基于杨树花的绿色碳量子点荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属于荧光材料制备领域，具体涉及一种基于废弃物杨树花的无掺杂荧光碳量子点及其制备方法和应用。


背景技术：

2.恩诺沙星(enrofloxacin，enr)又称乙基环丙沙星，属于氟喹诺酮类药物，是一种化学合成抑菌剂。恩诺沙星具备高效低毒，抗菌谱广泛，价格低廉，耐药交叉性好等优点，使其在牲畜家禽与水产养殖的过程中得到了广泛的应用。恩诺沙星此类药物在动物体内的半衰期较长，因此若在养殖家畜过程中长期使用该类药物，会导致动物体内的恩诺沙星残留量增高。同时家畜体内难以代谢的恩诺沙星会以动物排泄物的方式排出体外，对环境也会产生影响。人类长期食用了相关的肉源类食品或乳制品之后，恩诺沙星会在人体内富集，对人类的生命健康构成威胁。目前恩诺沙星的检测方法主要有高效液相色谱法、毛细血管电泳法、荧光光度法、化学发光分析法、酶联免疫法及电化学分析法等。这些分析方法存在很多问题，比如，高效液相色谱法与毛细血管电泳法具有较高的准确度，但仪器昂贵，分析灵敏度低；荧光光度法与化学发光法虽然具有较高的灵敏度，但是其需要特殊试剂且方法的选择性较差；而酶联免疫法制备的抗体与多种残留药物进行反应，不宜作为单一检测方法，仅适用于对大量样品的快速筛选与检测；电化学分析法通常需对电极界面进行修饰，导致检测过程费时，且分析的重现性也较差。因此急需一种设备成本低、操作方便快捷、灵敏度高、检测体系稳定的分析新手段用于恩诺沙星的检测。
3.碳量子点(carbon quantum dots,cqds)是一类新兴的具有光致发光(pl)的零维(0d)碳基材料，其粒径《10nm，呈类球形，具有良好的光化学性质。以碳量子点作为荧光探针，具有水溶性好、价格低廉等优点。这些优点使碳量子点在许多领域有着广泛的应用，如细胞成像，荧光传感等研究领域。现以生物基质为前体材料制备一种无需掺杂绿色碳量子点作为荧光探针，制备的碳量子点荧光探针具备水溶性好、低毒、低污染、成本低廉、生物相容性好等诸多优点。针对当下抗生素在各类乳制品中残留快速，大规模检测问题，开发简单荧光碳量子点的制备方法，实现对乳制品中恩诺沙星快速有效的检测具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种基于废弃物杨树花的无掺杂绿色碳量子点荧光探针及其制备方法和应用，该碳量子点具有较高荧光强度，原料杨树花来源广泛且低廉。合成的荧光碳量子点具有检测快速，灵敏等优点。可作为荧光探针生物传感器检测牛奶中恩诺沙星残留。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案来实现：
6.本发明提供的无掺杂绿色碳量子点荧光探针，采用的前体材料为废弃物杨树花，碳量子点整体呈类球形，平均粒径为6.40nm，具有水溶性好，低毒，生物相容性好的特点。
7.所述基于杨树花的绿色碳量子点荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
8.1)取干燥的杨树花粉末，溶解在超纯水中，涡旋，得到混合液；
9.2)将步骤1)中所得混合液加入到反应釜中加热反应；
10.3)将步骤2)中加热后得到的产物冷却至室温后，用滤膜过滤，将过滤后所得产物在真空冷冻干燥，得到无掺杂绿色碳量子点(cqds)固体，在低温保存备用；
11.4)将步骤3)中的无掺杂绿色cqds固体加入超纯水配制成cqds溶液，得到cqds荧光探针，放在低温保存。
12.上述基于杨树花的绿色碳量子点荧光探针的制备方法，其中：
13.所述步骤1)中，所述杨树花粉末与超纯水的投料比为：(0.40-0.60)g:(20-30)ml。在该投料比范围下所制备的cqds所具备的荧光性质差别较小，即在这个投料比范围内，所制备的碳量子点荧光强度变化在100-200a.u.以内。所述涡流时间为5-10min。
