一种马来酸酐脂环类化合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及微生物代谢产物及其在药物研究领域的应用技术，具体是一种马来酸酐脂环类化合物及其从篮状菌(talaromyces scorteus)的发酵产物中获得的制备方法与应用。


背景技术：

2.据国际癌症研究中心(international agency for research on cancer, iarc)报道，2020年全世界新发1930万例癌症病例，将近1000万例癌症死亡，且预计到2040年，全球癌症负担将达到2840万例，比2020年增加 47％。卵巢癌、膀胱癌等依然是全球主要的恶性肿瘤，其发病率在2020年癌症发病中分别排第8名(女性)和第6名(男性)。
3.近年来，恶性肿瘤的发病人数、发病率和死亡率持续升高，癌症已经成为困扰健康的重大疾病。除了进行及时的筛查防控，更急需开发新型药物来遏制日益严峻的恶性肿瘤发展趋势。
4.篮状菌属(talaromyces sp.)是一种普遍存在的真菌属，可在陆地和海洋生态系统中发现，包括河口沉积物、盐沼、红树林湿地和深海沉积物等 (p.dewapriya et al,organic letters,2017,19(8),2046-2049)，该菌属可代谢产生具有抗菌作用的环七肽、二萜类等化合物，但是，未见从该种真菌篮状菌(talaromyces scorteus)中分离得到具有抗肿瘤活性的马来酸酐脂环类化合物的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种马来酸酐脂环类化合物及其从篮状菌 (talaromyces scorteus)的发酵产物中获得的制备方法与应用。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.一种马来酸酐脂环类化合物，马来酸酐脂环类化合物结构如式i中所示, 分子式为c
27h38
o6；
[0008][0009]
一种马来酸酐脂环类化合物的制备方法，
[0010]
1)将篮状菌(talaromyces scorteus)接种于固体培养基(按重量计，每100毫升海水中含大米70克，玉米浆0.2克，蛋白胨0.3克，酵母粉0.5 克，味精0.6克)中发酵培养，然
后，将发酵液用乙酸乙酯萃取3-4次，合并提取液进行浓缩，获得发酵液粗提物；
[0011]
2)将步骤1)中的发酵液粗提物进行减压硅胶柱层析，依次采用梯度为100:0至1:1(v/v,下同)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至1:1的二氯甲烷-甲醇进行洗脱；
[0012]
3)将步骤2)中以石油醚-乙酸乙酯2:1梯度洗脱下的组分以甲醇-水(甲醇-水的比例10:90至100:0)作为洗脱液进行反相硅胶柱层析，收集甲醇
‑ꢀ
水60:40洗脱得到的组分，经过制备型薄层层析(prep.-tlc)纯化，所采用的展开体系为1:3的石油醚-二氯甲烷，然后经过甲醇凝胶柱层析，制得目标化合物。
[0013]
具体为：
[0014]
1)将所述篮状菌(talaromyces scorteus)在pda(马铃薯蔗糖琼脂) 培养基上于28℃下培养4天，取其菌丝体及孢子接种于大米固体培养基中，室温下静置发酵30天，发酵产物经石油醚萃取脱除小极性产物后，采用乙酸乙酯充分浸泡反复萃取，合并萃取液进行浓缩，获得粗提物；
[0015]
2)将上述粗提物进行减压硅胶柱层析，依次使用梯度分别为100:0至 1:1(v/v,下同)的石油醚-乙酸乙酯和20:1至1:1的二氯甲烷-甲醇洗脱体系进行梯度洗脱；
[0016]
3)收集上述步骤2)中的石油醚-乙酸乙酯2:1洗脱的组分浓缩，进行反相硅胶柱层析，使用梯度为10:90至100:0的甲醇-水洗脱体系进行梯度洗脱；
[0017]
4)收集上述步骤3)中的甲醇-水60:40的组分，经过制备型薄层层析 (prep.-tlc)纯化，所采用的展开体系为1:3的石油醚-二氯甲烷，然后采用sephadex lh-20甲醇凝胶柱层析进行纯化(以meoh作为洗脱剂)，得到式i所示马来酸酐脂环类化合物。
[0018]
一种马来酸酐脂环类化合物的应用，所述式i中的马来酸酐脂环类化合物在作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤制剂或其先导化合物中的应用。
