具有修饰的衣壳蛋白的病毒的制作方法

具有修饰的衣壳蛋白的病毒
发明领域
1.本发明涉及包含具有修饰的衣壳蛋白的腺病毒载体的制剂(preparations)。这些修饰的衣壳蛋白使得能够对腺病毒载体进行可定制的修饰，实现从个性化癌症疫苗到靶向基因治疗载体的不同应用及其混合。
2.特别地，具有修饰的衣壳蛋白的腺病毒载体可以是在六邻体和/或pix衣壳蛋白中被修饰的。
3.此外，本发明的腺病毒载体比现有技术的载体更不易被中和抗体清除。因此，有利的是，这些修饰的腺病毒载体可以逃避宿主免疫应答。
4.本发明的优选方面是在疫苗制备中使用具有修饰的衣壳蛋白的腺病毒载体。这些疫苗可以是预防性或治疗性的。在本发明的这一方面，修饰的衣壳蛋白能够实现抗原的模块化共价展示，从而诱导针对所述抗原及包含其的组合物的免疫应答。特别地，它涉及具有修饰的衣壳蛋白的腺病毒载体，该载体允许快速组装个性化疫苗疗法，以对抗疾病。本发明人已经显示，使用腺病毒载体展示抗原增加了针对抗原的免疫应答。
5.本发明的其他方面包括具有修饰的衣壳蛋白的腺病毒载体在制备溶瘤病毒、基因治疗载体和/或腺病毒趋向性重靶向中的用途。
6.本发明的又其他方面允许不同类型修饰的组合以同时实现几种治疗应用，诸如表达癌症抗原的溶瘤病毒。
7.发明背景
8.腺病毒(ad)具有包围线性双链基因组的二十面体蛋白衣壳。无脂质包膜。衣壳包含结构蛋白六邻体、纤维、五邻体、iiia、viii和ix。认为纤维衣壳蛋白通过knob结构域帮助附接至宿主细胞。ad依赖于感染宿主，以便能够利用宿主细胞的复制机制进行复制。人类腺病毒有可分为a-g七个“种类(species)”的至少57种血清型，ad1-57。类似地，存在动物ad，诸如犬ad和马ad，也可分为各种血清型和“种类”。血清型通常由抗血清在体外中和细胞感染的能力来定义。这些病毒已经被很好地研究和理解，它们可以以高滴度生长，它们可以感染分裂细胞和非分裂细胞两者，并可以作为附加体在宿主细胞中维持。这些特点使得它们成为良好的治疗选择，因为几乎所有的试验都表明它们是安全和良好耐受的。
9.二十面体衣壳由几种蛋白组成。六邻体是形成病毒衣壳的20个三角形面的主要蛋白。六邻体蛋白形成三聚体，并且每个三聚体与其他六个三聚体相互作用。12个顶点由五邻体衣壳粒形成，五邻体衣壳粒是3个纤维蛋白和5个五邻体蛋白的复合物。长纤维从每个顶点延伸，由三个相同的链组成，在末端形成knob。衣壳还包含次要蛋白，尤其是其中的piiia、pvi、pviii和pix。这些次要衣壳蛋白可以位于衣壳的内表面或外表面，并可以具有结构功能之外的另外的功能。例如，pvi可以促进六邻体蛋白进入细胞核，并且pix可以参与dna包装到衣壳中和转录活化。
10.ad通常用于基因治疗，特别是作为基因递送载体，因为它们具有包含另外的基因序列的能力。已经使用ad进行了超过2,000项基因治疗试验。腺病毒载体允许将其携带的转基因传递到宿主细胞核中，但不将病毒dna整合到宿主染色体中。当用作基因治疗载体时，
ad的插入序列很大，具有8-36kb的可用容量。
11.溶瘤性腺病毒正在被探索用于癌症，最值得注意的是用于治疗头颈癌。溶瘤病毒优先感染和杀伤癌细胞，溶瘤过程释放新的感染性腺病毒粒子，并且还募集宿主免疫系统以提高抗癌应答。各种手段已被用于确保溶瘤性腺病毒对癌细胞的靶向，包括使用衔接子分子(诸如融合蛋白，包含抗体与衣壳蛋白的融合蛋白)、直接修饰病毒衣壳蛋白或使用转录靶向。
12.此外，由于ad诱导先天免疫应答和适应性免疫应答两者的能力；具有诱导强烈的抗原特异性b细胞和t细胞免疫应答的能力，ad已经成为一种有前景的疫苗递送媒介物。腺病毒载体具有高度的免疫原性并在抗原递送方面有效。然而，该潜力尚未完全实现。几种基于腺病毒载体的疫苗候选物被开发并在临床试验中进一步研究，然而，这些都不成功。merck公司针对hiv-1开发的基于人类腺病毒血清型5(adhu5)的疫苗诱导了cd8

t细胞反应，但未能预防hiv感染。
13.基于腺病毒的载体在人类和动物治疗中成功的主要障碍是病毒特异性抗体的中和。腺病毒的自然感染在人类和动物群体中很高，并且因此适应性免疫系统可以通过分泌中和抗体(nab)来识别和响应腺病毒载体的存在。类似地，先天免疫系统也可以负责协助对腺病毒载体的反应。例如，估计50％至90％的成年群体对adhu5有预先存在的免疫力。这样的反应可以在观察到所需效果之前清除治疗性腺病毒载体。解决这一问题将使腺病毒治疗载体能够更常规的使用。
14.在腺病毒载体的使用中，已经采取了各种方法来逃避宿主的免疫应答。一种方法是将adhu5的高变区(hvr)与另一种腺病毒血清型的高变区互换，以产生“嵌合体”。这可以允许嵌合体逃避adhu5中和抗体，但只有在针对替代血清型的中和抗体不存在时才会有效。需要改进的逃避免疫应答的方法。
15.ad已被用作疫苗，主要作为dna疫苗递送载体，通过在腺病毒基因组中包含在宿主细胞内表达的抗原的基因序列。使用ad作为疫苗组合物的替代方法包括使用腺病毒颗粒本身来展示抗原。这种方法已得到不同程度的成功，取决于修饰的性质，诸如使用基因融合，使用修饰的抗体结合衣壳蛋白和点击化学。将免疫原性肽掺入到衣壳中提供潜在的优势，诸如诱导强烈的体液应答的能力，类似于天然衣壳蛋白产生的应答。
16.一种方法是修饰腺病毒衣壳蛋白以包含免疫原性肽，以展示在病毒表面。“抗原衣壳掺入”策略的主要障碍是对插入尺寸的限制，因为插入必须既不破坏衣壳蛋白的天然折叠，也不影响使衣壳蛋白保持在一起的相互作用。此外，在衣壳蛋白中直接编码抗原的一个缺点是为每种个体抗原优化疫苗所需的时间和工作的量。将理想的是，配制具有修饰的衣壳蛋白的腺病毒载体，该修饰的衣壳蛋白准备好附接任何所需抗原，而不需要优化衣壳蛋白内的插入。这样的“预准备”的腺病毒疫苗组合物在涉及制备个性化疫苗(其中疫苗以定制的方式仅为一个个体制备)时将特别有用。个性化疫苗可以是个性化癌症疫苗或提高对特定耐药微生物感染的免疫应答等的情况。
17.事实上，鉴于目前利用腺病毒作为治疗性递送载体的挑战(由于对病毒的中和，以及无法将长于100个氨基酸的序列包含到一些衣壳蛋白(包括最丰富的衣壳蛋白——六邻体)中)，仍然迫切需要开发将允许利用腺病毒载体的明显优势、允许治疗剂的个性化并且还降低载体的免疫清除的方法。将理想的是，制备具有修饰的衣壳蛋白的“预准备”的腺病
毒载体，该修饰的衣壳蛋白准备好接受实体(诸如抗原、免疫原性肽、蛋白、糖蛋白、抗体、靶向分子、细胞表面标志物、蛋白、肽、糖蛋白、脂蛋白等)的修饰。由于对衣壳蛋白的修饰已经完成，而这减少了可以实现的对病毒衣壳修饰的限制，因此“预准备(primed)”的腺病毒的产生可以允许个性化治疗剂的制备而无需费力的试错。
18.腺病毒衣壳蛋白先前已被修饰；最常见的工作是改变病毒载体的天然趋向性，而不是克服对基于病毒的载体的中和。对趋向性(支持病毒生长的宿主的特定细胞和/或组织)进行改变，使得病毒载体可以针对特定适应症靶向特定细胞类型。例如，基因治疗腺病毒载体可以希望只针对视网膜细胞，并且可以相应地改变趋向性。特别是对于疫苗应用，病毒的天然趋向性可能不那么重要，因为病毒疫苗载体的目的是诱导对其展示的抗原的免疫应答，而不是感染任何特定的细胞类型。
19.本发明涉及将修饰(诸如肽插入)掺入腺病毒衣壳蛋白中，以制备准备添加修饰的载体。这些插入允许不受尺寸限制的外来实体在腺病毒表面上模块化组装和展示。它还允许用最少量的准备来制备定制疗法，诸如疫苗，例如个性化的癌症疫苗或溶瘤病毒。本文描述的病毒载体是灵活的平台，允许使用相同的载体制备多于一种不同的治疗剂。这是首次被证明的新颖技术，在病毒表面使用模块化共价键合展示多于一个肽和蛋白伴侣。腺病毒载体先前从未使用本发明人提出的技术被成功地修饰。
20.本发明提供了对现有技术的重大改进。本发明人已经显示，该技术使得能够通过蛋白伴侣对将实体附接到衣壳蛋白，从而有效地屏蔽腺病毒免受中和抗体的影响。该改进通过抗原的附接得到了展示，但在实践中，任何实体都可以附接以产生这种屏蔽或阻断效果。值得注意的是，本发明人特别高兴地注意到，尽管使用该技术添加的一些实体的尺寸大，但腺病毒的感染性仍得到保留。因此，本发明技术可以通过简单地修饰衣壳蛋白和添加屏蔽实体来改进现有的基因治疗载体或溶瘤性腺病毒载体。
21.关于疫苗制剂，本发明使得能够针对展示的抗原产生免疫应答。有利的是，本发明人首次展示病毒表面可以用较大的抗原性蛋白修饰，所述抗原性蛋白具有通过有效中和单克隆抗体而阻断对病毒的中和的有利效果。因此，病毒疫苗载体不仅可以用于各种抗原类型，如果抗原足够大，展示的抗原还可以保护病毒疫苗载体免受宿主抗体的中和。这将确保病毒疫苗载体可以持续更长时间以诱导免疫应答，并可使相同载体用于多于一次免疫，而不会降低与载体中和相关的效力。
22.肽结合对，诸如基于来自细菌的附接蛋白的肽结合对，诸如spycatcher和spytag(wo2011/098772)的使用，已被建立为不可逆地缀合重组蛋白等的技术。通过蛋白之间的基因融合不可能实现的实体之间的生物缀合可以使用肽结合对来实现。现在有各种catcher和tag对可用，一些基于对spycatcher和spytag的修饰，而另一些基于来自替代细菌蛋白的类似化学。
23.关于腺病毒，本发明人发现在腺病毒衣壳蛋白中包含肽对并不像假设的那样常规或直接，特别是在提供抗原的附接手段方面。事实上，本发明人的工作已经显示，最常用的肽对，在这种情况下，将spytag插入到六邻体衣壳蛋白中，未允许形成功能性腺病毒载体(允许spycatcher有效偶联并能够感染细胞的载体)。事实上，在实施例中包括了示出spytag插入后反应性差的数据，以及关于修饰的腺病毒缺乏感染性的数据。因此，在开发关于修饰的腺病毒载体的系统方面已经开展了大量的工作，该修饰的腺病毒载体准备好接受
肽配对和实体通过插入衣壳蛋白中的肽伴侣附接到修饰的衣壳蛋白。
24.发明概述
25.根据本发明的第一方面，提供了一种用于制备预防性或治疗性腺病毒组合物的腺病毒载体，该腺病毒载体包含衣壳蛋白中的至少一种修饰，其中所述修饰包括在衣壳蛋白中包含第一肽伴侣，其中所述第一肽伴侣能够与第二肽伴侣形成共价键，所述第二肽伴侣可以附接到实体。
26.修饰可以是与第一肽伴侣的融合或将第一肽伴侣插入到衣壳蛋白中。
27.衣壳蛋白可以是任何衣壳蛋白，但优选为六邻体蛋白或pix蛋白。
28.第一肽伴侣和第二肽伴侣形成肽伴侣对，肽伴侣对可通过异肽键或酯键(优选为异肽键)共价连接。
29.在一方面，第一肽伴侣是“标签(tag)”伴侣，其可以通过异肽键或酯键与第二肽伴侣共价连接，第二肽伴侣是“捕手(catcher)”。在这方面，衣壳蛋白优选为六邻体蛋白。因此，修饰六邻体的第一肽伴侣或“标签”优选为dogtag、isopeptag、isopeptag-n、sdytag、pscstag或jo。优选第一肽伴侣或标签不是spytag。在该实施方案中，spytag在插入到六邻体蛋白期间未被修饰。
30.在替代方面，第一肽伴侣是“捕手”伴侣，其可以通过异肽键或酯键与第二肽伴侣共价连接，第二肽伴侣是“标签”。在这方面，衣壳蛋白优选为六邻体蛋白。因此，修饰六邻体的第一肽伴侣或“捕手”可以是dogcatcher、spycatcher、snoopcatcher、pilin-c、pilin-n、sdycatcher、pscscatcher或in。
31.在一方面，第一肽伴侣是“捕手”伴侣，其可以通过异肽键或酯键与第二肽伴侣共价连接，第二肽伴侣是“标签”。在这方面，衣壳蛋白优选为pix蛋白。因此，修饰pix的第一肽伴侣或“捕手”优选为spycatcher、dogcatcher、snoopcatcher、pilin-c、pilin-n、sdycatcher、pscscatcher或in。
32.在替代方面，第一肽伴侣是“标签”伴侣，其可以通过异肽键或酯键与第二肽伴侣共价连接，第二肽伴侣是“捕手”。在这方面，衣壳蛋白优选为pix蛋白。因此，修饰pix蛋白的第一肽伴侣或“标签”优选为spytag、snooptagjr、dogtag、isopeptag、isopeptag-n、sdytag、pscstag或jo。
33.在一方面，第一肽伴侣可以插入到六邻体蛋白中，并且任选地向六邻体蛋白中的插入的长度可以长达200个氨基酸、长达150个氨基酸或长达100个氨基酸。向六邻体蛋白中的插入可以位于任何适当的位点，任选地位于任何一个或更多个高变hvr环中。插入到六邻体蛋白中的第一肽伴侣可以是dogtag。dogtag能够与dogcatcher形成自发的共价键，或者在需要催化剂(snoopligase)的反应中与snooptagjr或snooptag形成共价键。因此，dogcatcher或snooptagjr或snooptag可以是第二肽伴侣。因此，dogtag或snooptagjr可以是第二肽伴侣。第二肽伴侣连接或附接到实体诸如抗原。令本发明人惊讶的是，在如上所述的spytag插入失败后，dogtag能够插入到六邻体衣壳蛋白中以形成功能性腺病毒载体，用于蛋白伴侣的衣壳展示。如实施例所示，将dogtag插入到六邻体中并与snooptagjr或dogcatcher配对，使得在偶联后修饰的腺病毒保持其在测试的细胞中的感染能力。范围广泛的snooptagjr和dogcatcher融合蛋白(一些尺寸超过50kda)已被有效地偶联并展示在腺病毒上，而病毒的感染性没有降低。如果腺病毒载体的治疗用途需要进入细胞，例如用于基
因治疗或作为溶瘤病毒，则保持感染性是很重要的。
34.其他可以包含在六邻体蛋白中的长度小于100个氨基酸的第一肽伴侣包括：
35.与pilin-c配对的isopeptag；
36.与pilin-n配对的isopeptag-n；
37.与sdycatcher配对的sdytag；
38.与pscscatcher配对的pscstag；
39.与in配对的jo，或
40.rrgatag/rrgatag2/dogtag，它们与rrgacatcher(这里也表示为“dogcatcher”)配对。
41.优选的是，在包含在六邻体蛋白中的可能的肽伴侣中，包含不是spytag的插入。在这种实施方案中，spytag被插入到六邻体的各种hvr中，并且发现在与spycatcher配对后，感染性降低到令人不满意的水平。因此，病毒适应能力受损。
42.在另一方面，第一肽伴侣可以与pix衣壳蛋白融合，任选地在n-末端或c-末端，优选地在c-末端。与pix衣壳蛋白融合的第一肽伴侣可以是spycatcher、snoopcatcher或dogcatcher。spycatcher能够与spytag形成共价键，spytag在此形成第二肽伴侣，并且因此可以附接到抗原。snoopcatcher能够与snooptag或snooptagjr形成共价键，并且dogcatcher能够与dogtag形成共价键，并且可以作为第一肽伴侣或第二肽伴侣以任一方向用作结合对。第一肽伴侣也可以是dogtag、spytag、snooptagjr或snooptag，其中匹配的第二肽伴侣是dogcatcher、snooptagjr、snooptag、spycatcher、dogtag、或snoopcatcher。其他可以适于以任一方向与pix融合的肽伴侣对为：rrgatag/rrgatag2/dogtag和rrgacatcher、isopeptag/pilin-c、isopeptag-n/pilin-n、sdytag/sdycatcher、pscstag/pscscatcher和jo/in。
43.在pix中插入spycatcher已经展示可以允许spytag缀合的实体(包括hcmv五聚体)的偶联，同时保持感染性。
44.特别优选的可以是将snoopcatcher或dogcatcher插入到pix中，因为它们在本文中都展示了具有良好的腺病毒存活力。此外，这些插入在遗传上稳定超过3代。
45.如本文用于本发明的任何方面，第一肽伴侣是能够在适当条件下形成共价键诸如异肽键或酯键的肽对的一部分。这些也被称为蛋白标签和捕手对或蛋白标签和结合伴侣对。第一肽伴侣可以是第一肽标签或可以是第一肽捕手。每个伴侣对可以包含标签和捕手。形成的共价键可以自发反应，或者需要第三个实体诸如连接酶的辅助。关于合适的肽对的其他信息包含于下文。
46.所述腺病毒载体可以用于疫苗的制备。疫苗可以是预防性或治疗性的。因此，本发明延伸到制备疫苗的方法，该方法包括使用如本文所述的腺病毒载体。该方法包括通过第二肽伴侣将抗原附接到腺病毒载体。所述第二肽伴侣附接到抗原，优选地融合到所述抗原，并且能够与存在于免疫原性腺病毒载体上的第一肽伴侣形成共价键。共价键以及由此产生的附接可以自发发生，或者可以需要使用第三实体诸如连接酶来促进结合。因此，抗原通过肽伴侣对的方式附接到腺病毒，肽伴侣对的第一伴侣包含在修饰的衣壳蛋白中。
47.在本发明的另一方面，提供了一种疫苗组合物，其包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包括衣壳蛋白中的至少一种修饰，其中所述修饰包括包含第一肽伴侣，并且所述第一肽
伴侣与附接到抗原的第二肽伴侣共价键合。所述腺病毒载体如本文广泛描述的。
48.在本发明的另一方面，提供了一种免疫原性腺病毒载体，其包含六邻体蛋白衣壳蛋白中的至少一种修饰，其中所述修饰包含：
49.a.第一肽伴侣；和
50.b.附接到抗原的第二肽伴侣；
51.其中第一肽伴侣和第二肽伴侣通过共价键偶联。
52.在本发明这方面的一种实施方案中，插入到六邻体蛋白衣壳蛋白中的第一肽伴侣长度小于200个氨基酸，长度小于150个氨基酸，长度小于100个氨基酸，任选地，其中所述第一肽伴侣是dogtag。如果dogtag是第一肽伴侣，则第二肽伴侣可以是dogcatcher或snooptagjr或snooptag。为了帮助dogtag和snooptagjr或snooptag之间形成共价键，可以使用连接酶。
53.插入到六邻体中的第一肽伴侣也可以是snooptag、snooptagjr、snoopcatcher、dogcatcher、isopeptag、pilin-c、isopeptag-n、pilin-n、sdytag、sdycatcher、pscstag、pscscatcher、rrgatag/rrgatag2、rrgacatcher、jo或in中的任何一个。
54.优选地，在spycatcher用作第二肽伴侣时，spytag不用作六邻体蛋白中的第一肽伴侣
55.在本发明的另一方面，提供了一种免疫原性腺病毒载体，其包含pix衣壳蛋白中的至少一种修饰，其中所述修饰包含：
56.a.第一肽伴侣；和
57.b.附接到抗原的第二肽伴侣；
58.其中第一肽伴侣和第二肽伴侣通过共价键偶联。
59.根据一方面，第一肽伴侣可以是spycatcher蛋白。在这种情况下，第二肽伴侣可以是spytag。在这些伴侣对之间形成的共价键是自发的而不需要帮助。snoopcatcher或dogcatcher同样可以用作第一肽伴侣，它们的伴侣对分别是snooptag/snooptagjr或dogtag。snooptagjr/snooptag或spytag同样可以用作第一肽伴侣，它们的伴侣对分别是snoopcatcher或spycatcher。
60.同样，可以使用以下任何一对：与pilin-c配对的isopeptag
61.与pilin-n配对的isopeptag-n；
62.与sdycatcher配对的sdytag；
63.与pscscatcher配对的pscstag；
64.与in配对的jo，或
65.与rrgacatcher(dogcatcher)配对的rrgatag/rrgatag2/dogtag。
66.本文所述的用第一肽伴侣对腺病毒衣壳蛋白的任何修饰都允许构建腺病毒载体，该腺病毒载体有效地是已经被“预准备”用于添加实体以制备预防性或治疗性组合物(诸如添加抗原以制备疫苗)的腺病毒载体。可选地，将腺病毒载体预准备以接收屏蔽实体的附接，该屏蔽实体的唯一目的是阻断宿主抗体对腺病毒的识别和结合。
67.然后，可以通过使腺病毒载体与附接到该实体的第二肽伴侣接触来添加该实体，该第二肽伴侣能够与腺病毒载体上的第一肽伴侣形成自发的或辅助的共价键。也可以使用该技术添加任何实体。因此，可以使用靶向实体或部分，诸如抗体或其片段、细胞表面标志
物结合剂或伴侣对。可选地，该实体可以是屏蔽实体。屏蔽实体可以是温和的(benign)、无活性的或无害的蛋白、多肽、肽、糖肽、脂肽、多糖或脂质，其唯一的功能是屏蔽腺病毒衣壳以避免宿主免疫细胞的结合。在这种情况下，温和的意指没有另外的功能的实体，诸如疫苗的抗原或靶向部分。所有的屏蔽实体所做的是为衣壳提供物理屏蔽，不允许宿主抗体结合。然而，本发明人已经显示，用这样的附接体(attachments)来保持感染性是可能的，这是令人惊讶的。这种作用特别地见于对病毒衣壳的主要组分六邻体的修饰。
68.腺病毒载体可以通过附接多于一种实体来修饰。腺病毒载体可以附接多于一种实体。每种实体可以具有不同的功能，例如，抗原和靶向部分。可以附接多于一种实体，每种实体附接到单独的第二肽伴侣。这使得多于一种实体附接到单一腺病毒载体。不同的实体可以用于同一适应症(例如，不同的抗原用于同一疾病)或不同的适应症(例如，在单一腺病毒载体上的组合的疫苗组合物用于不同疾病诸如麻疹、腮腺炎和风疹)。
69.对于疫苗，改变腺病毒的天然趋向性通常不是本发明的目的，因为本发明寻求产生针对所呈递的抗原的抗体或t细胞，而不是将载体重新靶向特定细胞类型。纤维组分被认为是趋向性的主要决定因素。本发明人已经观察到，对于在六邻体蛋白中使用dogtag修饰的几个实施例，对衣壳蛋白的修饰对转导特定靶细胞的能力几乎没有影响或没有影响。事实上，在这些实施例中，当dogtag插入到六邻体中并与抗原上的dogcatcher配对时，对hek293细胞的感染性没有下降。然而，在一些情况下，本发明人已经显示修饰可以影响病毒感染hek293细胞的能力，这一点在本文中通过将spytag插入到六邻体中并与抗原上的spycatcher配对得到了展示。观察到spytag插入的腺病毒的感染性下降了100倍。这是不期望和出乎意料的。事实上，鉴于这是最常用的肽标签，并且对于大多数应用来说通常是优选的，本发明人认为腺病毒可能对使用伴侣来修饰衣壳蛋白是不调和的。只有通过大量的工作，才意识到这并不适用于所有伴侣对，并且特别地dogtag是六邻体蛋白的一种可行修饰。
70.本文所述的修饰腺病毒载体已被精心工程化，使得它们易于产生，其产量与具有野生型衣壳蛋白(例如野生型六邻体或野生型pix衣壳蛋白)的载体相当。体外产生腺病毒的方法以及将重组基因引入到腺病毒中的方法是本领域技术人员熟知的。
71.本领域中广泛认识到，对病毒衣壳蛋白进行修饰和/或插入是困难的，并且对病毒的功能和复制经常是破坏性的。修饰必须不抑制衣壳蛋白的正确折叠或在组装过程中将修饰掺入病毒粒子的衣壳结构中。特别是对于抗原展示，必须进行修饰，使得展示的抗原的构象和位置能够被免疫系统识别，并且在感染性病毒颗粒的情况下，不妨碍病毒载体感染细胞的能力。先前的研究已经表明了这些要求的复杂性。在六邻体hvr环的情况下，matthews等人显示载体存活力取决于插入的尺寸和靶向哪个hvr环。[matthews ql，等人optimization of capsid-incorporated antigens for a novel adenovirus vaccine approach.virol j.2008 aug 21；5:98.doi:10.1186]。该研究还表明，对展示的表位的免疫识别也取决于插入的抗原的性质和位置。其他研究，诸如在gu等人中，揭示了接头序列的性质和长度对于促进有效表位展示的重要性。[linlin gu等人，a recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the v3 loop of hiv-1 gp120 in mice through the“antigen capsid-incorporation”strategy,virol j.2014 jun 16；11:112.doi:10.1186]。在本技术中，本发明人通过显示spycatcher与ad5-hvr-spytag载体的偶联效率较低，并且基本上妨碍了载体感染性(图2)，
而ad5-hvr-dogtag与dogcatcher的偶联效率很高，并且不妨碍载体感染性(图3)，再次展示了该现象。在腺病毒六邻体插入的情况下，与spytag:spycatcher偶联相比，dogtag:dogcatcher偶联具有更高的效率和效用是出乎意料的，因为spytag:spycatcher偶联在许多其他情况下都显示是高效的。事实上，有超过500项记录的使用spycatcher:spytag技术的构建体。
[0072]
在pix修饰的情况下，研究表明pix蛋白可以耐受c-末端的多种不同延伸。然而，存活力、衣壳稳定性和抗原展示效率高度依赖于融合体的性质和长度[igor p.dmitriev，等人engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the c terminus of capsid protein ix.j virol.2002 jul；76(14):6893-9][nadine c.salisch，等人antigen capsid-display on human adenovirus 35 via pix fusion is a potent vaccine platform.plos one.2017；12(3):e0174728]。
[0073]
在本发明任何方面的一些实施方案中，病毒衣壳蛋白中的至少一种修饰位于主要衣壳蛋白或次要衣壳蛋白中。病毒粒子外表面的所有腺病毒蛋白(六邻体、纤维、ix蛋白和五邻体)都能够被修饰。
[0074]
在一种实施方案中，主要衣壳蛋白中的修饰位于六邻体蛋白中。
[0075]
在其他实施方案中，次要衣壳蛋白中的修饰位于pix蛋白中。
[0076]
对于本发明的任何方面，至少一种修饰是将第一肽伴侣插入或融合到衣壳蛋白。优选地，至少一种修饰是通过对腺病毒基因组的遗传修饰将第一肽伴侣插入或融合到衣壳蛋白。适当地，修饰是在六邻体蛋白中插入第一肽伴侣，优选地插入到六邻体蛋白的一个或更多个hvr环中。因此，可以在六邻体蛋白的序列中进行插入，而不是将第一肽伴侣融合到n-末端或c-末端。适当地，修饰是在pix蛋白中融合第一肽伴侣。对于pix融合，第一肽伴侣可以在任何合适的位置融合，可选地c-末端或n-末端，优选地c-末端。修饰腺病毒领域的技术人员将知悉如何引入遗传修饰以如本文所讨论的修饰病毒衣壳蛋白。
[0077]
在本发明任何方面的一些实施方案中，共价键是异肽键。这允许第一肽伴侣与第二肽伴侣的不可逆缀合，从而形成共价稳定的多蛋白复合物。这种异肽键可以是自发的，即无需帮助，或需要帮助，即来自连接酶的帮助。特异性肽伴侣在本领域中是熟知的，并且包括非穷尽列表：spytag/spycatcher及其衍生物和修饰、snooptag/snoopcatcher、dogtag/dogcatcher、snooptagjr/snoopcatcher、snooptagjr/dogtag、isopeptag/pilin-c、isopeptag-n/pilin-n、sdytag/sdycatcher、pscstag/pscscatcher、rrgatag或rrgatag2/rrgacatcher和/或jo/in以及这些伴侣对中任何一个的修饰和变体。
[0078]
在一种实施方案中，第一肽伴侣可以是dogtag或spycatcher。可选地，第一肽伴侣可以是spytag。插入有dogtag的腺病毒衣壳蛋白被命名为“ad-dogtag”。插入有spytag的腺病毒衣壳蛋白被命名为“ad-spytag”。与spycatcher融合的腺病毒衣壳蛋白被命名为“ad-spycatcher”。
[0079]
在其他实施方案中，第二肽伴侣可以是dogcatcher、snooptagjr或spytag。在一种实施方案中，第一肽伴侣与第二肽伴侣偶联从而形成异肽键以形成肽:肽结合对。
[0080]
根据本文提供的数据，它表明dogtag插入到六邻体衣壳蛋白中的表现良好，并且能够获得良好的产量(图12)。
[0081]
根据本文提供的数据，在pix中插入以下第一肽伴侣表明是可行的：spycatcher、
snoopcatcher、dogcatcher、spytag和snooptagjr。在图12中表明，在某些情况下，spycatcher融合到pix中可能在遗传上不太稳定，而插入相同衣壳蛋白的snoopcatcher和dogcatcher可以在遗传上更稳定，并且因此在某些情况下更优选。然而，spycatcher融合是可操作的，参见图11，其中各种实体被附接，而病毒保持感染性。在图14中，展示了snooptagjr和spytag插入到pix中不会对感染产率产生不利影响，即使是当使用第二肽伴侣将实体(诸如抗原)附接到这些第一肽伴侣时。应当注意的是，来自sars-cov2的整个刺突蛋白超过500kda，并且因此是已经成功附接的大的附接物。因此，spycatcher、snoopcatcher、dogcatcher、spytag和snooptagjr可以作为第一肽伴侣插入到pix中，最优选地snoopcatcher、dogcatcher、spytag和snooptagjr可以作为第一肽伴侣插入到pix中。
[0082]
本文所述的肽:肽结合对的实例包括但不限于spytag和spycatcher、dogtag和dogcatcher、snooptag/snooptagjr和snoopcatcher；rrgatag/rrgatag2/dogtag和rrgacatcher、isopeptag/isopeptag-n和pilin-c或pilin-n、pscstag和pscscatcher；snooptagjr/snooptag和dogtag(由snoopligase介导)，以及所有这些系统的变体、衍生物和修饰。合适的肽标签/结合伴侣对详细描述于wo2011/09877、wo2016/193746、wo2018/18951和wo2018/197854中，通过引用并入本文。
[0083]
因此，第二肽伴侣可以连接或融合到实体。该实体可以是期望附接到腺病毒载体并且能够作为与第二肽伴侣的融合体而产生的任何实体。实体的类型将取决于腺病毒载体将用于的预防或治疗用途。该实体可以是靶向部分，诸如配体结合对的一部分、抗体或其片段或由细胞表面受体特异性识别的任何其他实体。这样的靶向部分可用于溶瘤病毒和基因治疗应用。然而，该实体也可以简单地具有阻断或屏蔽腺病毒与施用治疗的宿主中存在的抗体结合的功能。这样的屏蔽实体除了为腺病毒衣壳核心提供屏蔽使其能够逃避清除外，可以没有其他功能。优选地，该屏蔽实体不改变腺病毒的趋向性(天然感染性)。本发明人已经观察到，当具有附接的屏蔽实体的第二肽伴侣的尺寸超过约15kda时，该组合表现为有助于修饰的腺病毒逃避免疫应答。这一观察记录在图8a中，其中记录了snooptagjr-affiher2的部分屏蔽效应。根据凝胶迁移，认为snooptagjr-affiher2为约15kda。这种局部屏蔽效应可以是有利的。然而，如果组合的第二肽伴侣加附接的屏蔽实体的尺寸大于约25kda，则观察到更完全的屏蔽，如dogcatcher-nanp9(约25-30kda)的结果中观察到的，如图8b和图8c中观察到的。在疫苗的情况下，本发明人已经显示抗原可以具有双重功能，以在宿主中提高免疫应答，但也逃避宿主对腺病毒本身的免疫应答。由于先前不可能共价附接所考虑尺寸的实体，所以先前没有观察到这种效应。
