肽的制造方法与流程

1.本发明涉及肽的制造方法。


背景技术：

2.肽由于其多样性及生物相容性，自古以来在各种各样的领域中对其进行了研究，不仅在医药品中，而且在生化工具、食品等中也具有广泛的应用性。
3.另一方面，关于肽的合成方法，尽管经年累月已经进行了大量的研究，然而尚未确立能够足够令人满意的合成手法。例如，目前逐渐成为肽合成手法的标准的固相合成方法(spps)不仅价格昂贵，在工业规模合成方面也存在难点。另外，相对廉价的液相合成方法(lpps)具有其烦杂的保护
·
脱保护工序，容易发生差向异构化、操作性复杂等问题点。与此相对，最近报道了利用微流动反应器的使用了无保护氨基酸的肽链延长反应(例如参见非专利文献1)。
4.现有技术文献
5.非专利文献
6.非专利文献1：chem.eur.j.10.1002/chem.201903531


技术实现要素：

7.发明所要解决的课题
8.然而，在非专利文献1记载的方法中，在反应结束后的反应溶液中存在未反应原料、副反应产物等，因此，在进行与后续的不同氨基酸的缩合反应时，需要进行纯化工序。
9.本发明的课题在于提供有效的肽的制造方法。
10.用于解决课题的手段
11.本技术发明人进行了各种研究，结果发现，通过在水与疏水性有机溶剂的双相溶剂中进行使无保护的氨基酸缩合的反应，从而能够在不经过特别的纯化工序的情况下进行后续的氨基酸缩合反应，然后，进一步反复进行研究，从而完成了本发明。
12.即，本发明包括下述项1～4所示的肽的制造方法。
13.项1
14.肽的制造方法，所述制造方法中，
15.使氨基受到保护的氨基酸或中间体肽的羧基、与氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽的碱金属盐或碱土金属盐在包含水和疏水性有机溶剂的双相溶剂中进行反应。
16.项2
17.如项1所述的制造方法，其中，
18.进一步使氨基未受保护的相同或不同的氨基酸、或者n末端未受保护的相同或不同的中间体肽的碱金属盐或碱土金属盐进行反应。
19.项3
20.如项1或2所述的制造方法，其中，
21.上述水为呈碱性的水溶液。
22.项4
23.如项1～3中任一项所述的制造方法，其在相转移催化剂的存在下进行。
24.发明效果
25.根据本发明的制造方法，能够有效地进行肽链的延长反应。进一步具体而言，在使氨基酸依次与氨基酸或肽的末端氨基酸缩合的连续反应中，使得无需对各反应结束后生成的肽进行分离纯化的工序就能够进行后续反应。因此，本发明的肽的制造方法可以说是在工业上极为有利的方法。
附图说明
26.图1为实施例1-1中得到的肽的nmr图。
27.图2为实施例1-2中得到的肽的nmr图。
28.图3为实施例2中得到的保护肽的nmr图。
29.图4为实施例2中得到的肽的nmr图。
具体实施方式
30.以下，对本发明进行详细说明。
31.在本说明书中，“含有”是将“包含(comprise)”、“实质上仅由
…
构成(consist essentially of)”及“仅由
…
构成(consist of)”全部包括的概念。另外，在本说明书中，除非特别说明，以“a～b”表示数值范围时，是指a以上且b以下。
32.在本说明书中，“(未受保护的)氨基”不仅包括-nh2，也包括氮原子上的氢原子未受保护的环状氨基。
33.本发明的肽的制造方法是使氨基受到保护的氨基酸或中间体肽的羧基、与氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽的碱金属盐或碱土金属盐在包含水和疏水性有机溶剂的双相溶剂中进行反应的制造方法。
34.需要说明的是，氨基受到保护的氨基酸或中间体肽是指，氨基酸或中间体肽的n末端被保护基所保护的氨基酸或中间体肽。需要说明的是，氨基受到保护的中间体肽是指不仅n末端氨基受到保护，而且侧链的氨基也受到保护的中间体肽。
35.另外，本发明的制造方法没有特别限制，也包括如下方法：使以下通式(2)所示的氨基酸或中间体肽(以下有时称为“式(2)的氨基酸类”)与通式(3)所示的氨基酸或中间体肽(以下有时称为“式(3)的氨基酸类”)在包含水和疏水性有机溶剂的双相溶剂中进行反应的、制造通式(1)所示的肽(以下有时称为“式(1)的肽”)的方法。
36.[化学式1]
[0037]
q-a
1-cooh
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0038]
[式中，a1表示氨基酸残基或肽残基。q表示氨基的保护基。]
[0039]
[化学式2]
[0040]
[0041]
