一种甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的方法及应用
技术领域：
：1.本发明属于植物基因编辑和植物育种
技术领域：
：，具体涉及一种甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的方法及应用。
背景技术：
：：2.油菜(brassicanapusl.)是我国种植最广泛的油料作物之一，它不仅可以用来生产食用油，也可用来观赏，是我国重要的经济作物之一。生物育种和种子工程发展迅速，目前，我国的育种手段和技术更加注重生物育种，并即将对农业生物种质资源挖掘与创新利用设立重点专项，增强创新能力，提高自主研发水平。3.在现代社会，随着人们生活水平的提高，加之油菜花颜色鲜艳、花色多、分布广泛、管理简单、投入较低，很自然的就成为了极具观赏价值的农田景观作物，油菜旅游业逐渐愈发火热。最为出名的江苏兴化的垛田油菜花景区和青海门源的油菜花海景区，仅一天的门票收入就有近百万，综合旅游收入数十亿(数据来源江苏省人民政府、门源县人民政府)。4.基因编辑(geneediting)，是一种新兴、精确的能对生物体基因组特定基因进行修饰的基因工程技术。近年来，有研究利用基因编辑技术将大豆中lnk2基因的敲除影响了大豆的开花时间，还有研究利用crispr/cas9系统获得水稻突变体，发现丙酮酸酶和细胞周期蛋白的表达之间的关系，提高了籽粒产量；研究还发现通过多重grna和单grna敲除油菜中异源四倍体的多个溶血磷脂酸酰基转移酶lpat(lysophosphatidicacidacyltransferase)基因会引起脂肪酸含量变化。目前，crispr/cas9系统定点突变技术已经逐步成熟，可以极大缩短新种质的获得周期。5.目前，油菜在自然环境下生长开花时，油菜的各个部位可能会被传播核盘菌子囊孢子。在油菜的各个部位中，凋落的花瓣带菌率最高，且菌丝会随着花瓣的脱落飘落到茎和叶片上，对油菜进行再次侵染，进而造成大面积菌核病发病。除此之外，油菜还存在着角果易开裂，机械化收割造成菜籽损耗大、收割效率不高、适宜观赏花期短等问题。技术实现要素：6.针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的方法及应用。在本发明中，利用cirspr/cas9系统对甘蓝型油菜的bnhbbd基因定点突变来育种，获得了一种具有长开花期、抗菌核病和角果不易开裂的转基因植株。其中，基因bnhbbd名中，bn表示油菜英文简写，h、b、b、d分别为花(hua)、瓣(ban)、不(bu)、掉(diao)的汉语拼音首字母。7.本发明中，首先提供了一种用于甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的crispr/cas9系统序列元件组，其特征在于，所述序列元件组包括u6-26p-target1-grna、u6-26p-target2-grna和根据密码子优化后的cas9基因；所述u6-26p-target1-grna包括启动子u6-26p，grna骨架结构和target1；所述u6-26p-target2-grna包括启动子u6-26p，grna骨架结构，target2；8.其中，所述甘蓝型油菜bnhbbd基因包括bnhbbd-c06和bnhbbd-a07，所述target1为基因bnhbbd-c06的靶点序列，所述-target2为基因bnhbbd-a07的靶点序列。9.其中，所述target1的核苷酸序列为：5’‑tacgatggttctgctctgtc-3’(seq.id.no.1)；10.target2的核苷酸序列为：5’‑tgcaagaattggagccaccg-3’(seq.id.no.2)；11.sgrna的核苷酸序列为：12.gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt(seq.id.no.3)。13.进一步的，所述bnhbbd-c06的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，氨基酸序列如seq.id.no.6所示；14.bnhbbd-a07的核苷酸序列如seq.id.no.5所示，氨基酸序列如seq.id.no.7所示。15.本发明中还提供了一种基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr，所述基因编辑载体包含上述用于甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的crispr/cas9系统序列元件组。16.本发明中还提供了用于甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的基因工程菌，所述基因工程菌采用上述基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr转化宿主细菌得到。17.本发明中还提供了一种用于甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的试剂盒，所述试剂盒上述基因编辑载体或基因工程菌。18.本发明中还提供了上述序列元件组、基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr、基因工程菌或试剂盒的应用，所述应用包括：19.a)在甘蓝型油菜基因bnhbbd-c06和/或基因bnhbbd-a07定点突变中的应用，所述bnhbbd-c06基因的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，氨基酸序列如seq.id.no.6所示，所述bnhbbd-a07基因的核苷酸序列如seq.id.no.5所示，氨基酸序列如seq.id.no.7所示；20.b)在具有长开花期的甘蓝型油菜育种中的应用；和/或21.c)在具有抗菌核病的甘蓝型油菜育种中的应用；和/或22.d)在具有角果不易开裂的甘蓝型油菜育种中的应用。23.本发明中还提供了一种利用cirspr/cas9系统对甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的方法，包括：24.(1)针对甘蓝型油菜中的bnhbbd基因设计筛选靶点target1和target2，并设计sgrna序列，将2个靶点target1和target2分别与sgrna序列连接，构建出双靶点基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr；25.(2)将基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr转化农杆菌gv3101，得到含有基因编辑表达载体pkse401-bnhbbd-crispr的农杆菌；26.(3)扩大培养，利用得到的农杆菌菌液介导油菜下胚轴转化；27.(4)油菜下胚轴培养、诱导愈伤组织、再分化、生根培养、炼苗、移栽，得到转基因油菜；28.(5)鉴定获得bnhbbd基因发生突变的转基因植株。29.其中，所述甘蓝型油菜bnhbbd基因包括bnhbbd-c06和bnhbbd-a07，所述target1为基因bnhbbd-c06的靶点序列，所述-target2为基因bnhbbd-a07的靶点序列，30.所述target1的核苷酸序列如seq.id.no.1所示，31.所述target2的核苷酸序列如seq.id.no.2所示，32.所述sgrna的核苷酸序列如seq.id.no.3所示，33.所述bnhbbd-c06的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，氨基酸序列如seq.id.no.6所示，34.所述bnhbbd-a07的核苷酸序列如seq.id.no.5所示，氨基酸序列如seq.id.no.7所示。35.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：36.花序脱落缺失(inflorescencedeficientinabscission，ida)可以通过与膜上的共受体hae和hsl2蛋白进行结合，通过磷酸化和信号级联放大反应，将脱落信号传递给胞内下游调控因子，使得脱落区(abscissionzone，az)细胞扩大，最终导致花器官脱离，而突变体脱离区细胞不再扩张，花瓣不再脱落，使角果果皮和假隔膜之间的离层受到一定影响，进而使角果不易开裂，油菜粒不易脱落，减少机械化收货过程中的损失，提高油菜的生产效率。本发明中，在油菜的5个同源基因中，确定了表达量最高，且与拟南芥最为相近的2个在甘蓝型油菜中控制花器官脱落的有效基因bnhbbd-a07和bnhbbd-c06，利用cirspr/cas9系统对上述基因进行定点突变，获得了花瓣不脱落的油菜种质。由于只有在花瓣上，核盘菌的子囊孢子才能萌发形成菌丝，而直接落在油菜叶片上不能萌发形成菌丝，因此花瓣不脱落阻断了菌核菌进一步浸染下部叶片，可以达到抗菌核病的目的。