[0084]
因此，第二肽伴侣被连接或融合到抗原或者被合成以包含抗原。可以附接抗原以预防未来的疾病(预防性)或帮助免疫应答以对抗当前疾病(治疗性)。抗原可以是任何合适的组合物，包括肽、多肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、糖、多糖等。抗原可以是任何合适的抗原，包括自身抗原、癌症抗原、为过敏原的抗原、细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原或来自任何病原生物的抗原。抗原可以是全部或整个抗原，或者可以是抗原的片段，诸如表位。抗原可以是完全天然的，也可以是经过修饰的。抗原可以是病毒抗原或新表位或新抗原。抗原可以是特定类型癌症的共同抗原，例如，诸如共享的新表位。新表位或新抗原可以是患者特异性的。患者特异性抗原可以来自抗原的突变，例如编码序列的改变、移码突变或改变的翻译后修饰。例如，野生型snooptagjr序列已经被合成为融合肽以包含新表位序列。在另一实例中，
dogcatcher连接到抗原以形成dogcatcher融合体。
[0085]
在一种实施方案中，第一肽伴侣是dogtag，并且第二肽伴侣是dogcatcher。第一肽伴侣的附接，例如dogtag与六邻体衣壳蛋白的附接，形成载体ad-dogtag。在偶联到与抗原连接的第二肽伴侣dogcatcher后，形成的疫苗载体被称为ad-dogtag:dogcatcher-抗原。在另一实施方案中，第一肽伴侣是dogtag，并且第二肽伴侣是snooptagjr或snooptag。具有抗原(诸如新表位)的snooptagjr的合成产生snooptagjr融合体。具有抗原(诸如新表位)的snooptag的合成产生snooptag融合体。snooptagjr融合体或snooptag融合体与载体ad-dogtag的偶联分别产生称为ad-dogtag:snooptagjr融合体或ad-dogtag:snooptag融合体的载体。该反应需要snoopligase来促进dogtag与snooptagjr融合体或snooptag融合体之间的偶联。可以优选的是，dogtag附接到六邻体衣壳蛋白，任选地附接到hvr环。在一些实施方案中，dogtag可以用于修饰同一六邻体蛋白内的多于一个hvr环。这可以增加附接到病毒衣壳的机会。
[0086]
在另一实施方案中，第一肽伴侣是spycatcher，并且第二肽伴侣是spytag。spytag连接到抗原以形成ad-spycatcher:spytag-抗原。因此，可以观察到，第一肽伴侣可以是本领域中所称为的“标签”或“捕手”；第二肽伴侣组分分别是这对的伴侣，“捕手”或“标签”。在本文中两者都被命名为蛋白伴侣，因为它们可以以任一方向提供，从而修饰衣壳蛋白或附接到抗原。第一肽伴侣与第二肽伴侣的偶联使得抗原能够展示在免疫原性腺病毒病毒蛋白的表面上。在该实施方案中，衣壳蛋白优选为pix。在pix的情况下可以使用的其他“第一肽伴侣”和“第二肽伴侣”组合是第一伴侣(primary partner)snooptagjr和第二伴侣(secondary partner)snoopcatcher、第一伴侣spytag和第二伴侣spycatcher、第一伴侣snoopcatcher和第二伴侣snooptagjr或第一伴侣dogcatcher和第二伴侣dogtag。
[0087]
在另一实施方案中，插入到pix中的第一肽伴侣可以是snoopcatcher、dogcatcher、spytag和snooptagjr中的任何一个。这些都已表明是有效的插入，具有良好的产率存活力，并且可用于它们各自的第二结合对，以允许用期望的实体修饰腺病毒。本文全面讨论了相应的第二肽伴侣。所得的腺病毒可以称为“ad
‑‑
snoopcatcher”、“ad-dogcatcher”、“ad-spytag”和“ad-snooptagjr”。可选地，这些可以命名为“ad pix-snoopcatcher”、“ad pix-dogcatcher”、“ad pix-spytag”和“ad-pix snooptagjr”。
[0088]
在一些实施方案中，第二肽伴侣和用于附接/修饰的附接实体(诸如抗原)的组合具有显著的尺寸，例如尺寸超过20kda、25kda、30kda、40kda、50kda、60kda、70kda、80kda、90kda、110kda、120kda、130kda、140kda、150kda或160kda、170kda、180kda、190kda或更大，诸如尺寸超过200kda、超过300kda或超过400kda。这种对修饰的腺病毒的修饰意义重大，因为由于衣壳蛋白本身施加的尺寸限制，这种类型的添加不可能使用基因融合。本发明人已经显示，添加至少约25-30kda的第二肽伴侣实体具有屏蔽腺病毒免受中和抗体影响的有益效果。因此，为了提供屏蔽效果，优选附接到第二肽伴侣的实体的组合尺寸大于15kda，优选地大于20kda，任选地尺寸大于25kda，任选地尺寸至少30kda。
[0089]
本发明人已经展示，使用本发明的方法用较大的实体(超过约30kda)附接到腺病毒颗粒，本发明的修饰的腺病毒可以逃避通常的宿主对腺病毒的免疫应答。据推测，这是因为该实体屏蔽腺病毒以避免宿主免疫系统的抗体中和。逃避宿主对腺病毒颗粒本身的免疫可能是有用的，因为这将允许腺病毒载体即使在先前曾暴露于亲本腺病毒株的个体中也有
效。鉴于人群中很大比例的人预计先前被腺病毒感染过，这将是对现有技术的有用改进。宿主对预防性或治疗性腺病毒载体的免疫清除是当前疗法进入临床的主要障碍。因此，本发明可主要用作屏蔽任何腺病毒载体免受宿主免疫系统影响的方法。有利的是，使用该技术附接的实体本身可以具有治疗效果，诸如用于疫苗的抗原，或用于基因治疗或溶瘤病毒中的细胞靶向的靶向部分。
[0090]
在其他实施方案中，dogtag被插入到六邻体衣壳蛋白的表面环中。六邻体是腺病毒衣壳蛋白的主要组分，每个病毒粒子约720个拷贝。假设100％的六邻体蛋白与肽标签偶联，这使得每个病毒粒子展示多达720个配体。因此，在一些实施方案中，dogtag是第一肽伴侣。在一种实施方案中，dogtag被插入到六邻体的至少一个hvr环中。
[0091]
在其他实施方案中，spycatcher与腺病毒次要衣壳蛋白pix的c-末端融合。第一肽伴侣的附接，例如与pix衣壳蛋白融合的spycatcher，形成载体ad-spycatcher。在偶联到与抗原连接的第二肽伴侣spytag之后，形成的疫苗载体被称为ad-spycatcher:spytag-抗原。
[0092]
在另一实施方案中，插入到pix中的第一肽伴侣可以是snoopcatcher、dogcatcher、spytag和snooptagjr中的任何一个。所得的腺病毒可称为“ad-snoopcatcher”、“ad-dogcatcher”、“ad-spytag”和“ad-snooptagjr”。可选地，这些可以命名为“ad pix-snoopcatcher”、“ad pix-dogcatcher”、“ad pix-spytag”和“ad-pix snooptagjr”。在偶联到各自的肽对之后，它们可以形成：“ad-snoopcatcher:snooptag”、“ad-dogcatcher:dogtag”、“ad-spytag:spycatcher”和“ad-snooptagjr:snooptag”。可以将任何实体附接到第二肽伴侣，诸如用于疫苗组合物的抗原。
[0093]
如本文所用，冒号“：”是指肽对之间存在共价键。
[0094]
因此，在本发明的另一方面，提供了一种包含根据本发明的腺病毒载体的组合物。该组合物优选具有免疫原性。所述腺病毒载体包含修饰的衣壳蛋白，其中所述修饰使载体准备好接受实体的附接。修饰的衣壳蛋白包括第一肽伴侣的融合或插入。然后可以通过添加必需的第二肽伴侣来制备治疗性或预防性病毒，该第二肽伴侣附接到实体诸如抗原。第一肽伴侣和第二肽伴侣一起自发地或由第三实体诸如连接酶辅助形成共价键。因此，在治疗性或预防性组合物中，衣壳蛋白通过包含共价连接到第二肽伴侣的第一肽伴侣而被修饰，该第二肽伴侣附接到实体诸如抗原。如果附接的实体是抗原，则该组合物是疫苗组合物。这是该技术的优选用途，因为它利用了腺病毒本身的高免疫原性性质。事实上，在图10中可以观察到，当与肽和腺病毒作为单独实体一起提供的结果相比时，将抗原附接到载体(在这种情况下是肽抗原)是有利的。
[0095]
在本发明的另一方面，提供了一种产生根据本发明的腺病毒载体的方法。
[0096]
在另一方面，提供了一种产生疫苗的方法，该方法包括将根据本发明的腺病毒载体与附接到抗原的第二肽伴侣混合。所述方法可能需要使用第三实体或辅助实体，诸如连接酶。
[0097]
在另外的方面，提供了一种产生溶瘤病毒的方法，该方法包括将根据本发明的腺病毒载体与附接到实体(诸如靶向部分或屏蔽实体)的第二肽伴侣混合。所述方法可能需要使用第三实体或辅助实体，诸如连接酶。靶向部分可以是允许病毒靶向到细胞或组织类型的任何合适的实体。有利的是，所述部分还阻断宿主抗体与修饰的腺病毒的结合。可选地，屏蔽实体只是帮助已经靶向的溶瘤病毒逃避免疫应答。
[0098]
在另外的方面，提供了一种产生基因治疗载体的方法，该方法包括将根据本发明的腺病毒载体与附接到靶向部分的第二肽伴侣混合。所述方法可能需要使用第三实体或辅助实体，诸如连接酶。靶向部分可以是允许病毒靶向到细胞或组织类型的任何合适的实体。有利的是，所述部分还阻断宿主抗体与修饰的腺病毒的结合。本领域技术人员知悉腺病毒的许多基因治疗用途。本发明可用于屏蔽载体免受免疫系统影响和/或帮助载体的靶向。
[0099]
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防和/或治疗疾病的疫苗，该疫苗包含根据本发明的免疫原性腺病毒载体。适当地，所述疫苗包含根据本发明的任何方面或实施方案的免疫原性腺病毒载体。适当地，该疫苗用于哺乳动物，包括人类和动物。该疫苗适合用于人类，例如儿童、成人、育龄妇女或妊娠女性。在另一方面，本发明提供一种诱导免疫原性应答(例如保护性免疫应答)的方法，其中该方法包括施用根据本发明的任何方面或实施方案的组合物。在另外的方面，本发明提供了靶向一种或更多种肿瘤特异性突变的癌症疫苗，允许针对癌细胞的免疫应答的特异性靶向。还设想了个性化的癌症疫苗。这样的疫苗包含一种或更多种特异性地存在于患者的癌细胞上的抗原。这意味着疫苗针对患者患有的特定癌症进行个性化。这些肿瘤相关抗原或癌症相关抗原可以是新抗原，新抗原是癌细胞新表达的抗原。
[0100]
在本发明的另一方面，提供了一种包含根据本发明的腺病毒载体的试剂盒。试剂盒还可以包含连接到抗原的第二肽伴侣、准备与抗原进行蛋白融合的第二肽伴侣、或允许第二肽伴侣与抗原基因进行基因融合的第二肽伴侣的基因序列。
[0101]
本发明还延伸到用于制备疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的腺病毒载体。在所述试剂盒中还可以存在准备与抗原融合的第二肽伴侣的基因序列。另外的组成部分可以是使用说明书。还可以包含用于促进肽伴侣对之间共价键所必需的第三实体。
[0102]
在本发明的另一方面，提供了一种包含根据本发明的腺病毒载体的试剂盒。试剂盒还可以包含连接到靶向部分的第二肽伴侣、准备与靶向部分进行蛋白融合的第二肽伴侣、或允许第二肽伴侣与靶向部分的基因进行基因融合的第二肽伴侣的基因序列。
[0103]
本发明还延伸到用于制备溶瘤病毒的试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的腺病毒载体。在所述试剂盒中还可以存在准备与靶向部分融合的第二肽伴侣的基因序列。另外的组成部分可以是使用说明书。还可以包含用于促进肽伴侣对之间共价键所必需的第三实体。在这种情况下，腺病毒载体将具有复制能力，并可以被修饰以包含确保破坏受感染的癌细胞的基因。
[0104]
本发明人知悉肽结合伴侣先前已用于疫苗制备，特别是用于病毒样颗粒。然而，这项技术不同于病毒载体的使用，由于病毒载体本身产生的免疫应答，病毒载体在疫苗制备中可能有不同的效用。与病毒样颗粒相比，病毒载体能有效进入细胞质，并且通常也能进入细胞核，这导致对病毒载体的细胞毒性t细胞反应增强。对于许多感染性疾病和癌症，细胞毒性t细胞反应是保护性免疫的主要组成部分。病毒样颗粒(vlp)在其尺寸(约20-200nm)、形状和重复蛋白排列上与病毒相似，但缺乏来自病原体的任何遗传物质。因此，vlp的合成方法和从vlp制备疫苗所面临的挑战与制备病毒载体的方法和从病毒载体制备疫苗面临的挑战有很大不同。这些肽伴侣对先前从未被用于或建议用于修饰免疫原性病毒载体的衣壳蛋白。
[0105]
此外，本发明人知悉其他人已经使用肽结合伴侣(最值得注意的是spytag)来修饰
其他病毒的表面。其他团队选择进行修饰的其他病毒对那些手头的腺病毒提出了不同的挑战。首先，先前修饰的大多数病毒是有包膜的。因此，修饰发生在作为脂质包膜一部分的蛋白上。在腺病毒中，本发明人已经发现，修饰非包膜病毒的衣壳蛋白并不像预期的那样简单，并且结构限制意味着在一些情况下，包含修饰并将感染性保持到令人满意的水平是不可能的。此外，先前进行的用形成共价键的肽伴侣对修饰病毒的工作集中在重新靶向病毒或改变趋向性上。这与本技术的主要关注不同，本技术的主要关注是在衣壳表面正确展示抗原以提高免疫应答。
[0106]
发明详述
[0107]
附图
[0108]
图1(a-d).通过将spytag或dogtag插入到六邻体hvr环中对腺病毒衣壳的模块化共价修饰。
[0109]
图1示出了本发明实施方案的四种代表。图1a)spycatcher与spytag通过异肽键的反应。图1b)dogcatcher与dogtag通过异肽键的反应。图1c)由snoopligase催化的snooptagjr与dogtag之间的偶联反应。图1d)模块化的六邻体修饰，示出病毒衣壳上dogtag的表面展示，以及随后肽或蛋白抗原通过snooptagjr或dogcatcher的偶联。图1e)腺病毒六邻体蛋白的多序列比对指示高变区(hvr)环1、2和5的位置以及在每个基因座插入spytag或dogtag之前在插入位点产生的缺失。阴影残基指示与ad5不同的残基身份。示出了来自以下人类腺病毒血清型的六邻体序列：ad5和ad2(种类c)、ad12和ad18(种类a)、ad3和ad35(种类b)、ad4(种类e)、ad40和ad41(种类f)。注意，在所测试的三个hvr中的每一个处，spytag重组体和dogtag重组体之间所指示的插入位点是相同的。在每个基因座处，spytag或dogtag序列两翼为gsggsg序列。
[0110]
图2(a-d).插入到ad5 hvr环中之后spytag的反应性。图2a：在环hvr1、hvr2或hvr5中展示spytag的ad5(1e 10病毒颗粒)与spycatcher在4℃孵育16h的sds-page和考马斯染色分析。图2b：图2a所示的样品的载体感染性测定。数据示出重复孔的每毫升的感染单位(ifu)平均值 范围。图2(c-d)：在hvr1处展示spytag的ad5(gfp)载体(ad5(gfp)hvr1-spytag)(1e 10病毒颗粒)与15μm或40μm的生物素化spycatcher在如所示的不同条件下孵育。图2c：展示spytag的ad5与spycatcher在20℃或37℃孵育3小时或者在20℃或4℃孵育16小时的sds-page考马斯染色分析。图2d：对图2c所示的相同样品进行了载体感染性测定。数据示出了重复孔的平均值 范围。
[0111]
图3(a-d).插入到ad5 hvr环中之后dogtag的反应性。图3a：在六邻体表面(在hvr 1、2或5中)展示dogtag的ad5载体与具有未修饰的六邻体(wt)的ad5载体的产量比较。每种载体批次的p:i比率(通过紫外分光光度法计算的总计病毒颗粒与通过gfp焦点测定计算的感染单位的比率)在每个条形上方示出。图3b：在hvr1、hvr2或hvr5处展示dogtag的ad5(1e 10病毒颗粒)与dogcatcher(5μm)在4℃孵育16h的sds-page和考马斯染色分析。图3c：对图3b所示的样品进行了载体感染性测定。数据示出了一式三份的孔的均值 sd。图3d：展示dogtag的ad5与dogcatcher在4℃孵育0.1小时、1小时或16小时的sds-page和考马斯染色。
[0112]
图4(a-c).由snoopligase指导的ad5 hvr-dogtag与snooptagjr的反应性。图4a：融合到her2亲和体的snooptagjr(snjr-affiher2)与插入到不同的hvr环中的dogtag的由snoopligase催化的反应性，通过sds-page和考马斯染色评估。图4b-c：snjr-affiher2与
ad5(gfp)hvr5-dogtag的反应性的温度依赖性。图4b：在4℃或20℃由snoopligase催化的snjr-affiher2与ad5(gfp)hvr5-dogtag之间反应的sds-page和考马斯染色分析。图4c：对图4b所述的相同样品进行了载体感染性测定。数据示出了重复孔的平均值 范围。图4d：甘油(15％w/v)和盐添加对snoopligase介导的反应性的影响的sds-page和考马斯斯染色分析。
[0113]
图5(a-b).使用抗六邻体免疫染色测定对非荧光重组载体进行的载体感染性评估。图5a：用具有wt六邻体蛋白的ad5载体或在hvr5处展示dogtag的ad5载体感染的hek293a细胞的抗六邻体免疫染色。使用4
×
物镜的明视野显微术，其中六邻体阳性细胞显示为黑色。比例尺＝1000μm。图5b：使用gfp荧光测定和六邻体免疫染色测定两者比较ad5(gfp)六邻体wt和ad5(gfp)hvr5 dogtag的感染性滴度。两种测定都是用同一板上相同的孔进行的，n＝4。进行了双尾t检验，但在各组之间未观察到统计学上显著的差异。条形示出了平均值
±
sd；点代表来自个体孔的斑点(spot)计数。
[0114]
图6(a-f).插入到六邻体环中的dogtag与加snooptagjr标签的肽的反应性。图6a：使用dogcatcher(dc)的竞争测定来评估由snoopligase(snl)催化的snooptagjr-肽(snjr-肽)与六邻体-dogtag(六邻体-dt)偶联的效率的图示。图6b：使用dogcatcher竞争测定，对snooptagjr-htert肽与六邻体-dt的偶联效率的sds-page和考马斯分析。图6c：使用dogcatcher竞争测定，对snooptagjr-siinfekl肽(pep1；snjr-ggs-siinfekl。pep2；snjr-aay-siinfekl)与六邻体-dt的偶联效率的sds-page和考马斯分析。图6d：使用单价链霉亲和素(msa)直接凝胶迁移测定以及使用抗六邻体抗体的蛋白印迹法评估snjr-肽与六邻体-dt偶联的图示。如果在煮沸后加入，则生物素-链霉亲和素相互作用在sds-page上是稳定的。图6e：使用msa直接凝胶迁移测定，对snjr-生物素与ad5-dt偶联的sds-page和考马斯分析。图6f：对图6c中所示的相同样品进行了载体感染性测定。条形示出重复孔的平均值和范围。
[0115]
图7(a-c).ad5 hvr dogtag与dogcatcher融合蛋白的偶联。图7a：三种dogcatcher融合构建体的图示；nanp9、nanp18和nanpd，源自恶性疟原虫(plasmodium falciparum)分离株3d7环子孢子蛋白(pfcsp)。图示了ndvp和nanp四肽重复序列。图7b：dogcatcher-nanpn与插入到六邻体hvr5环中的dogtag的反应性的sds-page和考马斯分析。图7c：对图7b所示的相同样品进行了载体感染性测定。条形示出了重复孔的平均值和范围。表面修饰的尺寸：dogcatcher-nanp9(～25-30kda)、dogcatcher-nanp18(～35-40kda)和dogcatcher-nanp结构域(～60kda)
[0116]
图8(a-c).通过异肽键通过六邻体偶联到ad5表面降低了病毒中和抗体的效力。图8a：通过snoopligase通过六邻体偶联到ad5表面降低了病毒中和抗体的效力。在存在不同浓度的靶向腺病毒六邻体的单克隆抗体(mab 9c12)的情况下，将腺病毒添加到细胞。根据细胞中表达的腺病毒编码的gfp的荧光检测到生产性腺病毒感染。单独的ad5-dt、ad5-dt snjr-affiher2和ad5-dt snl snjr-affiher2的荧光强度。图8b：dogcatcher-nanpn通过六邻体偶联到ad5表面降低了病毒中和抗体的效力，如图8a所分析的。来自单独的ad5-dt或偶联到ad5 dogtag的dogcatcher-nanpn的荧光强度。图8c：在存在不同稀释度的腺病毒中和血清的情况下，将腺病毒添加到细胞。根据细胞中表达的腺病毒编码的gfp的荧光检测到生产性腺病毒感染。来自单独的ad5-dt或偶联到ad5dogtag的dogcatcher-nanpn的荧光强度。
在a-c中，条形表示重复值的平均值和范围。
[0117]
图9：skov3细胞的人凝血因子x依赖性载体转导。ad5(gfp)-dogtag(ad5)或ad5(gfp)-dogtag:dogcatcher-nanp18(ad5-nanp18)载体(2e 9病毒颗粒)在存在或不存在人凝血因子x(8μg/ml)的情况下，在无血清培养基中在skov3细胞上在37℃孵育2h。然后将培养基替换为新鲜的完全培养基并将板孵育另外48h。然后通过荧光显微术对gfp阳性焦点计数来计算感染滴度。样品一式两份铺板，并且条形示出数据值的平均值和范围。
[0118]
图10(a-c).在衣壳表面展示siinfekl肽的ad5(gfp)载体产生针对衣壳展示肽和内部编码的gfp抗原两者的cd8

t细胞反应。图10a：小鼠免疫原性实验的设计和免疫计划，以评估cd8

t细胞对ad5表面展示肽抗原的反应。为了证实肽表位物理附接到衣壳表面的重要性，将施用附接了siinfekl的ad5(gfp)hvr5 dogtag(ad5-dt:siinfekl)与共施用ad5(gfp)hvr5 dogtag(ad5-dt)和游离siinfekl肽(组1和组2与组3)，以及共施用siinfekl肽和poly i:c佐剂(组4)后的siinfekl特异性t细胞反应进行了比较。图10b：脾离体ifnγ-elispot对siinfekl的应答(每百万脾细胞中的斑点形成细胞)。图10c：脾离体ifnγ-elispot对表位dtlvnriel(egfp
118-126
)的应答。在图10b和图10c中，点代表个体动物的反应，而条形代表具有中位值和范围。
[0119]
图11(a-d).通过在pix的c-末端融合spycatcher对腺病毒衣壳进行模块化共价修饰。图11a：模块化腺病毒衣壳修饰，示出spycatcher通过与pix融合在病毒衣壳的表面展示，以及随后的肽或蛋白抗原通过spytag的偶联。图11b：ad5(gfp)pix-spycatcher与spytag-麦芽糖结合蛋白(spytag-mbp，5μm)或spytag-人巨细胞病毒(hcmv)五聚体(spytag-五聚体，2.5μm)在4℃偶联16h的sds-page分析。gh是包含spytag的五聚体亚基。使用抗spycatcher多克隆小鼠血清通过蛋白印迹法检测蛋白。图11c：与spytag-肽偶联的ad5(gfp)pix-spycatcher的sds-page分析。添加单价链霉亲和素(msa)来诱导明显的凝胶迁移，并使用抗spycatcher多克隆小鼠血清通过蛋白印迹检测蛋白。图11d：对图11b和图11c所示的相同样品进行了载体感染性测定。条形示出一式三份的孔的均值和sd。
[0120]
图12(a-b).具有融合到pix的c-末端的spycatcher、snoopcatcher或dogcatcher的不同重组腺病毒载体的存活力、遗传稳定性和产量。图12a：具有融合到pix的c-末端的spycatcher、snoopcatcher或dogcatcher形式的不同ad5(gfp)载体的pix氨基酸序列示意图，以及与载体在hek293a细胞中的存活力和遗传稳定性(》3代之后)相关的相应信息。spycatcher dn1(δn1)是指来自本文件的其他图中使用的相同的n-末端截短形式的spycatcher。spycatcher dn1dc2(δn1，δc2)是指具有另外的c-末端截短的更短形式的spycatcher。图12b：存活的在pix的c-末端展示spycatcher、snoopcatcher或dogcatcher的ad5载体的产量比较(如图12a所示)。使用相等体积的培养细胞和相同的载体收获/纯化方案，将具有pix-catcher融合体的载体产量与ad5(gfp)hvr5 dogtag进行比较。对于snoopcatcher和dogcatcher融合体，条形表示n＝2批次的平均值和范围。
[0121]
图13(a-c).融合到pix的c-末端的snoopcatcher和dogcatcher的反应性。图13a：ad5(gfp)pix-snoopcatcher载体与融合到来自sars cov2的全长刺突蛋白(spike)的snooptagjr或融合到sars cov2刺突的受体结合结构域(rbd)的snooptagjr的反应性。将ad5(gfp)pix-snoopcatcher(3e 9病毒颗粒)单独孵育或者与spike-snooptagjr(0.75μm)或rbd-snooptagjr(5μm)在4℃共孵育16h。将样品在sds-page上运行，并使用针对
snoopcatcher具有反应性的多克隆小鼠血清进行蛋白印迹。指示了代表pix-snoopcatcher(pix-snc)、pix-snoopcatcher:snooptagjr-rbd(pix-snc:snjr-rbd)和pix-snoopcatcher:snooptagjr-spike(pix-snc:snjr-spike)的种类。图13b：使用图13a中所示的相同样品进行载体感染性测定。条形显示一式三份样品的平均值和sd。图13c：ad5(gfp)pix-dogcatcher载体与融合到小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin modifier，sumo)的dogtag的反应性。将ad5(gfp)pix-dogcatcher(1e 9病毒颗粒)单独孵育或与sumo-dogtag(17μm)在4℃共孵育16h。将样品在sds-page上运行，并使用针对dogcatcher具有反应性的多克隆小鼠血清进行蛋白印迹。指示了代表pix-dogcatcher(pix-dc)和pix-dogcatcher:dogtag-sumo(pix-dc:dt-sumo)的种类。
[0122]
图14(a-c).融合到pix的c-末端的snooptagjr和spytag的反应性。图14a：展示融合到pix的c-末端的snooptagjr或spytag的ad5载体的产量比较。两种载体在pix和tag之间都有ggs(eaaak)3gs接头序列。使用相等体积的培养细胞和相同的载体收获/纯化方案，对pix-catcher融合体与ad5(gfp)hvr5 dogtag在hek293a细胞中的载体产量进行比较。图14b：ad5(gfp)pix-snooptagjr与融合到sars cov2 rbd的snoopcatcher的反应性和ad5(gfp)pix-spytag与融合到sars cov2rbd的spycatcher的反应性。将载体(1e 10病毒颗粒)单独孵育或者与rbd-snoopcatcher、snoopcatcher-rbd或rbd-spycatcher(均为3.5μm)在4℃共孵育16h。将样品在sds-page上运行，并使用多克隆抗rbd抗体进行蛋白印迹。代表pix-snooptagjr:snoopcatcher-rbd(pix-snjr:snc-rbd)、pix-spytag:spycatcher-rbd(pix-st:sc-rbd)和非偶联的snoopcatcher-rbd/spycatcher-rbd(snc/sc-rbd)的种类被指示并标记(*)。图14c：使用图14b所示的相同样品进行了载体感染性测定。条形示出了重复样品的平均值和范围。
[0123]
腺病毒
[0124]
腺病毒(ad)是无包膜的双链dna病毒，具有约36千碱基(kb)的基因组。有超过60种人类腺病毒血清型，分组为种类a-g。每组包括许多腺病毒血清型，例如，亚组种类c包括ad5和ad2。ad5是研究最广泛的血清型，并且也是溶瘤病毒开发中应用最广泛的平台。在溶瘤病毒的开发中，期望能够靶向特定的组织，并因此可以改变趋向性。在临床环境中使用一些腺病毒血清型(包括ad5)的主要问题是人类预先存在的免疫力。腺病毒的尺寸通常为70-90nm，具有二十面体衣壳形状。外衣壳结构(也称为
‘
衣壳蛋白’)包括三种主要蛋白类型(六邻体、纤维和五邻体基底(penton base))。外衣壳中有另外的次要蛋白，包括vi、viii、ix、iiia和iva2。六邻体是腺病毒衣壳的主要组分，占衣壳蛋白的83％以上。hexon修饰已显示允许在一些情况下规避预先存在的中和抗体，包括交换来自不同血清型的hvr。
[0125]
用于修饰的腺病毒
[0126]
腺病毒可以是复制缺陷的：某些基因从基因组中缺失，以确保当腺病毒用作治疗剂时，它不再能够复制。这可以是由一组基因从基因组中缺失而引起，并且在从事腺病毒工作的人员的技术范围内。这可能是用于疫苗的优势，其中腺病毒载体的目的是以使抗原具有高免疫原性的形式将抗原呈递给免疫系统，同时限制细胞毒性。然而，对于其他应用诸如溶瘤病毒，具有复制能力是关键的。具有复制能力的腺病毒可以另含有一些修饰，以防止在正常细胞中复制，例如通过关键基因缺失。溶瘤ad载体在其生命周期结束时溶解癌细胞，并且重要的是子代不感染正常组织。癌细胞通常更允许腺病毒复制，而正常细胞需要腺病毒
有完整的基因补充来辅助复制。
[0127]
腺病毒可以来自腺病毒的任何血清型或毒株。因此，适合用于修饰的腺病毒可以来自那些感染除人类之外的哺乳动物的腺病毒，以便使先前的暴露影响最小化。衣壳结构高度保守，因此腺病毒血清型和种类可以互换。
[0128]