[式中，a2表示氨基酸残基或肽残基。r1表示氢原子或氨基酸n末端取代基，可以与a2一起形成环。x1表示碱金属原子或碱土金属原子。]
[0042]
[化学式3]
[0043][0044]
[式中，q、a1、a2及r1与上文相同。x2表示氢原子、碱金属原子或碱土金属原子。]
[0045]
另外，本发明的肽的制造方法包括如下制造方法：使氨基受到保护的氨基酸或中间体肽的羧基、与氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽的碱金属盐或碱土金属盐在包含水和疏水性有机溶剂的双相溶剂中进行反应而制造中间体肽，进一步使氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽的碱金属盐或碱土金属盐与所制造的中间体肽进行反应。此时，之后进行反应的氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽可根据所得到的肽进行选择，可以与之前进行反应的氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽相同，也可以不同。
[0046]
即，本发明的制造方法也可以是指如下方法：将使式(2)的氨基酸类与式(3)的氨基酸类在包含水和疏水性有机溶剂的双相溶剂中进行反应而制造的式(1)的肽(x2＝氢原子)作为中间体肽，进而使通式(4)所示的氨基酸或中间体肽(以下有时称为“式(4)的氨基酸类”)在包含水和疏水性有机溶剂的双相溶剂中进行反应的、制造通式(5)所示的肽(以下有时称为“式(5)的肽”)的方法。
[0047]
[化学式4]
[0048][0049]
[式中，x1与上文相同。a3表示氨基酸残基或肽残基。r2表示氢原子或氨基酸n末端取代基，可以与a3一起形成环。]
[0050]
[化学式5]
[0051][0052]
[式中，q、a1、a2、a3、r1、r2及x2与上文相同。]
[0053]
反应结束后，所生成的式(1)的肽或式(5)的肽有时在反应液中以碱金属盐或碱土金属盐的状态存在，因而对于要以肽的形式提取的情况、或者用于后续反应的情况等，利用酸制备成羧酸的状态即可。作为酸，只要能够中和羧酸的碱金属盐或碱土金属盐则没有特别限定，例如可以举出盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、富马酸、草酸等有机酸，优选盐酸等无机酸。
[0054]
作为构成在本发明的制造方法中使用的氨基受到保护的氨基酸或中间体肽(式(2)的氨基酸类)的氨基酸，只要在一分子内具有氨基和羧基则就没有特别限定，例如可以举出甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、苯丙氨酸(phe)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、赖氨酸(lys)、5-羟基赖氨酸(hyl)、精氨酸(arg)、天冬氨酸(asp)、天冬酰胺(asn)、谷氨酸(glu)、谷氨酰胺(gln)、半胱氨酸(cysh)、胱氨酸
(cyss)、半胱氨酸(cya)、甲硫氨酸(met)、酪氨酸(tyr)、四碘甲腺原氨酸(thy)、脯氨酸(pro)、羟基脯氨酸(hyp)、色氨酸(trp)、组氨酸(his)、n-甲基甘氨酸、β-丙氨酸、n-甲基-β-丙氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸、红藻氨酸或者它们的衍生物等。这些氨基酸之中，优选甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、苯丙氨酸(phe)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、赖氨酸(lys)、5-羟基赖氨酸(hyl)、精氨酸(arg)、天冬氨酸(asp)、天冬酰胺(asn)、谷氨酸(glu)、谷氨酰胺(gln)、半胱氨酸(cysh)、胱氨酸(cyss)、半胱氨酸(cya)、甲硫氨酸(met)、酪氨酸(tyr)、甲状腺氨酸(thy)、脯氨酸(pro)、羟基脯氨酸(hyp)、色氨酸(trp)、组氨酸(his)等，更优选甘氨酸(gly)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、苯丙氨酸(phe)、半胱氨酸(cya)、甲硫氨酸(met)、酪氨酸(tyr)、甲状腺氨酸(thy)、脯氨酸(pro)、羟基脯氨酸(hyp)、色氨酸(trp)等。
