一种费氏链霉菌来源的环氧水解酶、基因、载体、工程菌、制备方法及应用

1.本发明涉及基因工程和蛋白质表达技术领域，尤其涉及一种费氏链霉菌来源的环氧水解酶、基因、载体、工程菌、制备方法及应用。


背景技术：

2.光学纯的环氧化物和邻二醇对映体是有机合成中具有商业高附加值的手性构件，是制备多种重要生物活性化合物的关键中间体，如扁桃酸、氟西汀、氨基醇、γ-内酯类等。医药、农药及精细化工等相关领域的快速发展使得手性环氧化物和邻二醇市场需求量逐年攀升，如何高效而又绿色的制备这两类手性化合物已成为当前的研究热点。其中，苯基缩水甘油醚(phenyl glycidyl ether,pge)是合成β阻滞剂、β分泌酶裂解酶抑制剂以及一些神经元保护分子的重要手性砌块。同化学合成法(如sharpless和jacobsen不对称环氧化等)相比，利用辅因子非依赖性的环氧水解酶在温和的条件下催化制备pge的r与s两种对映体是最具发展潜力的方法之一。
3.环氧水解酶(epoxide hydrolases,ec 3.3.2.-)能催化环氧化物水解开环生成对应分子结构的邻二醇，属于醚水解酶类。根据环氧水解酶的催化特性以及环氧化物的结构特征，其介导的水解方式主要有三种：(1)水解动力学拆分，即对映选择性环氧水解酶特异性催化外消旋(racemic,rac-)环氧化物中某一对映体优先水解为相应邻二醇，保留单一构型环氧化物。(2)对映归一性水解，当单一或两种催化剂分别优先作用于外消旋环氧化物的两个对映体的c
α
和c
β
时，可获得高对映体纯度和高产率邻二醇。(3)去对称性水解，即环氧水解酶专一性催化内消旋环氧化物的某一碳原子不对称水解为相应(s,s)-邻二醇或者(r,r)-邻二醇。
4.目前获取(r)-pge的方法主要是化学合成法，但化学合成法需要昂贵的配体，提高了成本。为解决这一问题，许多研究者通过环氧水解酶催化生成(r)-pge，如priya saini等(world journal of microbiology and biotechnology,2017,33(5):82)以及kai wu等(applied microbiology&biotechnology,2015,99(22):9511-9521)，他们获得(r)-pge的得率分别为34％和44.3％，但是，此(r)-pge的得率仍有待提升。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提出一种费氏链霉菌来源的环氧水解酶、基因、载体、工程菌、制备方法及应用，以解决现有酶的催化活性和对映选择性较低，(r)-pge得率有待提升的问题。
6.基于上述目的，本发明提供了一种费氏链霉菌来源的环氧水解酶，所述环氧水解酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
7.所述氨基酸序列是经替换、添加或遗失一个或若干氨基酸残基得到的，且编码具有环氧水解酶活性的由所述氨基酸序列衍生的蛋白质。本技术的环氧水解酶具备：同所限
定的氨基酸序列拥有≥98％同源性且具有环氧水解酶活性的蛋白质。
8.本发明还提供一种编码所述费氏链霉菌来源的环氧水解酶的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明还提供一种含所述基因的表达载体和工程菌。
10.所述工程菌是以真菌或细菌为宿主构建表达得到的。
11.本发明还提供所述费氏链霉菌来源的环氧水解酶的工程菌的制备方法，包括如下步骤：
12.步骤一、依据e.coli bl21de3系列菌株的密码子偏好性进行密码子优化以得到如seq id no.2所示sfeh1基因的核苷酸序列；
13.步骤二、以步骤一得到的sfeh1基因的核苷酸序列为模板进行pcr扩增，将扩增产物连接表达载体pcold ii得到重组表达质粒pcold ii-sfeh1；
14.步骤三、将重组表达质粒pcold ii-sfeh1导入e.coli bl21de3中，得到待表达的工程菌e.coli/sfeh1。
15.本发明还提供所述环氧水解酶、编码所述费氏链霉菌来源的环氧水解酶的基因、含所述基因的表达载体、含所述基因的工程菌在手性生物催化中的应用。