腺病毒可以是任何修饰的腺病毒。因此，修饰的腺病毒可以另外编码例如抗原。然后这些编码的抗原将在感染后表达。这提供了多方面预防或治疗的可能性，使得一种抗原可以展示在病毒表面，而另一种抗原在载体转导后使用宿主细胞机器表达。因此，腺病毒可以被遗传修饰，从而例如它包含转基因。该转基因被设计成用于递送至宿主细胞并且可以是例如编码抗原的基因。
[0129]
腺病毒介导的感染性
[0130]
腺病毒在表达柯萨奇病毒及腺病毒受体(car)的细胞中的感染性是通过纤维蛋白介导的。表达car受体的细胞系的实例是hek293细胞。纤维与细胞表面的car受体结合，并且这介导了病毒的最初附接。然而，最近表明，替代纤维介导的腺病毒进入，存在于人血清中的凝血因子因子x(fx)可以与一些腺病毒血清型的六邻体蛋白结合，以促进病毒进入一些细胞类型。通过六邻体蛋白介导感染的细胞系的实例是skov3。认为fx通过腺病毒六邻体介导的感染可以增强腺病毒载体在体内的肝趋向性。如实施例中所展示的，对六邻体蛋白的修饰诸如dogtag的插入和与抗原的偶联降低了六邻体介导的对细胞的感染性。这是一种理想的效果，因为当以非常高的剂量静脉内注射时，腺病毒的天然趋向性可以在患者中引起肝毒性。减少六邻体介导的感染性以减少肝毒性将有利于本发明。
[0131]
六邻体衣壳蛋白
[0132]
六邻体衣壳蛋白的尺寸为约100kda，每个病毒粒子720个单体。六邻体单体组织成三聚体，从而在20个面中的每个面上有12个三聚体，导致每个病毒粒子240个三聚体。六邻体序列包含对应于病毒外表面上的环的高变区(hvr)，并因此几乎覆盖了病毒的整个表面。每个单体具有7个hvr，被鉴定为hvr1-hvr7，它们是血清型特异性的。由于环位于病毒的外表面，因此六邻体环是主要的抗原识别位点，即宿主免疫应答的靶。六邻体蛋白的长度各不相同，例如，ad2是已知最长的六邻体，具有968个氨基酸的长度(uniprot id：p03277)。最常用的基因治疗腺病毒ad5具有952个氨基酸的长度(uniprot id：p04133)。修饰含有血清型特异性表位的六邻体hvr看起来是克服宿主中和反应的有前景的方法。任何一种hvr都可以被修饰。如本文所例示，令人惊讶地使用dogtag成功地对hvr1、hvr2和hvr5进行了修饰。当根据本发明修饰六邻体蛋白并通过肽伴侣对附接抗原时，抗腺病毒中和抗体的中和降低。
[0133]
pix衣壳蛋白
[0134]
pix蛋白是一种次要衣壳蛋白，其尺寸为约14.3kda。每个病毒粒子有约240个pix单体。pix蛋白的功能是稳定病毒表面的六邻体。pix蛋白的c-末端暴露在病毒表面，并因此是用于小肽和大肽融合的理想位点。ad5 pix具有通过柔性接头连接的两个结构域。ad5 pix蛋白具有196个氨基酸的长度(uniprot id：q2ks03)。
[0135]
对衣壳蛋白的修饰
[0136]
对衣壳蛋白的修饰可以是遗传的或非遗传的，包括化学的。可以通过将抗原掺入到衣壳中对衣壳蛋白进行遗传修饰。可选地，病毒颗粒表面可以被直接修饰。先前已展示了对所有三种主要衣壳蛋白的修饰。然而，这些修饰的结果好坏参半，并且最有前景的方法提
供的插入尺寸存在重大障碍，特别是在六邻体修饰方面。
[0137]
如本文所用的“至少一种修饰”是指使用任何适当的手段将第一肽伴侣插入到病毒衣壳蛋白中。例如，将第一肽伴侣插入到腺病毒的六邻体环中或将第一肽伴侣融合到腺病毒pix次要衣壳蛋白。这种修饰可以例如通过基因融合在遗传上进行，或在化学上进行。
[0138]
插入
[0139]
可以将第一肽伴侣直接插入到相关衣壳蛋白中。如本文所讨论的，这样的插入是通过遗传操作实现的。可选地，第一肽伴侣可以与任何合适长度的肽序列一起插入，该肽序列将第一肽伴侣与衣壳蛋白分隔。该肽序列可以描述为接头序列、间隔序列、结构序列诸如螺旋或甚至铰链序列。接头序列或间隔序列可以简单地分隔衣壳蛋白和第一肽伴侣，并用作两个实体之间的“连接(link)”。结构序列可以提供第一肽伴侣与衣壳蛋白的物理分隔。铰链序列可以用作衣壳蛋白和第一肽伴侣之间的接头，但允许发生一定程度的运动，使得第一肽伴侣可以相对于衣壳蛋白移动。本文举例说明了各种接头、间隔区和铰链序列，最值得注意的是图12中描绘的那些。
[0140]
当插入到序列的环中时，第一肽伴侣可以在一侧或两侧与衣壳蛋白分隔，即它的侧翼可以是为接头、间隔物、结构或铰链的序列。每个侧翼可以是相同或不同的。
[0141]
肽伴侣对
[0142]
能够自发形成异肽键的蛋白(所谓的“异肽蛋白”)已被有利地用于开发彼此共价结合并提供不可逆相互作用的肽伴侣对(即两部分接头(two-part linkers))(参见例如wo2011/098772和wo2016/193746，两者通过引用并入本文，以及wo2018/189517和wo2018/197854，两者通过引用并入本文)。在这方面，能够自发形成异肽键的蛋白可以表达为单独的片段，以提供第一肽伴侣和作为第一肽伴侣的肽结合伴侣的第二肽伴侣，其中这两种片段能够通过异肽键形成而共价重构。这种共价重构将融合到第二肽伴侣和必需的第一肽伴侣的分子或组分连接起来。由肽伴侣对形成的异肽键在非共价相互作用将快速解离的条件(例如长时间段(例如数周)、高温(到至少95℃)、高作用力或苛刻的化学处理(例如ph 2-11、有机溶剂、去污剂或变性剂))下是稳定的。
[0143]
异肽键是在羧基基团/羧酰胺基团和氨基基团之间形成的酰胺键，其中羧基基团或氨基基团中的至少一个在蛋白主链(蛋白的骨架)之外。这样的键在典型的生物条件下是化学上不可逆的，并且它们对大多数蛋白酶有抗性。由于异肽键本质上是共价键，因此它们导致了一些最强的测量到的蛋白-蛋白相互作用。
[0144]
简而言之，两部分接头，即肽伴侣对(所谓的肽标签/结合伴侣或捕手对)可以衍生自能够自发形成异肽键的蛋白(异肽蛋白)，其中该蛋白的结构域被单独表达以产生包含参与异肽键的残基之一(例如天门冬氨酸或天冬酰胺、或赖氨酸)的肽“标签”，以及包含参与异肽键的其他残基(例如赖氨酸、或天冬氨酸或天冬酰胺)和形成异肽键所需的至少一个其他残基(例如谷氨酸)的肽伴侣或肽结合伴侣(或“捕手”)。将肽标签和结合/捕手伴侣混合导致标签和结合伴侣之间自发形成异肽键。因此，通过将肽标签和结合伴侣分别掺入到不同的分子或组分例如蛋白中，可以通过在肽标签和结合伴侣之间形成的异肽键将所述分子或组分共价连接，即，在掺入肽标签和结合伴侣的分子或组分之间形成接头。
[0145]
异肽键的自发形成可以是孤立的，并不需要添加任何其他实体。对于一些肽标签和结合/捕手伴侣对，可能需要第三实体或辅助实体(诸如连接酶)的存在以便生成异肽键。
[0146]
肽标签/结合伴侣对(两部分接头)，称为spytag/spycatcher，衍生自化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)fbab蛋白的cnab2结构域(zakeri等人，2012，proc natl acad sci u s a 109，e690-697)并用于包括疫苗开发在内的各种应用(brune等人，2016，scientific reports 6，19234；thrane等人，2016，journal of nanobiotechnology 14,30)。
[0147]
结合对的变体、衍生物和修饰可以通过任何合适的方法进行。变体、衍生物和功能上可操作的修饰可以包括氨基酸添加、取代、改变或缺失，在与相关结合伴侣形成异肽键的能力方面保持相同功能。
[0148]
对于一些结合对，需要第三实体诸如酶的介导。例如，snoopligase可用于介导snooptagjr/snooptag和dogtag之间的键形成。因此，配对可能需要酶诸如连接酶的辅助。
[0149]
将理解，如本文所用，第一肽伴侣或第二肽伴侣中的任一种可以是肽“标签”，而另一种是“结合伴侣/捕手”。
[0150]
适当地，第一肽伴侣和第二肽伴侣形成称为spytag/spycatcher的肽伴侣对。适当地，spycatcher组分是deltan1(δn1)spycatcher(如在li,l.,fierer,j.o.,rapoport,t.a.&howarth,m.structural analysis and optimization of the covalent association between spycatcher and a peptide tag.j.mol.biol.426，309-317(2014)中所述)，与“spycatcher”相比，deltan1(δn1)spycatcher在n-末端具有23个氨基酸的截短。
[0151]
在其他实施方案中，第一肽伴侣和第二肽伴侣形成肽伴侣对，该肽伴侣对是spytag/spycatcher的突变形式，显示出增加的异肽键形成的反应速率，诸如，例如在共同未决申请gb1706430.4中描述的那些。在一些实施方案中，这些突变形式可以用于大蛋白(例如》50kda或》100kda，诸如本文举例说明的》160kda的hcmv五聚体蛋白)的附接，和/或其中反应缓慢或空间位阻可能是一个问题的附接。
[0152]
在其他实施方案中，形成肽伴侣对的异肽蛋白可以包括snooptag/snoopcatcher，例如在wo 2016/193746中描述的。
[0153]
在一些实施方案中，形成肽伴侣对的一种或两种异肽蛋白可以具有n-末端或c-末端截短，同时仍然保持异肽键的反应性。
[0154]
在下表中描述了示例性第一肽伴侣和第二肽伴侣对(肽标签/结合伴侣对；反应对)：
[0155][0156][0157]
这些实体在例如wo2011/098772、wo2016/193746、gb1706430.4、gb1705750.6或li l.,等人,j.mol.biol.426,309
–
317(2014)中描述。
[0158]
结合对的变体、衍生物和修饰可以通过任何合适的方法进行。变体、衍生物和功能上可操作的修饰可以包括在与相关结合伴侣形成异肽键的能力方面保持相同功能的氨基酸添加、取代、改变或缺失。
[0159]
对于一些结合对，需要第三实体诸如酶的介导。例如，snoopligase可用于介导snooptagjr和dogtag之间的键形成。因此，配对可能需要酶诸如连接酶的辅助。
[0160]
抗原
[0161]
如本文所用的抗原是指能够诱导免疫应答的任何分子。抗原可以是自身抗原、癌症抗原、过敏原性抗原、肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原或真菌抗原。肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原和新抗原(由癌细胞新形成的抗原)。“肿瘤特异性抗原”是指只存在于肿瘤细胞上的抗原。“肿瘤相关抗原”是指由肿瘤细胞和正常细胞两者呈
现的抗原。“新抗原”是指由肿瘤细胞新形成的抗原。如本文所用的“抗原”包括肽和表位、其变体和衍生物。
[0162]
肿瘤相关抗原包括但不限于脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、aim-2、aldh1a1、α-肌动蛋白-4、甲胎蛋白(“afp”)、artc1、b-raf、bage-1、bclx(l)、bcr-abl融合蛋白b3a2、β-连环蛋白、bing-4、ca-125、calca、癌胚抗原(cea)、cage 1至8、casp-5、casp-8、cd274、cd45、cdc27、cdk12、cdk4、cdkn2a、cea、clpp、coa-1、cpsf、csnk1a1、ctag1、ctag2、周期蛋白dl、周期蛋白-al、dek-can融合蛋白、dkk1、eftud2、延伸因子2、enah(hmena)、ep-cam、epcam、epha3、上皮肿瘤抗原(eta)、etv6-aml1融合蛋白、ezh2、erbb受体、e6、e7、fgf5、flt3-itd、fn1、g250/mn/caix、gage-1、gage-2、gage-8、gage-3、gage-4、gage-5、gage-6、gage-7、gas7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gntv、gp100/pmel 17、gpnmb、haus3、hepsin、her-2/neu、herv-k-mel、hla-a11、hla-a2、hla-dob、hsp70-2、hpv e2、hpv e6、hpv e7抗原、ido1、igf2b3、il13rα2、肠羧基酯酶、k-ras、激肽释放酶4、kif20a、kk-lc-1、kklc1、km-hn-1、kmhn1也称为ccdc110、lage-1、ldlr-岩藻糖基转移酶融合蛋白、lengsin、m-csf、mage-a1、mage-a 10、mage-a12、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a6、mage-a9、mage-c1、mage-c2、苹果酸酶、乳腺球蛋白-a、mart2、matn、mc1r、mcsp、mdm-2、me1、melan-a/mart-1、meloe、中期因子、mmp-2、mmp-7、muc1、muc5ac、粘蛋白、mum-1、mum-2、mum-3、肌球蛋白、肌球蛋白i类、n-raw、na88-a、neo-pap、nfyc、ny-br-1、ny-eso-l/lage-2、oa1、ogt、os-9、p多肽、p53、pap、pax5、pbf、pml-rarα融合蛋白、多态性上皮粘蛋白(pem)、ppp1r3b、prame、prdx5、psa、psma、ptprk、rab 38/ny-mel-1、rage-1、rbaf600、rgs5、rhoc、r f43、ru2as、sage、secernin 1、sirt2、snrpd1、sox10、spl7、spa17、ssx-2、ssx-4、steap1、存活蛋白、syt-ssx1或syt-ssx2融合蛋白、tag-1、tag-2、端粒酶、tgf-βrii、tpbg、trag-3、磷酸丙糖异构酶、trp-1/gp75、trp-2、trp2-int2、酪氨酸酶(tyr)、vegf、wt1、xage-lb/gaged2a。
[0163]
鉴定肿瘤相关抗原领域的技术人员将认识到，新的抗原，包括新抗原，不断被鉴定出来，并且因此该列表并不是穷尽的。
[0164]
病毒抗原包括但不限于以下病毒或病毒类别的抗原；人类乳头瘤病毒(hpv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、单纯疱疹病毒(hsv2/hsv1)、流感病毒(a型、b型和c型)、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、鼻病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、诺沃克病毒群、肠道病毒、星状病毒、麻疹病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒、人类巨细胞病毒(hcmv)、爱泼斯坦-巴尔病毒、腺病毒、风疹病毒、人类t细胞淋巴瘤i型病毒(htlv-i)、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、丁型肝炎病毒、痘病毒、马尔堡病毒和埃博拉病毒、sars-cov-2。
[0165]
细菌抗原包括但不限于以下细菌的抗原：结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、衣原体属(chlamydia)、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)、志贺氏菌属(shigella)、沙门氏菌属(salmonella)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、梅毒螺旋体(treponema pallidum)、假单胞菌属(pseudomonas)、百日咳博德特氏菌(bordetella pertussis)、布鲁氏菌属(brucella)、土拉弗朗西斯菌(francisella tularensis)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、问号钩端螺旋体(leptospira interrogans)、嗜肺军团菌(legionella pneumophila)、鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)、链球菌属(streptococcus)(a型和b型)、肺炎球菌属(pneumococcus)、脑膜炎球菌属
(meningococcus)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)(b型)、弓形虫(toxoplasma gondii)、弯曲菌属(campylobacter)、卡他莫拉菌(moraxella catarrhalis)、肉芽肿克雷伯菌(klebsiella granulomatis)和放线菌属(actinomyces)。
[0166]
真菌抗原包括但不限于以下真菌病原体的抗原：假丝酵母属(candida)和曲霉属(aspergillus)、隐球菌属(cryptococcus)、组织胞浆菌属(histoplasma)和肺孢子菌属(pneumocystis)。
[0167]
寄生虫抗原包括但不限于以下寄生虫病原体的抗原：带绦虫属(taenia)、吸虫(fluke)、圆虫(roundworm)、疟原虫属(plasmodium)、变形虫属(amoeba)、贾第虫属(giardia)、隐孢子虫属(cryptosporidium)、血吸虫属(schistosoma)、滴虫属(trichomonas)、锥虫属(trypanosoma)和旋毛虫属(trichinella)。
[0168]
为了在偶联之前增强抗原-第二肽伴侣的表达，可以使用前导序列。本领域技术人员知悉合适的增强表达的前导序列。这里举例说明了这些前导序列。
[0169]
药物组合物和用途
[0170]
本发明的组合物可以掺入疫苗或治疗性组合物中。适当地，疫苗或免疫原性组合物将包含免疫原性剂量的本发明的颗粒。
[0171]
药物组合物可以包含根据本发明的颗粒或组合物，其提供有药学上可接受的载体。合适的载体是本领域技术人员所熟知的。在一种实施方案中，药物组合物包含缓冲剂、赋形剂或载体(carrier)。适当地，药物组合物可以包含合适的赋形剂和配制剂(formulations)以保持组合物的稳定性。适当地，所述配制剂可以包含佐剂。在一种实施方案中，配制剂可以包含addavax
tm
或具有类似于的配方的类似的基于角鲨烯的水包油纳米乳液。其他合适的佐剂包括基于脂质体的佐剂，诸如matrix m和as01。其他合适的佐剂包括基于铝的配制剂，诸如在一种实施方案中，配制剂可以包含edta，例如浓度为5mm。合适的赋形剂或配制剂可取决于颗粒或免疫原性组合物的性质；例如，表达系统的选择可能影响组合物的蛋白的稳定性、糖基化或折叠，这继而可能影响组合物的最佳配方。确定合适的赋形剂、配制剂或佐剂的方法将是本领域技术人员已知的。
[0172]
疫苗
[0173]
疫苗是包含针对其可以引起免疫应答的片段或整个实体的制剂。它是能够诱导免疫应答的实体，诸如蛋白、肽、脂蛋白、糖蛋白或其片段。例如，疫苗可以包含微生物或其能够诱导针对所述微生物的免疫应答的部分。包含根据本发明的免疫原性腺病毒载体的疫苗可用于对抗任何病原体，对于所述病原体，所展示的抗原对诱导免疫应答至关重要。此外，疫苗可以包含根据本发明的展示肿瘤相关抗原的免疫原性腺病毒载体。这些肿瘤相关抗原可以是修饰的自身蛋白等。因此，疫苗可以提高对肿瘤细胞的免疫应答。
[0174]
这样的疫苗组合物(或其他免疫原性组合物)配制在合适的递送媒介物中。通常，免疫原性组合物的剂量在为治疗性组合物定义的范围内。任选地，本发明的疫苗组合物可以配制成含有其他组分，包括例如佐剂、稳定剂、ph调节剂、防腐剂等。这些组分是疫苗领域的技术人员熟知的。合适的佐剂的实例包括但不限于脂质体、明矾、单磷酰基脂质a和任何生物活性因子，诸如细胞因子、白细胞介素、趋化因子及其最佳组合。
[0175]
本发明可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠、表面(topically)、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮
下、囊内、粘膜、心包内、口服、局部和/或使用气雾剂、注射、输注、连续输注、直接或通过导管和/或灌洗对靶细胞进行局部灌注浴施用。
[0176]
如本文所用的用于治疗或预防疾病的疫苗包括但不限于泌尿生殖道癌(诸如前列腺癌、肾细胞癌、膀胱癌)、妇科癌(诸如卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌)、肺癌、胃肠道癌(诸如非转移性或转移性结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、恶性胶质母细胞瘤、恶性间皮瘤、非转移性或转移性乳腺癌(诸如激素难治性转移性乳腺癌)、恶性黑素瘤、默克尔细胞癌或骨和软组织肉瘤，以及血液肿瘤，诸如多发性骨髓瘤、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征和急性淋巴母细胞白血病。在优选实施方案中，该疾病是非小细胞肺癌(nsclc)、乳腺癌(例如激素难治性转移性乳腺癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、激素敏感或激素难治性前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、软组织肉瘤或小细胞肺癌。
[0177]
该疫苗可用于治疗或预防任何一种上文描述的致病病原体的感染。
[0178]
ad-dogtag
[0179]“ad-dogtag病毒载体包含dogtag向六邻体衣壳蛋白的表面环中的插入，从而能够展示多达～720个配体/病毒粒子。本发明人使用加snooptagjr标签的抗原(使用snoopligase作为催化剂)或直接通过dogcatcher连接的抗原实现了抗原与六邻体-dogtag的偶联。先前的技术仅能够将长度为＜100个氨基酸的小的免疫原性t细胞或b细胞表位插入到腺病毒六邻体环中。本发明展示了10-60kda的肽与六邻体的偶联，这在先前是不可能实现的。这代表着在开发特别是基于腺病毒的疫苗方面前进了一大步。
[0180]
ad-spycatcher
[0181]“ad-spycatcher”病毒载体包含spycatcher向腺病毒次要衣壳蛋白pix的c-末端上的融合。本发明在不损失病毒感染性的情况下成功地修饰了pix次要衣壳蛋白。
[0182]
ad-snoopcatcher
[0183]“ad-snoopcatcher”病毒载体包含snoopcatcher向腺病毒次要衣壳蛋白pix的c-末端上的融合。本文的工作显示在不损失病毒感染性的情况下成功地修饰了pix次要衣壳蛋白。
[0184]
ad-dogcatcher
[0185]“ad-dogcatcher”病毒载体包含dogcatcher向腺病毒次要衣壳蛋白pix的c-末端上的融合。本文的工作显示在不损失病毒感染性的情况下成功地修饰了pix次要衣壳蛋白。
[0186]
ad-snooptagjr
[0187]“ad-snooptagjr”病毒载体包含snooptagjr向腺病毒次要衣壳蛋白pix的c-末端上的融合。本文的工作显示在不损失病毒感染性的情况下成功地修饰了pix次要衣壳蛋白。
[0188]
ad-spytag
[0189]“ad-spytag”病毒载体包含spytag向腺病毒次要衣壳蛋白pix的c-末端上的融合。本文的工作显示在不损失病毒感染性的情况下成功地修饰了pix次要衣壳蛋白。
[0190]
在允许的情况下，本文提及的所有参考文献均通过引用并入本文。
实施例
[0191]
现在将通过实例的方式并参考上述附图来说明本发明的某些方面和实施方案。
[0192]
实施例
–
材料和方法：
[0193]
产生表达gfp的细菌人工染色体(bac)衍生的复制缺陷性ad5分子克隆
[0194]
从invitrogen获得质粒pad-pl-dest，一种e1/e3缺失(并因此复制缺陷)的ad5分子克隆。将由驱动增强型绿色荧光蛋白(egfp)表达的即刻早期巨细胞病毒启动子(cmvp)组成的表达构建体克隆到穿梭载体pentr4(invitrogen)中。然后使用invitrogen gateway位点特异性重组(lr克隆酶)技术将cmvp egfp表达构建体插入到ad5 e1基因座中。使用正向引物(5
’‑
ttaattaacgtcgaccaattctcatg)和反向引物(5
’‑
ttaattaagtcgacagcgacacacttg)扩增来自pbelobac11(neb)的bac序列，以在bac盒的任一端引入paci位点。随后用paci将整个ad5(gfp)基因组序列克隆到bac中，以产生pbac-ad5(gfp)。
[0195]
使用bacgalk重组工程化对pbac-ad5(gfp)进行遗传修饰以将蛋白强力胶技术(protein superglue technology)插入到病毒衣壳蛋白中
[0196]
galk重组工化所需的大肠杆菌(e.coli)菌株sw102从美国国立卫生研究院国家癌症研究所(national cancer institute,national institutes of health,usa)获得。由dh10b修饰而来的sw102细胞含有处于温度敏感型阻遏子控制下的λ-red编码的重组基因(exo、bet、gam)并且半乳糖激酶(galk)基因(该基因是使用半乳糖作为唯一碳源时细菌生长所必需的)缺失。galk重组工程化系统使得galk基因能够用于正选择和负选择两者，并且galk重组工程化完全按照warming等人，2005[warming s,costantino n,court dl,jenkins na,copeland ng.simple and highly efficient bac recombineering using galk selection.nucleic acids res.2005；33(4):e36]中的描述进行。在六邻体hvr环中(如图1e中所述)或pix的c-末端处创建插入位点，通过重组工程化将galk基因插入这些特定基因座，然后对galk的存在进行正选择。通过重组工程化来进行spytag/dogtag/snooptagjr/spycatcher/snoopcatcher/dogcatcher序列的插入以替换galk，并且然后使用2-脱氧半乳糖针对galk基因的存在进行选择。
[0197]
掺入了蛋白强力胶技术的重组腺病毒的拯救
[0198]
用paci将来自重组腺病毒分子克隆的bac dna线性化，以释放左侧和右侧的病毒末端反向重复序列(itr)。使用lipofectamine 2000试剂(invitrogen)将线性化dna转染到25cm2瓶(t25)中的e1补充性人胚胎肾(hek)293a细胞(invitrogen)。在观察到细胞病变效应(cpe)后，收获细胞，进行三个冻融循环，并将病毒在hek293a细胞中进一步扩增。根据标准方案，感染10
×
150cm2瓶(t150)后，48小时后从感染细胞中收获病毒，并通过cscl梯度超速离心纯化。纯化的病毒在蔗糖储存缓冲液(10mm tris-hcl、7.5％w/v蔗糖、ph7.8)中透析，并储存于-80℃。
[0199]
纯化病毒载体制剂的病毒颗粒计数的估计
[0200]
纯化制剂中腺病毒颗粒的数量可以通过260nm处的分光光度吸收测量病毒dna含量来估计，如maizel等人1968.[j.maizel,d.white,m.scharff,the polypeptides of adenovirus:i.evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of types 2,7a,and 12.virology,第36卷,第1期,1968年9月,第115-125页]所描述的。简而言之，将样品在含有1％w/v的十二烷基硫酸钠(sds)的病毒储存缓冲液中按1:10稀释，以从衣壳中释放病毒dna，并使用分光光度计测量260nm处的吸光度。在260nm处1.00的吸光度(au，1cm路径长度)对应于1.1
×
10
12
个病毒颗粒/ml。
[0201]
重组腺病毒在hek293a细胞中的感染性滴定
[0202]
通过单细胞感染性测定评估载体制剂对hek293a细胞的感染滴度。对于表达egfp的载体，受感染的hek293细胞通过荧光显微术直接进行可视化和计数。还通过六邻体衣壳蛋白表达的免疫染色对无荧光标志物的载体的替代测定进行了测试(图5)。在无菌96孔深孔板中，在完全培养基(dulbecco改良的eagles培养基，加1
×
glutamax和10％v/v胎牛血清)中对病毒进行10倍系列稀释。对每种病毒进行两次或三次系列稀释，并且含有80％-90％汇合的贴壁hek293细胞的96孔板的每个孔中添加50μl的每种稀释液(103至10
10
稀释度)。对于六邻体免疫染色，使用预涂覆聚-l-赖氨酸的96孔板来提高细胞与板表面的粘附性。将板在37℃、5％co2孵育48小时。对于表达egfp的载体的滴定，感染后48小时，通过荧光显微术对单个gfp阳性细胞进行计数，并以每毫升感染单位(ifu)计算感染滴度。对于六邻体免疫染色，从细胞单层吸出培养基，并用冰冷的甲醇固定细胞。然后将板以dulbecco磷酸盐缓冲盐水(pbs 1x，gibco)洗涤3次，然后用3％w/v低脂牛奶(marvel)封闭1小时。将检测性小鼠单克隆抗六邻体抗体(b025/ad51，thermo-fisher)以1:1000稀释添加到pbs中的1％w/v牛奶中，并在25℃孵育1小时。一抗孵育后，用pbs中的1％w/v牛奶再洗涤细胞3次，然后添加在pbs中的1％w/v牛奶中以1:1000稀释的碱性磷酸酶(alp)缀合的山羊抗小鼠二抗(star117a,biorad)。再孵育一小时后，将板以pbs洗涤五次，然后显影。为了显影，将100μl新鲜制备的sigmafast bcip/nbt溶液(sigma)添加到每个孔中，并将板在25℃孵育，直到出现代表单个感染细胞的深染色的焦点(dark stained foci)。cscl纯化的载体制剂的p:i比率通过将每毫升病毒颗粒的估计数量除以每毫升感染单位(ifu)数来计算。
[0203]
凝血因子x介导的载体对skov3细胞的转导的评估
[0204]
