用于同时调节基因表达的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年12月23日提交的欧洲专利申请号ep19219276.3和2020年6月23日提交的美国临时申请号63/042,890的权益，其各自通过引用整体并入本文。
3.序列表
4.本技术包含序列表，该序列表已以ascii格式电子提交，并通过引用整体并入本文。所述ascii副本创建于2020年12月18日，命名为57623_701_601_sl.txt，大小为326、570字节。
背景技术：
5.相较于无疾病或病症的人类个体中的蛋白质表达水平，许多人类疾病和病症由某些蛋白质的组合升高和/或降低的表达水平引起。增加一种靶蛋白的表达和/或分泌并降低另一种不同靶蛋白的表达的组合疗法可具有治疗效果。例如，需要针对冠状病毒感染，例如covid-19(由冠状病毒sars-cov-2感染引起的疾病)的疗法，所述疗法能够有效且特异性地减少一种或多种靶基因产物的产生并同时增加其他靶基因产物的产生。
技术实现要素：
6.本发明涉及使用一个重组多核酸或rna构建体同时调节两个或更多个蛋白质或核酸序列的表达。在一些实施方案中，本发明的重组多核酸或rna构建体通过提供编码能够结合特定靶标的单个或多个小干扰rna(sirna)的核酸序列和编码用于过表达的单个或多个蛋白质的核酸序列，而同时上调和下调两个或更多个蛋白质或核酸序列的表达。在一些实施方案中，本发明可用于治疗其中特定生理机制(例如，分解代谢)可受sirna控制而另一生理机制(例如，合成代谢)可以通过治疗蛋白的过表达而平行活化的疾病和病症。
7.本发明还提供了包含多核酸或rna的重组多核酸或rna构建体，其中所述多核酸或rna编码或包含：一个或多个小干扰rna(sirna)，所述sirna能够结合一个或多个冠状病毒靶rna和/或一个或多个编码宿主蛋白的rna，所述宿主蛋白例如病毒进入元件或促炎性细胞因子；以及编码用于过表达的一个或多个蛋白质的核酸序列，所述蛋白质例如宿主抗炎性细胞因子或诱饵蛋白，例如可溶性血管紧张素转换酶-2(ace2)。在一些实施方案中，冠状病毒靶rna是编码一个或多个冠状病毒蛋白的mrna，或是非编码rna。因此，本发明提供其中单个多核苷酸分子同时抑制病毒且调节宿主炎性反应的实施方案。
8.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中所述构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合靶rna(例如，mrna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码目的基因的核酸序列；其中该靶rna不同于由目的基因编码的mrna。在一些实施方案中，靶rna是mrna。
9.在一些实施方案中，以5'至3'方向包含(i)和(ii)。在一些实施方案中，不以5'至3'方向包含(i)和(ii)。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码或包含接头的核酸序列。在一些实施方案中，编码或包含接头的核酸序列连接(i)和(ii)。在一些实施方案
中，接头包含trna接头。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为至少6个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为多达80个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约80个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约15个核酸残基。
10.在一些实施方案中，重组多核酸构建体是环状的。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是线性的。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是dna。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是rna。
11.在一些实施方案中，重组多聚核酸构建体还包含编码或包含poly(a)尾的核酸序列。在一些实施方案中，poly(a)尾包含1-220个碱基对的poly(a)(seq id no:191)。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含5'帽。在一些实施方案中，5'帽包含抗反向帽类似物、clean cap、cap 0、cap 1、cap 2或锁核酸帽(lna-帽)。在一些实施方案中，5'帽包含m
27,3'-o
g(5')ppp(5')g、m7g、m7g(5’)g、m7gpppg或m7gpppgm。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含启动子。在一些实施方案中，启动子选自由t3、t7、sp6、p60、syn5和kp34组成的组。在一些实施方案中，启动子是t7启动子。在一些实施方案中，t7启动子位于所述至少一个编码或包含sirna的核酸序列的上游。在一些实施方案中，t7启动子包含含有taatacgactcactata(seq id no:25)的序列。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含kozak序列。
12.在一些实施方案中，sirna包含1-10个拷贝的sirna。在一些实施方案中，sirna包含有义sirna链。在一些实施方案中，sirna包含反义sirna链。在一些实施方案中，sirna包含有义和反义sirna链。在一些实施方案中，sirna不影响目的基因的表达。在一些实施方案中，sirna不抑制目的基因的表达。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含两个或更多个编码或包含sirna的核酸序列，其中所述sirna能够结合靶mrna。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码或包含接头的核酸序列。在一些实施方案中，编码或包含接头的核酸序列连接所述两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列中的每一个。在一些实施方案中，接头包含trna接头。在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna。在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列各自编码或包含能够结合不同靶mrna的sirna。在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列中的至少两个核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶mrna或不同靶mrna的sirna。
13.在一些实施方案中，靶rna是mrna。在一些实施方案中，靶mrna编码选自由以下组成的组的蛋白质：肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素、血管紧张素转换酶-2(ace2)、sars cov-2 orf1ab、sars cov-2 s和sars cov-2 n。在一些实施方案中，靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素、血管紧张素转换酶-2(ace2)、sars cov-2 orf1ab、sars cov-2 s、sars cov-2 n、超氧化物歧化酶-1(sod1)和激活素受体样激酶-2(alk2)。
14.在一些实施方案中，靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：白细胞介素8(il-8)、白细胞介素1β(il-β)、白细胞介素17(il-17)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6r(il-6r)、白细胞介素6r-α(il-6r-α)、白细胞介素6r-β(il-6r-β)、血管紧张素转换酶2(ace2)、sars cov-2 orf1ab、sars cov-2 s和sars cov-2 n。在一些实施方案中，靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：白细胞介素8(il-8)、白
细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素17(il-17)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6r(il-6r)、白细胞介素6r-α(il-6r-α)、白细胞介素6r-β(il-6r-β)、血管紧张素转换酶-2(ace2)、sars cov-2 orf1ab、sars cov-2 s、sars cov-2 n、超氧化物歧化酶-1(sod1)和激活素受体样激酶-2(alk2)。
15.在一些实施方案中，靶mrna编码选自由以下组成的组的蛋白质：白细胞介素8(il-8)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素17(il-17)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)。
16.在一些实施方案中，靶rna是冠状病毒靶rna或冠状病毒宿主细胞靶rna。在一些实施方案中，冠状病毒靶rna是编码冠状病毒蛋白的mrna。在一些实施方案中，冠状病毒靶rna是冠状病毒非编码rna。在一些实施方案中，冠状病毒蛋白是刺突蛋白(s)、核衣壳蛋白(n)、非结构蛋白(nsp)或orf1ab(多蛋白pplab)蛋白，例如sars cov-2 nsp1蛋白。在一些实施方案中，冠状病毒靶rna是sars cov-2 nsp12和13编码rna。在一些实施方案中，冠状病毒宿主细胞靶是宿主细胞蛋白。在一些实施方案中，宿主细胞是人细胞。在一些实施方案中，宿主细胞蛋白是ace2、il-6、il-6r-α或il-6r-β。
17.在一些实施方案中，靶rna的表达由能够结合靶rna的sirna调节。在一些实施方案中，靶rna的表达由能够结合靶rna的sirna下调。在一些实施方案中，靶rna的表达由能够结合靶mrna的sirna调节。在一些实施方案中，靶rna的表达由能够结合靶rna的sirna下调。在一些实施方案中，靶rna的表达由能够特异性结合靶rna的sirna调节。在一些实施方案中，靶rna的表达由能够特异性结合靶rna的sirna下调。
18.在一些实施方案中，重组核酸构建体包含两个或更多个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列各自编码相同目的基因。在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列各自编码不同目的基因。在一些实施方案中，两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自包含编码分泌蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自包含编码细胞内蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自包含编码细胞器内蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自包含编码膜蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码或包含接头的核酸序列。在一些实施方案中，编码或包含接头的核酸序列连接两个或更多个编码目的基因的核酸序列中的每一个。在一些实施方案中，接头包含2a肽接头或trna接头。在一些实施方案中，目的基因选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)、白细胞介素4(il-4)、干扰素β(ifnβ)、干扰素α(ifnα)、ace2可溶性受体、白细胞介素37(il-37)和白细胞介素38(il-38)。在一些实施方案中，目的基因选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)、白细胞介素4(il-4)、干扰素β(ifnβ)和ace2可溶性受体。在一些实施方案中，目的基因选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)、白细胞介素4(il-4)、干扰素β(ifnβ)、ace2可溶性受体和促红细胞生成素(epo)。在一些实施方案中，目的基因选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)和白细胞介素4。
19.在一些实施方案中，目的基因编码冠状病毒宿主蛋白。在一些实施方案中，由目的基因编码的宿主蛋白选自：ifn-α，例如干扰素α-n3、干扰素α-2a或干扰素α-2b、ifn-β、ifn-δ、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ν、ifn-τ、ifn-ω、ifn-γ、ifn-λ、il-37、il-38和可溶性ace2受体。
20.在一些实施方案中，目的基因的表达通过表达由目的基因编码的mrna或蛋白质来
调节。在一些实施方案中，目的基因的表达通过表达由目的基因编码的mrna或蛋白质而上调。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是密码子优化的。在一些实施方案中，重组多核酸构建体不是密码子优化的。
21.在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码靶基序的核酸序列。在一些实施方案中，编码靶基序的核酸序列有效地连接到至少一个编码目的基因的核酸序列上。在一些实施方案中，靶基序包含信号肽，核定位信号(nls)、核仁定位信号(nols)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管端定位信号(microtubule tip localization signal,mtls)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(er)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号或中心体定位信号(cls)。在一些实施方案中，靶基序选自由以下组成的组：(a)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；和(d)不具有天然靶基序功能的天然存在的氨基酸序列，其中该天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。在一些实施方案中，信号肽选自由以下组成的组：(a)与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该信号肽通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰，条件是该蛋白质不是氧化还原酶；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该信号肽通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；(d)不具有天然信号肽功能的天然存在的氨基酸序列，其中该天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。在一些实施方案中，信号肽n端的氨基酸1-9的平均疏水性评分在2以上。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是适用于基因疗法的载体。在一些方面，至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)以顺序方式包含在所述构建体中。在一些方面，至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)以顺序方式存在。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的下游。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游或下游。在一些方面，所述能够结合靶rna的sirna结合靶mrna的外显子。在一些方面，所述能够结合靶rna的sirna特异性结合一个靶rna。在一些方面，所述能够结合靶rna的sirna不由目的基因的内含子序列编码或由其组成。在一些方面，目的基因在没有rna剪接的情况下表达。
22.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，该rna构建体包含：(i)能够结合靶rna(例如，mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码目的基因的mrna；其中该靶rna不同于编码目的基因的mrna。在一些实施方案中，靶rna是mrna。
23.在一些实施方案中，以5'至3'方向包含(i)和(ii)。在一些实施方案中，不以5'至3'方向包含(i)和(ii)。在一些实施方案中，重组rna构建体还编码或包含接头。在一些实施
方案中，编码或包含接头的核酸序列连接(i)和(ii)。在一些实施方案中，接头包含trna接头。
24.在一些实施方案中，重组rna构建体还包含poly(a)尾。在一些实施方案中，poly(a)尾包含1-220个碱基对的poly(a)(seq id no:191)。在一些实施方案中，重组rna构建体还包含5'帽。在一些实施方案中，5'帽包含抗反向帽类似物、clean cap、cap 0、cap 1、cap 2或锁核酸帽(lna-帽)。在一些实施方案中，5'帽包含m
27,3'-o
g(5')ppp(5')g、m7g、m7g(5’)g、m7gpppg或m7gpppgm。在一些实施方案中，重组rna构建体还包含kozak序列。
25.在一些实施方案中，sirna包含1-10个拷贝的sirna。在一些实施方案中，sirna包含有义sirna链。在一些实施方案中，sirna包含反义sirna链。在一些实施方案中，sirna包含有义和反义sirna链。在一些实施方案中，sirna不影响目的基因的表达。在一些实施方案中，sirna不抑制目的基因的表达。在一些实施方案中，重组rna构建体包含两个或更多个核酸序列，所述核酸序列包含能够结合靶mrna的sirna。在一些实施方案中，重组rna构建体还包含接头。在一些实施方案中，接头连接两个或更多个包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列中的每一个。在一些实施方案中，接头包含trna接头。在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列各自包含能够结合相同靶mrna的sirna。在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列各自包含能够结合不同靶mrna的sirna。在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列中的至少两个编码或包含能够结合相同或不同靶mrna的sirna。