16.优选的，所述应用是以所述环氧水解酶和/或表达所述环氧水解酶的工程菌为催化剂，以rac-pge为底物，在20～35℃下，进行不对称催化反应。
17.进一步优选的，rac-pge在400mmol/l的浓度条件下，以每mmol/l对应0.2-0.3u的比例添加所述催化剂，在27℃，220rpm下振荡反应4h。
18.本发明的有益效果：本发明提供了一种streptomyces fradiae来源的新型环氧水解酶，命名为sfeh1，其相应的基因命名为sfeh1。sfeh1底物谱广泛，尤其对含有苯基的缩水甘油醚类化合物具有较高的水解活性和对映选择性，以rac-pge为底物时，经冷冻干燥的菌体全细胞催化活力为0.32u/mg，以较低的细胞浓度便可以在4h以内基本完成较高浓度(400mmol/l)rac-pge的动力学拆分反应，保留(r)-pge，其对映体过量率(enantiomeric excess,ee)接近100％，产率为45.9％。因此，sfeh1与其重组工程菌e.coli/sfeh1具备较大的应用潜力及社会经济价值。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为本发明表达重组sfeh1工程菌e.coli/sfeh1的菌液pcr鉴定核酸电泳图；其中，泳道m：dna marker(250bp)；泳道1～4：e.coli/sfeh1；
21.图2为本发明环氧水解酶sfeh1重组质粒pcold ii-sfeh1模式简图；
22.图3为本发明表达重组sfeh1工程菌e.coli/sfeh1的sds-page图；其中，泳道m：蛋白指示条带marker；泳道1和2分别代表e.coli/pcold ii的上清和沉淀；泳道3和4分别代表e.coli/sfeh1的上清和沉淀；
23.图4为本发明利用表达重组sfeh1工程菌e.coli/sfeh1水解拆分rac-pge的进程
图。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
25.需要说明的是，除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
26.实施例1
27.sfeh1基因的密码子优化及其表达质粒的构建
28.通过基因分析软件分析得sfeh1原始基因(如seq id no.1所示)的gc含量为75％，而过高的gc含量影响了后续基因操作的效率。利用jcat(http://www.jcat.de/)在线网站依据e.coli bl21(de3)系列菌株的密码子偏好性进行密码子优化，优化后的序列如seq id no.2所示。将优化后的序列进行人工合成，根据优化后的序列设计一对sfeh1的pcr反应的特异性引物，上下游引物(sfeh1-f和sfeh1-r)序列信息分别如seq id no.4和seq id no.5所示，并分别包含nde i和sal i的酶切位点。
29.以人工合成的、经过密码子优化后的sfeh1核苷酸为模板进行pcr扩增，条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行分析，切胶回收目的条带，胶回收操作按照上海生工的dlaspin柱式dna胶回收试剂盒的说明书进行。将胶回收产物与pmd 18-t于17℃过夜连接，连接体系为：pmd 18-t(1.0μl)、切胶回收产物(1.0μl)、灭菌水(3.0μl)、dna ligation kit(5.0μl)。将连接产物转化入e.coli jm109中，在含有氨苄青霉素(amp)抗性平板筛选之后，挑取阳性转化子于2ml amp抗性lb(amp/lb)液体培养基中培养4h后进行菌液pcr鉴定，将鉴定结果正确的菌株样本送至金唯智生物公司进行测序，保存测序结果正确的菌株并将重组克隆质粒命名为pmd 18-t-sfeh1。提取重组克隆质粒，用nde i与sal i分别处理pmd 18-t-sfeh1和表达载体pcold ii，双酶切体系为：10
×