[0055]
作为肽，只要是2个以上的上述氨基酸以肽键键合而得的化合物即可，构成肽的氨基酸的数量通常为100以下，优选为50以下，更优选为30以下。
[0056]
作为氨基酸或肽的氨基的保护基，可以举出苄基(bn)、对甲氧基苄基(pmb)、对甲氧基苯基(pmp)等胺型保护基；甲酰基、乙酰基(ac)等酰胺型保护基；邻苯二甲酰基(phth)等邻苯二甲酰亚胺型保护基；苄氧基羰基(cbz)、叔戊氧羰基(aoc)、9-芴基甲氧羰基(fmoc)、叔丁氧羰基(boc)、烯丙氧羰基(alloc)、2,2,2-三氯乙氧基羰基(troc)等氨基甲酸酯型保护基；3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(npys)、2-硝基苯磺酰基(ns)、(2-三甲基甲硅烷基)乙磺酰基(ses)等磺酰胺型保护基等，其中，优选苄氧基羰基(cbz)、9-芴基甲氧羰基(fmoc)、叔丁氧羰基(boc)、烯丙氧羰基(alloc)、对甲氧基苄基(pmb)、邻苯二甲酰基(phth)、2,2,2-三氯乙氧基羰基(troc)等，更优选苄氧基羰基(cbz)、9-芴基甲氧羰基(fmoc)、叔丁氧羰基(boc)、对甲氧基苄基(pmb)、2,2,2-三氯乙氧基羰基(troc)等。
[0057]
作为与这些氨基受到保护的氨基酸或中间体肽的羧基进行反应的、氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽(式(3)的氨基酸类(或式(4)的氨基酸类))，只要在一分子内具有氨基和羧基则没有特别限定，能够以与欲制造的肽相一致的方式选择使用上述的作为构成氨基受到保护的氨基酸或中间体肽的氨基酸而例示的物质。
[0058]
本发明的制造方法的特征在于，在水与疏水性有机溶剂的双相溶剂中进行。
[0059]
作为疏水性有机溶剂，是不易溶于水、或者不易与水掺混的有机溶剂，例如可以举出：在1个大气压(1.013
×
105pa)、20℃的条件下与相同容量的水进行搅拌，在静置后，能够与水层之间形成明确分界的溶剂；具体而言，可以举出正己烷、正庚烷等脂肪族烃；二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、三氯乙烷、二氯丙烷、1、2-二氯乙烯等卤代脂肪族烃；苯、甲苯、二甲苯、硝基苯等芳香族烃；氯苯、二氯苯、氯甲苯等卤代芳香族烃；乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯等酯化合物；二乙醚、环戊基甲醚(cpme)、四氢呋喃(thf)等醚化合物等。
[0060]
这些疏水性有机溶剂之中，优选二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷、苯、甲苯、硝基苯、氯苯、二氯苯、氯甲苯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯、二乙醚、环戊基甲醚、四氢呋喃等，更优选二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷、甲苯、氯苯、二氯苯、氯甲苯、二乙醚、环戊基甲醚等。原因在于，它们是疏水性极性有机溶剂，具有耐碱性，并且是缺乏缩合反应性的溶剂。
[0061]
这些疏水性有机溶剂可以单独使用或混合使用2种以上。
[0062]
在本发明的制造方法中，作为疏水性有机溶剂的使用量，没有特别限制，可以设为氨基受到保护的氨基酸、中间体肽或肽(式(2)的氨基酸类或式(1)的肽)能够充分溶解的量，例如，相对于该氨基酸或肽1质量份而言，疏水性有机溶剂为0.1～100质量份，优选为1～50质量份，更优选为2～10质量份。
[0063]
另外，在本发明的制造方法中作为溶剂使用的水只要不对本发明的制造方法造成不良影响，则可以为自来水、离子交换水、蒸馏水等，形成溶解有氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽(式(3)的氨基酸类(或式(4)的氨基酸类))的水溶液。因此，优选为呈碱性的水溶液。该呈碱性的水溶液的ph大于7，优选7.1以上，更优选8以上。另外，ph优选14以下，更优选11以下，进一步优选10.5以下。
[0064]