26.在一些实施方案中，靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素、血管紧张素转换酶-2(ace2)、sars cov-2 orf1ab、sars cov-2 s、sars cov-2 n。在一些实施方案中，靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素、血管紧张素转换酶-2(ace2)、sars cov-2orf1ab、sars cov-2 s、sars cov-2 n、超氧化物歧化酶-1(sod1)和激活素受体样激酶-2(alk2)。
27.在一些实施方案中，靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：白细胞介素8(il-8)、白细胞介素1β(il-β)、白细胞介素17(il-17)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6r(il-6r)、白细胞介素6r-α(il-6r-α)、白细胞介素6r-β(il-6r-β)、血管紧张素转换酶2(ace2)、sars cov-2 orf1ab、sars cov-2 s和sars cov-2 n。在一些实施方案中，靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：白细胞介素8(il-8)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素17(il-17)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6r(il-6r)、白细胞介素6r-α(il-6r-α)、白细胞介素6r-β(il-6r-β)、血管紧张素转换酶-2(ace2)、sars cov-2 orf1ab、sars cov-2 s、sars cov-2 n、超氧化物歧化酶-1(sod1)和激活素受体样激酶-2(alk2)。
28.在一些实施方案中，靶mrna选自由以下组成的组：白细胞介素8(il-8)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素17(il-17)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)。
29.在一些实施方案中，靶rna是冠状病毒靶rna或冠状病毒宿主细胞靶rna。在一些实施方案中，冠状病毒靶rna是编码冠状病毒蛋白的mrna。在一些实施方案中，冠状病毒靶rna是冠状病毒非编码rna。在一些实施方案中，冠状病毒蛋白是刺突蛋白(s)、核衣壳蛋白(n)、非结构蛋白(nsp)或orf1ab(多蛋白pplab)蛋白，例如sars cov-2 nsp1蛋白。在一些实施方案中，冠状病毒靶rna是sars cov-2 nsp12和13编码rna。在一些实施方案中，冠状病毒宿主细胞靶是宿主细胞蛋白。在一些实施方案中，宿主细胞是人细胞。在一些实施方案中，宿主
细胞蛋白是ace2、il-6、il-6r-α或il-6r-β。
30.在一些实施方案中，靶mrna的表达由能够结合靶mrna的sirna调节。在一些实施方案中，靶mrna的表达由能够结合靶mrna的sirna下调。
31.在一些实施方案中，重组rna构建体包含两个或更多个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列各自编码相同目的基因。在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列各自编码不同目的基因。在一些实施方案中，两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自包含编码分泌蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自包含编码细胞内蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自包含编码细胞器内蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自包含编码膜蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，重组rna构建体还包含接头或编码接头的核酸序列。在一些实施方案中，编码或包含接头的核酸序列连接两个或更多个编码目的基因的核酸序列中的每一个。在一些实施方案中，接头包含2a肽接头、trna接头或柔性接头。在一些实施方案中，目的基因选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)、白细胞介素4(il-4)、干扰素β(ifnβ)、干扰素α(ifnα)、ace2可溶性受体、白细胞介素37(il-37)和白细胞介素38(il-38)。在一些实施方案中，目的基因选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)、白细胞介素4(il-4)、干扰素β(ifnβ)和ace2可溶性受体。在一些实施方案中，目的基因选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)、白细胞介素4(il-4)、干扰素β(ifnβ)、ace2可溶性受体和促红细胞生成素(epo)。在一些实施方案中，目的基因选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)和白细胞介素4。
32.在一些实施方案中，目的基因编码冠状病毒宿主蛋白。在一些实施方案中，宿主蛋白选自：ifn-α，例如干扰素α-n3、干扰素α-2a或干扰素α-2b、ifn-β、ifn-δ、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ν、ifn-τ、ifn-ω、ifn-γ、ifn-λ、il-37、il-38和可溶性ace2受体。
33.在一些实施方案中，目的基因的表达通过表达由目的基因编码的mrna或蛋白质来调节。在一些实施方案中，目的基因的表达通过表达由目的基因编码的mrna或蛋白质而上调。在一些实施方案中，重组rna构建体是密码子优化的。在一些实施方案中，重组rna构建体不是密码子优化的。
34.在一些实施方案中，重组rna构建体还包含编码靶基序的核酸序列。在一些实施方案中，编码靶基序的核酸序列有效地连接到至少一个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，靶基序包含信号肽，核定位信号(nls)、核仁定位信号(nols)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管端定位信号(mtls)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(er)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号或中心体定位信号(cls)。在一些实施方案中，靶基序选自由以下组成的组：(a)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；和(d)不具有天然靶基序功能的天然存在的氨基酸序列，其中该天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。
35.在一些实施方案中，信号肽选自由以下组成的组：(a)与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该信号肽通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰，条件是该蛋白质不是氧化还原酶；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该信号肽通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；(d)不具有天然信号肽功能的天然存在的氨基酸序列，其中该天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。在一些实施方案中，信号肽n端的氨基酸1-9的平均疏水性评分在2以上。
36.在一些方面，本文提供细胞，其包含本文所述的任何重组多核酸或rna构建体的组合物。在一些方面，本文提供药物组合物，其包含本文所述的任何重组多核酸或rna构建体的组合物和药学上可接受的赋形剂。在一些方面，本文提供治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，其包括向受试者施用本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，该疾病或病况选自由以下组成的组：椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎和银屑病。在一些实施方案中，该疾病或病况选自由以下组成的组：椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎、银屑病、进行性骨化性纤维发育不良(fop)和肌肉萎缩性侧索硬化(als)。在一些实施方案中，该疾病或病况选自由以下组成的组：椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎、银屑病、进行性骨化性纤维发育不良(fop)、肌肉萎缩性侧索硬化(als)和冠状病毒感染，或由冠状病毒感染引起或与冠状病毒感染有关的疾病或病况。在一些实施方案中，受试者是人。
37.在一些方面，本文提供了治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，其包括向受试者施用本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，受试者中的疾病或病况是冠状病毒感染，或由冠状病毒感染引起或与冠状病毒感染有关的疾病或病况。在一些实施方案中，冠状病毒是sars-cov、mers-cov或sars-cov-2。在一些实施方案中，疾病或病况是sars、mers或covid-19。
38.在一些方面，本文提供了在细胞中自单个rna转录本同时表达sirna和mrna的方法，其包括将本文所述的任何重组多核酸或rna构建体的组合物引入细胞。在一些方面，本文提供了同时调节细胞中两个或更多个基因表达的方法，其包括将重组多核酸构建体引入细胞，其中所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码目的基因的核酸序列；其中该靶mrna不同于目的基因编码的mrna，且其中该靶mrna和该目的基因的表达同时被调节。
39.在一些方面，本文提供了同时上调和下调两个或更多个基因在细胞中的表达的方法，其包括将重组多核酸构建体引入细胞，其中该构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码目的基因的核酸序列；其中该靶mrna不同于目的基因编码的mrna，并且其中同时下调该靶mrna的表达并且上调该目的基因的表达。在一些实施方案中，靶mrna的表达通过能够结合靶mrna的sirna下调。在一些实施方案中，目的基因的表达通过表达目的基因编码的mrna或蛋白质而上调。
40.在一些方面，本文提供了产生rna构建体的方法，该构建体包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)和编码目的基因的mrna，其中该靶mrna不同于编码该目的基因的mrna，该方法包括：(a)提供以下以用于体外转录反应：(i)多核酸构建体，其包含启
动子、至少一个编码能够结合靶mrna的sirna的核酸序列、至少一个编码目的基因的核酸序列和编码poly(a)尾的核酸序列；(ii)rna聚合酶；和(iii)三磷酸核苷酸(ntp)的混合物；和(b)从体外转录反应混合物中分离并纯化转录的rna，因此产生rna构建体。在一些实施方案中，rna聚合酶选自由以下组成的组：t3 rna聚合酶、t7 rna聚合酶、sp6rna聚合酶、p60 rna聚合酶、syn5 rna聚合酶和kp34 rna聚合酶。在一些实施方案中，rna聚合酶是t7 rna聚合酶。在一些实施方案中，ntp混合物包含未修饰的ntp。在一些实施方案中，ntp混合物包含修饰的ntp。在一些实施方案中，修饰的ntp包含n
1-甲基假尿苷，假尿苷，n
1-乙基假尿苷，n
1-甲氧基甲基假尿苷，n
1-丙基假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、5-羧甲基酯尿苷、5-甲酰基尿苷、5-羧基尿苷、5-羟基尿苷、5-溴尿苷、5-碘尿苷、5,6-二氢尿苷、6-氮杂尿苷、噻吩并尿苷、3-甲基尿苷、1-羧甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-甲基胞苷、5-甲氧基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、5-羟基胞苷、5-碘胞苷、5-溴胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、n
4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、n
4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、n
1-甲基腺苷、n
6-甲基腺苷、n
6-甲基-2-氨基腺苷、n
6-异戊烯基腺苷、n6,n
6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。
41.在一些实施方案中，步骤(a)还包括提供加帽酶。在一些实施方案中，分离和纯化转录的rna包括柱纯化。
42.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合白细胞介素8(il-8)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码胰岛素样生长因子1(igf-1)的mrna。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。
43.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合白细胞介素1β(il-1β)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码胰岛素样生长因子1(igf-1)的mrna。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。
44.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合白细胞介素17(il-17)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码白细胞介素4(il-4)的mrna。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。
45.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合肿瘤坏死因子α(tnf-α)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码白细胞介素4(il-4)的mrna。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。
46.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合肿瘤坏死因子α(tnf-α)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)和能够结合白细胞介素17(il-17)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码白细胞介素4(il-4)的mrna。在相关方面，组合物包含或编码至少2、3、4、5或6个sirna。
47.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体包含选自由seq id no:1-8组成的组的核酸序列。
48.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合il-6mrna的sirna；和(ii)编码干扰素β(ifn-β)的
mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码针对il-6mrna的1个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对il-6mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:29或seq id no:30(化合物b1或b2)中所示的序列。
49.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6r(il-6r)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码针对il-6r mrna的1个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对il-6r mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:31(化合物b3)所示的序列。
50.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6rα(il-6r-α)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码针对il-6r-αmrna的1个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对il-6r-αmrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:32(化合物b4)所示的序列。
51.在一些方面，本文提供了包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6rβ(il-6r-β)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码针对il-6r-βmrna的1个sirna。在相关方面，该组合物包含或编码3个sirna，各自针对il-6r-βmrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:33(化合物b5)中所示的序列。
