一种nAChR受体α3β2亚型抑制失活型阻断剂、其制备方法及应用

一种nachr受体
α3β
2亚型抑制失活型阻断剂、其制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种nachr受体α3β2亚型抑制失活型阻断剂、其制备方法及应用。


背景技术：

2.乙酰胆碱受体(nachr)是由5个亚基组成的同源或异源跨膜五聚体，能够参与介导学习、感觉、疼痛等等多种神经信号传导。nachr受体包括肌肉型或神经型两大类，广泛分布于中枢、外周神经系统以及肌肉中。神经型nachr受体由12种亚基(α2-α7、α9、α10及β2-β4)组成，而肌肉型nachr由5种亚基(α1、β1、γ、δ、ε)组成。nachr受体是筛选、诊断和治疗一大类重要疾病的关键靶点，这些疾病包括疼痛、烟酒和毒品成瘾、乳腺癌、肺癌以及中枢神经紊乱等。
3.α-芋螺毒素是人们最早发现且研究最多的一大类芋螺毒素。α-芋螺毒素一级结构一般由10-30个氨基酸残基组成，含有四个半胱氨酸(cys i-iv)，其大部分半胱氨酸框架为i型框架，即ccxmcxnc(x代表氨基酸残基，m和n代表数量)，通常以cysi-cysiii，cysii-cysiv的形式形成两对二硫键。根据m和n的不同，又可将α-芋螺毒素分为3/5、3/6、4/2、4/3、4/4、4/5、4/6、4/7、4/8等亚家族。截止2019年，已知的i型框架芋螺毒素共有691个，其中以4/7型最多，3/5型次之。α-芋螺毒素对nachr各种亚型具有较好的抑制作用。因此，α-芋螺毒素是研究nachr各种亚型精细结构和生理药理功能的宝贵分子探针，且还是治疗nachr受体相关疾病的新药来源。
4.nachr受体具有多种亚型，不同nachr受体亚型参与生物体中不同的神经生理和病理过程。因此，在药物以及分子探针的开发中，发现高效、特异性作用于nachr某一亚型的抑制剂具有重要意义。nachr受体α3β2亚型在生物体内分布广泛，从背根神经节、脊髓到自主神经节神经元等均有表达。α-芋螺毒素在阻断其它受体亚型的同时，也会致使α3β2亚型被阻断，从而带来不可预期的副作用。因此，如何改造α-芋螺毒素使其对α3β2亚型的抑制活性降低或丧失，并对其它亚型保持特异的抑制活性，具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明尝试对gic、[a10l]pnia、ltia以及lsia等4/7型α-芋螺毒素的二硫键进行修饰，即在二硫键中插入连接骨架，通过研究发现，1,3位二硫键的修饰产物丧失对所有nachr受体亚型的活性，而多种2,4位二硫键的修饰产物则在丧失对nachr受体α3β2亚型阻断活性的基础上，保持对其它受体亚型的阻断活性。其中，所述nachr受体其它亚型包括但不限于α2β2、α2β4、α3β4、α4β2、α4β4、α6/α3β4、α6/α3β3β2、α7、α9α10、α1β1δε。
[0006]
为此，本发明提供了如下技术方案：
[0007]
α-芋螺毒素2,4位二硫键修饰在制备nachr受体α3β2亚型抑制失活型阻断剂中的应用。
[0008]
上述技术方案中，所述2,4位二硫键修饰为：在2,4位二硫键中插入连接骨架。所述连接骨架包括但不限于间二甲苯基、邻二甲苯基或对二甲苯基，其各自结构如下所示：
[0009][0010]
上述技术方案中，对α-芋螺毒素2,4位二硫键进行修饰所获得的产物，失去了对nachr受体α3β2亚型的抑制活性，从而在特异性阻断其它受体亚型的应用中，不会对nachr受体α3β2亚型产生阻断作用，从而能够减少α-芋螺毒素在应用中所存在的一些不可预期的副作用，这些副作用是由nachr受体α3β2亚型被阻断后所带来的。基于上述分析，本发明提供了一种nachr受体α3β2亚型抑制失活型阻断剂，即上述技术方案中对α-芋螺毒素2,4位二硫键进行修饰后所获得的产物。
[0011]