37.本发明成功利用基因编辑技术在甘蓝型油菜中进行编辑，极大的缩短了新种质的获得周期，为油菜育种提供新思路。本发明构建的基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr转化油菜后获得的转化株，为研究基因bnhbbd的功能及作用机制提供了实验材料，也可作为新的长开花期、抗菌核病和不落粒种质资源，为油菜育种提供新的基因源，有助于推动农业科学进步。附图说明38.图1为bnhbbd-a07和bnhbbd-c06核苷酸及氨基酸序列差异比对图。39.图2为所选取的target1和target2靶点在基因上的位置示意图(a)与pkse401-bnhbbd-crispr质粒中lb和rb范围内简略示意图(b)，图中，lb：左边界；rb：右边界；kan：卡那霉素抗性基因；p-camv35s：camv35启动子；u6-26p-target1-grna：grna表达元件组，包括启动子u6-26p、grna骨架结构和靶点1(target1)；u6-26p-target2-grna：grna表达元件组，包括启动子u6-26p、grna骨架结构和靶点2(target2)；cas9：根据密码子优化后的cas9基因。40.图3为经过转化得到2株阳性株中提取叶片基因组的pcr鉴定胶图；图中，wt：野生型；hbbd-1、hbbd-2：突变体转基因植株； ：正对照，pkse401-bnhbbd-crispr质粒；-：负对照，ddh2o；marker：takaradl2000dnamarker。41.图4为与野生型相比hbbd突变体中bnhbbd-a07基因(a)和bnhbbd-c06基因(b)的测序结果分析示意图。42.图5为hbbd突变体靶点1处t插入导致的移码突变简析示意图；图中(a)为与野生型相比突变体中bnhbbd-a07基因发生的改变；(b)为与野生型相比突变体中bnhbbd-c06基因发生的改变。43.图6为野生型(a)与hbbd突变体花器官不脱落表型(b)的花期对比图。44.图7为hbbd突变体3个不同株系的花器官不脱落表型(hbbd)与野生型(wt)的角果成熟期对比图。45.图8为突变体(hbbd)与野生型(wt)的花序时期对比图，图中数字代表油菜花序的位置编号，花苞开放的第一朵花编号为1，第二朵花编号为2，依次类推。46.图9为在自然情况下，核盘菌侵染hbbd突变体与野生型发病途径对比示意图。47.图10为在培养箱环境下，核盘菌侵染hbbd突变体与野生型wt发病情况对比示意图；其中图中(a)与(c)的小箭头处为核盘菌接种位置，(b)为长箭头代表野生型花瓣脱落至叶片上，(d)为长箭头与叉号代表突变体花瓣不脱落至叶片上，0dpi和4dpi代表接种核盘菌0天和4天。48.图11为接种核盘菌后发病数量统计图，经过t检验，p《0.001，差异显著，使用三个*表示。49.图12为突变体(hbbd)与野生型(wt)角果开裂力测定图，经过t检验，p《0.05，差异显著，使用一个*表示。具体实施方式50.下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。51.在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法均是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时表明，其后所用相同试剂无特殊说明，均以首次表明的内容相同；所涉及到的是试剂、材料等如无特殊说明，均为商业途径获得。52.本发明中所采用的培养基及其配方如下所示：53.lb液体培养基：称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g溶于80ml双蒸水中，定容1l，然后分装至10个锥形瓶用封口膜封口，121℃高温高压灭菌15min，冷却后放入4℃冰箱保存。54.lb固体培养基：称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g溶于800ml双蒸水中，然后定容1l，然后分装至10个锥形瓶用封口膜封口，121℃高温高压灭菌15min，冷却后放入4℃冰箱保存。使用时放入微波炉中加热至融化，待液体冷却到50℃左右加入抗生素，摇匀后立刻倒至无菌平皿中，每皿约10ml。55.m0培养基：ms粉4.4g/l，蔗糖30g/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，凝固剂agar10g/l，灭菌后分装。56.dm培养基：ms粉4.4g/l，蔗糖30g/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，灭菌，等培养基冷却后加入as，1l中加入1mlas(母液100μmol/ml),放于4℃冰箱待用，也可以在用时在加入as。57.m1培养基：ms粉4.4g/l，蔗糖30g/l，甘露醇18g/l，2,4-d1mg/l，kt0.3mg/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，凝固剂agar10g/l，灭菌后等培养基冷却后加入as，1l中加入1mlas(母液100μmol/ml),放于4℃冰箱待用，也可以在用时在加入as。58.m2培养基：ms粉4.4g/l，蔗糖30g/l，甘露醇18g/l，2,4-d1mg/l，kt0.3mg/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，凝固剂agar10g/l，灭菌后等培养基冷却后加入：特美汀tmt300mg/l，sts150μmol/l，卡那霉素25mg/l，然后分装到无菌平皿中。59.m3培养基：ms粉4.4g/l，葡萄糖10g/l，木糖0.25g/l，mes0.6g/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，凝固剂agar10g/l，灭菌后等培养基冷却后加入：zt2mg/l，iaa0.1mg/l，特美汀tmt300mg/l，agno3150μmol/l，卡那霉素25mg/l，然后分装到无菌平皿中。60.m4培养基：ms粉4.4g/l，蔗糖10g/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，凝固剂agar8g/l，灭菌后等培养基冷却后加入：特美汀tmt300mg/l，然后分装。61.pda固体培养基：称取购买自国药集团的马铃薯葡萄糖琼脂培养基粉末7.4g，加入200ml蒸馏水中，121℃高温高压灭菌15min，冷却后放入4℃冰箱保存，使用时放入微波炉中加热至融化，待液体冷却到50℃左右加入抗生素，摇匀后立刻倒至无菌平皿中，每皿约20ml。62.实施例1：bnhbbd基因的鉴定及获得63.在甘蓝型油菜中，hbbd有5个成员，本发明对其利用转录组数据及生物信息学分析，通过进化树及同源性比对获得2个表达量最高、同源性最高的hbbd基因——bnhbbd-a07和bnhbbd-c06，由于这两个基因相似度较高，仅有几个碱基的差别，难以通过普通pcr的方法区分开，本实施例中通过测序的方法来分辨bnhbbd-a07和bnhbbd-c06。64.根据油菜网站(https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)上的bnhbbd基因的编码序列设计引物，引物序列为：65.hbbd-f(seq.id.no.13):atggctccgtgtcgtacg66.hbbd-r(seq.id.no.14):tcaatgaggatgagagtc；67.然后以油菜品种y127(来源于华中农业大学)的叶片dna为模板，使用高保真酶2*phantamaxmastermix(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)扩增bnhbbd基因的cds序列，pcr反应如表1所示。68.表1.高保真酶pcr扩增反应体系69.pcr反应体系体积ddh2o20μl2*phantamaxmastermix25μl上游引物(10μm)2μl下游引物(10μm)2μl模板dna(50-400ng)1μl70.pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s、52℃退火15s、72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃终延伸5min。pcr反应结束后，将pcr产物在2％琼脂糖凝胶(质量体积分数)中120v下进行凝胶电泳30min，然后在紫外凝胶成像仪下照相，记录结果。结果显示，该引物扩增出的目的片段，即bnhbbd-a07和bnhbbd-c06基因片段的大小为231bp左右。71.