h buffer(2μl)、pcold ii或pmd 18-t-sfeh1(10μl)、超纯水(6μl)、nde i(1μl)、sal i(1μl)。37℃水浴4h后进行琼脂糖凝胶电泳分析，分别胶回收酶切处理后的sfeh1与pcold ii，构建连接体系并置于17℃过夜连接。连接体系为：双酶切后的基因片段(3.0μl)、双酶切后的pcold ii(5.0μl)、t
4 dna ligase(1.0μl)、10
×
t
4 dna ligase buffer(1.0μl)。将重组表达质粒导入e.coli bl21(de3)中，37℃于amp抗性平板中培养4h，挑取若干菌落接种于2ml amp/lb液体培养基中培养4h后进行菌液pcr验证(图1)，将菌液pcr验证结果正确的菌落送至金唯智生物公司测序，将测序结果正确的重组表达质粒命名为pcold ii-sfeh1(图2)，其对应的工程菌命名为e.coli/sfeh1。用同样的方法将不含有目的基因的空载质粒pcold ii转化到e.coli中，获得空载工程菌e.coli/pcold ii，用于之后实验的空白对照。
30.sfeh1重组蛋白在e.coli bl21(de3)中的诱导表达
31.挑取e.coli/sfeh1单菌落接种于2ml的amp/lb液体培养基中，37℃、220rpm培养过
夜。将2ml培养液(接种量为2％v/v)转接于100ml相同的培养基中，37℃、220rpm培养3～4h，添加iptg(终浓度0.4mmol/l)，15℃、220rpm诱导24h。离心收集菌体(8000rpm,5min)，使用去离子水洗涤2次，冷冻干燥得到全细胞冻干粉。同样方法诱导e.coli/pcold ii作为空白对照。使用去离子水重悬菌体冻干粉，配制5mg/ml菌体悬浮液，并用超声波破碎仪对e.coli/sfeh1和e.coli/pcold ii进行破碎，将破碎后的菌液于10000rpm离心5min，上清和沉淀分装入两个不同的离心管中，沉淀干燥后加入相同体积的去离子水复悬，然后制样进行sds-page，结果如图3所示。
32.重组工程菌e.coli/sfeh1的酶活力测定
33.于2ml离心管中加入850μl k2hpo
4-kh2po4磷酸缓冲液(50mmol/l ph7.5)和50μl全细胞悬浮液(15mg/ml)，于27℃预热2min后加入100μl由甲醇配制的200mmol/l rac-pge溶液震荡混匀，从而使得rac-pge的终浓度为20mmol/l。维持27℃，220rpm反应10min。吸取200μl反应液加入1ml乙酸乙酯(hplc级)萃取，上清有机相经无水mgso4干燥，过0.22μm有机滤膜后进行hplc检测。检测条件为：od-h色谱柱，正己烷:异丙醇＝80:20(v/v)，柱温30℃，流速0.8ml/min，检测波长为220nm，各主要物质的保留时间如表1所示，采用外标法测定样品中各物质的含量。以在相同培养条件下获得的e.coli/pcold ii和e.coli/sfeh1菌悬液作为实验的对照组。
34.酶活力定义为：在上述测定条件下，将每min消耗1μmol pge所需的酶量定义为1个酶活力单位(u)。经测定重组菌e.coli/sfeh1的环氧水解酶活力为0.32u/mg，而对照组无酶活。
35.表1底物苯基缩水甘油醚与产物苯氧基丙二醇
[0036][0037]
sfeh1或e.coli/sfeh1的应用
[0038]
根据酶活力配制酶催化体系：加入18.9ml 15mg/ml的e.coli/sfeh1菌悬液、1.1ml rac-pge油状母液(终浓度为400mmol/l)。体系置于27℃、220rpm的条件下开始反应，期间定时取样，利用上实施例中所述hplc法定量分析底物与产物的含量、水解率c以及(r)-pge的ee值和产率。结果如图4所示，当反应进行至约4h时(s)-pge几乎全部水解，此时可以获得ee≥99％的(r)-pge，其产率可达45.9％(手性拆分的理论产率为50％)。
[0039]
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
[0040]
本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。