14.所述步骤2)中，所述反应釜为聚四氟乙烯内胆高压反应釜；所述加热反应温度为160-200℃，加热反应时间为8-12h，其中，在反应釜中加热的目的是选择最佳荧光强度，过高或过低都能导致荧光强度变弱，加热时间过长或过短会降低cqds的荧光强度，优选加热反应温度为180℃，加热反应时间为10h。合适的反应温度和反应时间是获得高的荧光强度的条件，进而使cqds获得高的荧光量子产率。
15.所述步骤3)中，通过冷却至室温获得的溶液，采用0.22μm微孔滤膜过滤，除去溶液中大分子杂质，在真空冷冻(-80℃)干燥12-48h，在该干燥条件下得到的cqds固体具有较好的发光性质。干燥好的cqds固体放在0-6℃低温条件下保存备用。
16.所述步骤4)中，cqds固体加入超纯水配制成浓度为0.1mg/ml的cqds溶液，当浓度低于0.1mg/ml时荧光强度较低，且用量较大，当浓度高于0.1mg/ml时会增加后续实验中待测物用量，即cqds溶液浓度过低或过高都会增加测量的误差。
17.本发明提供的基于杨树花的绿色碳量子点荧光探针在检测牛奶中恩诺沙星的应用。
18.采用基于杨树花的绿色碳量子点荧光探针检测牛奶中恩诺沙星的检测方法，包括以下步骤：
19.s1，绘制恩诺沙星浓度标准曲线：将本发明方法制备的cqds荧光探针分别与多个不同浓度的恩诺沙星溶液混合并涡旋，得到恩诺沙星浓度范围为0.2-100μm的标准溶液，每个标准溶液都使用荧光分光光度计测试在激发波长为380-600nm下的荧光强度并记录，之后将荧光强度与恩诺沙星浓度线性拟合，得到标准曲线图；
20.s2牛奶加入乙腈，用超纯水定容，涡旋，离心，取上层清液，过滤，获得预处理后的牛奶样品；
21.s3将步骤s2中预处理所得的牛奶样品与本发明所制备的cqds荧光探针溶液混合，并用超纯水稀释，得到待测液，测定待测液的荧光强度并记录，结合步骤s1中得到的标准曲线图，获得牛奶样品中恩诺沙星残留浓度。
22.上述检测方法中，采用的荧光分光光度计的参数设置为：扫描速度(1000nm/min)，激发带宽(10nm)，发射带宽(10nm)，增益(中，650v)。
23.由于cqds具有较高的荧光量子产率，使得cqds固体或cqds溶液在紫外灯(365nm)的激发下，均呈蓝色荧光，通过荧光分光光度计检测，两者的最佳激发波长均为λex＝368nm，最佳发射波长均为λem＝445nm；而当恩诺沙星与cqds溶液混合时，由于恩诺沙星结
构中的c-f,c-n,-cooh基团能够与cqds表面-nh-基团形成氢键，导致cqds的荧光响应增强，在一定浓度范围内，荧光强度与恩诺沙星的浓度线性相关。本发明即是基于上述特性而提供本发明所述的无掺杂绿色碳量子点荧光探针在检测牛奶中恩诺沙星残留的应用，且该荧光探针对恩诺沙星一定范围内都具有良好的选择性和灵敏性，而其他的金属离子或其他种类抗生素对该检测体系干扰极小。因此，可通过cqds实现对牛奶中恩诺沙星的有效检测，并在生物、医学等领域具有很好的应用价值和应用前景。
24.与现有技术相比，本发明具有以下特点：
25.1)本发明制得的碳量子点荧光探针原料为废弃物杨树花，来源广泛。
26.2)本发明提供的碳量子点荧光探针制备过程简便、易操作、检测灵敏度高，产品性能稳定，信号响应强。
27.3)荧光探针对恩诺沙星表现出较强的选择性，可有效减少其他金属离子或其他种类抗生素对检测的干扰，使检测结果具有较高的可靠性。
28.4)本发明的荧光探针包含蓝色荧光的cqds，无需任何掺杂过程，且也不需要任何金属离子进行猝灭辅助。
29.5)本发明中的cqds在加入恩诺沙星后荧光强度明显增强，并且荧光强度与恩诺沙星浓度一定范围内具有良好的线性关系。
30.6)cqds荧光探针可实现对恩诺沙星的有效检测，在环境、生物和医学等领域具有很好的应用价值和应用前景。