参照uniq-10柱式dna胶回收试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中操作说明，从琼脂糖凝胶中回收pcr扩增产物bnhbbd基因，然后将回收的pcr扩增产物bnhbbd基因连接到pmd19-t载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)上，连接体系为：4.5μl胶回收产物、0.5μlpmd-19t载体、5μlsolutionⅰ(购自宝生物工程(大连)有限公司)，在16℃下连接过夜，得到连接产物。72.向30μl大肠杆菌感受态细胞(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)中加入10μl的连接产物，通过热激法将连接产物转入大肠杆菌中，然后利用含终浓度为30mg/ml的amp的lb培养基筛选阳性菌落，并挑取10个单菌落震荡培养12-16h，取2μl菌液作为模板pcr扩增进行鉴定，pcr反应的引物为：73.m13-f(seq.id.no.15)：tgtaaaacgacggccagt74.m13-r(seq.id.no.16)：caggaaacagctatgacc。75.pcr扩增反应体系如表2所示，pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸1min，共进行28个循环；72℃终延伸10min。76.表2.菌液pcr扩增反应体系77.pcr反应体系体积ddh2o6μlrtaq10μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μl菌液2μl78.将pcr扩增的结果在2％的琼脂糖凝胶上进行检测，检测发现得到的dna片段为400bp左右，说明转化成功，选10份转化成功的菌液各吸取100μl送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。分析测序结果可得bnhbbd-a07和bnhbbd-c06序列，其核苷酸序列如seq.id.no.4和seq.id.no.5所示，氨基酸序列如seq.id.no.6和seq.id.no.7所示。79.根据序列表比对发现bnhbbd-c06和bnhbbd-a07的核苷酸序列共相差4个碱基，这4个碱基在bnhbbd-c06和bnhbbd-a07中分别是第59位g→a、第129位t→c、第140位t→a和第159位c→g。上述核苷酸的序列差异导致了2个氨基酸变化，这2个氨基酸在bnhbbd-c06和bnhbbd-a07中分别是第20位n→s和第47位h→l，比对示意图见图1。80.实施例2：基于crispr/cas9系统定向突变甘蓝型油菜基因bnhbbd-a07和bnhbbd-c06编辑载体的构建81.将bnhbbd-a07和bnhbbd-c06基因序列提交到网站http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr，筛选靶点，选取靶位点target1和target2，所述target1序列为：5’‑tacgatggttctgctctgtc-3’(seq.id.no.1)，target2序列为5’‑tgcaagaattggagccaccg-3’(seq.id.no.2)，把上述2个靶点序列分别连接到2个相同的sgrna序列的5’端：[(20bptarget)gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt](seq.id.no.3)，其中，(20bptarget)分别为target1和target2的长度，使得建出的双靶点基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr可对目的序列敲除2次，保证产生有效编辑。[0082]根据筛选的靶点设计crispr/cas9载体靶点引物，引物序列如表3所示，确保设计的2个靶点可以同时敲除bnhbbd-a07和bnhbbd-c06。[0083]表3.crispr/cas9载体靶点引物[0084]引物序列5’‑3’hbbd-dt1-f0(seq.id.no.9)tgtacgatggttctgctctgtcgttttagagctagaaatagchbbd-dt2-r0(seq.id.no.10)aaccggtggctccaattcttgcacaatctcttagtcgactctachbbd-dt1-bs(seq.id.no.11)atatatggtctcgattgtacgatggttctgctctgtcgtthbbd-dt2-bsr(seq.id.no.12)attattggtctcgaaaccggtggctccaattcttgcacaa[0085]随后使用表3中的四种引物对模板入门载体pcbc-dt1t2(来自华中农业大学洪登峰老师)进行pcr扩增，pcr反应体系与表1中相同，pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s、52℃退火15s、72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。其中引物hbbd-dt1-bsf和hbbd-dt2-bsr正常引物浓度10μm；hbbd-dt1-f0和hbbd-dt2-r0稀释20倍，引物浓度应为5μm，纯化回收上述pcr产物，该pcr产物的长度为626bp，然后建立酶切-连接反应体系，具体的反应体系如表4所示，反应条件为37℃保持5h，50℃保持5min，80℃保持10min。[0086]表4.酶切-连接反应体系[0087]成分体积pcr产物(626bp)2μlpkse4012μl10*nebt4buffer1.5μl10*bsa1.5μlbsai(neb)1μlt4ligase(neb)/高浓度1μlddh2o6μl[0088]反应结束取5μl连接产物转化感受态大肠杆菌dh5α，使用含有50mg/mlkan的固体lb平板培养基进行筛选，37℃过夜培养后，挑取阳性克隆在400μl含有50mg/mlkan的液体lb培养基进行震荡培养4-6h，取2μl菌液作为模板pcr扩增进行鉴定，使用pkse401载体上u6启动子中的序列设计鉴定引物，退火温度改为57℃，其他pcr扩增反应体系和条件与表2中菌液pcr扩增反应相同，具体引物序列如下所示：[0089]u626-idf:tgtcccaggattagaatgattaggc(seq.id.no.17)[0090]u629-idr:agccctcttctttcgatccatcaac(seq.id.no.18)；[0091]经过pcr鉴定跑胶后得到的片段大小为726bp，吸取片段大小正确的阳性克隆菌液100μl送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，然后在pkse401载体上u6启动子中的序列设计正向测序引物，引物序列如下：[0092]u626-idf:tgtcccaggattagaatgattaggc(seq.id.no.17)[0093]u629-idf：ttaatccaaactactgcagcctgac(seq.id.no.19)；[0094]将测序结果中含有设计的2个靶点target1和target2的阳性克隆菌液进行扩大培养以提取质粒，从而获得pkse401-bnhbbd-crispr质粒，最后将质粒转入农杆菌gv3101中，扩大培养并保菌以待使用。[0095]图2为所选取的target1和target2靶点在基因上的位置示意图(a)与pkse401-bnhbbd-crispr质粒中lb和rb范围内简略示意图(b)。图中，lb：左边界；rb：右边界；kan：卡那霉素抗性基因；p-camv35s：camv35启动子；u6-26p-target1-grna：包括启动子u6-26p、grna骨架结构和靶点1(target1)；u6-26p-target2-grna：grna表达元件组，包括启动子u6-26p、grna骨架结构和靶点2(target2)；cas9：根据密码子优化后的cas9基因。[0096]实施例3：pkse401-bnhbbd-crispr基因编辑重组载体转化甘蓝型油菜(brassicanapus)[0097]a.播种：[0098]为了快速获得所需的油菜新种质，选取无需春化、可快速生长的甘蓝型油菜y127种子(种子来自华中农业大学洪登峰老师)，放在10ml离心管中，加入体积分数为75％的酒精，上下翻转，浸泡1min，用移液器吸取酒精，加入适量无菌水冲洗3-5遍；再加入15％bleach溶液(配置为8.115ml无菌水 1.875ml次氯酸钠 10μl曲拉通)，将离心管上下翻转，浸泡种子6min，污染较重的种子酒精消毒和灭菌的时间可以适当延长，但时间过长会影响种子发芽。随后吸掉消毒液，加入适量无菌水冲洗3-5遍，每次均上下翻转，保持离心管内为无菌环境。最后吸掉无菌水，用烧好的无菌镊子将灭菌种子播到m0培养基上，每瓶25粒左右，置于暗光24℃下培养6天，即可获得所需长度的油菜下胚轴。[0099]b.