上述nachr受体α3β2亚型抑制失活型阻断剂的制备方法，步骤如下：
[0012]
在室温条件下，将1,3位二硫键被acm保护基保护的α-芋螺毒素线性肽置于反应溶剂中，通入保护气体，然后将小分子化合物溶液滴加至反应体系中，密封混合反应1h；待反应完成后，调节反应液至酸性，然后用水稀释，将乙腈含量降低至10％以下，至溶液变成浑浊，有白色物质悬浮，未参加反应的小分子化合物在低浓度有机溶液条件下析出，过滤除沉淀，纯化溶液，获得α-芋螺毒素2,4位二硫键被修饰的产物。将反应产物置于强酸条件下，进行碘氧化，脱除acm保护基，1,3位巯基连接形成二硫键，经纯化后获得nachr受体α3β2亚型抑制失活型阻断剂。
[0013]
上述制备方法中，α-芋螺毒素线性肽可采用标准fmoc固相合成技术进行合成。
[0014]
上述制备方法中，反应溶剂选自碳酸氢铵的乙腈水溶液，其中，溶剂具体组成为：5％nh4hco3:60％acn:35％h2o，v:v:v，ph选自8.0～8.2。
[0015]
上述制备方法中，保护气体选自氮气或氩气。
[0016]
上述制备方法中，小分子化合物溶液选自小分子化合物的乙腈溶液。所述小分子化合物选自间二溴苄、邻二溴苄、对二溴苄。在本发明中，小分子化合物为α-芋螺毒素线性肽二硫键中的连接骨架提供来源。
[0017]
上述制备方法中，采用0.1％三氟乙酸水溶液调节反应液至酸性。
[0018]
上述制备方法中，强酸选自三氟乙酸。
[0019]
上述nachr受体α3β2亚型抑制失活型阻断剂在制备特异性阻断非α3β2亚型的nachr受体其它亚型的药物中的应用。
[0020]
在上述应用中，所述其它亚型包括但不限于α2β2、α2β4、α3β4、α4β2、α4β4、α6/α3β4、α6/α3β3β2、α7、α9α10、α1β1δε。
[0021]
本发明的有益效果为：
[0022]
本发明通过对α-芋螺毒素的2,4位二硫键进行修饰，使修饰后的α-芋螺毒素丧失对nachr受体α3β2亚型的阻断活性，但仍保持对其它受体亚型的阻断活性，从而表现为对其
它亚型的选择性增强，提高了α-芋螺毒素本身的特异性，使α-芋螺毒素相对特异性地作用于nachr受体其它亚型，而不受α3β2亚型被抑制后所带来的不可预期的副作用干扰。其可以作为靶向nachr的药理学工具，用于nachr受体在组织细胞上的鉴定以及功能研究。因此，被改造后的芋螺毒素可以作为药物载体，以共价或非共价的方式实现抗肿瘤药物的靶向给药，具有较好的应用前景。此外，在本发明的制备方法下，nachr受体α3β2亚型抑制失活型阻断剂收率高，有利于大规模生产，并促进市场应用和推广。
附图说明
[0023]
图1为α-芋螺毒素[a10l]pnia线性肽改造示意图；
[0024]
图2为非洲爪蟾卵母细胞；
[0025]
图3为nachr受体模型构建及电生理活性检测。
具体实施方式
[0026]
本发明选取4种对nachr受体α3β2亚型具有阻断活性的4/7型α-芋螺毒素进行试验，尝试在这些α-芋螺毒素的二硫键中插入连接骨架，以探究二硫键修饰能否引起α-芋螺毒素对α3β2亚型的抑制失活。4种4/7型α-芋螺毒素，如表1所示：
[0027]
表1
[0028]
α-芋螺毒素序列[a10l]pniagccslppcalnnpdyc#gicgccshpacagnnqhic#ltiagccaraacagihqelc#lsiasgccsnpacrvnnpnic#
[0029]
注明：#代表末端酰胺化。
[0030]
上述4/7型α-芋螺毒素线性肽由上海吉尔生化公司合成，采用的是标准fmoc固相合成技术。为了实现连接子在α-芋螺毒素1,3位或2,4位二硫键的定向插入，在氨基酸序列合成过程中，采用acm保护基(acetamidomethyl乙酰胺亚基)对1,3位或2,4位二硫键进行保护，以使合成的α-芋螺毒素线性肽存在如下两种情形：(1)1,3位二硫键被acm保护基保护起来，2,4位二硫键可参与连接子的修饰；(2)2,4位二硫键被acm保护基保护起来，1,3位二硫键可参与连接子的修饰。