附图说明
31.图1为本发明的用于恩诺沙星检测的基于废弃物杨树花的绿色碳量子点荧光探针的制备原理及检测原理示意图；
32.图2为本发明实施例1中制得的cqds固体的透射电镜图；
33.图3为本发明实施例2中的cqds及enr/cqds的红外光谱图；图(a)为cqds基团在红外吸收光谱图中的各归属峰，图(b)为cqds及enr/cqds红外光谱图中-nh-归属峰位置差异；
34.图4为本发明实施例3中cqds不同ph下的荧光强度的关系图；
35.图5为本发明实施例4中cqds在nacl中的稳定性图；
36.图6为本发明实施例5中其他种类抗生素对enr/cqds溶液荧光强度影响的对比图；f0为未加入其他种类抗生素时enr/cqds的荧光强度，f为加入其他种类抗生素后enr/cqds的荧光强度；
37.图7为本发明实施例5中不同金属离子对cqds溶液荧光强度影响的对比图；f0为未加入金属离子时，enr/cqds的荧光强度，f为加入金属离子后enr/cqds的荧光强度；
38.图8为本发明实施例6中不同enr浓度下cqds溶液的荧光发射谱图；
39.图9为本发明实施例6中不同enr浓度与cqds溶液荧光强度的关系图；f0为未加入enr时cqds的荧光强度，f为加入enr后enr/cqds的荧光强度。
40.图10为本发明实施例8中检测cqds溶液细胞毒性附图。
具体实施方式
41.下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案进一步的详细说明，但不构成对本
发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次修改、仍在本发明的权利要求保护范围之内。
42.实施例1
43.基于杨树花的绿色碳量子点荧光探针的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
44.1)将干燥的杨树花粉末0.40g，溶解在20ml超纯水中(ultra-pure water)，涡旋5min，得到混合液。
45.2)将步骤1)中所得混合液置于100ml衬有聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，在180℃条件下持续加热反应10h。
46.3)将步骤2)中加热反应后得到产物自然冷却至室温得到溶液，将所得溶液用0.22μm滤膜过滤，将过滤后的溶液在-80℃下真空冷冻干燥12h，得到cqds固体，放在0-6℃条件下低温保存。
47.4)取适量cqds固体分散在超纯水中配制浓度为0.1mg/ml cqds溶液，得到cqds荧光探针，保存在0-6℃低温条件下用于后续进一步表征和应用。
48.对制得的cqds固体材料进行透射电镜表征及光学表征，表征结果如下：
49.透射电镜表征：如图2所示，从图中可以观察到cqds的平均粒径为6.40nm，纳米粒子没有发生明显聚集，呈现出较好的单分散状态，表现出较好的分散性；
50.实施例2
51.enr/cqds荧光探针的制备
52.取5ml的离心管，加入实施例1中配制好的cqds(0.1mg/ml)溶液150μl，加入恩诺沙星(浓度为50μm)溶液150μl，并加超纯水稀释至3ml，涡旋60s，制得enr/cqds荧光探针。
53.经检测enr/cqds溶液在紫外灯(365nm)照射下荧光显著增强。
54.分别对相同浓度的cqds溶液以及enr/cqds进行红外吸收光谱表征，表征结果如下：
55.图3(a)为cqds基团在红外吸收光谱图中的各归属峰，图3(b)为cqds及enr/cqds红外光谱图中-nh-归属峰位置差异。如图3(b)所示，可以看到加入enr后，红外光谱图中cqds的-nh-归属峰吸收强度明显增强，峰宽变宽，-nh-的伸缩振动频率蓝移，说明cqds与恩诺沙星分子之间形成了氢键，由此推断，恩诺沙星与cqds的荧光增强机理是因为氢键的形成，分子结构的共平面性增强而导致非辐射通道关闭，辐射通道打开，最终导致cqds荧光强度显著增强。