菌液准备：[0100]播种5-7天后用液体lb培养实施例2中得到的含有pkse401-bnhbbd-crispr质粒的农杆菌，具体培养方式如下：在5ml抗性lb(加入50mg/lkan 50mg/lgen 50mg/lrif)中加入20μl含有pkse401-bnhbbd-crispr质粒的农杆菌，于28℃、180-220rpm摇床中培养约14-16h。[0101]由于农杆菌在培养液中繁殖速度与其活性有关，而在对数期繁殖状态下的农杆菌活力最好，最易侵染植物，所以要严格计算好接菌时间。选择间隔2h重复接菌，如分别18:00、20:00接菌，次日早8:00挑选合适浓度，能够防止出现细菌浓度过高的情况。摇菌之前要挑选阳性单菌落在抗性平板上接种细菌，28℃下培养48h，等到阳性细菌在平板上繁殖出单菌落后用10μl枪头吸取该单菌落在培养液中反复吹打几次，使得菌均匀生长。[0102]c.侵染及共培养：[0103]准备好共培养培养基m1和dm液，m1培养基经过121℃15min灭菌后快冷却(约50℃)时快冷却时(约50℃)加入乙酰丁香酮as(终浓度100μm)，dm液也加入as(终浓度100μm)，记为dm(as )，备用。[0104]采用分光光度计测步骤b中所述的lb培养基中菌的od值，选取od值为0.4左右时的菌液较好，一般摇菌14-16小时即可。吸取2ml培养好的菌液到无菌离心管中，3000rpm3min离心，弃上清；然后加入2mldm(as )液悬浮，3000rpm3min离心，弃上清；再加入2ml的dm(as )液悬浮，放4℃冰箱备用。[0105]用无菌解剖剪刀剪取步骤a播种后生长出来的油菜下胚轴，切成0.8cm-1.0cm的小段，放在含有18ml的dm液体的培养皿中，等下胚轴全部切成小段后，再倒入2ml上述用dm(as )液重悬后的菌液，这时皿里液体体积为20ml，浸染10-15min(时间不能长，不然外植体易死亡)，隔段时间摇晃1次，4～5次即可。当侵染8min时开始用移液器吸掉dm(as )菌液，用无菌镊子夹取外植体到无菌滤纸上放置片刻，吸走外植体上多余的菌液，然后将外植体再转到m1固体培养基中，外植体暗光下24℃放置或放在光照培养室避光处。[0106]d.选择培养及愈伤诱导：[0107]将在m1培养基中培养36-48h的外植体转入到m2培养基中，光下正常培养，培养条件为24℃条件下，采用白天16h、晚上8h的方式交替培养，2-3周诱导愈伤。[0108]e.再分化：-：负对照，ddh2o；marker：takaradl2000dnamarker。[0130]图中可以证实实施例3中所构建的基因编辑载体成功转入到油菜中，确定通过植物组织培养的过程，获得了鉴定成功的阳性株。[0131]为了进一步确定的阳性株所发生的基因编辑情况，需要将上述鉴定成功的阳性株的基因组，使用高保真酶对bnhbbd-a07和bnhbbd-c06进行pcr扩增、跑胶、胶回收以及连接pmd19-t载体，转化大肠杆菌，挑菌鉴定，送单克隆菌液至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，具体实验操作及方法与实施例1中相同。[0132]对得到的测序结果进行分析，测序结果如图4所示，并将测序结果与实施例1中得到的bnhbbd-a07和bnhbbd-c06野生型真实测序结果进行比对分析，可以发现较多的单克隆在靶点1处表现出t碱基的插入，故此对其进行进一步分析，分析结果见图5。[0133]图5为hbbd突变体靶点1处t插入导致的移码突变简析示意图；图中(a)为与野生型相比突变体中bnhbbd-a07基因发生的改变；(b)为与野生型相比突变体中bnhbbd-c06基因发生的改变。从图中可以看出，hbbd突变体的bnhbbd-a07和bnhbbd-c06基因中均会发生移码突变，导致hbbd基因翻译过程中的提前终止，hbbd蛋白不能正常合成，这可以证实基因编辑载体成功在目的靶点行使功能，成功敲除甘蓝型油菜中bnhbbd-a07和bnhbbd-c06基因。[0134]实施例5：转基因甘蓝型油菜的花器官不脱落表型分析[0135]将实施例4中验证成功的hbbd突变体进行自交，将分离掉载体所携带的外源基因片段的突变体后代，放置于16h光照，8h黑暗，相对湿度70％的培养箱中进行生长，待进入花期后，对野生型(甘蓝型油菜y127，来自华中农业大学洪登峰老师)和突变体进行观察并记录花瓣脱落情况。本实验进行3次生物学重复，花器官附着情况是指不受外力影响的自然脱落情况，具体时间从花蕾开放到完全脱落，结果如表5所示。[0136]表5.花器官附着情况统计表[0137]株系名称调查花器官数量花器官附着状况(天)wt105±0.5hbbd-112∞hbbd-210∞hbbd-311∞[0138]图6为野生型(a)与hbbd突变体花器官不脱落表型(b)的花期对比图，可以明显发现突变体花器官附着在脱离区，并且经过表5统计可以发现，hbbd突变体的花器官在不受外力的作用下，从花蕾期、初开期、盛花期、授粉期、成熟期，均可以持续的存在。图7为hbbd突变体3个不同株系的花器官不脱落表型(hbbd)与野生型(wt)的角果成熟期对比图。从图中可以看出，花器官的颜色从黄色逐步转变为白色，哪怕是角果生长期、角果成熟期，花器官不脱落的表型将会一直持续。图8为hbbd突变体型(hbbd)与野生型(wt)的花序时期对比图，图中数字代表油菜花序的位置编号，花苞开放的第一朵花编号为1，第二朵花编号为2，依次类推。从图中可以看出，按照花序的位置，进行标花，可以更加明显的看出花器官不脱离的表型。[0139]由于自然界中核盘菌的子囊孢子飘落在花瓣上，随着野生型花器官的脱落，飘落在叶或茎处时，核盘菌的菌丝开始生长，形成侵染环境，病情严重时，会在茎中形成菌核，此时油菜的茎会由于核盘菌的侵染变得中空，从而导致整株植物死亡，带来极大的经济损失。图9为在自然情况下，核盘菌侵染hbbd突变体与野生型发病途径对比示意图。从图中可以看出，hbbd突变体的花器官不脱落菌核病发病率低。[0140]本实施例中还在培养箱环境中测试了hbbd突变体花器官不脱落对菌核病的避病表型，具体测试方法为：将由试验田中分离得到的核盘菌菌核接种在pda固体培养皿中，28℃倒置培养6天，等到菌丝生长到培养皿的边缘后，取边缘处0.3cm*0.3cm的菌叠分别接种到3株野生型和3株突变体的花瓣上，每株接种6处花瓣，然后将接种后的植株均放置在人工气候箱(购买自上海一恒科学仪器有限公司)中进行培养，所述培养条件为温度22℃、湿度90％、12h弱光照、12h黑暗培养，每12h观察菌丝生长情况。花瓣上接种核盘菌后发病情况统计如表6所示。[0141]表6.花瓣上接种核盘菌后发病情况统计表[0142]株系名称接种花瓣数量接种后发病数量wt-166wt-265wt-365hbbd-161hbbd-260hbbd-360[0143]表6为花瓣上接种核盘菌后发病情况统计表，从表中可以看出，核盘菌侵染hbbd突变体与野生型wt后，野生型wt的花瓣接种后基本都发病，而hbbd突变体接种后发病率降低。[0144]图10为培养箱环境下核盘菌侵染hbbd突变体与野生型wt发病情况对比示意图，其中图中(a)与(c)的小箭头处为核盘菌接种位置，(b)为长箭头代表野生型花瓣脱落至叶片上，(d)为长箭头与叉号代表突变体花瓣不脱落至叶片上，dpi(dayofpost-inoculation)，0dpi和4dpi代表接种核盘菌0天和4天。从图中可以看出，野生型wt的花瓣会脱落，极大概率会带着已经开始生长的核盘菌脱离并附着在叶片上，核盘菌持续侵染使得植物叶片成腐烂状，造成了极大的病害；而hbbd突变体花器官不脱落，且处于植株的顶层，相对叶片处湿度较低，通风较好，核盘菌不易生长，发病概率显著降低，植物正常生长。[0145]图11为接种核盘菌后发病数量统计图，经过t检验，p《0.001，可以看出突变体hbbd的花瓣发病数量与野生型wt相比，显著降低。[0146]本实施例中还测试了hbbd突变体与野生型角果开裂力，具体测试步骤如下：取野生型和hbbd突变体开花后40天的共10个成熟角果，放置于温度25℃、湿度50％的环境一周，然后用胶水把角果粘在薄板上，使得油菜角果假隔膜所在平面平行于木板平面，角果的尾部与木板边沿对齐，角果柄处于木板之外。使用ta.xtplus物性仪(英国stablemicrosystem公司)把l形钩固定在探头上，在垂直于平板的方向于角果基部钩住固定在平板上角果和果柄的结合处。测定时用手压住平板，以1mm/min的速率匀速向上运动，当接触到角果柄时，转为0.5mm/min的速率匀速向上运动，拉开角果，同时记录野生型和突变体的拉裂力数据。[0147]角果开裂前，受到的力不断增加，角果开裂后，受到的力突然减小，受力峰值即为角果开裂力的最大拉裂力数据，峰值越大，角果抗裂角能力越大。图12为突变体(hbbd)与野生型(wt)角果开裂力测定图，从图中可以看出，野生型角果最大拉裂力数据在0.3-0.5n左右，突变体角果最大拉裂力数据在0.6-0.8n左右，经过t检验，p《0.05，突变体和野生型相比拉裂力显著增加，即角果抗裂角能力增强。[0148]上述实验结果可以说明甘蓝型油菜中hbbd蛋白也是调控花器官脱落的重要蛋白质之一，为延长花期、抗菌核病和机械化收割提供了一定的利用资源。[0149]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明属于植物基因编辑和植物育种
