检测猴痘病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途与流程

1.本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及检测猴痘病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途。


背景技术：

2.猴痘(monkeypox)亦称猴天花，并已被定为人畜共患病。以猴痘病毒为病原，发源于中、西非的热带雨林地区。猴痘病毒是一种基因组长达200kb左右的dna病毒，属于痘病毒科正痘病毒属，外形为回角砖形或卵圆形，大小为200-400nm，外被脂蛋白膜或封套，中间具有两个含蛋白质的侧体，有1个厚膜核心，核心内含很大的双链dna基因组。猴痘病毒的基因组为双链dna，长约197kb，基因组末端包含一个相同但方向相反的末端反向重复序列。该病毒包含190个开放阅读框，其中4个位于末端反向重复序列中；同一属的病毒还包括天花病毒、牛痘病毒等。猴痘是一种罕见的病毒性人畜共患病（从动物传播给人的病毒），病人症状与过去在天花病人身上所观察到的相似，但临床严重程度较轻。随着在1980年消灭了天花和随后停止接种天花疫苗，猴痘成为最严重的正痘病毒。
3.猴痘病毒（mpv）主要有两个分支：西非分支（west african clade）和刚果金（中非）分支（congo basin clade）。西非分支的致死率较低，死亡率达3.6%；相比之下，刚果金分支感染会出现大约两周的无症状潜伏期，死亡风险高达10.6%。可见，两种支系的致死性有明显差异。由于西非分支和刚果金分支这两种进化支病毒引起疾病的流行病学和临床特征均不相同，加强不同进化支病毒遗传学差异的特征研究，对西非支系和刚果金支系进行精准分型，对疾病的防控是十分必要的。
4.而猴痘只能由实验室确诊。国际上尚无一种通用的、安全快速的对天花和猴痘病毒感染的血清学诊断方法，而生物学鉴别诊断（病毒分离培养、电镜观察等）通常需3-6天，且存在生物安全危害隐患。由于血清学诊断与临床诊断的灵敏度不高，不易鉴别诊断天花、猴痘及其他出皮疹的疾病，所以采用分子诊断（pcr或荧光定量pcr）技术来进行病毒感染的快速特异诊断方法快速发展。而现有的分子诊断大多存在灵敏度不高等缺陷。
5.因此，本领域需求一种灵敏度高的快速诊断猴痘病毒并对西非支系和刚果金支系进行分型的产品，以便应对突发的猴痘疫情。