skov3细胞(人卵巢腺癌)从英国公共卫生部(public health england)获得，并在含有2mm谷氨酰胺和15％v/v的胎牛血清的mccoy 5a培养基(完全mccoy培养基)中培养。对于该测定，将表达gfp的载体在无血清培养基中系列稀释(1:10至1:107)。将人凝血因子x(fx)以8μg/ml的终浓度添加到稀释的载体中(包括未添加fx的对照样品)。将vector-fx混合物添加到96孔板中的skov3细胞单层(80％-90％汇合)中，并在37℃和5％co2与细胞一起孵育2h。2h后，用完全mccoy培养基替换载体-fx混合物，并将板在37℃、5％co2再孵育48h。48h后通过如上所述的gfp阳性焦点计数来评估感染性。
[0205]
蛋白和肽配体的产生
[0206]
spytag融合的肽配体和snooptagjr融合的肽配体由insight biotechnology使用固相合成技术以》95％的纯度产生。通过hplc和质谱法对肽进行质量控制。
[0207]
将用于表达加多组氨酸标签的重组dogcatcher-nanp融合蛋白的dna构建体克隆到表达质粒pet45( )(emd millipore)中，用于在bl21(de3)大肠杆菌(neb)中产生蛋白。分别合成dogcatcher和来自疟疾3d7株的恶性疟原虫环子孢子蛋白(pfcsp)的dna序列(geneart，thermo fisher)，通过pcr扩增个体构建体所需的dna片段，并通过限制性克隆组装到pet45( )中。根据先前公布的方案[snoopligase catalyzes peptide-peptide locking and enables solid-phase conjugate isolation.buldun cm,jean jx,bedford mr,howarth m.j am chem soc.2018 feb 28；140(8):3008-3018.doi:10.1021/jacs.7b13237]，使用亲和ni-nta树脂(qiagen)纯化重组蛋白，透析到pbs中，并储存于-80℃。
hvr-dogtag和dogcatcher(包括dogcatcher融合体)之间、ad5-hvr-spytag或ad5-pix-spytag和spycatcher(包括spycatcher融合体)之间、ad5-pix-spycatcher和spytag(包括spytag融合体)之间、ad5-pix-snoopcatcher和snooptagjr(包括snooptagjr融合体)之间、ad5-pix-dogcatcher和dogtag(包括dogtag融合体)之间以及ad5-pix-snooptagjr和snoopcatcher(包括snoopcatcher融合体)之间的反应在4℃孵育16h。由snoopligase催化的ad5-hvr-dogtag和snooptagjr(包括snooptagjr融合体)之间的反应在4℃孵育48h。snoopligase催化的反应在含有终浓度15％v/v甘油和最少盐的缓冲液中进行，以提高偶联效率。
[0216]
通过将5e 11的ad5(gfp)-hvr5-dogtag病毒颗粒与35μmsnooptagjr-ggssiinfekl、30μm snoopligase和15％v/v甘油在总体积400μl中在4℃共孵育48小时来制备用于免疫研究的肽修饰载体批次。为了去除过量的肽和snoopligase(图10a，组1)，使用spectrapor透析盒(100kda mwco)将偶联载体透析到蔗糖储存缓冲液中。透析后在考马斯染色的sds-page凝胶上没有检测到过量的肽。将肽修饰的载体储存于-80℃，内毒素测试，并在免疫前对储存批次重新进行感染性滴定。
[0217]
通过sds-page评估偶联效率
[0218]
如上所述进行偶联反应，并通过添加sds上样缓冲液(biorad，31.5mm tris-hcl，ph 6.8，10％甘油，1％sds，0.005％溴酚蓝，300mm dtt)停止偶联反应。样品在95℃煮沸5min，并加载到sds-page(nupage4％-12％bis-tris,invitrogen)凝胶上。对于评估配体与ad5-hvr-dogtag或ad5-hvr-spytag的偶联的直接凝胶迁移测定，通过sds-page(200v，40-55min)分离蛋白并通过考马斯染色[用quick coomassie(generon)染色16h，用水脱色]可视化。通过使用imagej比较未偶联的六邻体-dogtag/六邻体-spytag和六邻体-dogtag:dogcatcher/六邻体-spytag:spycatcher的条带强度来评估偶联效率(对于六邻体-spytag:spycatcher偶联效率，偶联的六邻体百分比＝六邻体-spytag:spycatcher的条带强度除以六邻体-spytag:spycatcher和未偶联的六邻体-spytag的条带强度之和，乘以100)。
[0219]
对于ad5-hvr-dogtag与snooptagjr融合肽的偶联的评估，由于使用直接凝胶迁移测定无法准确地评估低分子量肽的偶联的事实，因此进行采用dogcatcher(dc)蛋白的竞争测定。偶联后，向反应中添加过量的dogcatcher蛋白(30μm)，并将样品在4℃再孵育24小时。由于dc与ad5表面上～100％的游离(未偶联)六邻体-dogtag分子结合(参见图3b)，因此与snooptagjr-肽偶联的六邻体-dogtag的比例可以估计为与dogcatcher一起孵育后，在考马斯染色的sds-page上未经历～20kda(dogcatcher的分子量)的凝胶迁移的六邻体的比例。
[0220]
dogcatcher竞争测定的替代测定利用高亲和力生物素:链霉亲和素相互作用(在室温sds上样缓冲液中稳定)通过直接凝胶迁移评估snooptagjr-肽与六邻体-dogtag的偶联。如前所述，将生物素化snooptagjr-肽与snoopligase和ad5-hvr-dogtag一起孵育。48小时后，通过在sds上样缓冲液中煮沸以使所有蛋白和病毒粒子结构变性来停止偶联反应。将样品在冰上短暂冷却，然后在25℃与过量的单价链霉亲和素(msa，相对于生物素肽2倍过量)一起孵育30min。将样品在sds-page上运行，转移至硝酸纤维素膜，并使用抗六邻体小鼠单克隆一抗(克隆65h6，thermfisher)进行蛋白印迹。使用山羊抗小鼠二抗-碱性磷酸酶(1:1000稀释)，然后用bcip/nbt底物(sigma)进行显影，将六邻体蛋白的迁移可视化。通过msa
与生物素之间的相互作用，观察到与snooptagjr-生物素偶联的六邻体-dogtag蛋白的凝胶迁移(～50k da)。
[0221]
为了评估蛋白配体与ad5-pix-spycatcher、ad5-pix-snoopcatcher、ad5-pix-dogcatcher、ad5-pix-spytag或ad5-pix-snooptagjr的偶联，将样品在sds-page上运行，并且然后转移至硝酸纤维素膜用于蛋白印迹。如图例中所述，使用一抗或小鼠抗血清和碱性磷酸酶偶联的二抗检测与pix融合体共价偶联的蛋白种类。蛋白印迹如上文所述地显影。
[0222]
抗体中和测定
[0223]
为了评估有效的中和性小鼠单克隆抗体(mab)9c12(developmental studies hybridoma bank,university of iowa)对载体的中和，在完全培养基中将ad5(gfp)载体与系列稀释的mab 9c12抗体以1:1的比在37℃一起孵育1小时。然后将载体-抗体混合物添加到96孔板形式中的80％汇合的hek293a细胞单层(以200ifu/细胞的感染复数感染细胞)。将细胞与载体-抗体混合物一起在37℃5％co2孵育2小时，然后用新鲜培养基替换混合物，并将板返回到37℃5％co2再孵育24h。24h后，hek293a细胞内的gfp表达用作载体感染性的读数；在荧光计(tecan)上使用395nm的激发波长和509nm的发射波长测量批量荧光(bulk fluorescence)。
[0224]
为了评估ad5阳性血清对载体的中和，通过用1e 8ifu的表达卵白蛋白的ad5载体(载体具有未修饰的六邻体)免疫小鼠获得血清样品。免疫后两周收获血清，储存于-80℃，并且然后系列稀释用于中和测定(在完全培养基中制备从1:8至1:1024的两倍稀释液，以在细胞单层上提供1:16至1:2048的最终范围)。将稀释的血清与ad5(gfp)载体一起孵育，将混合物在hek293细胞上孵育，并且24h后读取批量gfp荧光，完全如上文所述。
[0225]
小鼠免疫
[0226]
所有小鼠程序均按照英国动物(科学程序)法案项目许可证(uk animals(scientific procedures)act project licence，pa7d20b85)的条款进行，并由牛津大学伦理审查机构(oxford university ethical review body)批准。饲养在无特定病原体环境中的雌性c57bl/6小鼠(6周龄，charles river)通过向每只动物的两条后肢中注射50μl配制在无内毒素pbs(gibco)中的疫苗进行肌肉内免疫(总共100μl)。腺病毒载体以5e 9病毒颗粒的剂量施用，肽以5μg的剂量施用，并且poly i:c(invivogen)以10μg的剂量施用。内毒素剂量为每只小鼠《1eu。实验在biomedical services,university of oxford进行，并在免疫后两周完成。
[0227]
离体ifn-γelispot
[0228]
脾离体干扰素γ(ifn-γ)elispot按照先前描述的标准方案进行[larsen kc,spencer aj,goodman al,gilchrist a,furze j,rollier cs,kiss-toth e,gilbert sc,bregu m,soilleux ej,hill av,wyllie dh,expression of tak1 and tram induces synergistic pro-inflammatory signalling and adjuvants dna vaccines.vaccine.2009sep 18；27(41):5589-98]。为了测量抗原特异性应答，用终浓度为5μg/ml的肽再次刺激细胞18-20小时。为了测量siinfekl特异性应答，使用了siinfekl肽(cambridge bioscience)。对于gfp特异性应答，使用egfp肽dtlvnriel(egfp
118
–
126
)(由insight biotechnology合成)。用自动化elispot读取器系统(aid)测量斑点形成细胞(spot forming cell，sfc)。
[0229]
修饰的腺病毒序列：
[0230]
ad5-hvr-spytag序列
[0231]
ad5-hvr1-spytag六邻体序列
[0232]
氨基酸(seqidno:1)：
[0233]
matpsmmpqwsymhisgqdaseylspglvqfaratetyfslnnkfrnptvapthdvttdrsqrltlrfipvdredtaysykarftlavgdnrvldmastyfdirgvldrgptfkpysgtaynalapkgapnpcewdeagsggsgahivmvdaykptkgsggsgthvfgqapysginitkegiqigvegqtpkyadktfqpepqigesqwyeteinhaagrvlkkttpmkpcygsyakptnenggqgilvkqqngklesqvemqffstteatagngdnltpkvvlysedvdietpdthisymptikegnsrelmgqqsmpnrpnyiafrdnfiglmyynstgnmgvlagqasqlnavvdlqdrntelsyqllldsigdrtryfsmwnqavdsydpdvriienhgtedelpnycfplggvintetltkvkpktgqengwekdatefsdkneirvgnnfameinlnanlwrnflysnialylpdklkyspsnvkisdnpntydymnkrvvapglvdcyinlgarwsldymdnvnpfnhhrnaglryrsmllgngryvpfhiqvpqkffaiknllllpgsytyewnfrkdvnmvlqsslgndlrvdgasikfdsiclyatffpmahntastleamlrndtndqsfndylsaanmlypipanatnvpisipsrnwaafrgwaftrlktketpslgsgydpyytysgsipyldgtfylnhtfkkvaitfdssvswpgndrlltpnefeikrsvdgegynvaqcnmtkdwflvqmlanynigyqgfyipesykdrmysffrnfqpmsrqvvddtkykdyqqvgilhqhnnsgfvgylaptmregqaypanfpypligktavdsitqkkflcdrtlwripfssnfmsmgaltdlgqnllyansahaldmtfevdpmdeptllyvlfevfdvvrvhrphrgvietvylrtpfsagnatt
[0234]
dna(包括终止密码子(incl.stop))(seq id no:2)：
[0235]
atggctaccccttcgatgatgccgcagtggtcttacatgcacatctcgggccaggacgcctcggagtacctgagccccgggctggtgcagtttgcccgcgccaccgagacgtacttcagcctgaataacaagtttagaaaccccacggtggcgcctacgcacgacgtgaccacagaccggtcccagcgtttgacgctgcggttcatccctgtggaccgtgaggatactgcgtactcgtacaaggcgcggttcaccctagctgtgggtgataaccgtgtgctggacatggcttccacgtactttgacatccgcggcgtgctggacaggggccctacttttaagccctactctggcactgcctacaacgccctggctcccaagggtgccccaaatccttgcgaatgggatgaagctggcagcggaggatccggcgcccatatcgtgatggtggacgcctacaagcctaccaaaggctctggcggaagcggcactcacgtatttgggcaggcgccttattctggtataaatattacaaaggagggtattcaaataggtgtcgaaggtcaaacacctaaatatgccgataaaacatttcaacctgaacctcaaataggagaatctcagtggtacgaaactgaaattaatcatgcagctgggagagtccttaaaaagactaccccaatgaaaccatgttacggttcatatgcaaaacccacaaatgaaaatggagggcaaggcattcttgtaaagcaacaaaatggaaagctagaaagtcaagtggaaatgcaatttttctcaactactgaggcgaccgcaggcaatggtgataacttgactcctaaagtggtattgtacagtgaagatgtagatatagaaaccccagacactcatatttcttacatgcccactattaaggaaggtaactcacgagaactaatgggccaacaatctatgcccaacaggcctaattacattgcttttagggacaattttattggtctaatgtattacaacagcacgggtaatatgggtgttctggcgggccaagcatcgcagttgaatgctgttgtagatttgcaagacagaaacacagagctttcataccagcttttgcttgattccattggtgatagaaccaggtacttttctatgtggaatcaggctgttgacagctatgatccagatgttagaattattgaaaatcatggaactgaagatgaacttccaaattactgctttccactgggaggtgtgattaatacagagactcttaccaaggtaaaacctaaaacaggtcaggaaaatggatgggaaaaagatgctacagaattttcagataaaaatgaaataagagttggaaataattttgccatggaaatcaatctaaatgccaacctgtggagaaatttcctgtactccaacatagcgctgtatttgcccgacaagctaaagtacagtccttccaacgtaaaaatttctgataacccaaacacctacgactacatgaacaagcgagtggtggctcccgggttagtggactgctacattaaccttggagcacgctggtcccttgactatatggacaacgtcaacccatttaaccaccacc
gcaatgctggcctgcgctaccgctcaatgttgctgggcaatggtcgctatgtgcccttccacatccaggtgcctcagaagttctttgccattaaaaacctccttctcctgccgggctcatacacctacgagtggaacttcaggaaggatgttaacatggttctgcagagctccctaggaaatgacctaagggttgacggagccagcattaagtttgatagcatttgcctttacgccaccttcttccccatggcccacaacaccgcctccacgcttgaggccatgcttagaaacgacaccaacgaccagtcctttaacgactatctctccgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaactgggcggctttccgcggctgggccttcacgcgccttaagactaaggaaaccccatcactgggctcgggctacgacccttattacacctactctggctctataccctacctagatggaaccttttacctcaaccacacctttaagaaggtggccattacctttgactcttctgtcagctggcctggcaatgaccgcctgcttacccccaacgagtttgaaattaagcgctcagttgacggggagggttacaacgttgcccagtgtaacatgaccaaagactggttcctggtacaaatgctagctaactacaacattggctaccagggcttctatatcccagagagctacaaggaccgcatgtactccttctttagaaacttccagcccatgagccgtcaggtggtggatgatactaaatacaaggactaccaacaggtgggcatcctacaccaacacaacaactctggatttgttggctaccttgcccccaccatgcgcgaaggacaggcctaccctgctaacttcccctatccgcttataggcaagaccgcagttgacagcattacccagaaaaagtttctttgcgatcgcaccctttggcgcatcccattctccagtaactttatgtccatgggcgcactcacagacctgggccaaaaccttctctacgccaactccgcccacgcgctagacatgacttttgaggtggatcccatggacgagcccacccttctttatgttttgtttgaagtctttgacgtggtccgtgtgcaccggccgcaccgcggcgtcatcgaaaccgtgtacctgcgcacgcccttctcggccggcaacgccacaacataa
[0236]
ad5-hvr2-spytag六邻体序列
[0237]
氨基酸(seq id no:3)：
[0238]
matpsmmpqwsymhisgqdaseylspglvqfaratetyfslnnkfrnptvapthdvttdrsqrltlrfipvdredtaysykarftlavgdnrvldmastyfdirgvldrgptfkpysgtaynalapkgapnpcewdeaataleinleeedddnedevdeqaeqqkthvfgqapysginitkegiqigvgsggsgahivmvdaykptkgsggsgpkyadktfqpepqigesqwyeteinhaagrvlkkttpmkpcygsyakptnenggqgilvkqqngklesqvemqffstteatagngdnltpkvvlysedvdietpdthisymptikegnsrelmgqqsmpnrpnyiafrdnfiglmyynstgnmgvlagqasqlnavvdlqdrntelsyqllldsigdrtryfsmwnqavdsydpdvriienhgtedelpnycfplggvintetltkvkpktgqengwekdatefsdkneirvgnnfameinlnanlwrnflysnialylpdklkyspsnvkisdnpntydymnkrvvapglvdcyinlgarwsldymdnvnpfnhhrnaglryrsmllgngryvpfhiqvpqkffaiknllllpgsytyewnfrkdvnmvlqsslgndlrvdgasikfdsiclyatffpmahntastleamlrndtndqsfndylsaanmlypipanatnvpisipsrnwaafrgwaftrlktketpslgsgydpyytysgsipyldgtfylnhtfkkvaitfdssvswpgndrlltpnefeikrsvdgegynvaqcnmtkdwflvqmlanynigyqgfyipesykdrmysffrnfqpmsrqvvddtkykdyqqvgilhqhnnsgfvgylaptmregqaypanfpypligktavdsitqkkflcdrtlwripfssnfmsmgaltdlgqnllyansahaldmtfevdpmdeptllyvlfevfdvvrvhrphrgvietvylrtpfsagnatt
[0239]
dna(包括终止密码子)(seq id no:4)：
[0240]
atggctaccccttcgatgatgccgcagtggtcttacatgcacatctcgggccaggacgcctcggagtacctgagccccgggctggtgcagtttgcccgcgccaccgagacgtacttcagcctgaataacaagtttagaaaccccacggtggcgcctacgcacgacgtgaccacagaccggtcccagcgtttgacgctgcggttcatccctgtggaccgtgaggatactgcgtactcgtacaaggcgcggttcaccctagctgtgggtgataaccgtgtgctggacatggcttccacgtactttgacatccgcggcgtgctggacaggggccctacttttaagccctactctggcactgcctacaacgccctggctcccaagggtgccccaaatccttgcgaatgggatgaagctgctactgctcttgaaataaacctagaagaagaggacgatg
acaacgaagacgaagtagacgagcaagctgagcagcaaaaaactcacgtatttgggcaggcgccttattctggtataaatattacaaaggagggtattcaaataggtgtcggcagcggaggatccggcgcccatatcgtgatggtggacgcctacaagcctaccaaaggctctggcggaagcggccctaaatatgccgataaaacatttcaacctgaacctcaaataggagaatctcagtggtacgaaactgaaattaatcatgcagctgggagagtccttaaaaagactaccccaatgaaaccatgttacggttcatatgcaaaacccacaaatgaaaatggagggcaaggcattcttgtaaagcaacaaaatggaaagctagaaagtcaagtggaaatgcaatttttctcaactactgaggcgaccgcaggcaatggtgataacttgactcctaaagtggtattgtacagtgaagatgtagatatagaaaccccagacactcatatttcttacatgcccactattaaggaaggtaactcacgagaactaatgggccaacaatctatgcccaacaggcctaattacattgcttttagggacaattttattggtctaatgtattacaacagcacgggtaatatgggtgttctggcgggccaagcatcgcagttgaatgctgttgtagatttgcaagacagaaacacagagctttcataccagcttttgcttgattccattggtgatagaaccaggtacttttctatgtggaatcaggctgttgacagctatgatccagatgttagaattattgaaaatcatggaactgaagatgaacttccaaattactgctttccactgggaggtgtgattaatacagagactcttaccaaggtaaaacctaaaacaggtcaggaaaatggatgggaaaaagatgctacagaattttcagataaaaatgaaataagagttggaaataattttgccatggaaatcaatctaaatgccaacctgtggagaaatttcctgtactccaacatagcgctgtatttgcccgacaagctaaagtacagtccttccaacgtaaaaatttctgataacccaaacacctacgactacatgaacaagcgagtggtggctcccgggttagtggactgctacattaaccttggagcacgctggtcccttgactatatggacaacgtcaacccatttaaccaccaccgcaatgctggcctgcgctaccgctcaatgttgctgggcaatggtcgctatgtgcccttccacatccaggtgcctcagaagttctttgccattaaaaacctccttctcctgccgggctcatacacctacgagtggaacttcaggaaggatgttaacatggttctgcagagctccctaggaaatgacctaagggttgacggagccagcattaagtttgatagcatttgcctttacgccaccttcttccccatggcccacaacaccgcctccacgcttgaggccatgcttagaaacgacaccaacgaccagtcctttaacgactatctctccgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaactgggcggctttccgcggctgggccttcacgcgccttaagactaaggaaaccccatcactgggctcgggctacgacccttattacacctactctggctctataccctacctagatggaaccttttacctcaaccacacctttaagaaggtggccattacctttgactcttctgtcagctggcctggcaatgaccgcctgcttacccccaacgagtttgaaattaagcgctcagttgacggggagggttacaacgttgcccagtgtaacatgaccaaagactggttcctggtacaaatgctagctaactacaacattggctaccagggcttctatatcccagagagctacaaggaccgcatgtactccttctttagaaacttccagcccatgagccgtcaggtggtggatgatactaaatacaaggactaccaacaggtgggcatcctacaccaacacaacaactctggatttgttggctaccttgcccccaccatgcgcgaaggacaggcctaccctgctaacttcccctatccgcttataggcaagaccgcagttgacagcattacccagaaaaagtttctttgcgatcgcaccctttggcgcatcccattctccagtaactttatgtccatgggcgcactcacagacctgggccaaaaccttctctacgccaactccgcccacgcgctagacatgacttttgaggtggatcccatggacgagcccacccttctttatgttttgtttgaagtctttgacgtggtccgtgtgcaccggccgcaccgcggcgtcatcgaaaccgtgtacctgcgcacgcccttctcggccggcaacgccacaacataa
[0241]
ad5-hvr5-spytag六邻体序列
[0242]
氨基酸(seq id no:5)：
[0243]
matpsmmpqwsymhisgqdaseylspglvqfaratetyfslnnkfrnptvapthdvttdrsqrltlrfipvdredtaysykarftlavgdnrvldmastyfdirgvldrgptfkpysgtaynalapkgapnpcewdeaataleinleeedddnedevdeqaeqqkthvfgqapysginitkegiqigvegqtpkyadktfqpepqigesqwyeteinhaagrvlkkttpmkpcygsyakptnenggqgilvkqqngklesqvemqffsgsggsgahivmvdaykptkgsggsgpkvvlys