56.实施例3
57.检测cqds的ph稳定性：
58.取多个5ml的离心管，分别将实施例1中制得的cqds(0.1mg/ml)溶液取150μl，通过加入不同浓度相同体积的naoh和hcl溶液，再用超纯水稀释到3ml，最终配制成ph梯度范围为1-13的溶液，涡旋60s，用ph计检测其ph，随后再进行荧光检测。检测结果如图4所示，可以看到当ph在3-11范围内时cqds的荧光强度变化不大，由此说明cqds只有在极端酸碱的条件下，其荧光强度才会明显改变，一般酸碱条件下，cqds具有较好的稳定性。
59.实施例4
60.检测cqds在nacl中的稳定性：
61.取多个5ml的离心管，分别将实施例1中制得的cqds(0.1mg/ml)溶液取150μl，通过
分别加入一定浓度不同体积的nacl溶液，再用超纯水稀释定容到3ml，最终配制成nacl梯度范围为0-1.5mol/l的溶液，涡旋60s，随后再进行荧光检测。检测结果如图5所示，可以看到当nacl浓度在0-1.5mol/l范围内时cqds的荧光强度变化不大，由此说明cqds在一般条件下，对nacl具有较好的稳定性。
62.实施例5
63.cqds荧光探针对金属离子和其他种类抗生素的抗干扰性实验：
64.取多个5ml的离心管，分别加入实施例1中制得的cqds(0.1mg/ml)溶液150μl和恩诺沙星溶液(浓度为50μm)150μl，之后分别加入含金属离子mg
2
,ca
2
,mn
2
,ba
2
,zn
2
，k

,na

的盐溶液150μl(浓度均为5mm)以及其他种类抗生素如庆大霉素(gentamicin,gen)，链霉素(streptomycin,str)，美洛西林钠(mezlocillin sodium,mez)，头孢羟氨苄(cefadroxil,cef)，甲氧苄啶(trimethoprim,tmp)，磺胺嘧啶(sodium sulfadiazine,sul)，环丙沙星(ciprofloxacin,cip)溶液150μl(浓度均为50μm)，测量并记录荧光强度。检测结果如图6及图7所示，可以看到cqds荧光探针对恩诺沙星具有较好的选择性，并不会轻易收到其他金属离子和抗生素的影响
65.实施例6
66.检测不同enr浓度下cqds的荧光强度：
67.取多个5ml的离心管，加入实施例1中制得的cqds(0.1mg/ml)溶液取150μl，加入相同浓度不同体积的enr溶液后，用超纯水稀释定容到3ml，涡旋60s，测量并记录荧光强度。检测结果如图8所示，可以看到enr浓度在0.2-100μm范围内时，cqds荧光强度随enr浓度的增加而增强。
68.将enr浓度与荧光强度进行线性拟合，拟合结果如图9所示，可以看到当enr浓度在0.2-100μm范围内时，enr浓度与荧光强度之间具有较好的线性关系(r2＝0.998)。
69.实施例7
70.采用基于杨树花的绿色碳量子点荧光探针检测牛奶中恩诺沙星的检测方法，包括如下步骤：
71.s1，绘制恩诺沙星浓度标准曲线：将实施例1中制得的cqds(0.1mg/ml)荧光探针与多个不同浓度的恩诺沙星溶液混合，涡旋60s，得到恩诺沙星浓度范围为0.2-100μm的标准溶液，每个标准溶液都使用荧光分光光度计测试在激发波长为380-600nm下的荧光强度并记录，之后将荧光强度与恩诺沙星浓度线性拟合，得到标准曲线图。
72.s2精密吸取牛奶1ml，再加入6ml乙腈，用超纯水定容至10ml，涡旋10min，用低速离心机以4200r/min的转速离心10min。离心完成后吸取上层清液，使用0.22μm的滤膜(水系)过滤，获得预处理后的牛奶样品。