52.一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合ace2 mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码针对ace2 mrna的一个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对ace2 mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:34或35(化合物b6或b7)所示的序列。
53.在一些方面，本文提供了包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orf1ab mrna的sirna，至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna，至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，一个针对sars cov-2 orflab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，以及一个针
对sars cov-2 n mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在某些方面，考虑此类组合物，例如包含化合物b8(seq id no:36)的组合物用于本文所述的方法中，例如用于调节或调控与sars cov感染、sars cov-2感染或两者相关的基因表达。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:36所示的序列。
54.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码针对sars cov-2 s mrna的1个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:37或39(化合物b9或b11)所示的序列。
55.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码针对sars cov-2 n mrna的1个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:38(化合物b10)所示的序列。
56.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orflab mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码针对sars cov-2 orflab mrna的1个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对sars cov-2 orflab mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在某些方面，考虑此类组合物，包括包含化合物b12(seq id no:40)的组合物用于本文所述的方法，例如，用于调节或调控与sars cov感染、mers-cov感染或两者相关的基因表达。在某些方面，考虑此类组合物，包括包含化合物b13(seq id no:41)的组合物用于本文所述的方法，例如，用于调节或调控与sars cov感染、sars cov-2感染、和/或mers-cov感染相关的基因表达。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:40、41和42(化合物b12、b13和b14)中任一项所示的序列。
57.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合il-6mrna的sirna，至少一个能够结合ace2 mrna的sirna，以及至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，一个针对il-6mrna，一个针对ace2 mrna，一个针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，编码ifn-β的mrna编码天然ifn-β信号肽或修饰的信号肽。在相关方面，修饰的ifn-β信号肽是如本文所述的sp1或sp2(分别为seq id no:52和54)。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:43、44和45(化合物b15、b16和b17)中任一项所示的序列。
58.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建
体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orflab mrna的小干扰rna，至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna，以及至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，一个针对orflab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，以及一个针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:46(化合物b18)所示的序列。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:190(化合物b18)所示的序列。
59.在一些方面，本文提供了包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2s mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码针对sars cov-2 s mrna的1个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含seq id no:47(化合物b19)所示的序列。
60.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合il-6mrna的sirna；和(ii)编码干扰素-β(ifn-β)的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，重组rna构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含针对il-6mrna的1个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，各自针对il-6mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:29或30所示的序列编码的序列。
61.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6r(il-6r)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，重组rna构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含针对il-6r mrna的1个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，各自针对il-6r mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:31所示的序列编码的序列。
62.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6rα(il-6r-α)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，重组rna构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含针对il-6r-αmrna的1个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，各自针对il-6r-αmrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:32所示的序列编码的序列。
63.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6rβ(il-6r-β)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码ace2可溶性受体。在相关方面，重组rna构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含针对il-6r-βmrna的1个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，各自针对il-6r-βmrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相
同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:33所示的序列编码的序列。
64.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合ace2 mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，重组rna构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含针对ace2 mrna的1个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，各自针对ace2 mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:34或35所示的序列编码的序列。
65.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orflab mrna的sirna，至少一个能够结合sars cov-2s mrna结合的sirna，至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，重组rna构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，一个针对sars cov-2 orflab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，一个针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在某些方面，考虑此类组合物，例如包含化合物b8(seq id no:36)的组合物用于本文所述的方法中，例如用于调节或调控与sars cov感染、sars cov-2感染或两者有关的基因表达。在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:36所示的序列编码的序列。
66.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，重组rna构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含针对sars cov-2 s mrna的1个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:37或39所示的序列编码的序列。
67.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，重组rna构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含针对sars cov-2 n mrna的1个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，各自针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:38所示的序列编码的序列。
68.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orflab mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，重组rna构建体包含针对sars cov-2 orflab mrna的1个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，各自针对sars cov-2 orflab mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。在某些方面，考虑此类组合物，例如包含化合物b12(seq id no:40)的组合物，用
于本文所述的方法，例如用于调节或调控与sars cov感染、mers感染或两者相关的基因表达。在某些方面，考虑此类组合物，例如包含化合物b13(seq id no:41)的组合物，用于本文所述的方法，例如用于调节或调控与sars cov感染、sars cov-2感染和/或mers感染相关的基因表达。在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:40、41和42中任一项所示的序列编码的序列。
69.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合il-6mrna的sirna，至少一个能够结合ace2 mrna的sirna，和至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，重组rna构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，一个针对il-6mrna，一个针对ace2 mrna，一个针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，编码ifn-β的mrna编码天然ifn-β信号肽或修饰的信号肽。在相关方面，修饰的ifn-β信号肽是如本文所述的sp1或sp2(分别为seq id no:52和54)。在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:43、44和45中任一项所示的序列编码的序列。
70.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orflab mrna的小干扰rna，至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna，以及至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，重组rna构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，一个针对orflab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，以及一个针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:46所示的序列编码的序列。
71.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，重组rna构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含针对sars cov-2 s mrna的1个sirna。在相关方面，重组rna构建体包含3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述至少3个sirna彼此相同、彼此不同，或是前述的组合。
72.在相关方面，重组rna构建体包含由seq id no:47所示的序列编码的序列。
73.在一些方面，本发明提供一种组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含由选自seq id no:29-47的序列编码的核酸序列。
74.在一些实施方案中，本发明的多核酸构建体包含：(i)sirna，其靶向选自以下的rna：il-8mrna、il-1βmrna、il-17mrna、tnf-αmrna、sars cov-2 orf1ab rna(多蛋白pp1ab，例如在非编码区域中或在编码选自以下的蛋白质的位置：sars cov-2非结构蛋白(nsp)、nsp1、nsp3(nsp3b、nsp3c、plpro和nsp3e)、nsp7_nsp8复合物、nsp9-nsp10和nsp14-nsp16、3clpro、e-通道(e蛋白)、orf7a、c端rna结合结构域(crbd)、n端rna结合结构域(nrbd)、解螺旋酶和rdrp)、sars cov-2刺突蛋白(s)mrna、sars cov-2核衣壳蛋白(n)mrna、肿瘤坏死因子α(tnf-α)mrna、白细胞介素mrna(包括但不限于白细胞介素1(例如il-1α、il-1β)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6r(il-6r)、白细胞介素6rα(il-6r-α)、白细胞介素6rβ(il-6r-β)、白细胞介素18(il-18)、白细胞介素36-α(il-36-α)、白细胞介素36-β(il-36-β)、白细胞介素36-γ(il-36-γ)、白细胞介素33(il-33))、血管紧张素转换酶-2(ace2)mrna、跨膜蛋