edvdietpdthisymptikegnsrelmgqqsmpnrpnyiafrdnfiglmyynstgnmgvlagqasqlnavvdlqdrntelsyqllldsigdrtryfsmwnqavdsydpdvriienhgtedelpnycfplggvintetltkvkpktgqengwekdatefsdkneirvgnnfameinlnanlwrnflysnialylpdklkyspsnvkisdnpntydymnkrvvapglvdcyinlgarwsldymdnvnpfnhhrnaglryrsmllgngryvpfhiqvpqkffaiknllllpgsytyewnfrkdvnmvlqsslgndlrvdgasikfdsiclyatffpmahntastleamlrndtndqsfndylsaanmlypipanatnvpisipsrnwaafrgwaftrlktketpslgsgydpyytysgsipyldgtfylnhtfkkvaitfdssvswpgndrlltpnefeikrsvdgegynvaqcnmtkdwflvqmlanynigyqgfyipesykdrmysffrnfqpmsrqvvddtkykdyqqvgilhqhnnsgfvgylaptmregqaypanfpypligktavdsitqkkflcdrtlwripfssnfmsmgaltdlgqnllyansahaldmtfevdpmdeptllyvlfevfdvvrvhrphrgvietvylrtpfsagnatt
[0244]
dna(包括终止密码子)(seq id no:6)：
[0245]
atggctaccccttcgatgatgccgcagtggtcttacatgcacatctcgggccaggacgcctcggagtacctgagccccgggctggtgcagtttgcccgcgccaccgagacgtacttcagcctgaataacaagtttagaaaccccacggtggcgcctacgcacgacgtgaccacagaccggtcccagcgtttgacgctgcggttcatccctgtggaccgtgaggatactgcgtactcgtacaaggcgcggttcaccctagctgtgggtgataaccgtgtgctggacatggcttccacgtactttgacatccgcggcgtgctggacaggggccctacttttaagccctactctggcactgcctacaacgccctggctcccaagggtgccccaaatccttgcgaatgggatgaagctgctactgctcttgaaataaacctagaagaagaggacgatgacaacgaagacgaagtagacgagcaagctgagcagcaaaaaactcacgtatttgggcaggcgccttattctggtataaatattacaaaggagggtattcaaataggtgtcgaaggtcaaacacctaaatatgccgataaaacatttcaacctgaacctcaaataggagaatctcagtggtacgaaactgaaattaatcatgcagctgggagagtccttaaaaagactaccccaatgaaaccatgttacggttcatatgcaaaacccacaaatgaaaatggagggcaaggcattcttgtaaagcaacaaaatggaaagctagaaagtcaagtggaaatgcaatttttctcaggcagcggaggatccggcgcccatatcgtgatggtggacgcctacaagcctaccaaaggctctggcggaagcggccctaaagtggtattgtacagtgaagatgtagatatagaaaccccagacactcatatttcttacatgcccactattaaggaaggtaactcacgagaactaatgggccaacaatctatgcccaacaggcctaattacattgcttttagggacaattttattggtctaatgtattacaacagcacgggtaatatgggtgttctggcgggccaagcatcgcagttgaatgctgttgtagatttgcaagacagaaacacagagctttcataccagcttttgcttgattccattggtgatagaaccaggtacttttctatgtggaatcaggctgttgacagctatgatccagatgttagaattattgaaaatcatggaactgaagatgaacttccaaattactgctttccactgggaggtgtgattaatacagagactcttaccaaggtaaaacctaaaacaggtcaggaaaatggatgggaaaaagatgctacagaattttcagataaaaatgaaataagagttggaaataattttgccatggaaatcaatctaaatgccaacctgtggagaaatttcctgtactccaacatagcgctgtatttgcccgacaagctaaagtacagtccttccaacgtaaaaatttctgataacccaaacacctacgactacatgaacaagcgagtggtggctcccgggttagtggactgctacattaaccttggagcacgctggtcccttgactatatggacaacgtcaacccatttaaccaccaccgcaatgctggcctgcgctaccgctcaatgttgctgggcaatggtcgctatgtgcccttccacatccaggtgcctcagaagttctttgccattaaaaacctccttctcctgccgggctcatacacctacgagtggaacttcaggaaggatgttaacatggttctgcagagctccctaggaaatgacctaagggttgacggagccagcattaagtttgatagcatttgcctttacgccaccttcttccccatggcccacaacaccgcctccacgcttgaggccatgcttagaaacgacaccaacgaccagtcctttaacgactatctctccgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaactgggcggctttccgcggctgggccttcacgcgccttaagactaaggaaaccccatcactgggctcgggctacgacccttattacacctactctggctctataccctacctagatggaaccttttacctcaaccacacctttaagaaggtggccattacctttgactcttctgtcag
ctggcctggcaatgaccgcctgcttacccccaacgagtttgaaattaagcgctcagttgacggggagggttacaacgttgcccagtgtaacatgaccaaagactggttcctggtacaaatgctagctaactacaacattggctaccagggcttctatatcccagagagctacaaggaccgcatgtactccttctttagaaacttccagcccatgagccgtcaggtggtggatgatactaaatacaaggactaccaacaggtgggcatcctacaccaacacaacaactctggatttgttggctaccttgcccccaccatgcgcgaaggacaggcctaccctgctaacttcccctatccgcttataggcaagaccgcagttgacagcattacccagaaaaagtttctttgcgatcgcaccctttggcgcatcccattctccagtaactttatgtccatgggcgcactcacagacctgggccaaaaccttctctacgccaactccgcccacgcgctagacatgacttttgaggtggatcccatggacgagcccacccttctttatgttttgtttgaagtctttgacgtggtccgtgtgcaccggccgcaccgcggcgtcatcgaaaccgtgtacctgcgcacgcccttctcggccggcaacgccacaacataa
[0246]
ad5-hvr-dogtag序列
[0247]
ad5-hvr1-dogtag六邻体序列
[0248]
氨基酸(seq id no:7)：
[0249]
matpsmmpqwsymhisgqdaseylspglvqfaratetyfslnnkfrnptvapthdvttdrsqrltlrfipvdredtaysykarftlavgdnrvldmastyfdirgvldrgptfkpysgtaynalapkgapnpcewdeagsggsgdipatyeftdgkhyitnepippkgsggsgthvfgqapysginitkegiqigvegqtpkyadktfqpepqigesqwyeteinhaagrvlkkttpmkpcygsyakptnenggqgilvkqqngklesqvemqffstteatagngdnltpkvvlysedvdietpdthisymptikegnsrelmgqqsmpnrpnyiafrdnfiglmyynstgnmgvlagqasqlnavvdlqdrntelsyqllldsigdrtryfsmwnqavdsydpdvriienhgtedelpnycfplggvintetltkvkpktgqengwekdatefsdkneirvgnnfameinlnanlwrnflysnialylpdklkyspsnvkisdnpntydymnkrvvapglvdcyinlgarwsldymdnvnpfnhhrnaglryrsmllgngryvpfhiqvpqkffaiknllllpgsytyewnfrkdvnmvlqsslgndlrvdgasikfdsiclyatffpmahntastleamlrndtndqsfndylsaanmlypipanatnvpisipsrnwaafrgwaftrlktketpslgsgydpyytysgsipyldgtfylnhtfkkvaitfdssvswpgndrlltpnefeikrsvdgegynvaqcnmtkdwflvqmlanynigyqgfyipesykdrmysffrnfqpmsrqvvddtkykdyqqvgilhqhnnsgfvgylaptmregqaypanfpypligktavdsitqkkflcdrtlwripfssnfmsmgaltdlgqnllyansahaldmtfevdpmdeptllyvlfevfdvvrvhrphrgvietvylrtpfsagnatt
[0250]
dna(包括终止密码子)(seq id no:8)：
[0251]
atggctaccccttcgatgatgccgcagtggtcttacatgcacatctcgggccaggacgcctcggagtacctgagccccgggctggtgcagtttgcccgcgccaccgagacgtacttcagcctgaataacaagtttagaaaccccacggtggcgcctacgcacgacgtgaccacagaccggtcccagcgtttgacgctgcggttcatccctgtggaccgtgaggatactgcgtactcgtacaaggcgcggttcaccctagctgtgggtgataaccgtgtgctggacatggcttccacgtactttgacatccgcggcgtgctggacaggggccctacttttaagccctactctggcactgcctacaacgccctggctcccaagggtgccccaaatccttgcgaatgggatgaagctggcagcggaggatccggcgatattccggctacatatgaatttaccgatggtaaacattatatcaccaatgaaccgataccgccgaaaggctctggcggaagcggcactcacgtatttgggcaggcgccttattctggtataaatattacaaaggagggtattcaaataggtgtcgaaggtcaaacacctaaatatgccgataaaacatttcaacctgaacctcaaataggagaatctcagtggtacgaaactgaaattaatcatgcagctgggagagtccttaaaaagactaccccaatgaaaccatgttacggttcatatgcaaaacccacaaatgaaaatggagggcaaggcattcttgtaaagcaacaaaatggaaagctagaaagtcaagtggaaatgcaatttttctcaactactgaggcgaccgcaggcaatggtgataacttgactcctaaagtggtattgtacagtgaagatgtagatatagaaaccccagacactcatatttcttacatgcccactattaaggaaggtaactcacgagaactaatgggccaacaatctatgcc
caacaggcctaattacattgcttttagggacaattttattggtctaatgtattacaacagcacgggtaatatgggtgttctggcgggccaagcatcgcagttgaatgctgttgtagatttgcaagacagaaacacagagctttcataccagcttttgcttgattccattggtgatagaaccaggtacttttctatgtggaatcaggctgttgacagctatgatccagatgttagaattattgaaaatcatggaactgaagatgaacttccaaattactgctttccactgggaggtgtgattaatacagagactcttaccaaggtaaaacctaaaacaggtcaggaaaatggatgggaaaaagatgctacagaattttcagataaaaatgaaataagagttggaaataattttgccatggaaatcaatctaaatgccaacctgtggagaaatttcctgtactccaacatagcgctgtatttgcccgacaagctaaagtacagtccttccaacgtaaaaatttctgataacccaaacacctacgactacatgaacaagcgagtggtggctcccgggttagtggactgctacattaaccttggagcacgctggtcccttgactatatggacaacgtcaacccatttaaccaccaccgcaatgctggcctgcgctaccgctcaatgttgctgggcaatggtcgctatgtgcccttccacatccaggtgcctcagaagttctttgccattaaaaacctccttctcctgccgggctcatacacctacgagtggaacttcaggaaggatgttaacatggttctgcagagctccctaggaaatgacctaagggttgacggagccagcattaagtttgatagcatttgcctttacgccaccttcttccccatggcccacaacaccgcctccacgcttgaggccatgcttagaaacgacaccaacgaccagtcctttaacgactatctctccgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaactgggcggctttccgcggctgggccttcacgcgccttaagactaaggaaaccccatcactgggctcgggctacgacccttattacacctactctggctctataccctacctagatggaaccttttacctcaaccacacctttaagaaggtggccattacctttgactcttctgtcagctggcctggcaatgaccgcctgcttacccccaacgagtttgaaattaagcgctcagttgacggggagggttacaacgttgcccagtgtaacatgaccaaagactggttcctggtacaaatgctagctaactacaacattggctaccagggcttctatatcccagagagctacaaggaccgcatgtactccttctttagaaacttccagcccatgagccgtcaggtggtggatgatactaaatacaaggactaccaacaggtgggcatcctacaccaacacaacaactctggatttgttggctaccttgcccccaccatgcgcgaaggacaggcctaccctgctaacttcccctatccgcttataggcaagaccgcagttgacagcattacccagaaaaagtttctttgcgatcgcaccctttggcgcatcccattctccagtaactttatgtccatgggcgcactcacagacctgggccaaaaccttctctacgccaactccgcccacgcgctagacatgacttttgaggtggatcccatggacgagcccacccttctttatgttttgtttgaagtctttgacgtggtccgtgtgcaccggccgcaccgcggcgtcatcgaaaccgtgtacctgcgcacgcccttctcggccggcaacgccacaacataa
[0252]
ad5-hvr2-dogtag六邻体序列
[0253]
氨基酸(seq id no:9)：
[0254]
matpsmmpqwsymhisgqdaseylspglvqfaratetyfslnnkfrnptvapthdvttdrsqrltlrfipvdredtaysykarftlavgdnrvldmastyfdirgvldrgptfkpysgtaynalapkgapnpcewdeaataleinleeedddnedevdeqaeqqkthvfgqapysginitkegiqigvgsggsgdipatyeftdgkhyitnepippkgsggsgpkyadktfqpepqigesqwyeteinhaagrvlkkttpmkpcygsyakptnenggqgilvkqqngklesqvemqffstteatagngdnltpkvvlysedvdietpdthisymptikegnsrelmgqqsmpnrpnyiafrdnfiglmyynstgnmgvlagqasqlnavvdlqdrntelsyqllldsigdrtryfsmwnqavdsydpdvriienhgtedelpnycfplggvintetltkvkpktgqengwekdatefsdkneirvgnnfameinlnanlwrnflysnialylpdklkyspsnvkisdnpntydymnkrvvapglvdcyinlgarwsldymdnvnpfnhhrnaglryrsmllgngryvpfhiqvpqkffaiknllllpgsytyewnfrkdvnmvlqsslgndlrvdgasikfdsiclyatffpmahntastleamlrndtndqsfndylsaanmlypipanatnvpisipsrnwaafrgwaftrlktketpslgsgydpyytysgsipyldgtfylnhtfkkvaitfdssvswpgndrlltpnefeikrsvdgegynvaqcnmtkdwflvqmlanynigyqgfyipesykdrmysffrnfqpmsrqvvddtkykdyqqvgilhqhnnsgfvgylaptmregqaypanfpypligktavdsitqkkflcdrtlwripfssnfmsmgal
tdlgqnllyansahaldmtfevdpmdeptllyvlfevfdvvrvhrphrgvietvylrtpfsagnatt
[0255]
dna(包括终止密码子)(seq id no:10)：
[0256]
atggctaccccttcgatgatgccgcagtggtcttacatgcacatctcgggccaggacgcctcggagtacctgagccccgggctggtgcagtttgcccgcgccaccgagacgtacttcagcctgaataacaagtttagaaaccccacggtggcgcctacgcacgacgtgaccacagaccggtcccagcgtttgacgctgcggttcatccctgtggaccgtgaggatactgcgtactcgtacaaggcgcggttcaccctagctgtgggtgataaccgtgtgctggacatggcttccacgtactttgacatccgcggcgtgctggacaggggccctacttttaagccctactctggcactgcctacaacgccctggctcccaagggtgccccaaatccttgcgaatgggatgaagctgctactgctcttgaaataaacctagaagaagaggacgatgacaacgaagacgaagtagacgagcaagctgagcagcaaaaaactcacgtatttgggcaggcgccttattctggtataaatattacaaaggagggtattcaaataggtgtcggcagcggaggatccggcgatattccggctacatatgaatttaccgatggtaaacattatatcaccaatgaaccgataccgccgaaaggctctggcggaagcggccctaaatatgccgataaaacatttcaacctgaacctcaaataggagaatctcagtggtacgaaactgaaattaatcatgcagctgggagagtccttaaaaagactaccccaatgaaaccatgttacggttcatatgcaaaacccacaaatgaaaatggagggcaaggcattcttgtaaagcaacaaaatggaaagctagaaagtcaagtggaaatgcaatttttctcaactactgaggcgaccgcaggcaatggtgataacttgactcctaaagtggtattgtacagtgaagatgtagatatagaaaccccagacactcatatttcttacatgcccactattaaggaaggtaactcacgagaactaatgggccaacaatctatgcccaacaggcctaattacattgcttttagggacaattttattggtctaatgtattacaacagcacgggtaatatgggtgttctggcgggccaagcatcgcagttgaatgctgttgtagatttgcaagacagaaacacagagctttcataccagcttttgcttgattccattggtgatagaaccaggtacttttctatgtggaatcaggctgttgacagctatgatccagatgttagaattattgaaaatcatggaactgaagatgaacttccaaattactgctttccactgggaggtgtgattaatacagagactcttaccaaggtaaaacctaaaacaggtcaggaaaatggatgggaaaaagatgctacagaattttcagataaaaatgaaataagagttggaaataattttgccatggaaatcaatctaaatgccaacctgtggagaaatttcctgtactccaacatagcgctgtatttgcccgacaagctaaagtacagtccttccaacgtaaaaatttctgataacccaaacacctacgactacatgaacaagcgagtggtggctcccgggttagtggactgctacattaaccttggagcacgctggtcccttgactatatggacaacgtcaacccatttaaccaccaccgcaatgctggcctgcgctaccgctcaatgttgctgggcaatggtcgctatgtgcccttccacatccaggtgcctcagaagttctttgccattaaaaacctccttctcctgccgggctcatacacctacgagtggaacttcaggaaggatgttaacatggttctgcagagctccctaggaaatgacctaagggttgacggagccagcattaagtttgatagcatttgcctttacgccaccttcttccccatggcccacaacaccgcctccacgcttgaggccatgcttagaaacgacaccaacgaccagtcctttaacgactatctctccgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaactgggcggctttccgcggctgggccttcacgcgccttaagactaaggaaaccccatcactgggctcgggctacgacccttattacacctactctggctctataccctacctagatggaaccttttacctcaaccacacctttaagaaggtggccattacctttgactcttctgtcagctggcctggcaatgaccgcctgcttacccccaacgagtttgaaattaagcgctcagttgacggggagggttacaacgttgcccagtgtaacatgaccaaagactggttcctggtacaaatgctagctaactacaacattggctaccagggcttctatatcccagagagctacaaggaccgcatgtactccttctttagaaacttccagcccatgagccgtcaggtggtggatgatactaaatacaaggactaccaacaggtgggcatcctacaccaacacaacaactctggatttgttggctaccttgcccccaccatgcgcgaaggacaggcctaccctgctaacttcccctatccgcttataggcaagaccgcagttgacagcattacccagaaaaagtttctttgcgatcgcaccctttggcgcatcccattctccagtaactttatgtccatgggcgcactcacagacctgggccaaaaccttctctacgccaactccgcccacgcgctagacatgacttttgaggtggatcccatggacgagccc
acccttctttatgttttgtttgaagtctttgacgtggtccgtgtgcaccggccgcaccgcggcgtcatcgaaaccgtgtacctgcgcacgcccttctcggccggcaacgccacaacataa
[0257]
ad5-hvr5-dogtag六邻体序列
[0258]
氨基酸(seq id no:11)：
[0259]
matpsmmpqwsymhisgqdaseylspglvqfaratetyfslnnkfrnptvapthdvttdrsqrltlrfipvdredtaysykarftlavgdnrvldmastyfdirgvldrgptfkpysgtaynalapkgapnpcewdeaataleinleeedddnedevdeqaeqqkthvfgqapysginitkegiqigvegqtpkyadktfqpepqigesqwyeteinhaagrvlkkttpmkpcygsyakptnenggqgilvkqqngklesqvemqffsgsggsgdipatyeftdgkhyitnepippkgsggsgpkvvlysedvdietpdthisymptikegnsrelmgqqsmpnrpnyiafrdnfiglmyynstgnmgvlagqasqlnavvdlqdrntelsyqllldsigdrtryfsmwnqavdsydpdvriienhgtedelpnycfplggvintetltkvkpktgqengwekdatefsdkneirvgnnfameinlnanlwrnflysnialylpdklkyspsnvkisdnpntydymnkrvvapglvdcyinlgarwsldymdnvnpfnhhrnaglryrsmllgngryvpfhiqvpqkffaiknllllpgsytyewnfrkdvnmvlqsslgndlrvdgasikfdsiclyatffpmahntastleamlrndtndqsfndylsaanmlypipanatnvpisipsrnwaafrgwaftrlktketpslgsgydpyytysgsipyldgtfylnhtfkkvaitfdssvswpgndrlltpnefeikrsvdgegynvaqcnmtkdwflvqmlanynigyqgfyipesykdrmysffrnfqpmsrqvvddtkykdyqqvgilhqhnnsgfvgylaptmregqaypanfpypligktavdsitqkkflcdrtlwripfssnfmsmgaltdlgqnllyansahaldmtfevdpmdeptllyvlfevfdvvrvhrphrgvietvylrtpfsagnatt
[0260]
dna(包括终止密码子)(seq id no:12)：
[0261]
atggctaccccttcgatgatgccgcagtggtcttacatgcacatctcgggccaggacgcctcggagtacctgagccccgggctggtgcagtttgcccgcgccaccgagacgtacttcagcctgaataacaagtttagaaaccccacggtggcgcctacgcacgacgtgaccacagaccggtcccagcgtttgacgctgcggttcatccctgtggaccgtgaggatactgcgtactcgtacaaggcgcggttcaccctagctgtgggtgataaccgtgtgctggacatggcttccacgtactttgacatccgcggcgtgctggacaggggccctacttttaagccctactctggcactgcctacaacgccctggctcccaagggtgccccaaatccttgcgaatgggatgaagctgctactgctcttgaaataaacctagaagaagaggacgatgacaacgaagacgaagtagacgagcaagctgagcagcaaaaaactcacgtatttgggcaggcgccttattctggtataaatattacaaaggagggtattcaaataggtgtcgaaggtcaaacacctaaatatgccgataaaacatttcaacctgaacctcaaataggagaatctcagtggtacgaaactgaaattaatcatgcagctgggagagtccttaaaaagactaccccaatgaaaccatgttacggttcatatgcaaaacccacaaatgaaaatggagggcaaggcattcttgtaaagcaacaaaatggaaagctagaaagtcaagtggaaatgcaatttttctcaggcagcggaggatccggcgatattccggctacatatgaatttaccgatggtaaacattatatcaccaatgaaccgataccgccgaaaggctctggcggaagcggccctaaagtggtattgtacagtgaagatgtagatatagaaaccccagacactcatatttcttacatgcccactattaaggaaggtaactcacgagaactaatgggccaacaatctatgcccaacaggcctaattacattgcttttagggacaattttattggtctaatgtattacaacagcacgggtaatatgggtgttctggcgggccaagcatcgcagttgaatgctgttgtagatttgcaagacagaaacacagagctttcataccagcttttgcttgattccattggtgatagaaccaggtacttttctatgtggaatcaggctgttgacagctatgatccagatgttagaattattgaaaatcatggaactgaagatgaacttccaaattactgctttccactgggaggtgtgattaatacagagactcttaccaaggtaaaacctaaaacaggtcaggaaaatggatgggaaaaagatgctacagaattttcagataaaaatgaaataagagttggaaataattttgccatggaaatcaatctaaatgccaacctgtggagaaatttcctgtactccaacatagcgctgtatttgcccgaca