另外，在本发明的制造方法中，式(3)的氨基酸类(或式(4)的氨基酸类)以水溶液的状态使用即可，也可以在碱金属盐、碱土金属盐等(碱金属碳酸盐、碱土金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、碱土金属碳酸氢盐、碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物等)的水溶液中溶解式(3)的氨基酸类(或式(4)的氨基酸类)的羧酸体而制备式(3)的氨基酸类(或式(4)的氨基酸类)。
[0065]
作为碱金属碳酸盐，可以举出碳酸钠、碳酸钾等，作为碱土金属碳酸盐，可以举出碳酸镁、碳酸钙等，作为碱金属碳酸氢盐，可以举出碳酸氢钠、碳酸氢钾等，作为碱土金属碳酸氢盐，可以举出碳酸氢镁、碳酸氢钙等，作为碱金属氢氧化物，可以举出氢氧化钠、氢氧化钾等，作为碱土金属氢氧化物，可以举出氢氧化镁、氢氧化钙等。
[0066]
作为这些水的使用量，没有特别限定，例如相对于氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽(式(3)的氨基酸类(或式(4)的氨基酸类))1质量份而言，水可以设为0.5～100质量份，优选设为1～50质量份，更优选设为2～10质量份。
[0067]
另外，作为在本发明的制造方法中使用的水与疏水性有机溶剂的使用比例，没有特别限定，相对于水1质量份而言，疏水性有机溶剂可以设为0.05～20质量份，优选设为0.1～10质量份，更优选设为0.33～3质量份。
[0068]
本发明的制造方法是使氨基受到保护的氨基酸或中间体肽(式(2)的氨基酸类(或式(1)的肽))、与氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽(式(3)的氨基酸类(或式(4)的氨基酸类))进行缩合反应而制造肽的方法，优选在使氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽(式(3)的氨基酸类(或式(4)的氨基酸类))溶解于水中的状态下进行反应。
[0069]
另一方面，氨基受到保护的氨基酸或中间体肽(式(2)的氨基酸类(或式(1)的肽))优选溶于疏水性有机溶剂中。在与氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽的反应时，氨基受到保护的氨基酸或中间体肽(式(2)的氨基酸类(或式(1)的肽))的羧酸优选被活化，该活化的手段可以应用以往已知的生成肽键的缩合反应，例如叠氮法、混合酸酐法、活性酯法(氯甲酸
·
酯法、对硝基苯基
·
酯法、n-羟基琥珀酸酰亚胺
·
酯法等)、伍德沃德氏试剂k法、使用了缩合剂(例如二环己基碳二亚胺(dcc)、二异丙基碳二亚胺(dic)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(cmpi)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(bop)、六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基磷(pybop)、o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸盐(hatu)、o-(苯并三唑-1-基)-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基
氧基)二甲氨基吗啉碳鎓六氟磷酸盐(comu)等)的方法等。这些方法中，特别优选应用混合酸酐法或活性酯法。
[0070]
如上所述，通过使基质分别存在于双相溶剂的各层中，并且对该溶剂进行搅拌，由此推进反应，能够使所生成的肽(式(1)的肽)存在于疏水性有机溶剂层中。
[0071]
在本反应中，关于氨基受到保护的氨基酸或中间体肽(式(2)的氨基酸类(或式(1)的肽))、与氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽(式(3)的氨基酸类(或式(4)的氨基酸类))的使用比例，相对于氨基受到保护的氨基酸或中间体肽(式(2)的氨基酸类(或式(1)的肽))而言，可以设为1～10当量，优选设为1.1～5当量，更优选设为1.2～3当量。
[0072]
本反应温度通常可以设为4～80℃，优选设为10～50℃，更优选设为20～30℃，本反应时间通常可以设为0.1～100小时左右，优选设为1～50小时左右，更优选设为5～20小时左右，可以根据所使用的氨基酸、肽的种类和量分别进行设定。
[0073]