[0019]
所述式i中的马来酸酐脂环类化合物在作为抗卵巢畸胎瘤、脑瘤、膀胱癌和咽鳞癌药物或先导化合物中的应用。
[0020]
所述卵巢畸胎瘤为pa-1卵巢畸胎瘤细胞；所述脑瘤为sf126脑瘤细胞；所述膀胱癌为5637膀胱癌细胞；所述咽鳞癌为fadu咽鳞癌细胞。
[0021]
本发明所具有的优点：
[0022]
1.本发明制备所得的马来酸酐脂环类化合物来源于篮状菌(talaromyces scorteus)的发酵产物，采用微生物发酵的方法制备该化合物，具有相对可控、快速高效且对环境友好的特点；
[0023]
2.本发明制备所得的马来酸酐脂环类化合物具有显著抗pa-1卵巢畸胎瘤细胞，sf126脑瘤细胞，5637膀胱癌细胞，fadu咽鳞癌细胞的活性，且化合物为尚未被报道的新化合物，可进一步探索其作用机制，以期开发为新型抗卵巢畸胎瘤药物或其先导化合物。经实验证明该化合物对卵巢畸胎瘤细胞株(pa-1)、脑瘤细胞株(sf126)，膀胱癌细胞株(5637)，咽鳞癌细胞株(fadu)具有较强的抑制活性，其半数抑制浓度ic
50
分别为11.89、 10.03、10.94和6.63μm。而阳性对照顺铂的ic
50
分别为0.13、8.38、1.31 和4.26μm。
具体实施方式
[0024]
下面结合一些非限定性的具体实施例对本发明做进一步阐述。
[0025]
实施例1：化合物结构式
[0026]
从篮状菌(talaromyces scorteus)发酵产物中分离获得的马来酸酐脂环类化合物结构如式(i)所示(式中的阿拉伯数字代表化学结构中的碳原子标位)：
[0027][0028]
实施例2：式i所示化合物的制备方法
[0029]
1)发酵培养
[0030]
取适量篮状菌(talaromyces scorteus)菌种接种在pda(马铃薯蔗糖琼脂)平板上，在pda培养基上菌丝体呈白色，后期产生墨绿色孢子，平板背面呈黄色，于28℃下培养4天后待用。
[0031]
将上述pda平板的菌丝体及孢子接种于无菌的大米固体培养基中，室温下静置培养30天，发酵产物通过石油醚萃取去除小极性产物后，使用乙酸乙酯浸泡萃取3-4次，合并浓缩后获得发酵粗提物；
[0032]
所述固体培养基配方为：每100毫升海水中含大米70克，玉米浆0.2 克，蛋白胨0.3克，酵母粉0.5克，味精0.6克。
[0033]
2)粗提物分离纯化
[0034]
将上述粗提物通过减压硅胶(100-200目)柱层析分段，并使用梯度为 100:0至1:1(100:0、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，v/v,下同)的石油醚-乙酸乙酯和20:1至1:1(20:1、10:1、5:1、1:1)的二氯甲烷-甲醇作为洗脱溶剂，依次进行梯度洗脱；收集石油醚-乙酸乙酯2:1洗脱得到的组分；
[0035]
将上述收集到的组分进行反相硅胶柱层析，以10:90至100:0的甲醇
‑ꢀ
水依次进行梯度洗脱；
[0036]
收集上述步骤中的甲醇-水60:40的组分，经过制备型薄层层析 (prep.-tlc)纯化，所采用的展开体系为1:3的石油醚-二氯甲烷，然后采用sephadex lh-20甲醇凝胶柱层析进行纯化(以meoh作为洗脱剂)，收集洗脱组分，干燥得到目标化合物86.2mg,其化学结构鉴定如式i所示,为马来酸酐脂环类化合物。
[0037]
该化合物具有以下理化和波谱特性：
[0038]
无色透明针状晶体；化学式c
27h38
o6；熔点96-98℃；比旋光度98℃；比旋光度uv(meoh)λ
max
(logε)246(2.63)；ecd(0.27mm, meoh)λ
max
(δε)207(
–
254.66),226( 141.27),275( 5.28),309( 24.26)nm；高分辨esi质谱m/z 457.2584[m-h]-(calcd for c
27h37
o6,457.2596)。1h-nmr和
13
c-nmr见表1。
[0039]
表1.核磁共振氢谱(500mhz，in cdcl3)碳谱(125mhz，in cdcl3)数据
[0040][0041][0042]
实施例3：抗肿瘤活性实验
[0043]
选择以下4株供试细胞株：卵巢畸胎瘤细胞株(pa-1)、脑瘤细胞株 (sf126)，膀胱癌细胞株(5637)，咽鳞癌细胞株(fadu)进行抗肿瘤活性测试。