[0262]
agctaaagtacagtccttccaacgtaaaaatttctgataacccaaacacctacgactacatgaacaagc
gagtggtggctcccgggttagtggactgctacattaaccttggagcacgctggtcccttgactatatggacaacgtcaacccatttaaccaccaccgcaatgctggcctgcgctaccgctcaatgttgctgggcaatggtcgctatgtgcccttccacatccaggtgcctcagaagttctttgccattaaaaacctccttctcctgccgggctcatacacctacgagtggaacttcaggaaggatgttaacatggttctgcagagctccctaggaaatgacctaagggttgacggagccagcattaagtttgatagcatttgcctttacgccaccttcttccccatggcccacaacaccgcctccacgcttgaggccatgcttagaaacgacaccaacgaccagtcctttaacgactatctctccgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaactgggcggctttccgcggctgggccttcacgcgccttaagactaaggaaaccccatcactgggctcgggctacgacccttattacacctactctggctctataccctacctagatggaaccttttacctcaaccacacctttaagaaggtggccattacctttgactcttctgtcagctggcctggcaatgaccgcctgcttacccccaacgagtttgaaattaagcgctcagttgacggggagggttacaacgttgcccagtgtaacatgaccaaagactggttcctggtacaaatgctagctaactacaacattggctaccagggcttctatatcccagagagctacaaggaccgcatgtactccttctttagaaacttccagcccatgagccgtcaggtggtggatgatactaaatacaaggactaccaacaggtgggcatcctacaccaacacaacaactctggatttgttggctaccttgcccccaccatgcgcgaaggacaggcctaccctgctaacttcccctatccgcttataggcaagaccgcagttgacagcattacccagaaaaagtttctttgcgatcgcaccctttggcgcatcccattctccagtaactttatgtccatgggcgcactcacagacctgggccaaaaccttctctacgccaactccgcccacgcgctagacatgacttttgaggtggatcccatggacgagcccacccttctttatgttttgtttgaagtctttgacgtggtccgtgtgcaccggccgcaccgcggcgtcatcgaaaccgtgtacctgcgcacgcccttctcggccggcaacgccacaacataa
[0263]
ad5-pix-spycatcher序列
[0264]
pix-(eaaak3)-spycatcher序列：
[0265]
氨基酸(seq id no:13)：
[0266]
mstnsfdgsivssylttrmppwagvrqnvmgssidgrpvlpansttltyetvsgtpletaasaaasaaaatargivtdfaflsplassaasrssarddkltallaqldsltrelnvvsqqlldlrqqvsalkassppnavggseaaakeaaakeaaakgsdsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgqvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvngkatkgdahi
[0267]
dna(包括终止密码子)(seq id no:14)：
[0268]
atgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggttggaggctccgaagccgccgctaaagaagctgctgccaaagaggccgctgcaaagggatccgacagcgccacacacatcaagttcagcaagagagatgaggacggcaaagagctggctggcgcaacaatggaactgagagatagcagcggcaagaccatcagcacctggatctccgacggccaagtgaaggacttctatctgtaccccggcaagtacaccttcgtggaaaccgccgctcctgacggatatgaagtggccaccgccatcaccttcaccgtgaatgagcagggacaagtgaccgtgaacggcaaggccacaaaaggcgacgcccacatttaa
[0269]
本专利中描述的用于衣壳修饰的配体：
[0270]
重组蛋白：
[0271]
dogcatcher
[0272]
氨基酸(seq id no:15)：
[0273]
mgsshhhhhhssglvprgshmklgdiefikvnkndkkplrgavfslqkqhpdypdiygaidqngtyqnvrtgedgkltfknlsdgkyrlfensepagykpvqnkpivafqivngevrdvtsivpq
[0274]
dna(包括终止密码子)(seq id no:16)：
[0275]
atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatgaaactgggcgatattgaatttattaaagtgaacaaaaacgataaaaagccgctgcgtggtgccgtgtttagcctgcagaaacagcatcccgactatcccgatatctatggcgcgattgatcagaatgggacctatcaaaatgtgcgtaccggcgaagatggtaaactgacctttaagaatctgagcgatggcaaatatcgcctgtttgaaaatagcgaacccgctggctataaaccggtgcagaataagccgattgtggcgtttcagattgtgaatggcgaagtgcgtgatgtgaccagcattgtgccgcagtaa
[0276]
dogcatcher-nanp9
[0277]
氨基酸(seq id no:17)：
[0278]
mahhhhhhvgtgklgdiefikvnkndkkplrgavfslqkqhpdypdiygaidqngtyqnvrtgedgkltfknlsdgkyrlfensepagykpvqnkpivafqivngevrdvtsivpqgsggsggsnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanp
[0279]
dna(包括终止密码子)(seq id no:18)：
[0280]
atggcacatcaccaccaccatcacgtgggtaccggtaaactgggcgatattgaatttattaaagtgaacaaaaacgataaaaagccgctgcgtggtgccgtgtttagcctgcagaaacagcatcccgactatcccgatatctatggcgcgattgatcagaatgggacctatcaaaatgtgcgtaccggcgaagatggtaaactgacctttaagaatctgagcgatggcaaatatcgcctgtttgaaaatagcgaacccgctggctataaaccggtgcagaataagccgattgtggcgtttcagattgtgaatggcgaagtgcgtgatgtgaccagcattgtgccgcagggctctggcggaagcggcggatccaatgcgaaccctaatgcgaatcccaatgcaaatcccaatgcgaaccctaacgcaaatccgaacgcaaaccctaacgcgaaccctaatgctaatcctaacgccaatccttaa
[0281]
dogcatcher-nanp18
[0282]
氨基酸(seq id no:19)：
[0283]
mahhhhhhvgtgklgdiefikvnkndkkplrgavfslqkqhpdypdiygaidqngtyqnvrtgedgkltfknlsdgkyrlfensepagykpvqnkpivafqivngevrdvtsivpqgsggsggsnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanp
[0284]
dna(包括终止密码子)(seq id no:20)：
[0285]
atggcacatcaccaccaccatcacgtgggtaccggtaaactgggcgatattgaatttattaaagtgaacaaaaacgataaaaagccgctgcgtggtgccgtgtttagcctgcagaaacagcatcccgactatcccgatatctatggcgcgattgatcagaatgggacctatcaaaatgtgcgtaccggcgaagatggtaaactgacctttaagaatctgagcgatggcaaatatcgcctgtttgaaaatagcgaacccgctggctataaaccggtgcagaataagccgattgtggcgtttcagattgtgaatggcgaagtgcgtgatgtgaccagcattgtgccgcagggctctggcggaagcggcggatccaatgctaaccctaacgctaaccccaacgccaatccgaatgcgaatcctaacgccaatccaaatgccaatccgaacgcgaacccaaacgctaatccaaacgcgaatccaaatgcgaaccctaatgcgaatcccaatgcaaatcccaatgcgaaccctaacgcaaatccgaacgcaaaccctaacgcgaaccctaatgctaatcctaacgccaatccttaa
[0286]
dogcatcher-nanp结构域
[0287]
氨基酸(seq id no:21)：
[0288]
mahhhhhhvgtgklgdiefikvnkndkkplrgavfslqkqhpdypdiygaidqngtyqnvrtgedgkltfknlsdgkyrlfensepagykpvqnkpivafqivngevrdvtsivpqgsggsggsnanpnvdpnanpnvdpnanpnvdpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnvdpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanp
[0289]
dna(包括终止密码子)(seq id no:22)：
[0290]
atggcacatcaccaccaccatcacgtgggtaccggtaaactgggcgatattgaatttattaaagtgaacaaaaacgataaaaagccgctgcgtggtgccgtgtttagcctgcagaaacagcatcccgactatcccgatatctatggcgcgattgatcagaatgggacctatcaaaatgtgcgtaccggcgaagatggtaaactgacctttaagaatctgagcgatggcaaatatcgcctgtttgaaaatagcgaacccgctggctataaaccggtgcagaataagccgattgtggcgtttcagattgtgaatggcgaagtgcgtgatgtgaccagcattgtgccgcagggctctggcggaagcggcggatccaatgcaaatccgaatgttgatccgaacgcgaacccgaacgtggaccctaacgccaatcctaatgtggacccaaatgcgaatccaaatgctaacccaaacgcaaacccgaatgcgaaccccaatgccaatccgaacgctaatcccaatgctaatcctaatgcaaatccaaacgcgaatccgaacgccaatcctaacgcaaacccgaacgcaaatccaaatgcaaacccaaatgctaatcctaatgcgaacccgaatgctaacccgaatgcaaaccctaacgttgaccctaatgctaaccctaacgctaaccccaacgccaatccgaatgcgaatcctaacgccaatccaaatgccaatccgaacgcgaacccaaacgctaatccaaacgcgaatccaaatgcgaaccctaatgcgaatcccaatgcaaatcccaatgcgaaccctaacgcaaatccgaacgcaaaccctaacgcgaaccctaatgctaatcctaacgccaatccttaa
[0291]
spytag-mbp
[0292]
氨基酸(seq id no:23)：
[0293]
mgsshhhhhhssglvprgshmgahivmvdaykptkgsgesgkieegklviwingdkgynglaevgkkfekdtgikvtvehpdkleekfpqvaatgdgpdiifwahdrfggyaqsgllaeitpdkafqdklypftwdavryngkliaypiavealsliynkdllpnppktweeipaldkelkakgksalmfnlqepyftwpliaadggyafkyengkydikdvgvdnagakagltflvdliknkhmnadtdysiaeaafnkgetamtingpwawsnidtskvnygvtvlptfkgqpskpfvgvlsaginaaspnkelakeflenylltdegleavnkdkplgavalksyeeelakdpriaatmenaqkgeimpnipqmsafwyavrtavinaasgrqtvdealkdaqtnsss
[0294]
dna(包括终止密码子)(seq id no:24)：
[0295]
atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatgggagcccacatcgtgatggtggacgcctacaagccgacgaagggtagtggtgaaagtggtaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcgataaaggctataacggtctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaattaaagtcaccgttgagcatccggataaactggaagagaaattcccacaggttgcggcaactggcgatggccctgacattatcttctgggcacacgaccgctttggtggctacgctcaatctggcctgttggctgaaatcaccccggacaaagcgttccaggacaagctgtatccgtttacctgggatgccgtacgttacaacggcaagctgattgcttacccgatcgctgttgaagcgttatcgctgatttataacaaagatctgctgccgaacccgccaaaaacctgggaagagatcccggcgctggataaagaactgaaagcgaaaggtaagagcgcgctgatgttcaacctgcaagaaccgtacttcacctggccgctgattgctgctgacgggggttatgcgttcaagtatgaaaacggcaagtacgacattaaagacgtgggcgtggataacgctggcgcgaaagcgggtctgaccttcctggttgacctgattaaaaacaaacacatgaatgcagacaccgattactccatcgcagaagctgcctttaataaaggcgaaacagcgatgaccatcaacggcccgtgggcatggtccaacatcgacaccagcaaagtgaattatggtgtaacggtactgccgaccttcaagggtcaaccatccaaaccgttcgttggcgtgctgagcgc
aggtattaacgccgccagtccgaacaaagagctggcaaaagagttcctcgaaaactatctgctgactgatgaaggtctggaagcggttaataaagacaaaccgctgggtgccgtagcgctgaagtcttacgaggaagagttggcgaaagatccacgtattgccgccactatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttctggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaacgccgccagcggtcgtcagactgtcgatgaagccctgaaagacgcgcagactaattcgagctcgtaa
[0296]
snoopligase
[0297]
氨基酸(seq id no:25)：
[0298]
mgswshhhhhhssggsgvnkndkkplrgavfslqkqhpdypdiygaidqngtyqnvrtgedgkltfknlsdgkyrlfenseppgykpvqnkpivafqivngevrdvtsivppgvpatyeft
[0299]
dna(包括终止密码子)(seq id no: 26)：
[0300]
atgggcagctggagccatcatcatcatcatcacagctctggtggtagtggtgtgaataagaacgataaaaagccgctgcgtggtgccgtgtttagcctgcagaaacagcatcccgactatcccgatatctatggcgcgattgatcagaatgggacctatcaaaatgtgcgtaccggcgaagatggtaaactgacctttaagaatctgagcgatggcaaatatcgcctgtttgaaaatagcgaacccccgggctataaaccggtgcagaataagccgattgtggcgtttcagattgtgaatggcgaagtgcgtgatgtgaccagcattgtgccgccgggtgtgccggctacatatgaatttacctaa
[0301]
snooptagjr-affiher2
[0302]
氨基酸(seq id no:27)：
[0303]
mgsshhhhhhssggklgsiefikvnkgsgesgsgasmtggqqmgrdpgvdnkfnkemrnayweiallpnlnnqqkrafirslyddpsqsanllaeakklndaqapkgle
[0304]
dna(包括终止密码子)(seq id no:28)：
[0305]
atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcgggaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaaggcagtggtgagtcgggatccggagctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgggatccgggcgtggacaacaaattcaacaaagaaatgaggaacgcttactgggagatagctcttttacccaacttaaacaatcaacagaaaagggctttcataaggtcgttatacgatgacccaagccaaagcgctaaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgctcaggcgccgaaaggcctcgagtaa
[0306]
spycatcher
[0307]
氨基酸(seq id no:29)：
[0308]
msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamvdtlsglsseqgqsgdmtieedsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgqvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvngkatkgdahi
[0309]
dna(包括终止密码子)(seq id no:30)：
[0310]
atgtcgtactaccatcaccatcaccatcacgattacgacatcccaacgaccgaaaacctgtattttcagggcgccatggttgataccttatcaggtttatcaagtgagcaaggtcagtccggtgatatgacaattgaagaagatagtgctacccatattaaattctcaaaacgtgatgaggacggcaaagagttagctggtgcaactatggagttgcgtgattcatctggtaaaactattagtacatggatttcagatggacaagtgaaagatttctacctgtatccaggaaaatatacatttgtcgaaaccgcagcaccagacggttatgaggtagcaactgctattacctttacagttaatgagcaaggtcaggttactgtaaatggcaaagcaactaaaggtgacgctcatatttaa
[0311]
hcmv五聚体
[0312]
hcmv gh-spytag
[0313]
氨基酸(seq id no:31)：
[0314]
mrpglpsyliilavclfshllssrygaeavsepldkafhlllntygrpirflrenttqctynsslrnstvvrenaisfnffqsynqyyvfhmprclfagplaeqflnqvdltetleryqqrlntyalvskdlasyrsfsqqlkaqdslgeqpttvpppidlsiphvwmppqttphgwteshttsglhrphfnqtcilfdghdllfstvtpclhqgfylidelryvkitltedffvvtvsidddtpmllifghlprvlfkapyqrdnfilrqtekhellvlvkkdqlnrhsylkdpdfldaaldfnyldlsallrnsfhryavdvlksgrcqmldrrtvemafayalalfaaarqeeagaqvsvpraldrqaallqiqefmitclsqtpprttlllyptavdlakralwtpnqitditslvrlvyilskqnqqhlipqwalrqiadfalklhkthlasflsafarqelylmgslvhsmlvhtterreifivetglcslaelshftqllahphheylsdlytpcsssgrrdhslerltrlfpdatvpatvpaalsilstmqpstletfpdlfclplgesfsaltvsehvsyivtnqylikgisypvsttvvgqsliitqtdsqtkceltrnmhtthsitvalnislencafcqsalleyddtqgvinimymhdsddvlfaldpynevvvssprthylmllkngtvlevtdvvvdatdsrllgsggsgahivmvdaykptkhhhhhh
[0315]
dna(包括终止密码子)(seq id no:32)：
[0316]
atgcggccaggcctcccctcctacctcatcatcctcgccgtctgtctcttcagccacctactttcgtcacgatatggcgcagaagccgtatccgaaccgctggacaaagcgtttcacctactgctcaacacctacgggagacccatccgcttcctgcgtgaaaataccacccagtgtacctacaacagcagcctccgtaacagcacggtcgtcagggaaaacgccatcagtttcaactttttccaaagctataatcaatactatgtattccatatgcctcgatgtctttttgcgggtcctctggcggagcagtttctgaaccaggtagatctgaccgaaaccctggaaagataccaacagagacttaacacttacgcgctggtatccaaagacctggccagctaccgatctttttcgcagcagctaaaggcacaagacagcctaggtgaacagcccaccactgtgccaccgcccattgacctgtcaatacctcacgtttggatgccaccgcaaaccactccacacggctggacagaatcacataccacctcaggactacaccgaccacactttaaccagacctgtatcctctttgatggacacgatctactattcagcaccgtcacaccttgtttgcaccaaggcttttacctcatcgacgaactacgttacgttaaaataacactgaccgaggacttcttcgtagttacggtgtccatagacgacgacacacccatgctgcttatcttcggccatcttccacgcgtacttttcaaagcgccctatcaacgcgacaactttatactacgacaaactgaaaaacacgagctcctggtgctagttaagaaagatcaactgaaccgtcactcttatctcaaagacccggactttcttgacgccgcacttgacttcaactacctagacctcagcgcactactacgtaacagctttcaccgttacgccgtggatgtactcaagagcggtcgatgtcagatgctggaccgccgcacggtagaaatggccttcgcctacgcattagcactgttcgcagcagcccgacaagaagaggccggcgcccaagtctccgtcccacgggccctagaccgccaggccgcactcttacaaatacaagaatttatgatcacatgcctctcacaaacaccaccacgcaccacgttgctgctgtatcccacggccgtggacctggccaaacgagccctttggacaccgaatcagatcaccgacatcaccagcctcgtacgcctggtctacatactctctaaacagaatcagcaacatctcatcccccaatgggcactacgacagatcgccgactttgccctaaaactacacaaaacgcacctggcctcttttctttcagccttcgcacgccaagaactctacctcatgggcagcctcgtccactccatgctggtacatacgacggagagacgcgaaatcttcatcgtagaaacgggcctctgttcattggccgagctatcacactttacgcagttgttagctcatccacaccacgaatacctcagcgacctgtacacaccctgttccagtagcgggcgacgcgatcactcgctcgaacgcctcacgcgtctcttccccgatgccaccgtccccgctaccgttcccgccgccctctccatcctatctaccatgcaaccaagcacgctggaaaccttccccgacctgttttgcttgccgctcggcgaatccttctccgcgctgaccgtctccgaacacgtcagttatatcgtaacaaaccagtacctgatcaaaggtatctcctaccctgtctccaccaccgtcgtaggccagagcctcatcatcacccagacggacagtcaaactaaatgcgaactgacgcgcaacatgcataccacacacagcatcacagtggcgctcaacatttcgctagaaaactgcgccttttgccaaagcgccctgctagaatacgacgacacgcaaggcgtcatcaacatcatgtacatgcacgactcggacgacgtccttttcgccctggatccctacaacgaagtggtggtctcatctccgcgaactcactacctcatgcttttgaaaaacggtacggtactagaagtaac
tgacgtcgtcgtggacgccaccgacagtcgtctcctcggaagcggaggctctggtgcccatatcgtgatggtggacgcctacaagcctaccaaacatcatcaccatcaccactaa
[0317]
hcmv gl
[0318]
氨基酸(seq id no:33)：
[0319]