本发明的制造方法中，为了易于推进反应，优选使用相转移催化剂。作为相转移催化剂，可以举出在有机合成化学中已知的催化剂，例如可以举出四甲基溴化铵、四甲基氯化铵、四乙基溴化铵、四丙基溴化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、苄基三乙基氯化铵、三辛基甲基氯化铵等卤化季铵类；四丁基溴化鏻、苄基三苯基溴化鏻、丁基三苯基溴化鏻等卤化季鏻类；15-冠醚-5,18-冠醚-6、二苯并-18-冠醚-6、二苯并-24-冠醚-8、二环己基-18-冠醚-6等冠醚类；聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇单甲醚等聚氧亚烷基二醇类等。
[0074]
作为相转移催化剂的使用量，相对于氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽(式(3)的氨基酸类(或式(4)的氨基酸类))1质量份而言，通常可以设为0.0001～10质量份，优选设为0.001～5质量份，更优选设为0.01～1质量份。
[0075]
根据本发明的制造方法，用于反应的氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽(式(3)的氨基酸类)的羧基不需要利用保护基进行保护。
[0076]
特别是，在使用氨基未受保护的氨基酸的情况下，所制造的肽(式(1)的肽)存在于疏水性有机溶剂中，未反应的氨基未受保护的氨基酸(式(3)的氨基酸)存在于水层中，因此，在反应结束后，通过分液操作采集有机层，能够容易地分离出目标肽(式(1)的肽)。
[0077]
此外，所得到的肽(式(1)的肽)在c末端的羧基上不存在保护基，因此不需要烦杂的脱保护反应。所得到的肽(式(1)的肽)为碱金属盐或碱土金属盐的情况下，也如上所述，能够通过酸处理容易地形成羧基。因此，在进一步对肽链进行延长时，可以应用本发明的制造方法，对于所得到的肽(式(1)的肽)，根据需要进行酸处理后作为中间体肽，与氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽(式(4)的氨基酸类)缩合。
[0078]
即，若用本发明的制造方法，则可以使氨基受到保护的氨基酸或中间体肽(式(2)的氨基酸类)与氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽(式(3)的氨基酸类)进行反应而制造肽(式(1)的肽)，对于所得到的式(1)的肽，根据需要进行酸处理后作为中间体肽，对反应液进行分液并取出有机层，(无需羧基的脱保护反应，)使用该有机层，使碱性水溶液中的新的氨基未受保护的氨基酸或n末端未受保护的中间体肽(式(4)的氨基酸类)进行(无需羧基的保护反应)反应而制造新的肽(式(5)的肽)，对反应液进行分液，取得存在该肽(式(5)的肽)的有机层。通过重复进行这些操作，可以有效地制造预定的肽。
[0079]
所得到的肽(式(1)的肽(或式(5)的肽))的n末端保护基可以利用已知的方法进行脱保护。
[0080]
实施例
[0081]
以下通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明不受它们任何限定。
[0082]
需要说明的是，在实施例中，所使用的测定设备如下所述。
[0083]
nmr：bruker公司制核磁共振装置，500mhz
[0084]
测定条件：使用氘代溶剂cdcl3，磁场强度：11.7t
[0085]
纯度：lc/ms：waters公司制。uplc部acquity qda检测器，ms部acquity qda检测器
[0086]
使用的柱：株式会社daicel制chiralpak zwix( )，溶剂：甲酸水溶液 二乙胺甲醇溶液。测定温度：25℃。
[0087]
实施例1
[0088]
(1-1)boc-gly-pro-hyp-oh的制造
[0089]
作为起始原料，使n末端为叔丁氧羰基(boc)保护、c末端为无保护的甘氨酸(boc-gly-oh)0.8633g(5mmol)溶解于二氯甲烷20ml中，在0℃添加氯甲酸异丁酯(clcooibu)1.0253g(7.5mmol)和三乙胺0.7592g(7.5mmol)并进行搅拌。在该溶液中添加脯氨酸(pro)0.8642g(7.5mmol)的碳酸氢钠水溶液(ph9.5)15ml，添加溴化十六烷基三甲基铵(ctab)0.20g(10mol％)，在室温(20℃)搅拌15小时。对所得到的反应液进行分液并取出有机层，利用饱和食盐水20ml进行洗涤，进行干燥。
[0090]