白酶、丝氨酸2(tmprss2)mrna和编码nsp12和13rna；和(ii)至少一个编码待过表达的蛋白质的目的基因或至少一个编码待过表达的蛋白质的mrna，其中该蛋白质选自：igf-1、il-4、igf-1(包括如本文其他地方所述的其衍生物)、羧肽酶(例如ace、ace2、cndp1、cpa1、cpa2、cpa4、cpa5、cpa6、cpb1、cpb2、cpe、cpn1、cpq、cpxm1、cpz、scpep1)；细胞因子(例如bmp1、bmp10、bmp15、bmp2、bmp3、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8a、bmp8b、c1qtnf4、ccl1、ccl11、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、ccl3、ccl3l1、ccl3l3、ccl4、ccl4l、ccl4l2、ccl5、ccl7、ccl8、cd40lg、cer1、cklf、clcf1、cntf、csf1、csf2、csf3、ctf1、cx3cl1、cxcl1、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl17、cxcl2、cxcl3、cxcl5、cxcl8、cxcl9、dkk1、dkk2、dkk3、dkk4、eda、ebi3、fam3b、fam3c、faslg、flt3lg、gdf1、gdf10、gdf11、gdf15、gdf2、gdf3、gdf5、gdf6、gdf7、gdf9、gpi、grem1、grem2、grn、ifna1、ifna13、ifna10、ifna14、ifna16、ifna17、ifna2、ifna21、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifnb1、ifne、ifng、ifnk、ifnl1、ifnl2、ifnl3、ifnl4、ifnw1、il10、il11、il12a、il12b、il13、il15、il16、il17a、il17b、il17c、il17d、il17f、il18、il19、il1a、il1b、il1f10、il2、il20、il21、il22、il23a、il24、il25、il26、il27、il3、il31、il32、il33、il34、il36a、il36b、il36g、il36rn、il37、il4、il5、il6、il7、il9、lefty1、lefty2、lif、lta、mif、mstn、nampt、nodal、osm、pf4、pf4v1、scgb3a1、sectm1、slurp1、spp1、thnsl2、thpo、tnf、tnfsf10、tnfsf11、tnfsf12、tnfsf13、tnfsf13b、tnfsf14、tnfsf15、tslp、vstm1、wnt1、wnt10a、wnt10b、wnt11、wnt16、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、xcl1和xcl2)；细胞外配体及转运蛋白(例如apcs、chi3l1、chi3l2、clec3b、dmbt1、dmkn、eddm3a、eddm3b、efna4、emc10、enam、epyc、ervh48-1、f13b、fcn1、fcn2、gldn、gpld1、heg1、itfg1、kazald1、kcp、lacrt、leg1、metrn、notch2nl、npnt、olfm1、olfml3、prb2、psap、psapl1、psg1、psg6、psg9、ptx3、ptx4、rbp4、rnase10、rnase12、rnase13、rnase9、rspry1、rtbdn、s100a12、s100a13、s100a7、s100a8、saa2、saa4、scg1、scg2、scg3、scgb1c1、scgb1c2、scgb1d1、scgb1d2、scgb1d4、scgb2b2、scgb3a2、scgn、scrg1、scube1、scube2、scube3、sdcbp、selenop、sfta2、sfta3、sftpa1、sftpa2、sftpc、sftpd、shbg、slurp2、smoc1、smoc2、smr3a、smr3b、snca、spata20、spata6、soga1、sparc、sparcl1、spata20、spata6、srpx2、ssc4d、stx1a、susd4、svbp、tcn1、tcn2、tctn1、tf、tulp3、tff2、tff3、thsd7a、tinag、tinagl1、tmeff2、tmem25、vwc2l)；细胞外基质蛋白(例如abi3bp、agrn、ccbe1、chl1、col15a1、col19a1、colec11、dmbt1、draxin、edil3、eln、emid1、emilin1、emilin2、emilin3、epdr1、fbln1、fbln2、fbln5、flrt1、flrt2、flrt3、frem1、gldn、ibsp、kera、kiaa0100、kirrel3、krt10、lamb2、mgp、rptn、sbspon、sdc1、sdc4、sema3a、sema3b、sema3c、sema3d、sema3e、sema3f、sema3g、siglec1、siglec10、siglec6、slit1、slit2、slit3、slitrk1、sned1、snorc、spaca3、spaca7、spon1、spon2、stath、svep1、tecta、tectb、tnc、tnn、tnr、tnxb)；葡萄糖苷酶(amy1a、amy1b、amy1c、amy2a、amy2b、cemip、chia、chit1、fuca2、glb1l、glb1l2、hpse、hyal1、hyal3、kl、lyg1、lyg2、lyzl1、lyzl2、man2b2、smpd1、smpdl3b、spaca5、spaca5b)；糖基转移酶(例如art5、b4galt1、extl2、galnt1、galnt2、glt1d1、mgat4a、st3gal1、st3gal2、st3gal3、st3gal4、st6gal1、xylt1)；生长因子(例如amh、artn、btc、cdnf、cfc1、cfc1b、chrdl1、chrdl2、clec11a、cnmd、efemp1、egf、egfl6、egfl7、egfl8、epgn、ereg、eys、fgf1、
fgf10、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19、fgf2、fgf20、fgf21、fgf22、fgf23、fgf3、fgf4、fgf5、fgf6、fgf7、fgf8、fgf9、frzb、gdnf、gfer、gkn1、hbegf、hgf、igf-1、igf2、inha、inhba、inhbb、inhbc、inhbe、ins、kitlg、manf、mdk、mia、ngf、nov、nrg1、nrg2、nrg3、nrg4、nrtn、ntf3、ntf4、ogn、pdgfa、pdgfb、pdgfc、pdgfd、pgf、prok1、pspn、ptn、sdf1、sdf2、sfrp1、sfrp2、sfrp3、sfrp4、sfrp5、tdgf1、tff1、tgfa、tgfb1、tgfb2、tgfb3、thbs4、timp1、vegfa、vegfb、vegfc、vegfd、wisp3)；生长因子结合蛋白(例如chrd、cyr61、esm1、fgfbp1、fgfbp2、fgfbp3、htra1、ghbp、igfals、igfbp1、igfbp2、igfbp3、igfbp4、igfbp5、igfbp6、igfbp7、ltbp1、ltbp2、ltbp3、ltbp4、sostdc1、nog、twsg1和wif1)；肝素结合蛋白(例如，ada2、adamtsl5、angptl3、apob、apoe、apoh、col5a1、comp、ctgf、fbln7、fn1、fstl1、hrg、lamc2、lipc、lipg、liph、lipi、lpl、pcolce2、postn、rspo1、rspo2、rspo3、rspo4、saa1、slit2、sost、thbs1、vtn)；激素(例如adcyap1、adipoq、adm、adm2、angptl8、apela、apln、avp、c1qtnf12、c1qtnf9、calca、calcb、cck、cga、cgb1、cgb2、cgb3、cgb5、cgb8、copa、cort、crh、csh1、csh2、cshl1、enho、epo、erfe、fbn1、fndc5、fshb、gal、gast、gcg、gh、gh1、gh2、ghrh、ghrl、gip、gnrh1、gnrh2、gpha2、gphb5、iapp、ins、insl3、insl4、insl5、insl6、lhb、metrnl、mln、nppa、nppb、nppc、ostn、oxt、pmch、ppy、prl、prlh、pth、pthlh、pyy、retn、retnlb、rln1、rln2、rln3、sct、spx、sst、stc1、stc2、tg、tor2a、trh、tshb、ttr、ucn、ucn2、ucn3、uts2、uts2b和vip)；水解酶(例如，aadacl2、abhd15、acp7、acpp、ada2、adamtsl1、aoah、arsf、arsi、arsj、arsk、btd、chi3l2、enpp1、enpp2、enpp3、enpp5、entpd5、entpd6、gbp1、ggh、gpld1、hpse、lipc、lipf、lipg、liph、lipi、lipk、lipm、lipn、lpl、pglyrp2、pla1a、pla2g10、pla2g12a、pla2g1b、pla2g2a、pla2g2d、pla2g2e、pla2g2f、pla2g3、pla2g5、pla2g7、pnlip、pnliprp2、pnliprp3、pon1、pon3、ppt1、smpdl3a、them6、thsd1和thsd4)；免疫球蛋白(例如，igsf10、igkv1-12、igkv1-16、igkv1-33、igkv1-6、igkv1d-12、igkv1d-39、igkv1d-8、igkv2-30、igkv2d-30、igkv3-11、igkv3d-20、igkv5-2、iglc1、iglc2、iglc3)；异构酶(例如，naxe、ppia、ptgds)；激酶(例如，adck1、adpgk、fam20c、icos、pkdcc)；裂合酶(例如，pm20d1、pam、ca6)；金属酶抑制剂(例如，fetub、spock3、timp2、timp3、timp4、wfikkn1、wfikkn2)；金属蛋白酶(例如，adam12、adam28、adam9、adamdec1、adamts1、adamts10、adamts12、adamts13、adamts14、adamts15、adamts16、adamts17、adamts18、adamts19、adamts2、adamts20、adamts3、adamts4、adamts5、adamts6、adamts7、adamts8、adamts9、clca1、clca2、clca4、ide、mep1b、mmel1、mmp1、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp16、mmp17、mmp19、mmp2、mmp20、mmp21、mmp24、mmp25、mmp26、mmp28、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、pappa、pappa2、tll1、tll2)；乳蛋白(例如csn1s1、csn2、csn3、lalba)；神经活性蛋白(例如cartpt、nms、nmu、npb、npff、nps、npvf、npw、npy、pcsk1n、pdyn、penk、pnoc、pomc、prok2、pth2、pyy2、pyy3、qrfp、tac1和tac3)；蛋白酶(例如，adamts6、c1r、c1rl、c2、casp4、cela1、cela2a、cela2b、cfb、cfd、cfi、cma1、corin、ctrb1、ctrb2、ctsb、ctsd、dhh、f10、f11、f12、f2、f3、f7、f8、f9、fap、furin、gzma、gzmk、gzmm、habp2、hgfac、htra3、htra4、ihh、klk10、klk11、klk12、klk13、klk14、klk15、klk3、klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk9、klkb1、masp1、masp2、mst1l、napsa、ovch1、ovch2、pcsk2、pcsk5、pcsk6、pcsk9、pga3、pga4、pga5、pgc、plat、plau、plg、proc、prss1、prss12、prss2、prss22、prss23、prss27、prss29p、prss3、prss33、prss36、prss38、prss3p2、prss42、prss44、prss47、prss48、prss53、prss57、prss58、prss8、prtn3、reln、ren、
tmprss11d、tmprss11e、tmprss2、tpsab1、tpsb2、tpsd1)；蛋白酶抑制剂(例如a2m、a2ml1、ambp、anos1、col28a1、col6a3、col7a1、cpamd8、cst1、cst2、cst3、cst4、cst5、cst6、cst7、cst8、cst9、cst9l、cst9lp1、cstl1、eppin、gpc3、hmsd、itih1、itih2、itih3、itih4、itih5、itih6、kng1、oprpn、ovos1、ovos2、papln、pi15、pi16、pi3、pzp、r3hdml、serpina1、serpina10、serpina11、serpina12、serpina13p、serpina3、serpina4、serpina5、serpina7、serpina9、serpinb2、serpinb5、serpinc1、serpine1、serpine2、serpine3、serpinf2、serping1、serpini1、serpini2、spink1、spink13、spink14、spink2、spink4、spink5、spink6、spink7、spink8、spink9、spint1、spint3、spint4、spock1、spock2、spp2、sspo、tfpi、tfpi2、wfdc1、wfdc10a、wfdc13、wfdc2、wfdc3、wfdc5、wfdc6、wfdc8)；蛋白磷酸酶(例如acp7、acpp、pten、ptprz1)；酯酶(例如bche、cel、ces4a、ces5a、notum、siae)；转移酶(例如mettl24、fkrp、chsy1、chst9、b3gat1)；血管活性蛋白(例如aggf1、agt、angpt1、angpt2、angptl4、angptl6、edn1、edn2、edn3、nts)、i型干扰素(例如ifn-α，包括但不限于干扰素α-n3、干扰素α-2a和干扰素α-2b、ifn-β、ifn-δ、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ν、ifn-τ和ifn-ω)、ii型干扰素(例如ifn-γ)、iii型干扰素(例如ifn-λ)、白细胞介素(例如il-37、il-38)和可溶性ace2受体。
75.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码目的基因的核酸序列；其中该靶rna不同于由目的基因编码的mrna。在一些方面，重组多核酸构建体包含两个或更多个编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列，其中所述两个或更多个核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶rna或不同靶rna的sirna。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含两个或更多个各自编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列，其中各靶rna彼此相同、彼此不同或是其组合。在一些实施方案中，靶rna是mrna。在一些实施方案中，靶rna是非编码rna。在一些方面，以顺序方式包含至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)。在某些方面，至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)以顺序方式存在。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的下游。在某些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游或下游。在一些方面，能够结合靶rna的sirna结合靶mrna的外显子。在一些方面，能够结合靶rna的sirna特异性结合一个靶rna。在一些方面，能够结合靶rna的sirna不由目的基因的内含子序列编码或由其组成。在一些方面，目的基因在没有rna剪接的情况下表达。在一些方面，靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素、血管紧张素转换酶-2(ace2)、sars cov-2 orf1ab、sars cov-2 s、sars cov-2 n。在一些方面，靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：白细胞介素8(il-8)、白细胞介素1β(il-β)、白细胞介素17(il-17)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6r(il-6r)、白细胞介素6r-α(il-6r-α)、白细胞介素6r-β(il-6r-β)、血管紧张素转换酶2(ace2)、sars cov-2 orf1ab、sars cov-2 s和sars cov-2 n。在一些实施方案中，
靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：白细胞介素8(il-8)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素17(il-17)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)。在一些方面，重组多核酸构建体包含两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中所述两个或更多个核酸序列各自编码相同目的基因或不同目的基因。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含两个或更多个各自编码目的基因的核酸序列，其中各目的基因彼此相同、彼此不同或是其组合。在一些方面，目的基因包含编码选自由以下组成的组的蛋白质的核酸序列：分泌蛋白、细胞内蛋白、细胞器内蛋白和膜蛋白。在一些方面，目的基因选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)和白细胞介素4(il-4)。在一些方面，重组多核酸构建体进一步包含编码靶基序的核酸序列，该靶基序有效地连接到至少一个编码目的基因的核酸序列，其中该靶基序包含信号肽、核定位信号(nls)、核仁定位信号(nols)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管端定位信号(mtls)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(er)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号或中心体定位信号(cls)。在一些方面，靶基序选自由以下组成的组：(a)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序，其中与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；和(d)不具有天然靶基序功能的天然存在的氨基酸序列，其中该天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。在某些方面，重组多核酸构建体进一步包含编码或包含poly(a)尾的核酸序列、编码或包含5'帽的核酸序列、编码或包含启动子的核酸序列、或编码或包含kozak序列的核酸序列。在一些方面，重组多核酸构建体还包含编码或包含接头的核酸序列。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列连接(a)至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，(b)两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列中的每一个，和/或(c)两个或多个编码目的基因的核酸序列中的每一个。在一些方面，接头包括trna接头、2a肽接头或柔性接头。在一些方面，接头的长度为至少6个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为不超过50个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为不超过80个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约50个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约80个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约15个核酸残基。在一些方面，重组多核酸构建体包含选自由seq id no:1-8组成的组的核酸序列。在一些方面，组合物包含重组rna构建体，该构建体包含：(i)能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码目的基因的mrna；其中靶rna不同于编码目的基因的mrna。在一些方面，组合物用于同时调节两个或更多个基因在细胞中的表达。在某些方面，以顺序方式包含至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)。在一些方面，组合物用于同时调节两个或更多个基因在细胞中的表达。在一些方面，至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)以顺序方式存在。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个
编码目的基因的核酸序列(ii)的下游。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游或下游。在一些方面，能够结合靶rna的sirna结合靶mrna的外显子。在一些方面，能够结合靶rna的sirna特异性结合一个靶rna。在一些方面，能够结合靶rna的sirna不由目的基因的内含子序列编码或由其组成。在某些方面，目的基因在没有rna剪接的情况下表达。
76.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物用于治疗或预防受试者的病毒性疾病或病况，该重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码或包含目的基因的mrna的核酸序列；其中靶rna不同于由目的基因编码的mrna。在一些方面，sirna不影响目的基因的mrna的表达和/或不能结合目的基因的mrna。在一些方面，重组多核酸构建体包含两个或更多个编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列，其中所述两个或更多个核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶rna或不同靶rna的sirna。在一些方面，重组多核酸构建体包含三个或更多个编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列，其中至少两个核酸序列编码或包含能够结合相同靶rna的sirna，并且至少一个核酸序列编码或包含能够结合不同靶rna的sirna。在一些实施方案中，靶rna是mrna。在一些实施方案中，靶rna是非编码rna。在一些实施方案中，各靶rna彼此相同或彼此不同。在一些实施方案中，靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：白细胞介素，血管紧张素转换酶-2(ace2)；sars cov-2 orflab；sars cov-2 s和sars cov-2 n。在一些实施方案中，白细胞介素选自由以下组成的组：il-1α、il-1β、il-6、il-6r、il-6r-α、白细胞介素il-6r-β、il-18、il-36-α、il-36-β；il-36-γ和il-33。在一些实施方案中，靶mrna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：il-6、il-6r、il-6r-α、il-6r-β、血管紧张素转换酶-2(ace2)；sars cov-2 orflab；sars cov-2 s和sars cov-2 n。在一些实施方案中，组合物在(ii)中包含两个或更多个各自编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，各mrna相同或不同。在一些实施方案中，至少两个mrna相同，并且至少一个mrna不同于该至少两个相同mrna。在一些实施方案中，(ii)的目的基因选自编码以下的基因：ifnα-n3、ifnα-2a、ifnα-2b、ifnβ-1a、ifnβ-1b、ace2可溶性受体、il-37和il-38。在一些实施方案中，(ii)的目的基因选自编码以下的基因：ifnβ和ace2可溶性受体。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码靶基序的核酸序列，该核酸序列有效地连接到至少一个编码目的基因的mrna的核酸序列，其中该靶基序包含信号肽、核定位信号(nls)、核仁定位信号(nols)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管端定位信号(mtls)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(er)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号或中心体定位信号(cls)。在一些实施方案中，靶基序选自由以下组成的组：(a)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；和(d)天然不具有靶基序的功能的天然存在的氨基酸序列，其中该天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码或包含poly(a)尾的核酸序列、编码或包含5'帽的核酸序列、编码或包含启动子的核酸序列、或编码或包含kozak序列的核酸序列。在一些实施方案
中，重组多核酸构建体还包含编码或包含接头的核酸序列。在一些实施方案中，编码或包含接头的核酸序列连接(a)至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，(b)两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列中的每一个，和/或(c)两个或更多个编码目的基因的核酸序列中的每一个。在一些实施方案中，接头包括trna接头、2a肽接头或柔性接头。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为至少6个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为不超过50个核酸残基。在某些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为不超过80个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约50个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约80个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约15个核酸残基。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是适用于基因疗法的载体。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含选自由seq id no:29-47组成的组的核酸序列。在一些方面，组合物包含重组rna构建体，该重组构建体包含：(i)能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码目的基因的mrna；其中靶rna不同于编码目的基因的mrna。在一些实施方案中，组合物用于同时调节两个或更多个基因在细胞中的表达。在一些实施方案中，组合物以足以治疗或预防受试者的病毒性疾病或病况的量存在。在一些方面，以顺序方式包含至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)。在一些方面，至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)以顺序方式存在。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的下游。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游或下游。在一些方面，能够结合靶rna的sirna结合靶mrna的外显子。在一些方面，能够结合靶rna的sirna特异性结合一个靶rna。在一些方面，能够结合靶rna的sirna不由目的基因的内含子序列编码或由其组成。在一些方面，目的基因在没有rna剪接的情况下表达。
77.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码或包含目的基因的mrna的核酸序列；其中(i)的靶rna不同于(ii)的mrna。在一些实施方案中，sirna不影响目的基因的mrna的表达和/或不能结合目的基因的mrna。在一些方面，重组多核酸构建体包含两个或更多个编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列，其中所述两个或更多个核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶rna或不同靶rna的sirna。在一些方面，重组多核酸构建体包含三个或更多个编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列，其中至少两个核酸序列编码或包含能够结合相同靶rna的sirna，并且至少一个核酸序列编码或包含能够结合不同靶rna的sirna。在一些实施方案中，靶rna是mrna。在一些实施方案中，靶rna是非编码rna。在一些实施方案中，各靶rna彼此相同或不同。在一些实施方案中，靶是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：il-8mrna、il-1βmrna、il-17mrna、tnf-αmrna、sars cov-2 orf1ab rna(多蛋白pp1ab，例如在非编码区域中或在编码选自以下的蛋白质的位置：sars cov-2非结构蛋白(nsp)、nsp1、nsp3(nsp3b、nsp3c、plpro和nsp3e)、
nsp7_nsp8复合物、nsp9-nsp10和nsp14-nsp16、3clpro、e-通道(e蛋白)、orf7a、c端rna结合结构域(crbd)、n端rna结合结构域(nrbd)、解螺旋酶及rdrp)、sars cov-2刺突蛋白(s)mrna、sars cov-2核衣壳蛋白(n)mrna、肿瘤坏死因子α(tnf-α)mrna、白细胞介素mrna(包括但不限于白细胞介素1(例如il-1α、il-1β)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6r(il-6r)、白细胞介素6rα(il-6r-α)、白细胞介素6rβ(il-6r-β)、白细胞介素18(il-18)、白细胞介素36-α(il-36-α)、白细胞介素36-β(il-36-β)、白细胞介素36-γ(il-36-γ)、白细胞介素33(il-33))、血管紧张素转换酶-2(ace2)mrna、跨膜蛋白酶、丝氨酸2(tmprss2)mrna和编码nsp12和13rna。在一些实施方案中，组合物在(ii)中包含两个或更多个核酸序列，各自编码目的基因的mrna。在一些实施方案中，各mrna相同或不同。在一些实施方案中，至少两个mrna相同，并且至少一个mrna不同于该至少两个相同mrna。在一些实施方案中，(ii)的目的基因选自编码以下的基因：igf-1、il-4、igf-1(包括如本文其他地方所述的其衍生物)、羧肽酶(例如ace、ace2、cndp1、cpa1、cpa2、cpa4、cpa5、cpa6、cpb1、cpb2、cpe、cpn1、cpq、cpxm1、cpz、scpep1)；细胞因子(例如bmp1、bmp10、bmp15、bmp2、bmp3、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8a、bmp8b、c1qtnf4、ccl1、ccl11、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、ccl3、ccl3l1、ccl3l3、ccl4、ccl4l、ccl4l2、ccl5、ccl7、ccl8、cd40lg、cer1、cklf、clcf1、cntf、csf1、csf2、csf3、ctf1、cx3cl1、cxcl1、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl17、cxcl2、cxcl3、cxcl5、cxcl8、cxcl9、dkk1、dkk2、dkk3、dkk4、eda、ebi3、fam3b、fam3c、faslg、flt3lg、gdf1、gdf10、gdf11、gdf15、gdf2、gdf3、gdf5、gdf6、gdf7、gdf9、gpi、grem1、grem2、grn、ifna1、ifna13、ifna10、ifna14、ifna16、ifna17、ifna2、ifna21、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifnb1、ifne、ifng、ifnk、ifnl1、ifnl2、ifnl3、ifnl4、ifnw1、il10、il11、il12a、il12b、il13、il15、il16、il17a、il17b、il17c、il17d、il17f、il18、il19、il1a、il1b、il1f10、il2、il20、il21、il22、il23a、il24、il25、il26、il27、il3、il31、il32、il33、il34、il36a、il36b、il36g、il36rn、il37、il4、il5、il6、il7、il9、lefty1、lefty2、lif、lta、mif、mstn、nampt、nodal、osm、pf4、pf4v1、scgb3a1、sectm1、slurp1、spp1、thnsl2、thpo、tnf、tnfsf10、tnfsf11、tnfsf12、tnfsf13、tnfsf13b、tnfsf14、tnfsf15、tslp、vstm1、wnt1、wnt10a、wnt10b、wnt11、wnt16、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、xcl1和xcl2)；细胞外配体及转运蛋白(例如apcs、chi3l1、chi3l2、clec3b、dmbt1、dmkn、eddm3a、eddm3b、efna4、emc10、enam、epyc、ervh48-1、f13b、fcn1、fcn2、gldn、gpld1、heg1、itfg1、kazald1、kcp、lacrt、leg1、metrn、notch2nl、npnt、olfm1、olfml3、prb2、psap、psapl1、psg1、psg6、psg9、ptx3、ptx4、rbp4、rnase10、rnase12、rnase13、rnase9、rspry1、rtbdn、s100a12、s100a13、s100a7、s100a8、saa2、saa4、scg1、scg2、scg3、scgb1c1、scgb1c2、scgb1d1、scgb1d2、scgb1d4、scgb2b2、scgb3a2、scgn、scrg1、scube1、scube2、scube3、sdcbp、selenop、sfta2、sfta3、sftpa1、sftpa2、sftpc、sftpd、shbg、slurp2、smoc1、smoc2、smr3a、smr3b、snca、spata20、spata6、soga1、sparc、sparcl1、spata20、spata6、srpx2、ssc4d、stx1a、susd4、svbp、tcn1、tcn2、tctn1、tf、tulp3、tff2、tff3、thsd7a、tinag、tinagl1、tmeff2、tmem25、vwc2l)；细胞外基质蛋白(例如abi3bp、agrn、ccbe1、chl1、col15a1、col19a1、colec11、dmbt1、draxin、edil3、eln、emid1、emilin1、emilin2、emilin3、epdr1、fbln1、fbln2、fbln5、flrt1、flrt2、flrt3、frem1、gldn、