技术领域：
：，具体涉及一种甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的方法及应用。
背景技术：
：：2.油菜(brassicanapusl.)是我国种植最广泛的油料作物之一，它不仅可以用来生产食用油，也可用来观赏，是我国重要的经济作物之一。生物育种和种子工程发展迅速，目前，我国的育种手段和技术更加注重生物育种，并即将对农业生物种质资源挖掘与创新利用设立重点专项，增强创新能力，提高自主研发水平。3.在现代社会，随着人们生活水平的提高，加之油菜花颜色鲜艳、花色多、分布广泛、管理简单、投入较低，很自然的就成为了极具观赏价值的农田景观作物，油菜旅游业逐渐愈发火热。最为出名的江苏兴化的垛田油菜花景区和青海门源的油菜花海景区，仅一天的门票收入就有近百万，综合旅游收入数十亿(数据来源江苏省人民政府、门源县人民政府)。4.基因编辑(geneediting)，是一种新兴、精确的能对生物体基因组特定基因进行修饰的基因工程技术。近年来，有研究利用基因编辑技术将大豆中lnk2基因的敲除影响了大豆的开花时间，还有研究利用crispr/cas9系统获得水稻突变体，发现丙酮酸酶和细胞周期蛋白的表达之间的关系，提高了籽粒产量；研究还发现通过多重grna和单grna敲除油菜中异源四倍体的多个溶血磷脂酸酰基转移酶lpat(lysophosphatidicacidacyltransferase)基因会引起脂肪酸含量变化。目前，crispr/cas9系统定点突变技术已经逐步成熟，可以极大缩短新种质的获得周期。5.目前，油菜在自然环境下生长开花时，油菜的各个部位可能会被传播核盘菌子囊孢子。在油菜的各个部位中，凋落的花瓣带菌率最高，且菌丝会随着花瓣的脱落飘落到茎和叶片上，对油菜进行再次侵染，进而造成大面积菌核病发病。除此之外，油菜还存在着角果易开裂，机械化收割造成菜籽损耗大、收割效率不高、适宜观赏花期短等问题。技术实现要素：6.针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的方法及应用。在本发明中，利用cirspr/cas9系统对甘蓝型油菜的bnhbbd基因定点突变来育种，获得了一种具有长开花期、抗菌核病和角果不易开裂的转基因植株。其中，基因bnhbbd名中，bn表示油菜英文简写，h、b、b、d分别为花(hua)、瓣(ban)、不(bu)、掉(diao)的汉语拼音首字母。7.本发明中，首先提供了一种用于甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的crispr/cas9系统序列元件组，其特征在于，所述序列元件组包括u6-26p-target1-grna、u6-26p-target2-grna和根据密码子优化后的cas9基因；所述u6-26p-target1-grna包括启动子u6-26p，grna骨架结构和target1；所述u6-26p-target2-grna包括启动子u6-26p，grna骨架结构，target2；8.其中，所述甘蓝型油菜bnhbbd基因包括bnhbbd-c06和bnhbbd-a07，所述target1为基因bnhbbd-c06的靶点序列，所述-target2为基因bnhbbd-a07的靶点序列。9.其中，所述target1的核苷酸序列为：5’‑tacgatggttctgctctgtc-3’(seq.id.no.1)；10.target2的核苷酸序列为：5’‑tgcaagaattggagccaccg-3’(seq.id.no.2)；11.sgrna的核苷酸序列为：12.gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt(seq.id.no.3)。13.进一步的，所述bnhbbd-c06的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，氨基酸序列如seq.id.no.6所示；14.bnhbbd-a07的核苷酸序列如seq.id.no.5所示，氨基酸序列如seq.id.no.7所示。15.本发明中还提供了一种基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr，所述基因编辑载体包含上述用于甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的crispr/cas9系统序列元件组。16.本发明中还提供了用于甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的基因工程菌，所述基因工程菌采用上述基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr转化宿主细菌得到。17.本发明中还提供了一种用于甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的试剂盒，所述试剂盒上述基因编辑载体或基因工程菌。18.本发明中还提供了上述序列元件组、基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr、基因工程菌或试剂盒的应用，所述应用包括：19.a)在甘蓝型油菜基因bnhbbd-c06和/或基因bnhbbd-a07定点突变中的应用，所述bnhbbd-c06基因的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，氨基酸序列如seq.id.no.6所示，所述bnhbbd-a07基因的核苷酸序列如seq.id.no.5所示，氨基酸序列如seq.id.no.7所示；20.b)在具有长开花期的甘蓝型油菜育种中的应用；和/或21.c)在具有抗菌核病的甘蓝型油菜育种中的应用；和/或22.d)在具有角果不易开裂的甘蓝型油菜育种中的应用。23.本发明中还提供了一种利用cirspr/cas9系统对甘蓝型油菜bnhbbd基因定点突变的方法，包括：24.(1)针对甘蓝型油菜中的bnhbbd基因设计筛选靶点target1和target2，并设计sgrna序列，将2个靶点target1和target2分别与sgrna序列连接，构建出双靶点基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr；25.(2)将基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr转化农杆菌gv3101，得到含有基因编辑表达载体pkse401-bnhbbd-crispr的农杆菌；26.(3)扩大培养，利用得到的农杆菌菌液介导油菜下胚轴转化；27.(4)油菜下胚轴培养、诱导愈伤组织、再分化、生根培养、炼苗、移栽，得到转基因油菜；28.(5)鉴定获得bnhbbd基因发生突变的转基因植株。29.其中，所述甘蓝型油菜bnhbbd基因包括bnhbbd-c06和bnhbbd-a07，所述target1为基因bnhbbd-c06的靶点序列，所述-target2为基因bnhbbd-a07的靶点序列，30.所述target1的核苷酸序列如seq.id.no.1所示，31.所述target2的核苷酸序列如seq.id.no.2所示，32.所述sgrna的核苷酸序列如seq.id.no.3所示，33.所述bnhbbd-c06的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，氨基酸序列如seq.id.no.6所示，34.所述bnhbbd-a07的核苷酸序列如seq.id.no.5所示，氨基酸序列如seq.id.no.7所示。35.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：36.花序脱落缺失(inflorescencedeficientinabscission，ida)可以通过与膜上的共受体hae和hsl2蛋白进行结合，通过磷酸化和信号级联放大反应，将脱落信号传递给胞内下游调控因子，使得脱落区(abscissionzone，az)细胞扩大，最终导致花器官脱离，而突变体脱离区细胞不再扩张，花瓣不再脱落，使角果果皮和假隔膜之间的离层受到一定影响，进而使角果不易开裂，油菜粒不易脱落，减少机械化收货过程中的损失，提高油菜的生产效率。本发明中，在油菜的5个同源基因中，确定了表达量最高，且与拟南芥最为相近的2个在甘蓝型油菜中控制花器官脱落的有效基因bnhbbd-a07和bnhbbd-c06，利用cirspr/cas9系统对上述基因进行定点突变，获得了花瓣不脱落的油菜种质。由于只有在花瓣上，核盘菌的子囊孢子才能萌发形成菌丝，而直接落在油菜叶片上不能萌发形成菌丝，因此花瓣不脱落阻断了菌核菌进一步浸染下部叶片，可以达到抗菌核病的目的。37.本发明成功利用基因编辑技术在甘蓝型油菜中进行编辑，极大的缩短了新种质的获得周期，为油菜育种提供新思路。