在0℃向所得到的有机层中添加氯甲酸异丁酯1.0266g(7.5mmol)和三乙胺0.7632g(7.5mmol)并进行搅拌。在该溶液中添加羟基脯氨酸(hyp)1.0075g(7.5mmol)的碳酸氢钠水溶液(ph9.5)15ml，在室温(20℃)搅拌15小时。在反应液中添加1n盐酸水溶液20ml后，进行分液并取出有机层，对于所得到的有机层，依次利用1n盐酸水溶液20ml、饱和食盐水20ml进行洗涤。将所得到的有机层在减压下进行浓缩，在真空管线中进行干燥，由此得到作为目标的肽(boc-gly-pro-hyp-oh)1.2733g(总收率66％)。
[0091]
将所得到的肽的nmr图示于图1。
[0092]
(1-2)gly-pro-hyp-oh的制造
[0093]
在0℃向在实施例1-1中得到的肽(boc-gly-pro-hyp-oh)添加4n氯化氢的乙酸乙酯溶液50ml后，进行搅拌直至反应体系的温度恢复到室温为止，进一步搅拌4小时。将在反应液中析出的固体过滤并取出，用乙酸乙酯30ml对该固体进行洗涤，得到目标肽(h-gly-pro-hyp-oh盐酸盐)1.0622g(纯度98％)。
[0094]
将所得到的肽的nmr图示于图2。
[0095]
实施例2gly-pro-hyp-oh的制造
[0096]
作为起始原料，使n末端为苄氧基羰基(cbz)保护、c末端为无保护的甘氨酸(cbz-gly-oh)1.0420g(5mmol)溶解于二氯甲烷20ml，在0℃添加氯甲酸异丁酯1.0300g(7.5mmol)和三乙胺0.7599g(7.5mmol)并进行搅拌。在该溶液中添加脯氨酸(pro)0.9001g(7.5mmol)的碳酸氢钠水溶液(ph9.5)15ml，接着添加溴化十六烷基三甲基铵(ctab)0.20g(10mol％)，在室温(20℃)搅拌15小时。在所得到的反应液中添加1n盐酸水溶液20ml后，进行分液并取出有机层，利用饱和食盐水20ml对所得到的有机层进行洗涤，并使之干燥。
[0097]
在0℃向所得到的有机层中添加氯甲酸异丁酯1.0097g(7.5mmol)和三乙胺
0.7625g(7.5mmol)并进行搅拌。在该溶液中添加羟基脯氨酸(hyp)1.01g(7.5mmol)的碳酸氢钠水溶液(ph9.5)15ml，在室温(20℃)搅拌15小时。在反应液中添加1n盐酸水溶液20ml后，进行分液并取出有机层，对于所得到的有机层，依次利用1n盐酸20ml、饱和食盐水20ml进行洗涤。将所得到的有机层在减压下进行浓缩，在真空管线中进行干燥，由此得到保护肽(cbz-gly-pro-hyp-oh)1.2916g(产率62％)。
[0098]
将所得到的保护肽的nmr图示于图3。
[0099]
对于保护肽(cbz-gly-pro-hyp-oh)，直接使用钯碳催化剂(pd/c)50mg、甲醇10ml，在大气压、氢气气氛下进行54小时的脱保护反应，由此得到作为目标的肽(h-gly-pro-hyp-oh)。
[0100]
将所得到的肽的nmr图示于图4。
[0101]
实施例3boc-gly-pro-gly-pro-gly-val-leu-oh的合成
[0102]
作为起始原料，使n末端为叔丁氧羰基(boc)保护、c末端为无保护的甘氨酸(boc-gly-oh；5mmol)溶解于二氯甲烷20ml中，在0℃添加氯甲酸异丁酯(7.5mmol)和三乙胺(7.5mmol)并进行搅拌。在该溶液中添加脯氨酸(pro；7.5mmol)的碳酸氢钠水溶液(ph9.5)15ml，接着添加溴化十六烷基三甲基铵(ctab；10mol％)，在室温(20℃)搅拌15小时。在所得到的反应液中添加1n盐酸水溶液20ml后，进行分液并取出有机层，利用饱和食盐水20ml对所得到的有机层进行洗涤，并使之干燥。
[0103]
在0℃向所得到的有机层中添加氯甲酸异丁酯(7.5mmol)和三乙胺(7.5mmol)并进行搅拌后，添加甘氨酸(gly；7.5mmol)的碳酸氢钠水溶液(ph9.5)15ml，在室温(20℃)搅拌15小时，在所得到的反应液中添加1n盐酸水溶液20ml后，进行分液并取出有机层，利用饱和食盐水20ml对所得到的有机层进行洗涤，并使之干燥而得到有机层。然后，以待引入的氨基酸代替甘氨酸并重复进行该操作，由此可以制造作为目标的肽。在本实施例中，使用脯氨酸代替甘氨酸进行反应，接下来依次使用甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸进行反应，由此制造目标肽(boc-gly-pro-gly-pro-gly-val-leu-oh)。
[0104]
利用lc-ms测定肽的生成，确认到与预想化合物相同的ms的峰。