[0044]
1)供试细胞株及其培养
[0045]
本发明采用的供试细胞株为卵巢畸胎瘤细胞株(pa-1)、脑瘤细胞株 (sf126)，膀胱癌细胞株(5637)，咽鳞癌细胞株(fadu)，将pa-1、sf126 和fadu细胞在含10％胎牛血清、1％pbs磷酸盐缓冲液以及青霉素-硫酸链霉素双抗混合液(100
×
)的dmem高糖培养基中培养，而5637细胞在含10％胎牛血清、1％pbs磷酸盐缓冲液以及青霉素-硫酸链霉素双抗混合液(100
×
)的rpmi1640培养基中培养。所有的实验都是采用第2代和第5 代之间的同一批细胞系且培养条件控制在5％co2,37℃。
[0046]
2)待测样品的配制
[0047]
测试样品为上述实施例中获得的纯化合物，准确称取适量样品，用二甲基亚砜(dmso)溶解混匀，母液浓度10mm。细胞培养基稀释至其10 倍的待测样品浓度。阳性对照顺铂配制方法同上。
[0048]
3)肿瘤细胞生长抑制活性测试(cck-8法)：
[0049]
本发明采用cell counting kit(cck-8)法进行肿瘤细胞的生长抑制活性测试，以评价化合物的作用效果。
[0050]
该测试方法的原理为：cck-8试剂盒中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐(wst-8)，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-methoxy pms)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(formazan)，而在死细胞中脱氢酶没有活性，因此不能形成甲臜产物。在一定细胞数量范围内，生成的甲臜物的数量与活细胞的数目成正比，即活细胞越多，产生的 formazan就越多，颜色越深。formazan在450nm处有最大吸收峰，因此，使用酶标仪在450nm波长处检测其吸光值，就可间接反映活细胞的数目，从而评价药物对肿瘤细胞的抑制活性。
[0051]
测试流程：用含10％胎牛血清的培养液将细胞配成单个细胞悬液，96 孔板每孔接种90μl 5
×
104/ml的贴壁细胞和9
×
104/ml的悬浮细胞，在5％ co2，37℃的条件下预培养24h。然后，每孔加入10μl样品溶液，ic
50
测定8个浓度(0,10-9
,10-8
,10-7
,10-6
,5
×
10-6
,10-5
,2
×
10-5
mol/l)，每种浓度均设3个复孔；置于37℃培养箱培养48h，从贴壁细胞中吸出旧培养基和药物溶液(悬浮细胞直接加入10μl cck-8溶液原液)，每孔加入稀释10倍的100μl cck-8溶液，在37℃，5％co2继续培养1-4h(避光操作，实时观察)。最后，在微量震荡器上震荡2分钟，使formazan分布均匀，采用酶标仪测定每孔450nm处的吸光值(od值)。
[0052]
抑制率(ir％)计算：od值取三孔平均，公式：ir％＝(od
control-od
drug
) /(od
control-od
blank
)
×
100％，计算所得值即为样品对细胞增殖的抑制率 (ir％)。应用graphpad prism 8(版本8.0.2，graphpad software inc)软件进行原始数据标准化处理，实验结果用
±
sd表示。
[0053]
ic
50
值：抑制率(ir％)为50％时对应的样品溶液浓度。
[0054]
实验结果见表2。
[0055]
表2.实施例获得化合物的抗肿瘤活性(ic
50
±
sd,μm)
[0056][0057]
实验结果表明该化合物对脑瘤细胞株(sf126)和咽鳞癌细胞株(fadu) 具有强抑制活性，ic
50
值小于10μm，且与阳性对照相当；对膀胱癌细胞株 (5637)，也具有较强的抑制作用。同时，对卵巢畸胎瘤细胞株(pa-1)，也有一定的抑制作用。
[0058]
上述实验结果证明本发明所涉及的化合物对所试脑瘤细胞株(sf126) 和咽鳞癌
细胞株(fadu)具有很强的生长抑制作用，其效果与阳性对照顺铂的活性相当，对所试卵巢畸胎瘤细胞株(pa-1)和膀胱癌细胞株(5637)，也具有较强的抑制作用。因此可将此化合物制备为抗肿瘤制剂或先导化合物，且有望以任何药学上可接受的盐、酯或溶剂化物或与化疗、靶向治疗、肿瘤免疫治疗等方法中的一种或几种联合使用。