本发明构建的基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr转化油菜后获得的转化株，为研究基因bnhbbd的功能及作用机制提供了实验材料，也可作为新的长开花期、抗菌核病和不落粒种质资源，为油菜育种提供新的基因源，有助于推动农业科学进步。附图说明38.图1为bnhbbd-a07和bnhbbd-c06核苷酸及氨基酸序列差异比对图。39.图2为所选取的target1和target2靶点在基因上的位置示意图(a)与pkse401-bnhbbd-crispr质粒中lb和rb范围内简略示意图(b)，图中，lb：左边界；rb：右边界；kan：卡那霉素抗性基因；p-camv35s：camv35启动子；u6-26p-target1-grna：grna表达元件组，包括启动子u6-26p、grna骨架结构和靶点1(target1)；u6-26p-target2-grna：grna表达元件组，包括启动子u6-26p、grna骨架结构和靶点2(target2)；cas9：根据密码子优化后的cas9基因。40.图3为经过转化得到2株阳性株中提取叶片基因组的pcr鉴定胶图；图中，wt：野生型；hbbd-1、hbbd-2：突变体转基因植株； ：正对照，pkse401-bnhbbd-crispr质粒；-：负对照，ddh2o；marker：takaradl2000dnamarker。41.图4为与野生型相比hbbd突变体中bnhbbd-a07基因(a)和bnhbbd-c06基因(b)的测序结果分析示意图。42.图5为hbbd突变体靶点1处t插入导致的移码突变简析示意图；图中(a)为与野生型相比突变体中bnhbbd-a07基因发生的改变；(b)为与野生型相比突变体中bnhbbd-c06基因发生的改变。43.图6为野生型(a)与hbbd突变体花器官不脱落表型(b)的花期对比图。44.图7为hbbd突变体3个不同株系的花器官不脱落表型(hbbd)与野生型(wt)的角果成熟期对比图。45.图8为突变体(hbbd)与野生型(wt)的花序时期对比图，图中数字代表油菜花序的位置编号，花苞开放的第一朵花编号为1，第二朵花编号为2，依次类推。46.图9为在自然情况下，核盘菌侵染hbbd突变体与野生型发病途径对比示意图。47.图10为在培养箱环境下，核盘菌侵染hbbd突变体与野生型wt发病情况对比示意图；其中图中(a)与(c)的小箭头处为核盘菌接种位置，(b)为长箭头代表野生型花瓣脱落至叶片上，(d)为长箭头与叉号代表突变体花瓣不脱落至叶片上，0dpi和4dpi代表接种核盘菌0天和4天。48.图11为接种核盘菌后发病数量统计图，经过t检验，p《0.001，差异显著，使用三个*表示。49.图12为突变体(hbbd)与野生型(wt)角果开裂力测定图，经过t检验，p《0.05，差异显著，使用一个*表示。具体实施方式50.下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。51.在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法均是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时表明，其后所用相同试剂无特殊说明，均以首次表明的内容相同；所涉及到的是试剂、材料等如无特殊说明，均为商业途径获得。52.本发明中所采用的培养基及其配方如下所示：53.lb液体培养基：称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g溶于80ml双蒸水中，定容1l，然后分装至10个锥形瓶用封口膜封口，121℃高温高压灭菌15min，冷却后放入4℃冰箱保存。54.lb固体培养基：称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g溶于800ml双蒸水中，然后定容1l，然后分装至10个锥形瓶用封口膜封口，121℃高温高压灭菌15min，冷却后放入4℃冰箱保存。使用时放入微波炉中加热至融化，待液体冷却到50℃左右加入抗生素，摇匀后立刻倒至无菌平皿中，每皿约10ml。55.m0培养基：ms粉4.4g/l，蔗糖30g/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，凝固剂agar10g/l，灭菌后分装。56.dm培养基：ms粉4.4g/l，蔗糖30g/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，灭菌，等培养基冷却后加入as，1l中加入1mlas(母液100μmol/ml),放于4℃冰箱待用，也可以在用时在加入as。57.m1培养基：ms粉4.4g/l，蔗糖30g/l，甘露醇18g/l，2,4-d1mg/l，kt0.3mg/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，凝固剂agar10g/l，灭菌后等培养基冷却后加入as，1l中加入1mlas(母液100μmol/ml),放于4℃冰箱待用，也可以在用时在加入as。58.m2培养基：ms粉4.4g/l，蔗糖30g/l，甘露醇18g/l，2,4-d1mg/l，kt0.3mg/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，凝固剂agar10g/l，灭菌后等培养基冷却后加入：特美汀tmt300mg/l，sts150μmol/l，卡那霉素25mg/l，然后分装到无菌平皿中。59.m3培养基：ms粉4.4g/l，葡萄糖10g/l，木糖0.25g/l，mes0.6g/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，凝固剂agar10g/l，灭菌后等培养基冷却后加入：zt2mg/l，iaa0.1mg/l，特美汀tmt300mg/l，agno3150μmol/l，卡那霉素25mg/l，然后分装到无菌平皿中。60.m4培养基：ms粉4.4g/l，蔗糖10g/l，双蒸水定容，调节ph值为5.84-5.88，凝固剂agar8g/l，灭菌后等培养基冷却后加入：特美汀tmt300mg/l，然后分装。61.pda固体培养基：称取购买自国药集团的马铃薯葡萄糖琼脂培养基粉末7.4g，加入200ml蒸馏水中，121℃高温高压灭菌15min，冷却后放入4℃冰箱保存，使用时放入微波炉中加热至融化，待液体冷却到50℃左右加入抗生素，摇匀后立刻倒至无菌平皿中，每皿约20ml。62.实施例1：bnhbbd基因的鉴定及获得63.在甘蓝型油菜中，hbbd有5个成员，本发明对其利用转录组数据及生物信息学分析，通过进化树及同源性比对获得2个表达量最高、同源性最高的hbbd基因——bnhbbd-a07和bnhbbd-c06，由于这两个基因相似度较高，仅有几个碱基的差别，难以通过普通pcr的方法区分开，本实施例中通过测序的方法来分辨bnhbbd-a07和bnhbbd-c06。64.根据油菜网站(https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)上的bnhbbd基因的编码序列设计引物，引物序列为：65.hbbd-f(seq.id.no.13):atggctccgtgtcgtacg66.hbbd-r(seq.id.no.14):tcaatgaggatgagagtc；67.然后以油菜品种y127(来源于华中农业大学)的叶片dna为模板，使用高保真酶2*phantamaxmastermix(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)扩增bnhbbd基因的cds序列，pcr反应如表1所示。68.表1.高保真酶pcr扩增反应体系69.pcr反应体系体积ddh2o20μl2*phantamaxmastermix25μl上游引物(10μm)2μl下游引物(10μm)2μl模板dna(50-400ng)1μl70.pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s、52℃退火15s、72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃终延伸5min。pcr反应结束后，将pcr产物在2％琼脂糖凝胶(质量体积分数)中120v下进行凝胶电泳30min，然后在紫外凝胶成像仪下照相，记录结果。结果显示，该引物扩增出的目的片段，即bnhbbd-a07和bnhbbd-c06基因片段的大小为231bp左右。71.参照uniq-10柱式dna胶回收试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中操作说明，从琼脂糖凝胶中回收pcr扩增产物bnhbbd基因，然后将回收的pcr扩增产物bnhbbd基因连接到pmd19-t载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)上，连接体系为：4.5μl胶回收产物、0.5μlpmd-19t载体、5μlsolutionⅰ(购自宝生物工程(大连)有限公司)，在16℃下连接过夜，得到连接产物。