[0031]
氨基酸按顺序连接完毕后，经切割液(tfa/water/phenol/thioanisole/edt；82.5:5:5:5:2.5，v/v/v/v/v)切割树脂1.5～2h后，将溶液抽滤至-20℃冰乙醚中，在4℃条件下8000
×
g高速离心15min，反复用冰乙醚洗涤、沉淀三次，待乙醚挥发后得到目标产物粗肽。首先利用uplc-ms检测其分子量是否与理论相符，然后通过制备型hplc纯化，得到含目标产物的溶液。选取纯度高的线性肽溶液置于-80℃超低温冰箱中冷冻3～4h，然后用冷冻干燥仪冻干得到线性肽粉末，惰性气体环境下密封保存于-80℃冰箱中。
[0032]
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。本发明所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，其中：
[0033]
tfa指的是三氟乙酸。
[0034]
or-2溶液：称量96.4gnacl、3g kcl、4g mgcl2·
6h2o和24g hepes，加入适量超纯水溶解后，定容至1l，调节ph至7.5，获得配制好的20
×
or2溶液；使用超纯水将配置好的20
×
or2溶液稀释20倍，高压灭菌锅灭菌后作为or-2溶液备用。
[0035]
nd96溶液：(1)20
×
nd96溶液(1l)：称量112.2gnacl、3g kcl、4g mgcl2·
6h2o和5.3g cacl2·
2h2o，加入适量超纯水溶解后，定容至1l，高压灭菌锅灭菌后作为储备液备用。(2)100mm hepes溶液(1l)：称取23.8g hepes，加入双蒸水定容至1l，并调节ph至7.5，高压灭菌锅灭菌后作为储备液备用。(3)1
×
nd96溶液(1l)：量取50ml 20
×
nd96和50ml 100mm hepes溶液，倒入nd96缓冲液存放瓶中，超纯水定容至1l，高压灭菌锅灭菌备用。
[0036]
实施例1
[0037]
α-芋螺毒素二硫键改造：
[0038]
以1,3位二硫键被acm保护的α-芋螺毒素[a10l]pnia线性肽为例，展示在2,4位二硫键定向插入对二甲苯基的过程(如图1)，具体改造方法如下：
[0039]
(1)在2,4位二硫键插入连接骨架
[0040]
将1.3mg对二溴苄溶于1ml乙腈中待用。取50ml离心管，通入氮气或氩气，加入含5mgα-芋螺毒素[a10l]pnia线性肽的乙腈(14ml)-水(8.75ml)溶液，再加0.75mlnh4hco3溶液，混合均匀。然后将对二溴苄溶液边混合边滴加至离心管中，密封混合反应1h，混合采用旋转混合器(50rpm)混合。反应后期取样加10倍体积水稀释，超高速离心机离心后取上清，uplc-ms分析，检测原料是否反应完全。待反应完成，加0.1％tfa水溶液，将反应液调节成酸性，然后用水稀释，将乙腈含量降低至10％以下，可以观察到溶液变成浑浊，有白色物质悬浮，未参加反应的对二溴苄在低浓度有机溶液条件下析出，然后采用0.22μm微孔滤膜进行过滤除沉淀，得到含有产物的滤液。取滤液用hplc进行分析，得到分离产物与杂质的洗脱梯度，最后用高效液相色谱仪纯化得到产物溶液，即巯基连接小分子骨架产物溶液，溶液体积10ml，经分析型高效液相色谱仪定量，收率85％。
[0041]
(2)碘氧化脱除1,3位的acm保护基
[0042]
称取20mg的碘，溶于5ml纯乙腈待用。取反应瓶，向其中加入10ml乙腈，加10ml水，加1ml tfa(三氟乙酸)，混合均匀后，通入氮气，然后将碘溶液加入反应瓶中，边搅拌边加入10ml步骤(1)中的产物溶液，加超纯水稀释至多肽浓度为0.1mm、碘浓度为0.4mg/ml，密闭搅拌反应10min，向其中加入饱和维生素c钠水溶液至反应液刚好变为无色，反应终止。加水将乙腈比例降至10％以下，抽滤，取样hplc分析，上制备型hplc纯化，质谱鉴定的目标产物进行hplc纯度分析，取纯度95％以上的产物，合并冻干，得到产物肽，即2,4位二硫键被对二甲苯基修饰的α-芋螺毒素[a10l]pnia线性肽，收率65％。
