基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法与流程

技术特征：
1.基于基因多拷贝筛选高表达fad-gdh重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤一：构建重组质粒ppiczαa-gdh，将质粒puc57-gdh和质粒ppiczαa分别进行ecor i和not i双酶切，酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收，得到有相同粘性末端的目的基因gdh和载体；用t4连接酶连接回收产物，连接后的产物转化入大肠杆菌top10感受态，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行酶切、测序，比对分析重组质粒构建成功；步骤二：构建多拷贝重组表达载体，利用ppiczαa含有的两个同尾酶bg lii和bam hi酶切位点，构建基因多拷贝重组质粒；步骤三：不同基因拷贝数阳性转化子的获得及重组蛋白的诱导表达，将构建成功的不同拷贝数重组载体质粒进行bam h i线性化后分别电转表达宿主pichia pastoris x33感受态，构建重组菌株；步骤四：发酵罐放大表达fad-gdh，选择一株单拷贝菌株和一株四拷贝菌株进行发酵罐扩大培养，挑单克隆接种于ypd培养基培养10h，按3％接种量转接于100ml bmgy培养基至od
600
≈6-8接种于发酵罐。2.根据权利要求1所述的基于基因多拷贝筛选高表达fad-gdh重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤一中，fad-gdh基因序列有bgl ii酶切位点，不利于后期同尾酶法构建基因多拷贝菌株，设计引物将1404位点由a突变为g，引物序列为a-g：fatcagaaggtctttcgagtcttaccctttg；a-g：rgaaagaccttctgatgtacttagcaacagca，用q5连接酶进行pcr扩增，程序为：98℃，5min；98℃，30s，退火温度分别设为58℃、60℃、62℃，60s，72℃，延伸10min，20个循环；72℃，延伸20min；16℃，保存；模板采用所述ppiczαa-gdh质粒；pcr结果用dpnⅰ酶消解，热激转化top10感受态，分别涂布于lb zeocin平板上，37℃过夜培养；分别挑取单菌落于lb液体培养基中培养，提取质粒，进行bglii和bam hi双酶切验证，酶切正确的送测序进一步验证，用于基因多拷贝构建的重组质粒ppiczαa-gdh构建成功。3.根据权利要求1所述的基于基因多拷贝筛选高表达fad-gdh重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤二的具体操作如下：质粒ppiczαa-gdh分别进行bglii和bam h i双酶切和bam h i单酶切，然后分别将酶切产物切胶回收，将表达框片段和线性化的重组表达载体片段用t4 dna连接酶连接，将连接产物转化至大肠杆菌感受态top10中，筛选阳性克隆子后进行试剂盒提质粒，即得到fad依赖的葡萄糖脱氢酶两拷贝重组表达载体ppiczαa-2gdh；将两拷贝重组表达载体ppiczαa-2gdh分别进行bg l ii和bam h i双酶切和bam h i单酶切，然后分别将酶切产物切胶回收，将表达框片段和线性化的重组表达载体片段用t4 dna连接酶连接，将连接产物转化至大肠杆菌感受态中，筛选阳性克隆子，即得到4拷贝的重组表达载体ppiczαa-4gdh；两拷贝载体单切线性化与单拷贝的表达框连接得到3拷贝的重组表达载体ppiczαa-3gdh，同理，得到多拷贝重组表达载体。4.根据权利要求1所述的基于基因多拷贝筛选高表达fad-gdh重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤三中，电转条件：2kv，4-5ms，快速加入1ml预冷的ypds液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃培养箱静置培养2-6h，4000rpm离心5min，弃上清，用1ml生理盐水洗3次，然后将菌液涂布在添加博来霉素zeocin的ypd平板上，在30℃下培养72h，从而获得转化子；将重组菌株挑取单菌落接种于5ml添加zeocin的ypcs试管培养基中，14-18h后加1％(v/v)甲醇，之后24h和48h后均各加1％(v/v)甲醇诱导，72h收菌，8000r/min离心5
分钟收集上清，上清液利用dcip的方法测定fad依赖葡萄糖脱氢酶的活力，并以此来筛选高酶活菌株。5.根据权利要求4所述的基于基因多拷贝筛选高表达fad-gdh重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述dcip反应体系包括终浓度50mm乙酸钠缓冲液，ph5.5，300μm dcip和100mm葡萄糖；反应温度30℃。具体如下：(1)、反应体系3.1ml：底物葡萄糖2.9ml、9
×
10-3mol/l dcip100μl、酶液100μl；(2)、检测520nm处吸光值的变化(吸光值下降)；(3)、计算公式：酶活(u/ml)＝
△
a
×
3.1
×
稀释倍数d/6.9
×
0.1
×
3min。6.根据权利要求1所述的基于基因多拷贝筛选高表达fad-gdh重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤四中，具体发酵方法如下：(1)、菌株培养阶段：发酵培养基接种前先加入28％氨水使培养基的ph达到5.0(氨水同时也作为菌株生长的氮源)，再按每升培养基加入4.37ml ptm1，以10％的接量接种种子液；30℃通气搅拌培养18-24h；在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量将由100％逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量将再度升高至50—70％以上；(2)、碳源饲喂阶段：流加50％甘油(包含12ml/l ptm1)，流加量为12ml/h/l，培养4h，此时培养基中的溶氧量为0；(3)、饥饿饲喂阶段：至od
600
≈180，停止流加甘油，当碳源消耗完后溶氧量将再度升高至50—70％以上；(4)、诱导表达阶段：流加甲醇(含12ml/l ptm1)，使甲醇终浓度维持在0.3％，溶氧量始终为0，ph维持在6.0，在诱导过程中每隔24h加维生素c水溶液(终浓度80μg/l)，甲醇诱导72h后一次性外源添加维生素b2(终浓度0.5mm)，每隔12h取样一次检测od
600
，每隔12h测定表达的fad依赖的葡萄糖脱氢酶的活性。

技术总结
本发明提供了一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，包括如下步骤：通过同尾酶法构建了FAD依赖的葡萄糖脱氢酶FAD-GDH的2-4拷贝重组表达载体pPICZαA-2GDH、pPICZαA-3GDH和pPICZαA-4GDH；其中在试管水平，单拷贝平均酶活11.953U/mL，二拷贝平均酶活27.99U/mL，三拷贝平均酶活44.792U/mL，四拷贝平均酶活57.027U/mL；分别比单拷贝提高2.34、3.75、4.78倍；选择单拷贝菌株和四拷贝菌株进行10L罐扩大培养，单拷贝菌株诱导108h酶活达到最高697.125U/mL，四拷贝菌株诱导132h酶活达到最高1063.279U/mL，比单拷贝酶活提高52.52％。本发明表明通过增加目的基因拷贝数策略有助于提高FAD-GDH的表达量。GDH的表达量。


技术研发人员：董聪 王玥 高庆华 罗同阳 刘攀 王庆庆
受保护的技术使用者：河北省微生物研究所有限公司
技术研发日：2022.05.31
技术公布日：2022/8/12