72.向30μl大肠杆菌感受态细胞(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)中加入10μl的连接产物，通过热激法将连接产物转入大肠杆菌中，然后利用含终浓度为30mg/ml的amp的lb培养基筛选阳性菌落，并挑取10个单菌落震荡培养12-16h，取2μl菌液作为模板pcr扩增进行鉴定，pcr反应的引物为：73.m13-f(seq.id.no.15)：tgtaaaacgacggccagt74.m13-r(seq.id.no.16)：caggaaacagctatgacc。75.pcr扩增反应体系如表2所示，pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸1min，共进行28个循环；72℃终延伸10min。76.表2.菌液pcr扩增反应体系77.pcr反应体系体积ddh2o6μlrtaq10μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μl菌液2μl78.将pcr扩增的结果在2％的琼脂糖凝胶上进行检测，检测发现得到的dna片段为400bp左右，说明转化成功，选10份转化成功的菌液各吸取100μl送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。分析测序结果可得bnhbbd-a07和bnhbbd-c06序列，其核苷酸序列如seq.id.no.4和seq.id.no.5所示，氨基酸序列如seq.id.no.6和seq.id.no.7所示。79.根据序列表比对发现bnhbbd-c06和bnhbbd-a07的核苷酸序列共相差4个碱基，这4个碱基在bnhbbd-c06和bnhbbd-a07中分别是第59位g→a、第129位t→c、第140位t→a和第159位c→g。上述核苷酸的序列差异导致了2个氨基酸变化，这2个氨基酸在bnhbbd-c06和bnhbbd-a07中分别是第20位n→s和第47位h→l，比对示意图见图1。80.实施例2：基于crispr/cas9系统定向突变甘蓝型油菜基因bnhbbd-a07和bnhbbd-c06编辑载体的构建81.将bnhbbd-a07和bnhbbd-c06基因序列提交到网站http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr，筛选靶点，选取靶位点target1和target2，所述target1序列为：5’‑tacgatggttctgctctgtc-3’(seq.id.no.1)，target2序列为5’‑tgcaagaattggagccaccg-3’(seq.id.no.2)，把上述2个靶点序列分别连接到2个相同的sgrna序列的5’端：[(20bptarget)gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt](seq.id.no.3)，其中，(20bptarget)分别为target1和target2的长度，使得建出的双靶点基因编辑载体pkse401-bnhbbd-crispr可对目的序列敲除2次，保证产生有效编辑。[0082]根据筛选的靶点设计crispr/cas9载体靶点引物，引物序列如表3所示，确保设计的2个靶点可以同时敲除bnhbbd-a07和bnhbbd-c06。[0083]表3.crispr/cas9载体靶点引物[0084]引物序列5’‑3’hbbd-dt1-f0(seq.id.no.9)tgtacgatggttctgctctgtcgttttagagctagaaatagchbbd-dt2-r0(seq.id.no.10)aaccggtggctccaattcttgcacaatctcttagtcgactctachbbd-dt1-bs(seq.id.no.11)atatatggtctcgattgtacgatggttctgctctgtcgtthbbd-dt2-bsr(seq.id.no.12)attattggtctcgaaaccggtggctccaattcttgcacaa[0085]随后使用表3中的四种引物对模板入门载体pcbc-dt1t2(来自华中农业大学洪登峰老师)进行pcr扩增，pcr反应体系与表1中相同，pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s、52℃退火15s、72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。其中引物hbbd-dt1-bsf和hbbd-dt2-bsr正常引物浓度10μm；hbbd-dt1-f0和hbbd-dt2-r0稀释20倍，引物浓度应为5μm，纯化回收上述pcr产物，该pcr产物的长度为626bp，然后建立酶切-连接反应体系，具体的反应体系如表4所示，反应条件为37℃保持5h，50℃保持5min，80℃保持10min。[0086]表4.酶切-连接反应体系[0087]成分体积pcr产物(626bp)2μlpkse4012μl10*nebt4buffer1.5μl10*bsa1.5μlbsai(neb)1μlt4ligase(neb)/高浓度1μlddh2o6μl[0088]反应结束取5μl连接产物转化感受态大肠杆菌dh5α，使用含有50mg/mlkan的固体lb平板培养基进行筛选，37℃过夜培养后，挑取阳性克隆在400μl含有50mg/mlkan的液体lb培养基进行震荡培养4-6h，取2μl菌液作为模板pcr扩增进行鉴定，使用pkse401载体上u6启动子中的序列设计鉴定引物，退火温度改为57℃，其他pcr扩增反应体系和条件与表2中菌液pcr扩增反应相同，具体引物序列如下所示：[0089]u626-idf:tgtcccaggattagaatgattaggc(seq.id.no.17)[0090]u629-idr:agccctcttctttcgatccatcaac(seq.id.no.18)；[0091]经过pcr鉴定跑胶后得到的片段大小为726bp，吸取片段大小正确的阳性克隆菌液100μl送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，然后在pkse401载体上u6启动子中的序列设计正向测序引物，引物序列如下：[0092]u626-idf:tgtcccaggattagaatgattaggc(seq.id.no.17)[0093]u629-idf：ttaatccaaactactgcagcctgac(seq.id.no.19)；[0094]将测序结果中含有设计的2个靶点target1和target2的阳性克隆菌液进行扩大培养以提取质粒，从而获得pkse401-bnhbbd-crispr质粒，最后将质粒转入农杆菌gv3101中，扩大培养并保菌以待使用。[0095]图2为所选取的target1和target2靶点在基因上的位置示意图(a)与pkse401-bnhbbd-crispr质粒中lb和rb范围内简略示意图(b)。图中，lb：左边界；rb：右边界；kan：卡那霉素抗性基因；p-camv35s：camv35启动子；u6-26p-target1-grna：包括启动子u6-26p、grna骨架结构和靶点1(target1)；u6-26p-target2-grna：grna表达元件组，包括启动子u6-26p、grna骨架结构和靶点2(target2)；cas9：根据密码子优化后的cas9基因。[0096]实施例3：pkse401-bnhbbd-crispr基因编辑重组载体转化甘蓝型油菜(brassicanapus)[0097]a.播种：[0098]为了快速获得所需的油菜新种质，选取无需春化、可快速生长的甘蓝型油菜y127种子(种子来自华中农业大学洪登峰老师)，放在10ml离心管中，加入体积分数为75％的酒精，上下翻转，浸泡1min，用移液器吸取酒精，加入适量无菌水冲洗3-5遍；再加入15％bleach溶液(配置为8.115ml无菌水 1.875ml次氯酸钠 10μl曲拉通)，将离心管上下翻转，浸泡种子6min，污染较重的种子酒精消毒和灭菌的时间可以适当延长，但时间过长会影响种子发芽。随后吸掉消毒液，加入适量无菌水冲洗3-5遍，每次均上下翻转，保持离心管内为无菌环境。最后吸掉无菌水，用烧好的无菌镊子将灭菌种子播到m0培养基上，每瓶25粒左右，置于暗光24℃下培养6天，即可获得所需长度的油菜下胚轴。[0099]b.菌液准备：[0100]播种5-7天后用液体lb培养实施例2中得到的含有pkse401-bnhbbd-crispr质粒的农杆菌，具体培养方式如下：在5ml抗性lb(加入50mg/lkan 50mg/lgen 50mg/lrif)中加入20μl含有pkse401-bnhbbd-crispr质粒的农杆菌，于28℃、180-220rpm摇床中培养约14-16h。