[0043]
其它类型α-芋螺毒素线性肽的改造，包括gic、ltia、lsia等α-芋螺毒素线性肽，包括对上述线性肽的1,3位或2,4位二硫键进行修饰，包括各种连接骨架的选用——例如连接骨架o、m和p，其改造方法均参考上述1,3位二硫键被acm保护的α-芋螺毒素[a10l]pnia线性肽的改造，并根据反应底物的不同，对反应条件作适应性调整即可，最终均能获得二硫键被连接骨架插入修饰的α-芋螺毒素线性肽。
[0044]
实施例2
[0045]
α3β2亚型抑制失活验证：
[0046]
1、乙酰胆碱受体表达模型的构建
[0047]
本实施例通过在非洲爪蟾卵母细胞上构建各nachr受体亚型的模式细胞，并对上述实施例1制备的各产物肽进行活性测试。
[0048]
取发育良好的非洲爪蟾(xenopus laevis)，埋于碎冰之下1h左右进行低温麻醉处理，在干净环境中剖开其腹腔，取一侧卵母细胞置于事先灭菌好的or-2溶液中。将20mg胰蛋白酶溶于40ml or-2溶液中，将剪切成均匀小块的蛙卵团加至溶液中，放于摇床上均匀摇晃，酶解30min后，每5min取样，显微镜下观察酶解进程，待大部分蛙卵可以无粘连、无粘膜后即终止酶解。用or-2溶液洗净残留的胰蛋白酶后即可进行挑蛙卵工作。在显微镜下挑选形状圆润饱满、大小合适、黑白分明、无血丝的蛙卵(如图2所示)，置于含抗生素的nd96溶液中，在17℃培养箱种培养12～24h，挑出状态良好的蛙卵进行crna注射。
[0049]
本实施例对如下nachr受体亚型进行测试：(rat,r)rα2β4、rα3β2、rα3β4、rα4β2、rα4β4、rα6/α3β4、rα7、rα9α10、rα6/α3β3β2，(human,h)hα7，(mouse,m)mα1β1δε。各nachr受体亚基激动剂均为含bsa和ach的nd96溶液，其中，rα7激动剂为200μmach；rα9α10和mα1β1δε激动剂为10μmach；其余受体激动剂均为100μmach。本实施例中除肌肉型nachr受体各亚基crna配比为α1:β1:δ:ε＝2:1:1:1(ng/μl)外，其余需要搭配不同亚基的受体其crna的配比均为1:1。
[0050]
nachr受体在蛙卵细胞上的模型构建如图3所示：将各nachr受体亚基crna均匀混合，通过显微注射注入到非洲爪蟾卵母细胞中，注射体积在59.6nl以内，保证每个亚基注射量在10ng以上。然后在恒温培养箱中孵育4～5天待用，每天更换新鲜的含抗nd-96培养液(含有青霉素10μg/ml，链霉素10μg/ml，庆大霉素100μg/ml)。
[0051]
2、电生理活性检测流程
[0052]
取100nmol实施例1制备的产物肽加入1mlnd96溶液，配置浓度为10-4
mol/l(m)的溶液待用(配制高浓度的母液一般用不含bsa的nd96溶液)；取10μl 10-4
m母液加至90μl含bsa的nd96溶液中配制浓度为10-5
m的溶液，涡旋混合均匀，依次取每个浓度的溶液配制10-6
～10-10
m的浓度梯度待用。
[0053]
利用双电极电压膜片钳系统检测产物肽对各nachr受体亚型的阻断活性。电生理仪器使用之前，首先对用次氯酸钠溶液在电极表面镀一层银黑(镀20min左右)，然后冲洗灌流体系管路，排除气泡，调整灌流系统流速约为2ml/min，乙酰胆碱道流速稍稍大于含bsa的nd96溶液道。
[0054]
如图3所示，将蛙卵细胞置于蛙卵槽中，调整位置，将两根电极针微微扎进蛙卵细胞中，调整仪器，-70mv钳制电压条件下进行测量，此过程需注意要及时触摸屏蔽网除去手上的静电。本发明采用的α-芋螺毒素为nachr受体拮抗剂，可与乙酰胆碱竞争性阻断nachr受体，经给药孵育后检测电流变化情况，即可判断产物肽对nachr受体的阻断活性。