ibsp、kera、kiaa0100、kirrel3、krt10、lamb2、mgp、rptn、sbspon、sdc1、sdc4、sema3a、sema3b、sema3c、sema3d、sema3e、sema3f、sema3g、siglec1、siglec10、siglec6、slit1、slit2、slit3、slitrk1、sned1、snorc、spaca3、spaca7、spon1、spon2、stath、svep1、tecta、tectb、tnc、tnn、tnr、tnxb)；葡萄糖苷酶(amy1a、amy1b、amy1c、amy2a、amy2b、cemip、chia、chit1、fuca2、glb1l、glb1l2、hpse、hyal1、hyal3、kl、lyg1、lyg2、lyzl1、lyzl2、man2b2、smpd1、smpdl3b、spaca5、spaca5b)；糖基转移酶(例如art5、b4galt1、extl2、galnt1、galnt2、glt1d1、mgat4a、st3gal1、st3gal2、st3gal3、st3gal4、st6gal1、xylt1)；生长因子(例如amh、artn、btc、cdnf、cfc1、cfc1b、chrdl1、chrdl2、clec11a、cnmd、efemp1、egf、egfl6、egfl7、egfl8、epgn、ereg、eys、fgf1、fgf10、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19、fgf2、fgf20、fgf21、fgf22、fgf23、fgf3、fgf4、fgf5、fgf6、fgf7、fgf8、fgf9、frzb、gdnf、gfer、gkn1、hbegf、hgf、igf-1、igf2、inha、inhba、inhbb、inhbc、inhbe、ins、kitlg、manf、mdk、mia、ngf、nov、nrg1、nrg2、nrg3、nrg4、nrtn、ntf3、ntf4、ogn、pdgfa、pdgfb、pdgfc、pdgfd、pgf、prok1、pspn、ptn、sdf1、sdf2、sfrp1、sfrp2、sfrp3、sfrp4、sfrp5、tdgf1、tff1、tgfa、tgfb1、tgfb2、tgfb3、thbs4、timp1、vegfa、vegfb、vegfc、vegfd、wisp3)；生长因子结合蛋白(例如chrd、cyr61、esm1、fgfbp1、fgfbp2、fgfbp3、htra1、ghbp、igfals、igfbp1、igfbp2、igfbp3、igfbp4、igfbp5、igfbp6、igfbp7、ltbp1、ltbp2、ltbp3、ltbp4、sostdc1、nog、twsg1和wif1)；肝素结合蛋白(例如ada2、adamtsl5、angptl3、apob、apoe、apoh、col5a1、comp、ctgf、fbln7、fn1、fstl1、hrg、lamc2、lipc、lipg、liph、lipi、lpl、pcolce2、postn、rspo1、rspo2、rspo3、rspo4、saa1、slit2、sost、thbs1、vtn)；激素(例如adcyap1、adipoq、adm、adm2、angptl8、apela、apln、avp、c1qtnf12、c1qtnf9、calca、calcb、cck、cga、cgb1、cgb2、cgb3、cgb5、cgb8、copa、cort、crh、csh1、csh2、cshl1、enho、epo、erfe、fbn1、fndc5、fshb、gal、gast、gcg、gh、gh1、gh2、ghrh、ghrl、gip、gnrh1、gnrh2、gpha2、gphb5、iapp、ins、insl3、insl4、insl5、insl6、lhb、metrnl、mln、nppa、nppb、nppc、ostn、oxt、pmch、ppy、prl、prlh、pth、pthlh、pyy、retn、retnlb、rln1、rln2、rln3、sct、spx、sst、stc1、stc2、tg、tor2a、trh、tshb、ttr、ucn、ucn2、ucn3、uts2、uts2b和vip)；水解酶(例如aadacl2、abhd15、acp7、acpp、ada2、adamtsl1、aoah、arsf、arsi、arsj、arsk、btd、chi3l2、enpp1、enpp2、enpp3、enpp5、entpd5、entpd6、gbp1、ggh、gpld1、hpse、lipc、lipf、lipg、liph、lipi、lipk、lipm、lipn、lpl、pglyrp2、pla1a、pla2g10、pla2g12a、pla2g1b、pla2g2a、pla2g2d、pla2g2e、pla2g2f、pla2g3、pla2g5、pla2g7、pnlip、pnliprp2、pnliprp3、pon1、pon3、ppt1、smpdl3a、them6、thsd1和thsd4)；免疫球蛋白(例如igsf10、igkv1-12、igkv1-16、igkv1-33、igkv1-6、igkv1d-12、igkv1d-39、igkv1d-8、igkv2-30、igkv2d-30、igkv3-11、igkv3d-20、igkv5-2、iglc1、iglc2、iglc3)；异构酶(例如naxe、ppia、ptgds)；激酶(例如adck1、adpgk、fam20c、icos、pkdcc)；裂合酶(例如pm20d1、pam、ca6)；金属酶抑制剂(例如fetub、spock3、timp2、timp3、timp4、wfikkn1、wfikkn2)；金属蛋白酶(例如adam12、adam28、adam9、adamdec1、adamts1、adamts10、adamts12、adamts13、adamts14、adamts15、adamts16、adamts17、adamts18、adamts19、adamts2、adamts20、adamts3、adamts4、adamts5、adamts6、adamts7、adamts8、adamts9、clca1、clca2、clca4、ide、mep1b、mmel1、mmp1、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp16、mmp17、mmp19、mmp2、mmp20、mmp21、mmp24、mmp25、mmp26、mmp28、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、pappa、pappa2、tll1、tll2)；乳蛋白(例如csn1s1、csn2、csn3、lalba)；神经活性
蛋白(例如cartpt、nms、nmu、npb、npff、nps、npvf、npw、npy、pcsk1n、pdyn、penk、pnoc、pomc、prok2、pth2、pyy2、pyy3、qrfp、tac1和tac3)；蛋白酶(例如adamts6、c1r、c1rl、c2、casp4、cela1、cela2a、cela2b、cfb、cfd、cfi、cma1、corin、ctrb1、ctrb2、ctsb、ctsd、dhh、f10、f11、f12、f2、f3、f7、f8、f9、fap、furin、gzma、gzmk、gzmm、habp2、hgfac、htra3、htra4、ihh、klk10、klk11、klk12、klk13、klk14、klk15、klk3、klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk9、klkb1、masp1、masp2、mst1l、napsa、ovch1、ovch2、pcsk2、pcsk5、pcsk6、pcsk9、pga3、pga4、pga5、pgc、plat、plau、plg、proc、prss1、prss12、prss2、prss22、prss23、prss27、prss29p、prss3、prss33、prss36、prss38、prss3p2、prss42、prss44、prss47、prss48、prss53、prss57、prss58、prss8、prtn3、reln、ren、tmprss11d、tmprss11e、tmprss2、tpsab1、tpsb2、tpsd1)；蛋白酶抑制剂(例如a2m、a2ml1、ambp、anos1、col28a1、col6a3、col7a1、cpamd8、cst1、cst2、cst3、cst4、cst5、cst6、cst7、cst8、cst9、cst9l、cst9lp1、cstl1、eppin、gpc3、hmsd、itih1、itih2、itih3、itih4、itih5、itih6、kng1、oprpn、ovos1、ovos2、papln、pi15、pi16、pi3、pzp、r3hdml、serpina1、serpina10、serpina11、serpina12、serpina13p、serpina3、serpina4、serpina5、serpina7、serpina9、serpinb2、serpinb5、serpinc1、serpine1、serpine2、serpine3、serpinf2、serping1、serpini1、serpini2、spink1、spink13、spink14、spink2、spink4、spink5、spink6、spink7、spink8、spink9、spint1、spint3、spint4、spock1、spock2、spp2、sspo、tfpi、tfpi2、wfdc1、wfdc10a、wfdc13、wfdc2、wfdc3、wfdc5、wfdc6、wfdc8)；蛋白磷酸酶(例如acp7、acpp、pten、ptprz1)；酯酶(例如bche、cel、ces4a、ces5a、notum、siae)；转移酶(例如mettl24、fkrp、chsy1、chst9、b3gat1)；血管活性蛋白(例如aggf1、agt、angpt1、angpt2、angptl4、angptl6、edn1、edn2、edn3、nts)、i型干扰素(例如ifn-α，包括但不限于干扰素α-n3、干扰素α-2a和干扰素α-2b、ifn-β、ifn-δ、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ν、ifn-τ和ifn-ω)、ii型干扰素(例如ifn-γ)、iii型干扰素(例如ifn-λ)、白细胞介素(例如il-37、il-38)和可溶性ace2受体。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码靶基序的核酸序列，该核酸序列有效地连接至编码目的基因的mrna的至少一个核酸序列，其中该靶基序包含信号肽、核定位信号(nls)、核仁定位信号(nols)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管端定位信号(mtls)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(er)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号或中心体定位信号(cls)。在一些实施方案中，靶基序选自由以下组成的组：(a)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；和(d)不具有天然靶基序功能的天然存在的氨基酸序列，其中该天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码或包含poly(a)尾的核酸序列、编码或包含5'帽的核酸序列、编码或包含启动子的核酸序列、或编码或包含kozak序列的核酸序列。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码或包含接头的核酸序列。在一些实施方案中，编码或包含接头的核酸序列连接(a)至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，(b)两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列中的每一个，和/或(c)两个或更多个编码目的基因的核酸
序列中的每一个。在一些方面，接头包括trna接头、2a肽接头或柔性接头。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为至少6个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为不超过50个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为不超过80个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约50个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约80个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约15个核酸残基。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是适用于基因疗法的载体。在一些实施方案中，组合物可用于同时调节两个或更多个基因在细胞中的表达。
78.在一些实施方案中，以顺序方式包含至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)。在一些实施方案中，至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)以顺序方式存在。在一些实施方案中，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游。在一些实施方案中，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的下游。在一些实施方案中，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游或下游。在一些实施方案中，能够结合靶rna的sirna结合靶mrna的外显子。在一些实施方案中，能够结合靶rna的sirna特异性结合一个靶rna。在一些实施方案中，能够结合靶rna的sirna不由目的基因的内含子序列编码或由其组成。在一些实施方案中，目的基因在没有rna剪接的情况下表达。在一些实施方案中，组合物以足以治疗或预防病毒性感染、疾病或病况、或选自由椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎和银屑病组成的组的疾病或病况的量存在或施用。在一些实施方案中，组合物以足以治疗或预防病毒性感染、疾病或病况、或选自由椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎和银屑病、进行性骨化性纤维发育不良(fop)和肌萎缩侧索硬化(als)组成的组的疾病或病况的量存在或施用。在一些实施方案中，以顺序方式包含至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)。在一些实施方案中，至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)以顺序方式存在。在一些实施方案中，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游。在一些实施方案中，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的下游。在一些实施方案中，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游或下游。在一些实施方案中，能够结合靶rna的sirna结合靶mrna的外显子。在一些实施方案中，能够结合靶rna的sirna特异性结合一个靶rna。在一些实施方案中，能够结合靶rna的sirna不由目的基因的内含子序列编码或由其组成。在一些实施方案中，目的基因在没有rna剪接的情况下表达。
79.在一些方面，本发明的组合物包含含有sirna的多核酸构建体，其中该sirna包含由选自seq id no:80-109和seq id no:140-145的序列编码的有义链序列。在一些实施方案中，该sirna包含由选自seq id no:80-109和seq id no:140-145的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:110-139和seq id no:146-151的序列编码的相应反义链。在一些方
面，本发明的组合物包含含有sirna的多核酸构建体，其中该sirna包含由选自seq id no:80-92的序列编码的有义链序列。在一些实施方案中，该sirna包含由选自seq id no:80-92的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:110-122的序列编码的相应反义链。在一些方面，本发明的组合物包含含有sirna的多核酸构建体，其中该sirna包含由选自seq id no：93-109的序列编码的有义链序列。在一些实施方案中，该sirna包含由选自seq id no:93-109的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:123-139的序列编码的相应反义链。在一些方面，本发明的组合物包含含有sirna的多核酸构建体，其中该sirna包含由选自seq id no:140-145的序列编码的有义链。在一些实施方案中，该sirna包含由选自seq id no:140-145的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:146-151的序列编码的相应反义链。
80.通过引用并入
81.本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其引用的程度如同各单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示以引用的方式并入一样。
附图说明
82.本公开的特征在所附权利要求中特别阐述。通过参考以下详细描述(其中阐述了利用本公开的原理的举例说明性实施方案)以及附图，将获得对本公开的特征和优点的更好理解：
83.图1描述了构建体设计的示意图。t7：t7启动子，sirna：小干扰rna。
84.图2a显示，针对hek-293细胞中的igf-1表达，比较了igf-1mrna构建体和化合物a1(cpd.1)；图2b显示，在hek-293细胞的il-8过表达模型中，包含靶向il-8的sirna的化合物a1的同时rna干扰。对照：单独il-8过表达构建体。
85.图3显示，在hek-293细胞的il-8过表达模型中，包含靶向il-8的sirna的化合物a1(cpd.1)的剂量依懒性rna干扰。
86.图4a显示，化合物a2(cpd.2)在thp-1细胞中对il-8表达的调节。对照：单独il-8过表达构建体。
87.图4b显示，化合物a2(cpd.2)在hek-293细胞中的igf-1表达。
88.图5a显示，化合物a3(cpd.3)在thp-1细胞中对il-8表达的调节。对照：单独il-8过表达构建体。
89.图5b显示，化合物a3(cpd.3)在hek-293细胞中的igf-1表达。
90.图6a显示，针对thp-1细胞中的il-8表达，比较化合物a4(cpd.4)和化合物a5(cpd.5)。对照：单独il-8过表达构建体。
91.图6b显示，针对thpl细胞中的il-8表达，比较化合物a3(cpd.3)和化合物a5(cpd.5)。对照：单独il-8过表达构建体。
92.图7显示，针对hek-293细胞中的il-8表达，比较化合物a4(cpd.4)和化合物a5(cpd.5)。对照：单独il-8过表达构建体。
93.图8a显示，化合物a6(cpd.6)在thp-1细胞中内源性il-1β(il1b)表达中的作用。对照：仅lps dsdna。
94.图8b显示，化合物a6(cpd.6)在thp-1细胞中内源性il-1β(il1b)表达中的作用。对
照：仅lps dsdna。
95.图8c显示，化合物a6(cpd.6)在hek-293细胞中的igf-1表达。
96.图9a显示，化合物a7(cpd.7)在thp-1细胞中内源性il-1β(il1b)表达中的作用。对照：仅lps dsdna。
97.图9b显示，化合物a7(cpd.7)在thp-1细胞中内源性il-1β(il1b)表达中的作用。对照：仅lps dsdna。