mcrrpdcgfsfspgpvillwcclllpivssaavsvaptaaekvpaecpeltrrcllgevfegdkyeswlrplvnvtgrdgplsqliryrpvtpeaansvlldeafldtlallynnpdqlralltllssdtaprwmtvmrgysecgdgspavytcvddlcrgydltrlsygrsiftehvlgfelvppslfnvvvairneatrtnravrlpvstaaapegitlfyglynavkefclrhqldppllrhldkyyaglppelkqtrvnlpahsrygpqavdar
[0320]
dna(包括终止密码子)(seq id no:34)：
[0321]
atgtgccgccgcccggattgcggcttctctttctcacctggaccggtgatactgctgtggtgttgccttctgctgcccattgtttcctcagccgccgtcagcgtcgctcctaccgccgccgagaaagtccccgcggagtgccccgaactaacgcgccgatgcttgttgggtgaggtgtttgagggtgacaagtatgaaagttggctgcgcccgttggtgaatgttaccgggcgcgatggcccgctatcgcaacttatccgttaccgtcccgttacgccggaggccgccaactccgtgctgttggacgaggctttcctggacactctggccctgctgtacaacaatccggatcaattgcgggccctgctgacgctgttgagctcggacacagcgccgcgctggatgacggtgatgcgcggctacagcgagtgcggcgatggctcgccggccgtgtacacgtgcgtggacgacctgtgccgcggctacgacctcacgcgactgtcatacgggcgcagcatcttcacggaacacgtgttaggcttcgagctggtgccaccgtctctctttaacgtggtggtggccatacgcaacgaagccacgcgtaccaaccgcgccgtgcgtctgcccgtgagcaccgctgccgcgcccgagggcatcacgctcttttacggcctgtacaacgcagtgaaggaattctgcctgcgtcaccagctggacccgccgctgctacgccacctagataaatactacgccggactgccgcccgagctgaagcagacgcgcgtcaacctgccggctcactcgcgctatggccctcaagcagtggatgctcgctaa
[0322]
hcmv ul131a
[0323]
氨基酸(seq id no:35)：
[0324]
mrlcrvwlsvclcavvlgqcqretaekndyyrvphywdacsralpdqtrykyveqlvdltlnyhydashgldnfdvlkrinvtevsllisdfrrqnrrggtnkrttfnaagslapharslefsvrlfan
[0325]
dna(包括终止密码子)——包含内含子(黑体)(seq id no:36)：
[0326][0327]
hcmv ul128
[0328]
氨基酸(seq id no:37)：
[0329]
mspkdltpfltalwlllghsrvprvraeeccefinvnhppercydfkmcnrftvalrcpdgevcyspektaeirgivttmthsltrqvvhnkltscnynplyleadgrircgkvndkaqyllgaagsvpyrwinleydkitrivgldqylesvkkhkrldvcrakmgymlq
[0330]
dna(包括终止密码子)——包含内含子(黑体)(seq id no:38)：
[0331][0332]
hcmv ul130
[0333]
氨基酸(seq id no:39)：
[0334]
mlrlllrhhfhclllcavwatpclaspwstltanqnpsppwskltyskphdaatfycpflypspprsplqfsgfqrvstgpecrnetlyllynregqtlversstwvkkviwylsgrnqtilqrmprtaskpsdgnvqisvedakifgahmvpkqtkllrfvvndgtryqmcvmkleswahvfrdysvsfqvrltfteannqtytfcthpnlivggggsggggsggggsepea
[0335]
dna(包括终止密码子)(seq id no:40)：
[0336]
atgctgcggcttctgcttcgtcaccactttcactgcctgcttctgtgcgcggtttgggcaacgccctgtctggcgtctccgtggtcgacgctaacagcaaaccagaatccgtccccgccatggtctaaactgacgtattccaaaccgcatgacgcggcgacgttttactgtccttttctctatccctcgcccccacgatcccccttgcaattctcggggttccagcgggtatcaacgggtcccgagtgtcgcaacgagaccctgtatctgctgtacaaccgggaaggccagaccttggtggagagaagctccacctgggtgaaaaaggtgatctggtacctgagcggtcggaaccaaaccatcctccaacggatgccccgaacggcttcgaaaccgagcgacggaaacgtgcagatcagcgtggaagacgccaagatttttggagcgcacatggtgcccaagcagaccaagctgctacgcttcgtcgtcaacgatggcacacgttatcagatgtgtgtgatgaagctggagagctgggctcacgtcttccgggactacagcgtgtcttttcaggtgcgattgacgttcaccgaggccaataaccagacttacaccttctgcacccatcccaatctcatcgttggaggcggaggatctggcggaggtggaagtggcggaggcggatctgagcccgaggcctaa
[0337]
肽(固相合成的——仅氨基酸序列)：
[0338]
snooptagjr-htert(seq id no:41)：gklgsiefikvnkgearpalltsrlrfipk
[0339]
snooptagjr-ggs-siinfekl(pep1)(seq id no:42)：gklgsiefikvnkgggssiinfekl
[0340]
snooptagjr-aay-siinfekl(pep2)(seq id no:43)：gklgsiefikvnkgaaysiinfekl
[0341]
生物素-snooptagjr(seq id no:44)：生物素-gklgsiefikvnk(n-末端生物素)
[0342]
生物素-spytag003(seq id no:45)：生物素-gsrgvphivmvdaykryk(n-末端生物素)
[0343]
修饰的腺病毒序列：
[0344]
ad5-pix-spycatcher序列
[0345]
ad5-pix-spycatcher(无接头)pix序列
[0346]
氨基酸(seq id no:46)：
[0347]
mstnsfdgsivssylttrmppwagvrqnvmgssidgrpvlpansttltyetvsgtpletaasaaasaaaatargivtdfaflsplassaasrssarddkltallaqldsltrelnvvsqqlldlrqqvsalkassppnavdsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgqvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvngkatkgd
[0348]
ahi
[0349]
dna(包括终止密码子)(seq id no:47)：
[0350]
atgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggttgacagcgccacacacatcaagttcagcaagagagatgaggacggcaaagagctggctggcgcaacaatggaactgagagatagcagcggcaagaccatcagcacctggatctccgacggccaagtgaaggacttctatctgtaccccggcaagtacaccttcgtggaaaccgccgctcctgacggatatgaagtggccaccgccatcaccttcaccgtgaatgagcagggacaagtgaccgtgaacggcaaggccacaaaaggcgacgcccacatttaa
[0351]
ad5-pix-spycatcher(eaaak3-gs接头)pix序列
[0352]
氨基酸(seq id no:48)：
[0353]
mstnsfdgsivssylttrmppwagvrqnvmgssidgrpvlpansttltyetvsgtpletaasaaasaaaatargivtdfaflsplassaasrssarddkltallaqldsltrelnvvsqqlldlrqqvsalkassppnaveaaakeaaakeaaakgsdsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgqvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvngkatkgdahi
[0354]
dna(包括终止密码子)(seq id no:49)：
[0355]
atgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggttgaagccgccgctaaagaagctgctgccaaagaggccgctgcaaagggatccgacagcgccacacacatcaagttcagcaagagagatgaggacggcaaagagctggctggcgcaacaatggaactgagagatagcagcggcaagaccatcagcacctggatctccgacggccaagtgaaggacttctatctgtaccccggcaagtacaccttcgtggaaaccgccgctcctgacggatatgaagtggccaccgccatcaccttcaccgtgaatgagcagggacaagtgaccgtgaacggcaaggccacaaaaggcgacgcccacatttaa
[0356]
ad5-pix-spycatcher(ggs-eaaak3接头)pix序列
[0357]
氨基酸(seq id no:50)：
[0358]
mstnsfdgsivssylttrmppwagvrqnvmgssidgrpvlpansttltyetvsgtpletaasaaasaaaatargivtdfaflsplassaasrssarddkltallaqldsltrelnvvsqqlldlrqqvsalkassppnavggseaa
akeaaakeaaakdsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgqvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvngkatkgdahi
[0359]
dna(包括终止密码子)(seq id no:51)：
[0360]
atgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggttggaggctccgaagccgccgctaaagaagctgctgccaaagaggccgctgcaaaggacagcgccacacacatcaagttcagcaagagagatgaggacggcaaagagctggctggcgcaacaatggaactgagagatagcagcggcaagaccatcagcacctggatctccgacggccaagtgaaggacttctatctgtaccccggcaagtacaccttcgtggaaaccgccgctcctgacggatatgaagtggccaccgccatcaccttcaccgtgaatgagcagggacaagtgaccgtgaacggcaaggccacaaaaggcgacgcccacatttaa
[0361]
ad5-pix-spycatcher(eaaak3接头，无ggs或gs铰链)pix序列
[0362]
氨基酸(seq id no:52)：
[0363]
mstnsfdgsivssylttrmppwagvrqnvmgssidgrpvlpansttltyetvsgtpletaasaaasaaaatargivtdfaflsplassaasrssarddkltallaqldsltrelnvvsqqlldlrqqvsalkassppnaveaaakeaaakeaaakdsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgqvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvngkatkgdahi
[0364]
dna(包括终止密码子)(seq id no:53)：
[0365]
atgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggttgaagccgccgctaaagaagctgctgccaaagaggccgctgcaaaggacagcgccacacacatcaagttcagcaagagagatgaggacggcaaagagctggctggcgcaacaatggaactgagagatagcagcggcaagaccatcagcacctggatctccgacggccaagtgaaggacttctatctgtaccccggcaagtacaccttcgtggaaaccgccgctcctgacggatatgaagtggccaccgccatcaccttcaccgtgaatgagcagggacaagtgaccgtgaacggcaaggccacaaaaggcgacgcccacatttaa
[0366]
ad5-pix-spycatcher(ggs-eaaak5-gs接头)pix序列
[0367]
氨基酸(seq id no:54)：
[0368]
mstnsfdgsivssylttrmppwagvrqnvmgssidgrpvlpansttltyetvsgtpletaasaaasaaaatargivtdfaflsplassaasrssarddkltallaqldsltrelnvvsqqlldlrqqvsalkassppnavggseaaakeaaakeaaakeaaakeaaakgsdsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgqvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvngkatkgdahi
[0369]
dna(包括终止密码子)(seq id no:55)：
[0370]
atgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgaccta
cgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggttggaggctccgaagccgccgctaaagaagctgctgccaaagaggccgctgcaaaggaggccgcagctaaggaagccgccgctaagggatccgacagcgccacacacatcaagttcagcaagagagatgaggacggcaaagagctggctggcgcaacaatggaactgagagatagcagcggcaagaccatcagcacctggatctccgacggccaagtgaaggacttctatctgtaccccggcaagtacaccttcgtggaaaccgccgctcctgacggatatgaagtggccaccgccatcaccttcaccgtgaatgagcagggacaagtgaccgtgaacggcaaggccacaaaaggcgacgcccacatttaa
[0371]
ad5-pix-spycatcher(δn1δc2)pix序列
[0372]
氨基酸(seq id no:56)：
[0373]
mstnsfdgsivssylttrmppwagvrqnvmgssidgrpvlpansttltyetvsgtpletaasaaasaaaatargivtdfaflsplassaasrssarddkltallaqldsltrelnvvsqqlldlrqqvsalkassppnavggseaaakeaaakeaaakgsdsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgqvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvng
[0374]
dna(包括终止密码子)(seq id no:57)：
[0375]
atgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggttggaggctccgaagccgccgctaaagaagctgctgccaaagaggccgctgcaaagggatccgacagcgccacccacatcaagttcagcaagagggacgaggacggcaaggagctggccggcgcaacaatggagctgagggacagcagcggcaagaccatcagcacctggatcagcgacggccaggtgaaggacttctacctgtaccccggcaagtacaccttcgtggagaccgccgcccccgacggctacgaggtggccaccgccatcaccttcaccgtgaacgagcagggccaggtgaccgtgaacggctaa
[0376]
ad5-pix-snoopcatcher序列
[0377]
ad5-pix-snoopcatcher pix序列
[0378]
氨基酸(seq id no:58)：
[0379]
mstnsfdgsivssylttrmppwagvrqnvmgssidgrpvlpansttltyetvsgtpletaasaaasaaaatargivtdfaflsplassaasrssarddkltallaqldsltrelnvvsqqlldlrqqvsalkassppnavggseaaakeaaakeaaakgshmkplrgavfslqkqhpdypdiygaidqngtyqnvrtgedgkltfknlsdgkyrlfensepagykpvqnkpivafqivngevrdvtsivpqdipatyeftngkhyitnepippk
[0380]
dna(包括终止密码子)(seq id no:59)：
[0381]
atgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctg
cgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggttggaggctccgaagccgccgctaaagaagctgctgccaaagaggccgctgcaaagggatcccacatgaagcccctgaggggcgccgtgttcagcctgcagaagcagcaccccgactaccccgacatctacggcgccatcgaccagaacggcacctaccagaacgtgaggaccggcgaggacggcaagctgaccttcaagaacctgagcgacggcaagtacaggctgttcgagaacagcgagcccgccggctacaagcccgtgcagaacaagcccatcgtggccttccagatcgtgaacggcgaggtgagggacgtgaccagcatcgtgccccaggacatccccgccacctacgagttcaccaacggcaagcactacatcaccaacgagcccatcccccccaagtaa
[0382]
ad5-pix-dogcatcher序列
[0383]
ad5-pix-dogcatcher pix序列
[0384]
氨基酸(seq id no:60)：
[0385]
mstnsfdgsivssylttrmppwagvrqnvmgssidgrpvlpansttltyetvsgtpletaasaaasaaaatargivtdfaflsplassaasrssarddkltallaqldsltrelnvvsqqlldlrqqvsalkassppnavggseaaakeaaakeaaakgsklgdiefikvnkndkkplrgavfslqkqhpdypdiygaidqngtyqnvrtgedgkltfknlsdgkyrlfensepagykpvqnkpivafqivngevrdvtsivpq
[0386]
dna(包括终止密码子)(seq id no:61)：
[0387]
atgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggttggaggctccgaagccgccgctaaagaagctgctgccaaagaggccgctgcaaagggatccaaactgggcgatattgaatttattaaagtgaacaaaaacgataaaaagccgctgcgtggtgccgtgtttagcctgcagaaacagcatcccgactatcccgatatctatggcgcgattgatcagaatgggacctatcaaaatgtgcgtaccggcgaagatggtaaactgacctttaagaatctgagcgatggcaaatatcgcctgtttgaaaatagcgaacccgctggctataaaccggtgcagaataagccgattgtggcgtttcagattgtgaatggcgaagtgcgtgatgtgaccagcattgtgccgcagtaa
[0388]
ad5-pix-spytag序列
[0389]
ad5-pix-spytag pix序列
[0390]
氨基酸(seq id no:62)：
[0391]
mstnsfdgsivssylttrmppwagvrqnvmgssidgrpvlpansttltyetvsgtpletaasaaasaaaatargivtdfaflsplassaasrssarddkltallaqldsltrelnvvsqqlldlrqqvsalkassppnavggseaaakeaaakeaaakgsahivmvdaykptk
[0392]
dna(包括终止密码子)(seq id no:63)：
[0393]
atgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggttggaggctccgaagccgccgctaaagaagctgctgccaaagaggccgctgcaaagggatccgcccacatcgttatggtggatgcctacaagcccaccaaataa
[0394]
ad5-pix-snooptagjr序列
[0395]
ad5-pix-snooptagjr pix序列
[0396]
氨基酸(seq id no:64)：
[0397]
mstnsfdgsivssylttrmppwagvrqnvmgssidgrpvlpansttltyetvsgtpletaasaaasaaaatargivtdfaflsplassaasrssarddkltallaqldsltrelnvvsqqlldlrqqvsalkassppnavggseaaakeaaakeaaakgsklgsiefikvnk
[0398]
dna(包括终止密码子)(seq id no:65)：
[0399]
atgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggttggaggctccgaagccgccgctaaagaagctgctgccaaagaggccgctgcaaagggatccaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaataa
[0400]
本技术中描述的用于衣壳修饰的配体：
[0401]
重组蛋白：
[0402]
sars cov2刺突-snooptagjr
[0403]
氨基酸(seq id no:66)：
[0404]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnspgsassvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldppeaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqgsgivqqqnnllraieaqqhllqltvwgikqlqarilaggsgghttwmewdreinnytslihslieesqnqqekneqellegsggsgklgsiefikvnkepea
[0405]
dna(包括终止密码子)(seq id no:67)：
[0406]
atgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtgaacctgaccaccagaacacagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctg
cactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactaccacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatatcgccgataccacagacgccgttagagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccaggacgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccagacacagacaaacagccctggcagcgcctcttctgtggccagccagagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgctgcctcctctgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctacaggttcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctctgtgctgaacgatatcctgagcagactggaccctcctgaggccgaggtgcagatcgacagactgatcacaggcagactgcagagcctccagacatacgtgacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggccag
agcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatatgtgcccgctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacacagcggaacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggacaagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgatatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcaaggctctggaattgtgcagcagcaaaacaatctgctgcgggccatcgaggctcagcagcatctgctgcagctgaccgtgtggggaatcaagcagctccaggccagaatcctggctggtggatctggcggccataccacctggatggaatgggacagagagatcaacaactacaccagcctgatccacagcctgattgaggaatcccagaatcagcaagagaagaacgagcaagaactgctggaaggaagcggaggctctggtaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaagagcccgaagcctaa
[0407]
sars cov2刺突rbd-snooptagjr
[0408]
氨基酸(seq id no:68)：
[0409]
mfvflvllplvssqcrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstngsggsgklgsiefikvnkepea
[0410]
dna(包括终止密码子)(seq id no:69)：
[0411]
atgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtcgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatggaagcggaggctctggtaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaagagcccgaagcctaa
[0412]
sars cov2刺突rbd-snoopcatcher
[0413]
氨基酸(seq id no:70)：
[0414]
mfvflvllplvssqcrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstngsggsggsggsghmkplrgavfslqkqhpdypdiygaidqngtyqnvrtgedgkltfknlsdgkyrlfensepagykpvqnkpivafqivngevrdvtsivpqdipatyeftngkhyitnepippkepea
[0415]
dna(包括终止密码子)(seq id no:71)：
[0416]
atgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtcgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgc
ctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatggaagcggaggctctggtggatccggtggatctggacacatgaagcctctgagaggcgccgtgttcagcctgcagaaacagcaccctgactaccccgatatctacggcgccatcgaccagaacggcacctaccagaatgttcggacaggcgaggatggcaagctgaccttcaagaacctgagcgacggcaagtaccggctgttcgagaattctgagcctgccggctacaagcccgtgcagaacaaacctatcgtggccttccagatcgtgaacggcgaagtgcgggatgtgaccagcatcgtgcctcaggatatccccgccacctacgagttcaccaacggcaagcactacatcaccaacgagcccattcctccaaaagagcccgaagcctaa
[0417]
snoopcatcher-sars cov2刺突rbd
[0418]
氨基酸(seq id no:72)：
[0419]
metdtlllwvlllwvpgstgdghmkplrgavfslqkqhpdypdiygaidqngtyqnvrtgedgkltfknlsdgkyrlfensepagykpvqnkpivafqivngevrdvtsivpqdipatyeftngkhyitnepippkgsggsggsrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnepea
[0420]
dna(包括终止密码子)(seq id no:73)：
[0421]
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacggtcacatgaagcccctgaggggcgccgtgttcagcctgcagaagcagcaccccgactaccccgacatctacggcgccatcgaccagaacggcacctaccagaacgtgaggaccggcgaggacggcaagctgaccttcaagaacctgagcgacggcaagtacaggctgttcgagaacagcgagcccgccggctacaagcccgtgcagaacaagcccatcgtggccttccagatcgtgaacggcgaggtgagggacgtgaccagcatcgtgccccaggacatccccgccacctacgagttcaccaacggcaagcactacatcaccaacgagcccatcccccccaagggctctggcggaagcggcggatcccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatgagcccgaggcctaa
[0422]
sars cov2刺突rbd-spycatcher
[0423]
氨基酸(seq id no:74)：
[0424]
mfvflvllplvssqcrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsa
sfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstngsggsggsggsgdsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgqvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvngkatkgdahiepea
[0425]
dna(包括终止密码子)(seq id no:75)：
[0426]
atgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtcgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatggaagcggaggctctggtggatccggtggatctggcgattctgccacacacatcaagttcagcaagcgcgacgaggacggcaaagaactggctggcgctaccatggaactgagagacagcagcggcaagaccatcagcacctggatctccgacggccaagtgaaggacttctatctgtaccccggcaagtacaccttcgtggaaaccgccgctcctgacggatatgaagtggccaccgccatcaccttcaccgtgaatgagcagggacaagtgaccgtgaacggcaaggccacaaaaggcgacgcccacattgagcccgaagcctaa
[0427]
实施例1
–
通过将spytag或dogtag插入到六邻体hvr环中对腺病毒衣壳进行模块化共价修饰。
[0428]
为了修饰腺病毒衣壳的六邻体蛋白，进行了序列比对，以鉴定图1e中高变区(hvr)环1、2和5的位置[以下腺病毒的序列比较；ad5和ad2(种类c)、ad12和ad18(种类a)、ad3和ad35(种类b)、ad4(种类e)、ad40和ad41(种类f)]。在图1e中指示的hvr环的插入位点处生成缺失。在每个基因座处插入spytag和dogtag。在所测试的三个hvr中的每一个中，spytag重组体和dogtag重组体之间指示的插入位点是相同的。在每个基因座处，spytag或dogtag序列的每侧侧翼为gsggsg序列。
[0429]
实施例2
–
spycatcher与插入到hvr环中的spytag的偶联
[0430]
将在hvr1、hvr2或hvr5处展示spytag的ad5载体与15μm或40μm的生物素化spycatcher一起孵育，以评估spytag与spycatcher之间的偶联反应。将样品在sds-page上运行，并通过考马斯染色将蛋白可视化，如图2a所示。偶联效率通过使用imagej软件比较未偶联的六邻体-spytag与六邻体-spytag:spycatcher的条带强度来评估(偶联的六邻体百分比＝六邻体-spytag:spycatcher的条带强度除以六邻体-spytag:spycatcher和未偶联的六邻体-spytag的条带强度之和，乘以100)。
[0431]
在图2a所述的偶联反应之后，立即用同一样品进行载体感染性测定(图2b)。将样品系列稀释，施加至96孔板中的hek293a细胞单层，并在37℃和5％co2孵育48h。通过荧光显微术对gfp荧光焦点计数来计算感染滴度。感染滴度计算为每毫升的感染单位(ifu)数。
[0432]
将在hvr1处展示spytag的ad5(gfp)载体(ad5(gfp)hvr1spytag)(1e 10病毒颗粒)与15μm或40μm的生物素化spycatcher在不同条件下孵育(图2c)。将样品在sds-page上运
行，并通过考马斯斯染色将蛋白可视化。对图2c所示的相同样品进行载体感染性测定(图2d)。
[0433]
结果表明，spytag插入ad5 hvr环后反应性差，并且在将spycatcher与病毒衣壳上》50％的六邻体蛋白偶联后，载体感染性显著降低(超过100倍)。
[0434]
实施例3
–
dogcatcher与插入到hvr环中的dogtag的偶联
[0435]
用野生型ad5(gfp)(天然六邻体蛋白)或插入到hvr1(hvr1dt)、hvr2(hvr2dt)或hvr5(hvr5dt)中的dogtag感染hek293a细胞。来自感染了在六邻体表面展示dogtag的ad5的1500cm2的贴壁hek293a细胞的载体产量与未修饰的六邻体ad5的载体产量相当(图3a)。
[0436]
将在hvr1、hvr2或hvr5处展示dogtag的ad5(gfp)载体(1e 10病毒颗粒)与5μm的dogcatcher一起孵育。反应在4℃进行16h，如图3b所示。如实施例2所述，通过使用imagej比较未偶联的六邻体-dogtag和六邻体-dogtag:dogcatcher的条带强度来评估偶联效率。图3c示出了对与图3b中相同的样品进行的感染性测定。
[0437]
将在hvr1、hvr2或hvr5处展示dogtag的ad5(gfp)载体(1e 10病毒颗粒)与20μm或80μm的dogcatcher在4℃一起孵育0.1小时、1小时或16小时，如图3d所示。如上所述评估了偶联效率。
[0438]
数据表明，dogtag在插入到ad5 hvr环中之后具有高度反应性，并且尽管》90％衣壳六邻体的覆盖率，但与dogcatcher偶联没有抑制载体感染性。
[0439]
实施例4
–
snooptagjr与插入到hvr环中的dogtag的反应性。
[0440]
将在hvr1、hvr2或hvr5处展示dogtag的ad5(gfp)载体(1e 10病毒颗粒)与snooptagjr-affiher2(80μm)和snoopligase(70μm)一起孵育。将样品在sds-page上运行，并通过考马斯斯染色将蛋白可视化。通过使用imagej比较未偶联的六邻体-dogtag和六邻体-dogtag:snjr-affiher2的条带强度来量化偶联效率(图4a)。
[0441]
为了评估六邻体-dogtag与snooptagjr-affiher2偶联的温度依赖性，将在hvr5处展示dogtag的ad5(gfp)载体(1e 10病毒颗粒)与snooptagjr-affiher2(80μm)和snoopligase(70μm)在20℃或4℃一起孵育16h(图4b)。如实施例3所述对用于图4b的样品进行载体感染性测定(图4c)。
[0442]
将在hvr5处展示dogtag的ad5(gfp)载体(1e 10病毒颗粒)与snooptagjr-affiher2(80μm)和snoopligase(70μm)在4℃一起孵育16h(图4d)。以150mm或75mm添加不同浓度的nacl，并按指示以15％(v/v)添加甘油。通过sds-page和考马斯染色对样品进行分析。
[0443]
实施例5
–
对非荧光重组载体的载体感染性评估。
[0444]
用ad5(gfp)(具有wt六邻体)和ad5(gfp)hvr5 dogtag进行六邻体免疫染色测定以评估载体感染性。将两种载体系列稀释，将50μl的每种稀释液转移到涂覆了聚-l-赖氨酸的96孔板中的hek293a细胞单层。在37℃和5％co2孵育48h后，通过荧光显微术对gfp阳性细胞计数。对于免疫染色，同一板上的细胞用冰冷的甲醇固定，并使用抗六邻体小鼠单克隆抗体(克隆65h6，thermofisher)来检测感染细胞内的六邻体蛋白。然后使用碱性磷酸酶缀合的二抗和bcip/nbt底物溶液对六邻体阳性细胞进行染色。结果表明，用具有wt六邻体蛋白的ad5载体和在hvr5处展示dogtag的ad5载体感染的hek293a细胞显示出相同强度的六邻体免疫染色。
[0445]
使用gfp荧光和六邻体免疫染色测定对ad5(gfp)(六邻体wt)和ad5(gfp)hvr5 dogtag的感染滴度进行了比较。两种测定在同一板上用相同的孔进行，n＝4。条形示出平均值 sd，并且点表示来自个体孔的斑点计数。通过双尾t检验计算的结果没有显著差异(ns)。
[0446]
实施例6
–
插入六邻体环的dogtag与加snooptagjr标签的肽的反应性
[0447]
合成由与t细胞表位融合的snooptagjr序列组成的肽。使用snoopligase将这些加snooptagjr标签的肽与ad5(gfp)hvr5 dogtag偶联。由于这些短肽的低分子量(～3kda)，使用考马斯染色的凝胶迁移测定不适合评估偶联效率。替代地，肽偶联的效率使用与dogcatcher的竞争测定来评估(如图6a所述)。snooptagjr-肽(snjr-肽)和六邻体-dogtag(六邻体-dt)使用snoopligase(snl)进行偶联。偶联后，将过量的dogcatcher(dc)蛋白添加到反应中。dc与ad5表面上》90％的游离(未偶联)六邻体-dt分子结合(参见图3b)，因此与snjr-肽偶联的六邻体-dt的比例可以估计为与dc一起孵育后在sds-page上未进行～20kda的凝胶迁移的六邻体的比例。
[0448]
使用上述dogcatcher竞争测定评估snooptagjr-htert肽(snooptagjr与来自人端粒酶逆转录酶的t细胞表位earpalltsrlrfipk融合)与六邻体-dt的偶联效率。将ad5(gfp)hvr5 dogtag(ad5-dt，1e 10病毒颗粒)与snl(70μm)和snjr-htert(80μm)的不同组合一起孵育，并且在一些样品中，在肽-肽偶联反应后添加dogcatcher(20μm，过量)以评估偶联效率(图6b)。所有反应均在4℃进行。将样品在sds-page上运行，随后进行考马斯染色(图6b)。通过比较所示的条带强度来评估偶联的六邻体-dt:snjr-htert与六邻体-dt:dc(代表初始snl催化反应后的游离六邻体-dt)的比例。六邻体-dt:snjr-htert反应的最佳时间间隔被确定为48h。
[0449]
图6c示出了使用上述dogcatcher竞争测定对snooptagjr-siinfekl肽(siinfekl是源自卵白蛋白的小鼠cd8

t细胞表位)与六邻体-dt的偶联效率的评估。pep1对应于肽序列snjr-ggssiinfekl，并且pep2对应于肽序列snjr-aaysiinfekl。将ad5-dt(1e 10病毒颗粒)与snjr-siinfekl肽(pep1或pep2，80μm)和snl(70μm)在4℃一起孵育48h。随后添加dc(20μm)。然后将样品在4℃再孵育24h。将样品在sds-page上运行，并如上述评估肽偶联效率。
[0450]
可选地，使用单价链霉亲和素(msa)的直接凝胶迁移测定可以用于评估短肽的偶联效率，如图6d所述。如前所述，将生物素化snjr-肽与snl和ad5-dt一起孵育。48h后，通过在包含十二烷基硫酸钠(sds)和二硫苏糖醇(dtt)的样品缓冲液中煮沸以使所有蛋白和病毒粒子结构变性来停止偶联反应。将样品在冰上短暂冷却，然后在20℃与过量的单价链霉亲和素(msa)一起孵育30min。将样品在sds-page上运行，转移至硝酸纤维素膜，并使用抗六邻体小鼠单克隆一抗(克隆65h6，thermfisher)进行蛋白印迹。通过msa与生物素的强相互作用(六邻体-dt:snjr-生物素/msa)，观察到与snjr-生物素偶联的六邻体-dt蛋白的凝胶迁移(～50kda)。图6e示出了上述msa直接凝胶迁移测定的sds-page和另外的对照。指示了对应于六邻体-dt:snjr-生物素/msa和六邻体-dt种类的条带。图6f示出了对图6c所示相同样品进行的载体感染性测定(通过gfp焦点计数，如实施例5中所述)。结果表明，ad5-dt感染性未被snjr-肽的表面展示影响。
[0451]
实施例7
–
ad5 hvr dogtag与dogcatcher融合蛋白的偶联。
[0452]
恶性疟原虫(pf)的环子孢子蛋白(csp)作为疟疾疫苗候选抗原已被广泛研究。该
蛋白含有高度免疫原性的重复区域，主要由序列nanp的重复组成。将来自该区域的不同长度的重复序列融合到dogcatcher的c-末端，并将得到的融合蛋白与ad5(gfp)hvr5 dogtag偶联。三种dogcatcher融合构建体nanp9、nanp18和nanpd(由来自3d7株的pfcsp的整个nanp重复结构域组成)在图7a中示出。
[0453]
评估了dogcatcher-nanpn与插入到六邻体hvr5环中的dogtag的反应性。将在hvr5处展示dogtag的ad5(gfp)载体(1e 9病毒颗粒)与15μm不同的dogcatcher-nanpn融合体(如所示)一起孵育。反应在4℃进行16h。将样品在sds-page上运行，并且蛋白通过考马斯染色可视化(图7b)。如上所述评估了偶联效率。对图7b中所示的相同样品进行了载体感染性测定(通过gfp焦点计数，如上所述)(图7c)。
[0454]
实施例8
–
dogcatcher-nanpn通过六邻体偶联到ad5表面降低了病毒中和抗体的效力。
[0455]
将ad5(gfp)hvr5 dogtag载体(ad5-dt，1e 10病毒颗粒)与snoopligase(snl)和snjr-affiher2(或单独的snjr-affiher2)在4℃一起孵育48h。48h后，约60％-65％的六邻体与snjr-affiher2偶联(偶联效率与图4b所示的实验相当)。将偶联载体与系列稀释的病毒中和性小鼠单克隆抗六邻体抗体mab 9c12(developmental studies hybridoma bank,university of iowa)在37℃一起孵育1h，然后将载体-抗体混合物添加到96孔板形式中的80％汇合的hek293a细胞单层(以200ifu/细胞的感染复数被感染细胞)。将细胞与载体-抗体混合物在37℃和5％co2孵育2h，然后用新鲜培养基替换混合物，并将板返回到37℃5％co2再孵育24h。24h后，hek293a细胞内的gfp表达用作感染性的读数——在荧光计上使用395nm的激发和509nm的发射测量批量荧光。图8a中示出的数据表明，在snooptagjr-affiher2与ad5 dogtag偶联后，有效的中和性抗六邻体单克隆抗体的ic
50
增加。使用偶联载体(ad5-dt snl snjr-affiher2)，mab9c12中和的ic
50
从2.5ng/ml(单独的ad5-dt，和仅ad5-dt snjr-affiher2)增加到7ng/ml。
[0456]
在图8b中，使用图7a中描述的dogcatcher-nanpn融合体进行了与上述类似的实验。将ad5(gfp)hvr5 dogtag载体(ad5-dt，1e 9病毒颗粒)与dogcatcher-nanpn构建体在4℃一起孵育16h，完全如图7所述。每个构建体与ad5-dt的偶联效率与图7b中所示的相似。如上所述，将载体与mab 9c12一起孵育1h，将混合物以200ifu/细胞的感染复数添加到细胞，持续2h，并用新鲜培养基替换载体，然后在另24h后读取gfp荧光。与单独的ad5-dt相比，使用dogcatcher-nanpn偶联载体观察到mab 9c12的ic
50
显著增加，这意味着六邻体被屏蔽免受中和单克隆抗体影响(图8b)。ad5-dt:dc-nanp18表现出最大的ic
50
增加，与单独的ad5-dt相比》10倍。
[0457]
在图8c中，用ad5阳性小鼠血清(而不是mab 9c12)对偶联的ad5-dt:dc-nanpn载体进行了中和测定。为了产生ad5阳性小鼠血清，用1e 8ifu的ad5(卵白蛋白)(wt六邻体)载体(在e1基因座处编码的组成型cmv启动子的控制下表达卵白蛋白而不是gfp的具有未修饰的六邻体的ad5 e1和e3缺失载体)对小鼠进行肌肉内免疫，并在免疫后两周收获血清。中和测定的结果表明，与单独的ad5-dt相比，使用ad5-dt:nanp9和ad5-dt:nanp18，中和抗血清的ic
50
增加(图8c)。
[0458]
实施例9
–
skov3细胞的人凝血因子x依赖性载体转导
[0459]
已经展示，特别是在静脉内施用后，包括ad5在内的一些腺病毒血清型可以通过人
凝血因子x(fx)和病毒的六邻体蛋白之间的相互作用转导肝细胞[simon n.waddington,john h.mcvey,david bhella,menzo j.e.havenga,stuart a.nicklin,andrew h.baker,adenovirus serotype 5hexon mediates liver gene transfer.cell,2008,第132卷,第3期,p397-409]。在体外，fx介导的感染可以通过测量在存在或不存在fx的情况下skov3细胞(一种人类卵巢癌细胞系)的载体转导来评估。
[0460]
在存在或不存在人凝血因子x(8μg/ml)的情况下，将ad5(gfp)-dogtag(ad5)或ad5(gfp)-dogtag:dogcatcher-nanp18(ad5-nanp18)载体(2e 9病毒颗粒)在无血清培养基中与skov3细胞在37℃一起孵育2h。然后用新鲜的完全培养基替换培养基，并将板再孵育48h。然后通过荧光显微术对gfp阳性焦点计数来计算感染滴度。
[0461]
数据指示，dogcatcher-nanp18与ad5六邻体的偶联减少了对skov3细胞的fx依赖性感染，可能是通过屏蔽病毒衣壳免受与fx相互作用。
[0462]
实施例10
–
评估cd8

t细胞对ad5表面展示的肽抗原的应答的小鼠免疫原性实验。
[0463]
将c57bl/6小鼠(4只/组)用以下进行肌肉内免疫：表面展示载体ad5(gfp)hvr5-dt:snjr-ggssiinfekl(5e 9病毒颗粒，透析以去除过量的肽和snoopligase)(组1)、与组1相同但未透析去除过量的肽和snoopligase的siinfekl表面展示载体(5e 9病毒颗粒，过量的siinfekl肽0.7μg)(组2)、与snjr-ggssiinfekl肽(0.7μg，未与载体偶联)共施用的ad5(gfp)载体(5e 9病毒颗粒)(组3)、或snjr-ggssiinfekl肽(5μg，与10μg poly i:c共施用)(组4)(图10a)。考虑到snjr-ggssiinfekl的分子量，80％六邻体覆盖率的偶联效率(参见图6c，pep1)，每个病毒粒子720个六邻体拷贝，以及每疫苗剂量5e 9个病毒粒子，来自组1的偶联载体上展示的siinfekl肽的有效剂量计算为约10ng。组4中的肽剂量是组1的500倍高。免疫后14天之后，处死小鼠，并通过过夜离体ifnγ-elispot测量脾中的cd8

t细胞应答。
[0464]
对siinfekl(鼠cd8

t细胞表位)的脾离体ifnγ-elispot应答在图10b示出。组1和组2中的siinfekl应答高于组3中的siinfekl应答，表明snjr-ggssiinfekl与载体衣壳的附接是实现有效的siinfekl t细胞应答所需的。脾对dtlvnriel(egfp
118
–
126
)(细胞转导后由载体表达的存在于编码的gfp转基因中的鼠cd8

t细胞表位)的脾离体ifnγ-elispot应答在图10c中示出。组1-3之间的egfp
118
–
126
反应没有显著差异，表明对载体衣壳的表面修饰没有损害t细胞对编码的gfp转基因抗原的应答。
[0465]
实施例11
–
通过在pix的c-末端融合spycatcher对腺病毒衣壳进行模块化共价修饰。
[0466]
如图11a所示，在病毒pix的c-末端和spycatcherδn1的n-末端之间插入了(eaaak)3接头，以促进病毒的成功拯救和有效的衣壳展示。
[0467]
将ad5(gfp)pix-spycatcher载体(3e 9病毒颗粒)与spytag-麦芽糖结合蛋白(spytag-mbp，5μm)或spytag-人巨细胞病毒五聚体(spytag-五聚体，2.5μm)在4℃一起孵育16h(图11b)。含有仅spytag-mbp或spytag-五聚体的样品作为对照。缀合后，将样品在sds-page上运行，并转移至硝酸纤维素膜用于蛋白印迹。pix-spycatcher、pix-spycatcher:spytag-mbp和pix-spycatcher:spytag-gh(来自hcmv五聚体)种类使用来自用spycatcher蛋白免疫的小鼠的抗血清进行检测(图11b)。
[0468]
将ad5(gfp)pix-spycatcher载体(3e 9病毒颗粒)与生物素化spytag肽(5μm)在4℃一起孵育16h(图11c)。为了通过凝胶迁移测定评估肽与pix-spycatcher的偶联效率，将
载体材料在包含十二烷基硫酸钠(sds)和dtt的样品缓冲液中变性和煮沸，然后冷却并与单价链霉亲和素(msa)一起孵育，如图6d中所述。pix-spycatcher和pix-spycatcher:spytag-生物素/msa种类通过sds-page和蛋白印迹用抗spycatcher抗血清来检测，如图11b中所述。
[0469]
对图11b和图11c所示的相同样品进行了载体感染性测定(通过gfp焦点计数，如前所述)(图11d)。结果表明，ad5(gfp)pix-spycatcher感染性不受spytag蛋白融合或肽的表面展示的影响。
[0470]
实施例12
–
具有融合到pix的c-末端的spycatcher、snoopcatcher或dogcatcher的不同重组腺病毒载体的存活力、遗传稳定性和产量
[0471]
进一步的研究表明，实施例11中描述的载体构建体(通过eaaak3接头融合到pix的c-末端的spycatcher)虽然具有反应性，但在遗传上不是稳定的。构建了一系列具有替代接头序列(gsggsggsg(gsg3)、ggseaaakeaaakeaaakgs(eaaak3)或ggspanlkaleaqkqkeqrqaaeelanakklkeqlekgs(来自核糖体蛋白l9的螺旋序列，veggiani等人,proc natl acad sci u s a.2016feb2；113(5):1202-7.doi:10.1073/pnas.1519214113)(helix))、接头任一侧的gs铰链序列或替代catcher(spycatcher dn1、spycatcher dn1dc2、snoopcatcher、dogcatcher)的替代构建体(图12a)。每种载体dna构建体通过paci限制性消化进行线性化，以在转染到hek293a细胞中之前释放病毒末端反向重复序列(itr)。每种构建体的存活力通过检查细胞单层的细胞病变效应(cpe)的发展来评估，细胞病变效应(cpe)将指示重组病毒的成功拯救。对存活病毒载体制剂进行传代以增加病毒滴度，通常需要三次传代以(从初始转染)获得足够的材料用于通过cscl梯度超速离心进行纯化。需要进行第四次传代以获得第二批各种存活载体，并在第三次和第四次传代后通过对pix基因座进行测序来评估遗传稳定性。为了评估载体产量，从总共10
×
t150瓶(总表面积1500cm2的hek293a细胞)扩增了存活载体，通过cscl超速离心纯化，并如前所述通过gfp感染性测定计算感染滴度(图12b)。
[0472]
实施例13
–
融合到pix的c-末端的snoopcatcher和dogcatcher的反应性
[0473]
为了评估ad5(gfp)pix-snoopcatcher与snooptagjr融合配体的反应性，将ad5(gfp)pix-snoopcatcher载体与加标签的全长sars cov2刺突(spike)或sars cov2刺突受体结合结构域(rbd)蛋白一起孵育。两种重组蛋白均在哺乳动物悬浮293f细胞中产生，snooptagjr在c-末端融合。在4℃进行16h偶联反应后，将样品在sds-page上运行，并使用针对snoopcatcher具有反应性的小鼠血清(来自用imx313-dogtag:snooptag-cidr:snoopligase免疫的小鼠的血清，andersson,a.c.,buldun,c.m.,pattinson,d.j.等人snoopligase peptide-peptide conjugation enables modular vaccine assembly.sci rep 9,4625(2019))进行蛋白印迹(图13a)。对照包括单独的载体(vector)，单独的刺突(spike)和单独rbd(rbd)。指示了包括pix-snoopcatcher(pix-snc)和共价偶联的pix-snoopcatcher:snooptagjr-刺突(pix-snc:snjr-spike)和pix-snoopcatcher:snooptagjr-rbd(pix-snc:snjr-rbd)的种类。在图13a中描述的偶联反应之后，立即对相同的样品进行载体感染性测定(gfp焦点)(图13b)。数据指示，当融合到pix的c-末端融合时snoopcatcher具有反应性，并且配体与pix的偶联不损害载体在体外的感染性(尽管sars cov2刺突三聚体的尺寸超过500kda)。
[0474]
为了评估ad5(gfp)pix-dogcatcher与dogtag融合配体的反应性，将ad5(gfp)pix-dogcatcher载体与大肠杆菌表达的小泛素样修饰蛋白(sumo)(其中dogtag在c-末端融合)
一起孵育。在4℃进行16h偶联反应后，将样品在sds-page上运行，并使用针对dogcatcher具有反应性的小鼠血清进行蛋白印迹(图13c)。图13a中描述的用于蛋白印迹的相同小鼠血清也用于图13c中，因为dogcatcher与snoopcatcher共有显著程度的序列同一性。对照包括单独的载体(vector)和单独的sumo(sumo)。指示了种类pix-dogcatcher(pix-dc)和pix-dogcatcher:dogtag-sumo(pix-dc:dt-sumo)。
[0475]
实施例14
–
融合到pix的c-末端的snooptagjr和spytag的反应性
[0476]
ad5(gfp)载体是用融合到pix的c-末端的snooptagjr或spytag构建的，在pix和标签之间具有侧翼为ggs和gs铰链的eaaak3接头，类似于图12a中所示的snoopcatcher和dogcatcher融合构建体。将ad5 pix-snooptagjr载体和ad5 pix-spytag载体两者转染到hek293a细胞中，传代并扩增到10
×
t150 cm2瓶中。两种载体的感染性产量都很高，并且与ad5(gfp)hvr5-dogtag相当(图14a)。
[0477]
为了评估展示为pix融合体的snooptagjr和spytag的反应性，将ad5 pix-snooptagjr(ad5 pix-snjr)或ad5 pix-spytag(ad5 pix-st)载体与重组哺乳动物(中国仓鼠卵巢，cho)细胞共孵育，该细胞表达与snoopcatcher融合的sars cov2 rbd蛋白(rbd-snc或snc-rbd，分别为c-末端或n-末端与rbd融合)或与spycatcher融合的sars cov2 rbd蛋白(rbd-sc，c-末端融合)。在4℃进行16h偶联反应后，将样品在sds-page上运行，并使用抗sars cov2 rbd多克隆抗体(sino biology)进行蛋白印迹(图14b)。表示标签和捕手模块之间偶联的蛋白种类被指示(*)。在图14b中描述的偶联反应之后，立即对相同的样品进行载体感染性测定(gfp焦点)(图14c)。配体的偶联没有损害ad5 pix-snooptagjr或ad5pix-spytag的感染性。