技术实现要素：

6.有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测猴痘病毒的组合物，所述组合物包括：猴痘病毒通用上游引物（mpv-f）：5'-agagattggtcttttcgtat-'3（seq id no:1）；猴痘病毒通用下游引物（mpv-r）：5'-atttagctgcattatttttag-'3（seq id no:2）；以及猴痘病毒通用探针（mpv-p）：5'-tccgtcaatgtctacacaggcataaaa-'3（seq id no:3）。
7.使用本发明的组合物，能够以200拷贝/ml的灵敏度对猴痘病毒进行快速检测。同
时，成本低、时间少，能够应对突发的猴痘疫情。
8.在一些具体的实施方案中，本发明组合物进一步包括：猴痘病毒西非分支上游引物（mpvwa-f）：5'-ctcacaccgtctcttccacaga-'3（seq id no:4）；猴痘病毒西非分支下游引物（mpvwa-r）：5'-tggatacaggttaatttccacatcg-'3（seq id no:5）；以及猴痘病毒西非分支探针（mpvwa-p）：5'-aacccgtcgtaaccagcaatacatttaac-'3（seq id no:6）。
9.在一些具体的实施方案中，本发明组合物进一步包括：猴痘病毒刚果金分支上游引物（mpvcb-f）：5'-tgtctacctggatacagaaagc-'3（seq id no:7）；猴痘病毒刚果金分支下游引物（mpvcb-r）：5'-ggcatctccgtttaatacattg-'3（seq id no:8）；以及猴痘病毒刚果金分支探针（mpvcb-p）：5'-cccatatatgctaaatgtaccggtaccgg-'3（seq id no:9）。
10.在一些具体的实施方案中，本发明组合物进一步包括：猴痘病毒西非分支上游引物：5'-ctcacaccgtctcttccacaga-'3（seq id no:4）；猴痘病毒西非分支下游引物：5'-tggatacaggttaatttccacatcg-'3（seq id no:5）；和猴痘病毒西非分支探针：5'-aacccgtcgtaaccagcaatacatttaac-'3（seq id no:6）；以及猴痘病毒刚果金分支上游引物：5'-tgtctacctggatacagaaagc-'3（seq id no:7）；猴痘病毒刚果金分支下游引物：5'-ggcatctccgtttaatacattg-'3（seq id no:8）；和猴痘病毒刚果金分支探针：5'-cccatatatgctaaatgtaccggtaccgg-'3（seq id no:9）。
11.使用本发明的组合物，能够在一管内以200拷贝/ml的灵敏度快速诊断猴痘病毒并对西非支系和刚果金支系进行分型，在反应体系中同时实现猴痘病毒的检测和分型。使得不同毒株能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更效率。本发明的组合物，成本低，通量高。并且操作简便，结果读取过程通过不同通道即可以判定。检测全过程均在封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。
12.在一些具体的实施方案中，本发明组合物进一步包括检测内标的引物和探针。
13.在一个具体的实施方案中，内标引物和探针如所示。
14.上游引物：5'-caagatcatcagcaatgcct-'3（seq id no:10）；下游引物：5'-agtccttccacgataccaaa-'3（seq id no:11）；以及探针：5'-caccaccaactgcttagcacccct-'3（seq id no:12）进一步地，各个探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
15.在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用fam、hex、
rox和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
16.在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。
17.在本发明中，荧光报告基团可以选自fam、hex、rox、vic、cy5、5-tamra、tet、cy3和joe，但不限于此。
18.在一些具体的实施方案中，本发明如seq id no:3所示的探针的荧光基团是fam；如seq id no:6所示的探索的荧光基团是rox；如seq id no:9的探针的荧光基团是cy5；如seq id no:12所示的探索的荧光基团是hex。
19.进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1、bhq2，或mgb。
20.在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为bhq1。
21.在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为mgb。
22.进一步地，所述组合物中引物的用量为0.05μm~0.15μm；所述组合物中探针的用量为0.05μm~0.15μm。
23.在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于单独包装中。
24.在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
25.第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测猴痘病毒并分型的试剂盒中的用途。
26.第三方面，本发明提供了一种检测猴痘病毒并分型的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
27.进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
28.进一步地，所述试剂盒还包括dntp、pcr缓冲液以及mg
2
中的至少一种。
29.更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、尿嘧啶糖基化酶以及dna聚合酶中的至少一种。
30.更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntp、尿嘧啶糖基化酶、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg
2
中的至少一种。
31.进一步地，所述dna聚合酶的浓度为3u/反应~15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。