[0055]
将电磁阀设程序自动控制，运行程序，电磁阀首先打开乙酰胆碱道给予蛙卵2s刺激，而后打开nd96溶液道冲洗58s将ach从蛙卵细胞膜受体上冲掉。该过程由于ach的刺激，受体通道会有短暂的开发随后闭合，即发生钠离子内流，钾离子外流，膜内外形成电压差，经信号放大器检测处理后将其转化为电流的形式输出。每个程序包含三个sweep程序，即连续运行三次。
[0056]
本实施例中对照组数据采用空白nd96溶液，测量完一个sweep后，5分钟后再给予同样的刺激，取三组对照，数值差在
±
10％以内，计算平均值作为空白对照。
[0057]
从蛙卵槽中吸取5μl溶液，然后将5μl待测药物溶液加至50μl蛙卵槽中，孵育5min后，给与同等刺激，记录给药前后电流大小变化百分率，得到该乙酰胆碱受体对于不同浓度的样品的response数据。为了结果的准确性和重现性，需在3-6颗不同批次蛙卵上测量，每个浓度至少重复三次。
[0058]
3、电生理活性结果与分析
[0059]
(1)α-芋螺毒素gic线性肽
[0060]
由表1可知，gic[2,4]-o对于nachr受体rα3β4亚型有良好的阻断活性，其ic
50
为225.1nm，但是丧失对nachr受体rα3β2亚型的活性。并且，gic[2,4]-o在10μm浓度下对于mα1β1δε、rα4β2、rα4β4、rα6/α3β4、rα9α10等nachr受体亚型均无明显阻断活性，从而最终保持了对rα3β4的特异阻断活性。
[0061]
表1
[0062][0063]
注明：gic[1,3]-p指的是α-芋螺毒素gic线性肽的1,3位二硫键中插入对二苯基；其它产物肽与之等似理解。
[0064]
(2)α-芋螺毒素[a10l]pnia线性肽
[0065]
由表2可知，[a10l]pnia[2,4]-o丧失对于nachr受体rα3β2亚型的活性，但是保留了对于rα7的阻断活性。同时[a10l]pnia[2,4]-o在10μm浓度下对于mα1β1δε、rα2β4、rα3β4、rα4β2、rα4β4、rα6/α3β4均无明显阻断活性，从而最终保持了对rα7的特异阻断活性。
[0066]
表2
[0067][0068]
注明：[a10l]pnia[1,3]-p指的是α-芋螺毒素[a10l]pnia线性肽的1,3位二硫键中插入对二苯基；其它产物肽与之等似理解。
[0069]
(3)α-芋螺毒素ltia线性肽
[0070]
由表3可知，ltia[2,4]-o丧失了对于rα3β2的活性，但在10μm对rα6/α3β3β2有65％阻断，其ic
50
数值未检测。
[0071]
表3
[0072]
[0073]
注明：ltia[1,3]-o指的是α-芋螺毒素ltia线性肽的1,3位二硫键中插入邻二苯基；其它产物肽与之等似理解。“*”表示10μm有65％阻断。
[0074]
(4)α-芋螺毒素lsia线性肽
[0075]
由表4可知，在lsia的2,4位插入连接骨架，并不显然导致其对rα3β2受体亚型的活性丧失。因此，lsia不能被用来开发nachr受体rα3β2亚型抑制失活型阻断剂。
[0076]
表4
[0077][0078]
注明：lsia[1,3]-o指的是α-芋螺毒素lsia线性肽的1,3位二硫键中插入邻二苯基；其它产物肽与之等似理解。
[0079]
综上所述，α-芋螺毒素1,3位二硫键的插入改造会致使其对所有nachr受体亚型的抑制失活，从而失去改造意义。而对2,4位二硫键的插入改造，则能够使多种α-芋螺毒素丧失对nachr受体α3β2亚型的活性，从而提高其对其它亚型的选择性和特异性，对于nachr受体α3β2亚型抑制失活型阻断剂的开发具有重要意义。
[0080]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。