98.图9c显示，化合物a7(cpd.7)在hek-293细胞中的igf-1表达。
99.图10a显示，在hek-293细胞的tnf-α过表达模型中，包含tnf-α-靶向sirna的化合物a8(cpd.8)的rna干扰。对照：单独tnf-α过表达构建体。
100.图10b显示，在thp-1细胞中的内源性tnf-α表达模型中，包含tnf-α-靶向sirna的化合物a8(cpd.8)的rna干扰。对照：仅lps r848。
101.图10c显示，在与图10a相同的细胞(hek-293)培养物中，化合物a8(cpd.8)的il-4表达。
102.图10d显示，在与图10b相同的细胞(thp-1)培养物上清液中，化合物a8(cpd.8)的il-4表达。
103.图11描述了在过去二十年中导致人类疾病爆发的三种冠状病毒的系统发育分析，mers-cov(顶部)、sars-cov-2(中间)和sars-cov(底部)。基因组序列是公众可获得的(从ncbi nucleotide获得)并在geneious prime v.2019.2.3中使用tamura-nei遗传距离模型进行分析；用upgma算法制作系统发育树。
104.图12a显示，在thp-1细胞中的内源性tnf-α表达模型中，包含靶向tnf-α的sirna的化合物a9(cpd.9)和化合物a10(cpd.10)的rna干扰。对照：仅lps r848，sc-sirna：乱序sirna。数据代表4次重复平均的平均值
±
标准误差。通过student t检验评估sirna活性的显著性(*,《0.05)。通过单向方差分析，然后是相对于对照的dunnet多重比较检验，评估显著性(***,p《0.001)。
105.图12b显示，化合物a9(cpd.9)和化合物a10(cpd.10)在thp-1细胞中的il-4表达。数据代表4次重复平均的平均值
±
标准误差。通过student t检验评估il-4表达的显著性(**,《0.01)。
106.图13a显示，在hek-293细胞中的tnf-α过表达模型中，包含靶向tnf-α的sirna的化合物a9(cpd.9)和化合物a10(cpd.10)的rna干扰。对照：单独tnf-α过表达构建体。数据代表4次重复平均的平均值
±
标准误差。通过单向方差分析，然后是相对于对照的dunnet多重比较检验，评估显著性(**,p《0.01)。
107.图13b显示，化合物a9(cpd.9)和化合物a10(cpd.10)在hek-293细胞中的il-4表达。数据代表4次重复平均的平均值
±
标准误差。通过student t检验评估显著性(***,《0.001)。
108.图14显示，在a549细胞中的内源性alk2表达模型中，包含靶向alk2的sirna的化合物a11(cpd.11)的剂量依赖rna干扰，和在a549细胞中化合物a11(cpd.11)的igf-1表达。数据代表4次重复平均的平均值
±
标准误差。
109.图15a显示，在imr32细胞中的内源性sod1表达模型中，包含靶向sod1的sirna的化合物a12(cpd.12)和化合物13(cpd.13)的剂量依赖性rna干扰。数据代表3次重复平均的平
均值
±
标准误差。
110.图15b显示，在imr32细胞中，化合物a13(cpd.13)的剂量依赖性epo表达。数据代表4次重复平均的平均值
±
标准误差。
111.图15c显示，在imr32细胞中，化合物a12(cpd.12)的剂量依赖性igf-1表达。数据代表4次重复平均的平均值
±
标准误差。
112.图16a显示，在hek-293细胞中的il-1β过表达模型中，包含靶向il-1β的sirna的化合物a14(cpd.14)和化合物a15(cpd.15)的rna干扰。对照：单独il-1β过表达构建体。数据代表4次重复平均的平均值
±
标准误差。通过student t检验评估显著性(*，《0.05)。通过单向方差分析，然后是相对于对照的dunnet多重比较检验，评估显著性(***，p《0.001)。
113.图16b显示，化合物a14(cpd.14)和化合物a15(cpd.15)在hek-293细胞中的igf-1表达。数据代表4次重复平均的平均值
±
标准误差。通过student t检验评估显著性(***，《0.001)。
114.图17a显示，用pcdna3
载体转染的egfp阳性a549细胞的表达，该载体含有编码用egfp标记的sars cov-2核衣壳蛋白的序列。
115.图17b显示，用pcdna3
载体共转染的egfp阳性a549细胞的表达，该载体含有编码用egfp标记的sars cov-2核衣壳蛋白的序列和包含3个sirna的化合物b18(cpd.b18)，其中一个sirna靶向sars cov-2核衣壳蛋白。
116.图17c显示，包含靶向sars cov-2核衣壳蛋白的sirna的化合物b18(cpd.b18)在a549细胞中的rna干扰，该a549细胞表达用egfp标记的sars cov-2核衣壳蛋白。对照：单独sars cov-2核衣壳蛋白-egfp构建体。与对照相比，通过student t检验评估化合物b18(cpd.b18)的显著性(***,《0.001)。
具体实施方式
117.阐述本发明的某些特定细节以便提供对各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践本公开。在其他情况下，没有详细示出或描述众所周知的结构以避免不必要地模糊实施方案的描述。除非上下文另有要求，否则在随后的说明书和权利要求书中，“包含”一词及其变体，应以开放、包括的意义解释，即“包括，但不限于。”此外，本文提供的标题仅为方便起见，并不解释所要求保护的发明的范围或含义。
118.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。下面描述了合适的方法和材料，但与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试。
119.定义
120.如在本说明书和所附权利要求中使用的，除非内容另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称。还应注意，除非内容另有明确规定，否则术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用。如本文所用，术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等同形式可以互换使用。这些术语表示，任何组合都是具体考虑的。仅出于举例说明目的，以下短语“a、b和/或c”或“a、b、c或其任何组合”可以表示“单个a；单个b；单个c；a和b；b和c；a和c；以及a、b和c。”除非上下文特别提到以析取式使用，否则术语“或”可以以合取或析取方式
使用。
121.术语“约”或“大约”可以表示在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准差内。或者，“约”可表示给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示在值的数量级以内、在5倍以内、更优选地在2倍以内。在本技术和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”的含义应推定为在特定值的可接受误差范围内。
122.如在本说明书和权利要求中使用的，词语“包含”(以及任何形式的包含)、“具有”(以及任何形式的具有)、“包括”(以及任何形式的包括)或“含有”(以及任何形式的含有)是包容性或开放式，不排除额外的、未列举的元素或方法步骤。本说明书中讨论的任何实施方案均可以包括参照本公开的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本公开的组合物可用于实现本公开的方法。
123.在说明书中述及“实施方案”、“某些实施方案”、“优选实施方案”、“特定实施方案”、“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”，是指与所述实施方案结合描述的特定特征、结构或特性可以包括在本公开的至少一些实施方案中，但不必包括在所有实施方案中。为了便于理解本公开，以下定义了多个术语和短语。
124.如本文所用，术语“rna”包括编码氨基酸序列的rna(例如，mrna等)以及不编码氨基酸序列的rna(例如，sirna、shrna等)。如本文所用，rna可以是编码rna，即编码氨基酸序列的rna。此类rna分子也称为mrna(信使rna)，是单链rna分子。如本文所用，rna可以是非编码rna，即不编码氨基酸序列或不翻译成蛋白质的rna。非编码rna可包括但不限于小干扰rna(sirna)、短或小发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、piwi-相互作用rna(pirna)和长非编码rna(incrna)。如本文所用，sirna可包含双链rna(dsrna)区、发夹结构、环结构或其组合。在一些实施方案中，如本文所用，sirna可包含至少一个shrna、至少一个dsrna区域或至少一个环结构。在一些实施方案中，如本文所用，sirna可以从dsrna或shrna加工而来。rna可通过本领域普通技术人员已知的合成化学和酶学方法，或通过使用重组技术制备，或可从天然来源分离，或通过它们的组合制备。rna可以任选地包含本领域已知的非天然和天然存在的核苷修饰，例如n
1-甲基假尿苷，本文也称为甲基假尿苷。
125.术语“核酸序列”、“多核酸序列”、“核苷序列”和“核苷酸序列”在本文中可互换使用并且在本文中具有相同的含义，优选地是指dna或rna。术语“核酸序列”、“核苷序列”和“核苷酸序列”可以与术语“多核苷酸序列”同义使用。在一些实施方案中，核酸序列是包含核苷酸单体或由其组成的聚合物，其中所述核苷酸单体通过糖/磷酸主链的磷酸二酯键彼此共价连接。术语“核酸序列”还包括修饰的核酸序列，例如碱基修饰的、糖修饰的或主链修饰的dna或rna。
126.本文所述的重组多核酸或rna构建体可包括一个或多个核苷酸变体，包括非标准核苷酸(一个或多个)、非天然核苷酸(一个或多个)、核苷酸类似物(一个或多个)和/或修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的实例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基queosine、肌苷、n6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、
2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基queosine、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸可以包括对其磷酸部分的修饰，包括对三磷酸部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括更长的磷酸酯链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸部分的磷酸酯链)和用硫醇部分修饰(例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯)。
127.本文所述的重组多核酸或rna构建体可以在碱基部分(例如，在通常可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸主链修饰。在一些实施方案中，主链修饰包括但不限于，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、缩苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、缩苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)、氨基磷酸酯和二氨基磷酸酯键。硫代磷酸酯键用硫原子代替磷酸酯主链中的非桥连氧，延迟寡核苷酸的核酸酶降解。二氨基磷酸酯键(n3
’→
p5’)可以防止核酸酶识别和降解。在一些实施方案中，主链修饰包括在主链结构中具有肽键而不是磷(例如，肽核酸中通过肽键连接的n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元)，或具有连接基团，包括氨基甲酸酯、酰胺、和直链和环状烃基。在micklefield,backbone modification of nucleic acids:synthesis,structure and therapeutic applications,curr.med.chem.,8(10):1157-79,2001和lyer等人,modified oligonucleotides-synthesis,properties and applications,curr.opin.mol.ther.,1(3):344-358,1999中综述了具有修饰主链的寡核苷酸。
128.术语“肽”是指通常通过相邻氨基酸残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。
129.如本文所用，术语“靶基序”或“靶向基序”可以指，新合成的如下多肽或蛋白质中存在的任何短肽，其中所述多肽或蛋白质被定位到细胞膜、细胞外区室、或细胞质或胞质溶胶之外的细胞内区室的任何部分。细胞内区室包括但不限于细胞内细胞器，例如细胞核、核仁、内体、蛋白酶体、核糖体、染色质、核膜、核孔、外泌体(exosome)、黑素体(melanosome)、高尔基体、过氧化物酶体、内质网(er)、溶酶体、中心体、微管、线粒体、叶绿体、微丝、中间丝或质膜。其他术语包括但不限于信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽。靶基序可以包括信号肽、核定位信号(nls)、核仁定位信号(nols)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管端定位信号(mtls)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(er)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号或中心体定位信号(cls)。
130.术语“信号肽”在本文中也称为信号肽或前结构域(pre-domain)，是一种短肽(通常为16-40个氨基酸长)，存在于预定进入分泌途径的新合成蛋白质的n端。本发明的信号肽的长度优选地为10-50个，更优选地为11-45个，甚至更优选地为12-45个，最优选地为13-45个，特别的为14-45个，更特别地为15-45个，甚至更特别地为16-40个氨基酸。根据本发明的信号肽位于目的蛋白质的n端或目的蛋白质的前蛋白形式的n端。根据本发明的信号肽通常
是真核来源的，例如真核蛋白的信号肽，优选哺乳动物来源的信号肽，例如哺乳动物蛋白的信号肽，更优选人来源的信号肽，例如哺乳动物蛋白的信号肽。在一些实施方案中，待修饰的异源信号肽和/或同源信号肽是真核蛋白质的天然存在的信号肽，优选哺乳动物蛋白质的天然存在的信号肽，更优选人蛋白质的天然存在的信号肽。
131.如本文所用，术语“蛋白质”是指通常包含一个或多个肽或多肽的分子。肽或多肽通常是由肽键连接的氨基酸残基链。肽通常包含2到50个氨基酸残基。多肽通常包含超过50个氨基酸残基。蛋白质通常折叠成3维形式，这可能是蛋白质发挥其生物学功能所必需的。如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质片段和融合蛋白。在一些实施方案中，蛋白质是哺乳动物例如人来源的，即，是人蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是通常由细胞分泌的蛋白质，即，在自然界中由细胞分泌的蛋白质，或由病毒产生的蛋白质。在一些实施方案中，如本文所指的蛋白质选自由以下组成的组：羧肽酶；细胞因子；细胞外配体和转运蛋白，包括受体；细胞外基质蛋白；葡萄糖苷酶；糖基转移酶；生长因子；生长因子结合蛋白；肝素结合蛋白；激素；水解酶；免疫球蛋白；异构酶；激酶；裂合酶；金属酶抑制剂；金属蛋白酶；乳蛋白；神经活性蛋白；蛋白酶；蛋白酶抑制剂；蛋白磷酸酶；酯酶；转移酶；和血管活性蛋白。在一些实施方案中，如本文所述，蛋白质是病毒蛋白质，例如冠状病毒蛋白质。
132.羧肽酶是蛋白质，其是在蛋白质的羧基末端(c端)水解(切割)肽键的蛋白酶；细胞因子是分泌的蛋白质，其通过在细胞表面的受体，作为靶细胞信号传导的调节剂局部或系统地发挥作用，常参与免疫反应；胞外配体和转运蛋白是通过与其他蛋白质结合或通过携带其他蛋白质或其他分子来发挥一定生物学功能的分泌蛋白质；细胞外基质蛋白质是由支持细胞分泌的一系列蛋白质，所述支持细胞为周围细胞提供结构和生化支持；葡糖苷酶是参与将复杂碳水化合物如淀粉和糖原分解成单体的酶；糖基转移酶是建立天然糖苷键的酶；生长因子是能够刺激细胞生长、增殖、愈合和细胞分化的分泌蛋白，其通过细胞表面的受体，作为靶细胞信号传导的调节剂局部或系统地发挥作用，通常参与营养反应和存活或细胞稳态信号传导；生长因子结合蛋白是结合生长因子从而调节其生物活性的分泌蛋白；肝素结合蛋白是与肝素相互作用以调节其生物学功能的分泌蛋白，常常具有与生长因子或激素的另一结合；激素是由多细胞生物中的腺体产生的一类信号传导分子的成员，这些信号分子分泌并由循环系统运输至远端靶器官，通过结合其靶细胞上的特定受体来调节生理和行为；水解酶是生化催化分子断裂的一类酶，其利用水来破坏化学键，从而导致较大的分子分裂为较小的分子；免疫球蛋白是主要由浆细胞产生的大型y形分泌蛋白，免疫系统使用这些蛋白来中和病原菌和病毒等病原体；异构酶是一类酶，可将分子从一种异构体转化为另一种异构体，从而促进分子内重排，其中发生键的断裂和形成；激酶是催化磷酸基团从高能、供磷酸分子转移到特定底物的酶；裂合酶是通过水解和氧化以外的方式催化各种化学键断裂的酶，通常形成新的双键或新的环结构；金属酶抑制剂是基质金属蛋白酶(mmp)的细胞抑制剂；金属蛋白酶是其催化机制涉及金属离子的蛋白酶；乳蛋白是分泌到乳中的蛋白质；神经活性蛋白是分泌蛋白，可以在局部或通过一定距离发挥作用，以支持神经元功能、生存和生理；蛋白酶(也称为肽酶或蛋白酶)是通过水解肽键进行蛋白水解的酶；蛋白酶抑制剂是抑制蛋白酶功能的蛋白质；蛋白磷酸酶是从其底物蛋白的磷酸化氨基酸残基中去除磷酸基团的酶；酯酶是在化学反应中在氨基酸残基处用水将酯分解成酸和醇的酶；转移酶是一类催化特定官能团(例如甲基或糖基)从一个分子(称为供体)转移到另一个分子(称为
受体)的酶；血管活性蛋白是在生物学上影响血管功能的分泌蛋白。本文提及的羧肽酶；细胞因子；细胞外配体和转运蛋白；细胞外基质蛋白；葡糖苷酶；糖基转移酶；生长因子；生长因子结合蛋白；肝素结合蛋白；激素；水解酶；免疫球蛋白；异构酶；激酶；裂合酶；金属酶抑制剂；金属蛋白酶；乳蛋白；神经活性蛋白；蛋白酶；蛋白酶抑制剂；蛋白磷酸酶；酯酶；转移酶；和血管活性蛋白可在uniprot数据库中找到。
133.在一些实施方案中，本文所指的蛋白质是分泌的并且通过细胞表面上的受体作为靶细胞信号传导的调节剂局部或系统地发挥作用、通常参与免疫反应的蛋白质如细胞因子、参与病毒感染的其他宿主蛋白质和病毒蛋白。在本发明的上下文中有用的蛋白质的核苷酸和氨基酸序列，包括由目的基因编码的蛋白质，是本领域已知的并且可在文献中获得，例如在uniprot数据库中获得。