32.在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：taq酶、尿嘧啶糖基化酶、mg
2
、mn
2
、dntp、引物、探针和pcr缓冲液。
33.常见的pcr缓冲液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton x-100等缓冲体系构成。一般单个pcr反应管中总体积为20
µ
l~100
µ
l。
34.在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字pcr扩增体系，即可以直接用于数字pcr仪上进行扩增。
35.第四方面，提供了一种用于检测猴痘病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：1）提取或释放待测样本的核酸；2）使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量pcr分析；3）获得并分析结果。
36.在一些具体的实施方案中，所述样本是全血、囊泡、脓疱。
37.在又一具体的实施方案中，本发明提供了一种用于以非诊断目的检测猴痘病毒并
分型的方法，所述方法包括以下步骤：1）提取或释放待测样本的核酸；2）使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量pcr分析；3）获得并分析结果。
38.在一些具体的实施方案中，所述样本是全血、囊泡、脓疱。
39.在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染猴痘病毒的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有猴痘病毒并分型。
附图说明
40.图1为本发明组合物检测通用猴痘病毒的检测结果；图2为本发明组合物检测各种病毒分支的检测结果；图3~5为本发明对比例组合物检测各种病毒分支的检测结果。
具体实施方式
41.下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
42.实施例1、本发明所使用的引物及探针表1其中，mpv-p的荧光基团是fam；mpvwa的荧光基团是rox；mpvcb的荧光基团是cy5；内标的荧光基团是hex。
43.实施例2、检测猴痘病毒并分型的方法使用圣湘生物科技股份有限公司的样本释放试剂（货号：s1011e）或核酸提取或纯化试剂（货号：s50016e）按说明书提取猴痘病毒dna。
44.扩增程序如下：结果分析：1）目的检测信号为fam，cy5/rox及rox，内参检测信号为hex；2）baseline的设置：baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点（start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点（end）比最早出现指数扩增的样本ct减少1-2个循环。threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。
45.实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对猴痘病毒基因质粒样本进行验证，结果显示能准确检测，说明本发明组合物能准确的将猴痘病毒鉴别诊断，检测如图1所示。同时分型结果如图2所示，说明本发明组合物同时也能够准确对西非和中非分支猴痘病毒进行分型。
46.实施例4、本发明组合物的灵敏度将上述质粒分别使用全血、囊泡、脓疱阴性样本梯度稀释至1.00e 04 copies /ml、1.00e 03 copies /ml、4.00e 02 copies/ml、2.00e 02 copies /ml、1.00e 02 copies /ml作为待测样本，每个梯度重复测试20次，使用三批试剂分别进行检测，以95%检出水平作为本试剂盒最低检测限，结果如表2~4所示：表2、三批试剂检测限确定检测结果表-全血样本
表3、三批试剂检测限确定检测结果表-囊泡样本
表4、三批试剂检测限确定检测结果表-脓疱样本
结论：根据上述结果，浓度为2.00e 02 copies/ml的样本，经三批试剂各进行20次检测，阳性检出率均在95%以上。因此，最终确定发明组合物的最低检测限为2.00e 02 copies /ml。
47.实施例5、本发明组合物的特异性交叉反应以核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状的病原体样本作为待测样本，样本信息如下所示：竞争性干扰分别使用上述交叉反应的样本将已定值的atcc猴痘dna定量参考品稀
释至2.00e 02 copies /ml作为待测样本进行检测。
48.交叉反应及竞争性干扰研究结果用三批试剂在slan-96p仪器上检测，通过检测阴阳性符合率，考查试剂盒的特异性。试验结果如下表5所示：表5、三批试剂检测交叉反应结果统计表6、三批试剂竞争性干扰检测结果统计结论：使用三批试剂检测，交叉反应样本检测结果均为阴性，表明本试剂盒具有很好的特异性。同时，经验证上表中高浓度病原体也不会对检出限浓度水平的猴痘病毒核酸
检测产生影响。
49.实施例6、本发明组合物的抗干扰性7为考察样本中可能存在的内源/外源性物质对检测结果的影响，将已定值的atcc猴痘dna定量参考品稀释至最低检测限，分成若干份，每份中分别加入下表中所列的可能存在抑制物/干扰物质，通过用样本稀释干扰物的方法调节干扰物质终浓度如表8所示，以仅添加阴性稀释基质（不含干扰物）的待测样品为参照。
50.表7、加入的干扰物质及浓度用三批试剂在slan-96p仪器上检测，每个样本重复检测3次，通过与对照样本的比较，考查试剂盒的抗干扰能力。试验结果如下所示：表8、干扰试验验证检测结果表
结论：由上述结果可以看出，含各种上述干扰物质的样本经三批试剂重复3次检测均为阳性，且ct值与对照无明显区别，因此可以说明在本试剂盒的实验条件下，样本中可能存在的上述干扰物质对试剂盒的检测结果无明显干扰。
51.对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针由于碱基互补配对原则，引物和（或）探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性（保守性对检测的准确性至关重要），又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
52.因此，发明人还设计了其余一些引物和探针（序列未示出）组成了不同的检测体系1、2和3，同样用于检测猴痘病毒并分型。具体检测结果如图3~5，从图中可以看出检测只出现部分扩增曲线，且扩增曲线增幅低重复性差，而其他靶标甚至无扩增曲线，因此，整体检
测效果差。