明的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒与上述病原体无交叉反应，可用于麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的特异性鉴定检测。
[0100]
实施例3
[0101]
本实施例为麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒灵敏度测试
[0102]
按照实施例1中的试剂盒制备与操作方法进行测试，采用麻疹病毒质粒质控品、风疹病毒质粒质控品、腮腺炎病毒质粒质控品及内源性内标gapdh基因质粒质控品进行引物探针组合测试，将质粒质控品分别10倍梯度进行稀释，得到从1
×
103～1
×
10
10
copies/ml共8个稀释度的阳性质粒作为标准模版。根据实施例1表3配制的反应体系进行测试，根据实施例1表4所示反应程序进行多重rt-qpcr反应，获得不同荧光检测通道荧光扩增曲线(结果参见图2～图5)，不同荧光通道检测结果ct值统计结果见表5。
[0103]
表5不同病原检测结果ct值统计
[0104][0105]
根据扩增检测结果，本发明的试剂盒对麻疹、风疹、腮腺炎病毒和内标gapdh基因核酸进行扩增获得的荧光扩增曲线均呈典型的s型曲线，且在不同浓度下获得的各荧光扩增曲线间距均匀，具有良好的相关性。同时，通过对四个荧光通道的灵敏度进行重复性验证，四个荧光通道的最低检出限均为1
×
103copies/ml，且四个荧光通道的扩增效率相近，引物间相互干扰少，试剂盒性能稳定。
[0106]
实施例4
[0107]
本实施例为麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒精密度测试
[0108]
分别将麻疹病毒质粒质控品、风疹病毒质粒质控品、腮腺炎病毒质粒质控品及内源性内标gapdh基因质粒质控品稀释至1
×
107copies/ml和5
×
104copies/ml作为精密度参考品，按照实施例1中的试剂盒制备与操作方法进行检测，每个浓度参考品各重复测定10次，计算各通道精密度参考品ct值的变异系数。
[0109]
检测结果参见图6～图9：
[0110]
经测试，麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒和内标基因精密度参考品的变异系数分别为0.62％、0.27％、0.77％、0.44％，四个检测靶基因精密度参考品的变异系数均小于5.00％。
[0111]
实施例5
[0112]
本实施例为麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒临床样本检测
[0113]
采集疑似麻疹、风疹和流行性腮腺炎咽拭子样本共15份，采用广东华银医药科技有限公司的核酸提取纯化试剂(粤穗械备20160045)提取样本核酸。按照实施例1中的试剂盒制备与操作方法进行检测，结果15份样本中共检出3份麻疹病毒阳性，6份风疹病毒阳性，5份腮腺炎病毒阳性，检测结果见图10～图13。将检测结果进一步与临床检验结果对比，结果符合率为100％。
[0114]
对比例1
[0115]
本对比例为多种病毒引物和探针组合物的设计
[0116]
本试剂盒对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒不同型别的毒株全基因组序列进行深入比对分析后，针对目标基因靶序列分别设计了多对的引物和探针，由于多重反应体系容易存在引物之间的竞争抑制作用、引物退火温度差异大导致扩增效率低、以及易产生引物二聚体等原因，很难获得有效的多重pcr扩增引物以及探针组合。本发明人通过大量的实验探索，对设计的引物和探针进行筛选及优化并进行实验验证，最终确定了可以用于同时检测麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的多重pcr扩增的引物和探针序列及其组合。
[0117]
在引物探针组合的筛选过程中，不同引物组合进行单重及多重扩增的效果存在明显差异。其中测试使用的部分引物和探针组合见表6。按照实施例1中的试剂盒制备与操作方法进行测试，在实际测试中，发现麻疹病毒引物探针组合3扩增不同浓度麻疹阳性样本核酸时存在明显荧光衰减现象(结果参见图14)，且与麻疹病毒引物探针组合1对比扩增线型较差。风疹病毒引物探针组合2在多重检测中，空白对照检测中存在非特异性扩增，提示与其他引物彼此间可能存在错配情况(结果参见图15)。腮腺炎病毒引物探针组合2在检测较高浓度样本核酸时，存在明显扩增荧光值衰减问题(结果参见图16)，表明该组合不适用于低浓度样本的检测。通过引物探针组合的筛选测试，确定每种病原的单重检测引物探针组，再经过多重引物探针组合及调整测试，最终确定了麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒和内标基因的引物探针组合。
[0118]
表6部分测试引物和探针组合表
[0119]
[0120]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。