73.s3将步骤s2中预处理所得的牛奶样品与实施例1中所制备的cqds(0.1mg/ml)荧光探针溶液混合，并用超纯水稀释，得到待测液，测定待测液的荧光强度并记录，结合步骤s1中得到的标准曲线图，获得牛奶样品中恩诺沙星残留浓度。
74.实施例8
75.检测所制备的cqds溶液细胞毒性：
76.实验过程：为了评估所制备的cqds荧光探针的细胞毒性，进行了细胞毒性实验。采用cck-8(细胞计数试剂盒-8)比色法检测cqds的生物相容性。测量了在cqds存在的情况下
hepa1-6(小鼠肝癌细胞)、mef(小鼠胚胎成纤维细胞)和hct-116(人结肠癌细胞)的存活率。具体步骤如下：
77.1)hepa1-6、mef和hct-116在杜尔贝科改良培养基(dmem)中于37℃、5％co2的恒温条件下培养48h。
78.2)将步骤1)中的hepa1-6、mef和hct116定量(每孔5000-10000)注入costar 96孔组织培养集群，之后培养24h。
79.3)使用超纯水作为溶剂将cqds稀释至一系列浓度，向各种细胞培养液中添加100μl不同浓度(0、12.5、25、50、100、200μg/ml)的cqds溶液，分别培养12h、24h、48h和60h。每个样本应平行重复三次。对照组为不添加cqds的细胞培养液。向每个孔中添加10μl cck-8溶液，将其放置在培养箱中，并在37℃下培养4h。之后从每个孔中吸取培养基并溶解于甲瓒，然后在85rpm的恒温摇床上振摇15min。
80.4)在450nm的微孔板读取器中测量步骤3)中每个孔的吸光度，根据公式计算细胞存活率
81.实验结果：如图10所示，在上述实验方法的基础上，观察了不同浓度(12.5～200μg/ml)的cqds溶液对细胞存活率的影响。如图10所示，培养60小时后，即使在最高浓度cqds(200μg/ml)的作用下，细胞存活率仍高于90％。经检验证明，cqds组与对照组之间无显著性差异。这足以表明即使是本研究制备的cqds也具有低毒性和良好的生物相容性。
82.实施例9
83.基于杨树花的绿色碳量子点荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
84.1)将干燥的杨树花粉末0.50g，溶解在25ml超纯水中(ultra-pure water)，涡旋7min，得到混合液。
85.2)将步骤1)中所得混合液置于100ml衬有聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，在160℃条件下持续加热反应12h。
86.3)将步骤2)中加热反应后得到产物自然冷却至室温得到溶液，将所得溶液用0.22μm滤膜过滤，将过滤后的溶液在-80℃下真空冷冻干燥48h，得到cqds固体，放在0-6℃条件下低温保存。
87.4)取适量cqds固体分散在超纯水中配制浓度为0.1mg/ml cqds溶液，得到cqds荧光探针，保存在0-6℃低温条件下用于后续进一步表征和应用。
88.实施例10
89.基于杨树花的绿色碳量子点荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
90.1)将干燥的杨树花粉末0.60g，溶解在30ml超纯水中(ultra-pure water)，涡旋10min，得到混合液。
91.2)将步骤1)中所得混合液置于100ml衬有聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，在200℃条件下持续加热反应8h。
92.3)将步骤2)中加热反应后得到产物自然冷却至室温得到溶液，将所得溶液用0.22μm滤膜过滤，将过滤后的溶液在-80℃下真空冷冻干燥24h，得到cqds固体，放在0-6℃条件下低温保存。
93.4)取适量cqds固体分散在超纯水中配制浓度为0.1mg/ml cqds溶液，得到cqds荧光探针，保存在0-6℃低温条件下用于后续进一步表征和应用。