[0101]由于农杆菌在培养液中繁殖速度与其活性有关，而在对数期繁殖状态下的农杆菌活力最好，最易侵染植物，所以要严格计算好接菌时间。选择间隔2h重复接菌，如分别18:00、20:00接菌，次日早8:00挑选合适浓度，能够防止出现细菌浓度过高的情况。摇菌之前要挑选阳性单菌落在抗性平板上接种细菌，28℃下培养48h，等到阳性细菌在平板上繁殖出单菌落后用10μl枪头吸取该单菌落在培养液中反复吹打几次，使得菌均匀生长。[0102]c.侵染及共培养：[0103]准备好共培养培养基m1和dm液，m1培养基经过121℃15min灭菌后快冷却(约50℃)时快冷却时(约50℃)加入乙酰丁香酮as(终浓度100μm)，dm液也加入as(终浓度100μm)，记为dm(as )，备用。[0104]采用分光光度计测步骤b中所述的lb培养基中菌的od值，选取od值为0.4左右时的菌液较好，一般摇菌14-16小时即可。吸取2ml培养好的菌液到无菌离心管中，3000rpm3min离心，弃上清；然后加入2mldm(as )液悬浮，3000rpm3min离心，弃上清；再加入2ml的dm(as )液悬浮，放4℃冰箱备用。[0105]用无菌解剖剪刀剪取步骤a播种后生长出来的油菜下胚轴，切成0.8cm-1.0cm的小段，放在含有18ml的dm液体的培养皿中，等下胚轴全部切成小段后，再倒入2ml上述用dm(as )液重悬后的菌液，这时皿里液体体积为20ml，浸染10-15min(时间不能长，不然外植体易死亡)，隔段时间摇晃1次，4～5次即可。当侵染8min时开始用移液器吸掉dm(as )菌液，用无菌镊子夹取外植体到无菌滤纸上放置片刻，吸走外植体上多余的菌液，然后将外植体再转到m1固体培养基中，外植体暗光下24℃放置或放在光照培养室避光处。[0106]d.选择培养及愈伤诱导：[0107]将在m1培养基中培养36-48h的外植体转入到m2培养基中，光下正常培养，培养条件为24℃条件下，采用白天16h、晚上8h的方式交替培养，2-3周诱导愈伤。[0108]e.再分化：-：负对照，ddh2o；marker：takaradl2000dnamarker。[0130]图中可以证实实施例3中所构建的基因编辑载体成功转入到油菜中，确定通过植物组织培养的过程，获得了鉴定成功的阳性株。[0131]为了进一步确定的阳性株所发生的基因编辑情况，需要将上述鉴定成功的阳性株的基因组，使用高保真酶对bnhbbd-a07和bnhbbd-c06进行pcr扩增、跑胶、胶回收以及连接pmd19-t载体，转化大肠杆菌，挑菌鉴定，送单克隆菌液至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，具体实验操作及方法与实施例1中相同。[0132]对得到的测序结果进行分析，测序结果如图4所示，并将测序结果与实施例1中得到的bnhbbd-a07和bnhbbd-c06野生型真实测序结果进行比对分析，可以发现较多的单克隆在靶点1处表现出t碱基的插入，故此对其进行进一步分析，分析结果见图5。[0133]图5为hbbd突变体靶点1处t插入导致的移码突变简析示意图；图中(a)为与野生型相比突变体中bnhbbd-a07基因发生的改变；(b)为与野生型相比突变体中bnhbbd-c06基因发生的改变。从图中可以看出，hbbd突变体的bnhbbd-a07和bnhbbd-c06基因中均会发生移码突变，导致hbbd基因翻译过程中的提前终止，hbbd蛋白不能正常合成，这可以证实基因编辑载体成功在目的靶点行使功能，成功敲除甘蓝型油菜中bnhbbd-a07和bnhbbd-c06基因。[0134]实施例5：转基因甘蓝型油菜的花器官不脱落表型分析[0135]将实施例4中验证成功的hbbd突变体进行自交，将分离掉载体所携带的外源基因片段的突变体后代，放置于16h光照，8h黑暗，相对湿度70％的培养箱中进行生长，待进入花期后，对野生型(甘蓝型油菜y127，来自华中农业大学洪登峰老师)和突变体进行观察并记录花瓣脱落情况。本实验进行3次生物学重复，花器官附着情况是指不受外力影响的自然脱落情况，具体时间从花蕾开放到完全脱落，结果如表5所示。[0136]表5.花器官附着情况统计表[0137]株系名称调查花器官数量花器官附着状况(天)wt105±0.5hbbd-112∞hbbd-210∞hbbd-311∞[0138]图6为野生型(a)与hbbd突变体花器官不脱落表型(b)的花期对比图，可以明显发现突变体花器官附着在脱离区，并且经过表5统计可以发现，hbbd突变体的花器官在不受外力的作用下，从花蕾期、初开期、盛花期、授粉期、成熟期，均可以持续的存在。图7为hbbd突变体3个不同株系的花器官不脱落表型(hbbd)与野生型(wt)的角果成熟期对比图。从图中可以看出，花器官的颜色从黄色逐步转变为白色，哪怕是角果生长期、角果成熟期，花器官不脱落的表型将会一直持续。图8为hbbd突变体型(hbbd)与野生型(wt)的花序时期对比图，图中数字代表油菜花序的位置编号，花苞开放的第一朵花编号为1，第二朵花编号为2，依次类推。从图中可以看出，按照花序的位置，进行标花，可以更加明显的看出花器官不脱离的表型。[0139]由于自然界中核盘菌的子囊孢子飘落在花瓣上，随着野生型花器官的脱落，飘落在叶或茎处时，核盘菌的菌丝开始生长，形成侵染环境，病情严重时，会在茎中形成菌核，此时油菜的茎会由于核盘菌的侵染变得中空，从而导致整株植物死亡，带来极大的经济损失。图9为在自然情况下，核盘菌侵染hbbd突变体与野生型发病途径对比示意图。从图中可以看出，hbbd突变体的花器官不脱落菌核病发病率低。[0140]本实施例中还在培养箱环境中测试了hbbd突变体花器官不脱落对菌核病的避病表型，具体测试方法为：将由试验田中分离得到的核盘菌菌核接种在pda固体培养皿中，28℃倒置培养6天，等到菌丝生长到培养皿的边缘后，取边缘处0.3cm*0.3cm的菌叠分别接种到3株野生型和3株突变体的花瓣上，每株接种6处花瓣，然后将接种后的植株均放置在人工气候箱(购买自上海一恒科学仪器有限公司)中进行培养，所述培养条件为温度22℃、湿度90％、12h弱光照、12h黑暗培养，每12h观察菌丝生长情况。花瓣上接种核盘菌后发病情况统计如表6所示。[0141]表6.花瓣上接种核盘菌后发病情况统计表[0142]株系名称接种花瓣数量接种后发病数量wt-166wt-265wt-365hbbd-161hbbd-260hbbd-360[0143]表6为花瓣上接种核盘菌后发病情况统计表，从表中可以看出，核盘菌侵染hbbd突变体与野生型wt后，野生型wt的花瓣接种后基本都发病，而hbbd突变体接种后发病率降低。[0144]图10为培养箱环境下核盘菌侵染hbbd突变体与野生型wt发病情况对比示意图，其中图中(a)与(c)的小箭头处为核盘菌接种位置，(b)为长箭头代表野生型花瓣脱落至叶片上，(d)为长箭头与叉号代表突变体花瓣不脱落至叶片上，dpi(dayofpost-inoculation)，0dpi和4dpi代表接种核盘菌0天和4天。从图中可以看出，野生型wt的花瓣会脱落，极大概率会带着已经开始生长的核盘菌脱离并附着在叶片上，核盘菌持续侵染使得植物叶片成腐烂状，造成了极大的病害；而hbbd突变体花器官不脱落，且处于植株的顶层，相对叶片处湿度较低，通风较好，核盘菌不易生长，发病概率显著降低，植物正常生长。[0145]图11为接种核盘菌后发病数量统计图，经过t检验，p《0.001，可以看出突变体hbbd的花瓣发病数量与野生型wt相比，显著降低。[0146]本实施例中还测试了hbbd突变体与野生型角果开裂力，具体测试步骤如下：取野生型和hbbd突变体开花后40天的共10个成熟角果，放置于温度25℃、湿度50％的环境一周，然后用胶水把角果粘在薄板上，使得油菜角果假隔膜所在平面平行于木板平面，角果的尾部与木板边沿对齐，角果柄处于木板之外。使用ta.xtplus物性仪(英国stablemicrosystem公司)把l形钩固定在探头上，在垂直于平板的方向于角果基部钩住固定在平板上角果和果柄的结合处。测定时用手压住平板，以1mm/min的速率匀速向上运动，当接触到角果柄时，转为0.5mm/min的速率匀速向上运动，拉开角果，同时记录野生型和突变体的拉裂力数据。[0147]角果开裂前，受到的力不断增加，角果开裂后，受到的力突然减小，受力峰值即为角果开裂力的最大拉裂力数据，峰值越大，角果抗裂角能力越大。图12为突变体(hbbd)与野生型(wt)角果开裂力测定图，从图中可以看出，野生型角果最大拉裂力数据在0.3-0.5n左右，突变体角果最大拉裂力数据在0.6-0.8n左右，经过t检验，p《0.05，突变体和野生型相比拉裂力显著增加，即角果抗裂角能力增强。[0148]上述实验结果可以说明甘蓝型油菜中hbbd蛋白也是调控花器官脱落的重要蛋白质之一，为延长花期、抗菌核病和机械化收割提供了一定的利用资源。[0149]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12当前第1页12
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