134.术语“片段”或“序列的片段”在本文中具有相同含义，是例如核酸分子如dna或rna或蛋白质的全长序列的较短部分。因此，片段通常由与全长序列内的相应区段相同的序列组成。在本发明的上下文中，优选的序列片段由连续的一段实体诸如核苷酸或氨基酸组成，与该片段所来源的分子中连续的一段实体相对应，并占该片段所来源的整个(即，全长)分子的至少5％，通常至少20％，优选地至少30％，更优选地至少40％，更优选地至少50％，甚至更优选地至少60％，甚至更优选地至少70％，最优选地至少80％。
135.如本文所用，术语“载体”或“表达载体”是指用于在细胞中摄取、增殖、表达或递送核酸的天然存在或合成产生的构建体，例如质粒、小环、噬菌粒、粘粒、人工染色体/微型染色体、噬菌体、病毒如杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、噬菌体。载体可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以作为自主复制的构建体保留在宿主细胞内。用于构建载体的方法为本领域技术人员所熟知并在各种出版物中有所描述。具体而言，用于构建合适载体的技术，包括功能性和调节性组分如启动子、增强子、终止子和多腺苷酸化信号、选择标志物、复制起点和剪接信号的描述，是本领域技术人员已知的。真核表达载体通常还包含促进载体在细菌中扩增的原核序列，例如复制起点和用于在细菌中选择的抗生素抗性基因，其可在真核细胞转染之前去除。含有可以有效连接多核苷酸的克隆位点的多种真核表达载体是众所周知的，并且一些可以从诸如agilent technologies,santa clara,calif.；invitrogen,carlsbad,calif.；promega,madison,wis.或invivogen,san diego,calif等公司商业获得。
136.如本文所用，术语“转录单元”、“表达单元”或“表达盒”是指载体、构建体或多核苷酸序列内的区域，其含有一个或多个待转录的基因，其中，该区段内所包含的基因彼此有效连接。所述基因从单个启动子转录，并且转录由至少一个多聚腺苷酸化信号终止。结果，不同的基因至少在转录水平上是相连的。可以从各转录单元(多顺反子转录单元)转录和表达一个以上的蛋白质或产物。各转录单元将包含转录和翻译在该单元内含有的任何选定序列所必需的调节元件。并且各转录单元可含有相同或不同的调节元件。例如，各转录单元可以含有相同的终止子。ires元件或内含子可用于转录单元内基因的功能性连接。载体或多核苷酸序列可以含有一个以上的转录单元。
137.如本文所用，术语“骨骼肌损伤”是指由肌肉偏心收缩、伸长和肌肉超负荷引起的任何骨骼肌损伤和断裂，优选骨骼肌断裂。原则上，任何骨骼肌都可受到这种损伤或断裂的影响。优选地，骨骼肌损伤是骨骼肌的损伤和断裂，其中骨骼肌选自头部、颈部、胸部、背部、
腹部、骨盆、手臂、腿和臀部的肌肉群。
138.更优选地，骨骼肌损伤是损伤和断裂，其中骨骼肌选自由以下组成的组：跖肌(plantaris)、颞肌(temporal)、乳头肌(papillary)、胸大肌(pectoralis major)、胫后肌(tibialis posterior)、胫骨前肌(tibialis anterior)、腓肠肌(gastrocnemius)、喙肱肌(coracobrachialis)、膈肌(diaphragma)、掌长肌(palmaris longus)、腹直肌(rectus abdominis)、肛门外括约肌(external anal sphincter)、肛门内括约肌(internal anal sphincter)、肩胛下肌(subscapularis)、二头肌(biceps)、三头肌(triceps)、股四头肌(quadriceps)、小腿(calf)、腹股沟(groin)、腘绳肌(hamstring)、三角肌(deltoid)、大圆肌(teres major)、肩袖冈上肌(rotator cuff supraspinatus)、肩袖冈下肌(rotator cuff infraspinatus)、肩袖小圆肌(rotator cuff teres minor)、肩袖肩胛下肌(rotator cuff subscapularis)、股直肌(rectus femoralis)、腹直肌(rectus abdominis)、腹外斜肌(abdominal external oblique)、咬肌(masseter)、斜方肌(trapezius)、背阔肌(latissimus)、胸大肌(pectoralis)、竖脊肌(erector spinae)、髂肋肌(iliocostalis)、最长肌(longissimus)、棘肌(spinalis)、背阔肌(latissimus dorsi)、横棘肌(transversospinales)、背半棘肌(semispinalis dorsi)、半棘肌颈(semispinalis cervices)、头半棘肌(semispinalis capitis)、多裂肌(multifidus)、旋转肌(rotatores)、棘间肌(interspinales)、横突间肌(intertransversarii)、头脾肌(splenius capitis)、颈脾肌(splenius cervices)、肋间肌(intercostals)、肋下肌(subcostales)、胸横肌(transversus thoracis)、肋提肌(levatores costarum)、前锯肌下后肌(serratus posterior inferior)、上后锯肌(serratus posterior superior)、腹横肌(transversus abdominis)、腹直肌(rectus abdominis)、锥体肌(pyramidalis)、提睾肌(cremaster)、腰方肌(quadratus lumborum)、外斜肌(external oblique)、内斜肌(internal oblique)。甚至更优选骨骼肌损伤是损伤和断裂，其中骨骼肌选自跖肌、颞肌、乳头肌、胸大肌、胫骨后肌、胫骨前肌、腓肠肌、喙肱肌、膈肌、掌长肌、腹直肌、肛门外肌括约肌、肛门内括约肌、肩胛下肌、二头肌、三头肌、股四头肌、小腿、腹股沟、腘绳肌、三角肌、大圆肌、肩袖冈上肌、肩袖冈下肌、肩袖小圆肌、肩袖肩胛下肌、股直肌、腹直肌、腹外肌斜肌、咬肌、斜方肌、背阔肌、胸大肌。
139.优选地，通过本发明的方法治疗由肌肉偏心收缩、伸长或肌肉超负荷引起的任何骨骼肌损伤和断裂，优选骨骼肌断裂。
140.术语“受试者”或“患者”包括哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人、非人灵长类动物如黑猩猩和其他猿类和猴类；农场动物，如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，如兔子、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。一方面，哺乳动物是人。如本文所用，术语“动物”包括人和非人动物。在一个实施方案中，“非人动物”是哺乳动物，例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠。在一个实施方案中，非人动物是小鼠。
141.术语“药物组合物”和“药物制剂”(或“制剂”)可互换使用，表示待施用于受试者如有需要的人的、包含治疗有效量的活性药物成分以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的混合物或溶液。
142.术语“药学上可接受的”表示可用于制备药物组合物的材料的属性，其通常是安全的、无毒的，并且在生物学上或其他方面都不是不期望的，并且对于兽医以及人的药物用途
都是可接受的。“药学上可接受的”可以指诸如载体或稀释剂的材料，其不会消除化合物的生物活性或性质，并且相对无毒，即该材料可以施用于个体而不会引起不期望的生物效应或以有害的方式与包含它的组合物的任何组分相互作用。
143.术语“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的载体”和“治疗惰性的赋形剂”可以互换使用并且表示药物组合物中的任何药学上可接受的成分，它们没有治疗活性并且对所施用的受试者无毒，例如用于配制药物产品的崩解剂、粘合剂、填充剂、溶剂、缓冲剂、张度剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、载体、稀释剂、赋形剂、防腐剂或润滑剂。
144.术语“重组多核酸”或“重组rna”可指非天然存在且在体外合成或操作的多核酸或rna。重组多核酸或rna可以在实验室合成，并且可以通过使用dna或rna的酶促修饰，例如酶促限制性消化、连接和克隆，利用重组dna或rna技术制备。可以在体外转录重组多核酸以产生信使rna(mrna)，并且可以分离、纯化重组mrna并用于转染。本文使用的重组多核酸或rna可以编码蛋白质、多肽、靶基序、信号肽和/或非编码rna，例如小干扰rna(sirna)。在合适的条件下，重组多核酸或rna可以掺入细胞并在细胞内表达。
145.如本文所用，术语多核酸、基因、dna或rna的“表达”可以指多核酸、基因、dna或rna的转录和/或翻译。如本文所用，术语“调节”、“增加”、“上调”、“降低”或“下调”多核酸、基因如目的基因、dna或rna如靶mrna的表达，可以指通过影响多核酸、基因如目的基因、dna或rna如靶mrna的转录和/或翻译来调节、增加、上调、降低、下调由多核酸、基因如目的基因、dna或rna如靶mrna编码的蛋白质的水平。术语“抑制”多核酸、基因如目的基因、dna或rna如靶mrna的表达可以指影响多核酸、基因如目的基因、dna或rna如靶mrna的转录和/或翻译，使得由多核酸、基因例如目的基因、dna或rna如靶mrna编码的蛋白质的水平降低或消除。
146.术语“有效连接”可以指两个或更多个核酸序列之间的功能关系，例如转录调节序列或信号序列与转录序列的功能关系。例如，如果靶基序或编码靶基序的核酸表达为参与将由编码序列编码的多肽靶向细胞膜、细胞内区室或细胞外区室的前蛋白，则该靶基序或编码靶基序的核酸有效地连接至编码序列。例如，如果信号肽或编码信号肽的核酸表达为参与编码序列编码的多肽分泌的前蛋白，则该信号肽或编码信号肽的核酸有效地连接至编码序列。例如，如果启动子刺激或调节编码序列的转录，则该启动子是有效地连接的。
147.术语“kozak序列”、“kozak共有序列”或“kozak共有”可以指充当蛋白质翻译起始位点的核酸序列基序。kozak序列在文献如kozak,m.,gene 299(1-2):1-34中详细描述，通过引用其整体并入本文。
148.构建体设计
149.本文公开的本发明涉及组合物，其包含多核酸或rna构建体，以自单个rna转录本表达(i)能够结合一个或多个靶rna(例如mrna)的sirna和(ii)一个或多个的目的基因。本发明提供了一种从单个rna转录本同时表达(i)能够结合一个或多个靶mrna的sirna和(ii)一个或多个目的蛋白质的手段和方法。本发明提供了一种同时调节两个或更多个基因表达的手段和方法。在一些实施方案中，组合物中能够结合靶mrna的sirna可以下调该靶mrna的表达，同时目的基因可以表达或过表达以增加目的基因编码的蛋白质的水平。在一些实施方案中，本发明的重组多核酸或rna构建体包含(i)可以靶向多个mrna的sirna和多个目的基因，(ii)可以靶向一个mrna的多个拷贝的sirna和多个拷贝的相同目的基因，或(iii)(i)和(ii)的组合。在一些实施方案中，本发明的重组多核酸或rna构建体包含靶向多个mrna的
sirna和多个拷贝的相同目的基因。在一些实施方案中，本发明的重组多核酸或rna构建体包含可以靶向一个mrna的多个拷贝的sirna和多个目的基因。
150.在一些方面，本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，其中该重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列；(ii)至少一个编码目的基因的核酸序列；其中靶mrna不同于由目的基因编码的mrna。在一些实施方案中，至少一个编码或包含能够结合靶标的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列是分开的。在一些实施方案中，至少一个编码或包含能够结合靶标的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列由核酸序列分隔开。在一些实施方案中，该分隔核酸序列编码或包含接头。在一些实施方案中，至少一个编码或包含能够结合靶标的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列串联排列。例如，至少一个编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列不插入至少一个编码目的基因的核酸序列内。例如，至少一个编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列不插入至少一个编码目的基因的核酸序列的内含子序列内。在一些实施方案中，sirna不影响目的基因的表达。在一些实施方案中，sirna不降低目的基因的表达。在一些实施方案中，包含重组多核酸构建体的组合物还包含或编码接头。在一些实施方案中，编码或包含接头的核酸序列连接(i)和(ii)。在一些实施方案中，至少一个编码或包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，通过编码或包含接头的核酸序列连接。在一些实施方案中，接头包含trna接头。trna系统在生物之间是进化保守的，并利用内源性rnase p和z来加工多顺反子构建体(dong等人,2016)。在一些实施方案中，trna接头可包含含有aacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggt tcgattcccggctggtgca(seq id no:24)的核酸序列。
151.在一些方面，本文提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；(ii)编码目的基因的mrna；其中靶mrna不同于编码目的基因的mrna。
152.在一些实施方案中，以5’至3’方向包含(i)和(ii)。在一些实施方案中，不以5’至3’方向包含(i)和(ii)。在一些实施方案中，以3’至5’方向包含(i)和(ii)。在一些实施方案中，不以顺序方式包含(i)和(ii)，或(i)和(ii)不以顺序方式存在。在一些实施方案中，以顺序方式包含(i)和(ii)，或(i)和(ii)以顺序方式存在。在一些方面，至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)，以顺序方式被包含或存在。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的下游。在一些方面，编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游或下游。在一些方面，能够结合靶rna的sirna结合靶mrna的外显子。在一些方面，能够结合靶rna的sirna特异性结合一个靶rna。在一些方面，能够结合靶rna的sirna不由目的基因的内含子序列编码或由其组成。在一些方面，目的基因在没有rna剪接的情况下表达。在一些实施方案中，(i)和(ii)可以分开。在一些实施方案中，(i)和(ii)可以串联排列。在一些实施方案中，能够结合靶rna的sirna和编码目的基因的mrna是分开的。在一些实施方案中，能够结合靶rna的sirna和编
码目的基因的mrna串联排列。例如，组合物中，能够结合靶rna的sirna位于编码目的基因的mrna的上游或下游。
153.在一些实施方案中，当组合物包含编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列位于编码目的基因的核酸序列的下游(或3')时，与在编码目的基因的核酸序列的上游(或编码目的基因的核酸序列的5')包含编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列的组合物相比，目的基因的表达增加。在一些实施方案中，当组合物在3’至5’方向上包含编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列和编码目的基因的核酸序列时，与在5’至3’方向上包含编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列和编码目的基因的核酸序列的组合物相比，目的基因的表达增加。
154.如本文所述，在一些实施方案中，在包含重组多核酸构建体的组合物中，以顺序方式包含至少一个编码或包含至少一个能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，在包含重组多核酸构建体的组合物中，至少一个编码或包含至少一个能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列以顺序方式存在。在一些实施方案中，组合物以顺序方式包含至少一个编码或包含两个或更多个、优选2至10个、更优选2至6个能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，当组合物在5’至3’方向上包含编码或包含两个或更多个、优选2至10个、更优选2至6个能够结合靶rna的sirna的核酸序列和编码目的基因的核酸序列时，与在3’至5’方向上包含编码或包含两个或更多个能够结合靶rna的sirna的核酸序列和编码目的基因的核酸序列的组合物相比，目的基因的表达降低。在一些实施方案中，当组合物包含编码或包含两个或更多个、优选2至10个、更优选2至6个能够结合靶rna的sirna的核酸序列位于编码目的基因的核酸序列的上游(或5’)时，与在编码目的基因的核酸序列的下游(或3’)包含编码或包含两个或更多个能够结合靶rna的sirna的核酸序列的组合物相比，目的基因的表达降低。在一些实施方案中，当顺序方式包含至少一个编码目的基因的核酸序列位于编码或包含两个或更多个，优选2至10个，更优选2至6个sirna的至少一个核酸序列的下游(或3’)时，与顺序方式包含至少一个编码目的基因的核酸序列位于编码或包含两个或更多个sirna的至少一个核酸序列的上游(或5’)时相比，目的基因的表达降低。
155.在一些实施方案中，当组合物在3’至5’方向上包含编码或包含两个或更多个、优选2至10个、更优选2至6个能够结合靶rna的sirna的核酸序列和编码目的基因的核酸序列时，与在5’至3’方向上包含编码或包含两个或更多个能够结合靶rna的sirna的核酸序列和编码目的基因的核酸序列的组合物相比，目的基因的表达增加。在一些实施方案中，当组合物在编码目的基因的核酸序列的下游(或在编码目的基因的核酸序列的5’)包含编码和包含两个或更多个，优选2至10个，更优选2至6个能够结合靶rna的sirna的核酸序列时，与在编码目的基因的核酸序列的上游(或在编码目的基因的核酸序列的3’)包含编码和包含两个或更多个能够结合靶rna的sirna的核酸序列的组合物相比，目的基因的表达增加。当顺序方式包含至少一个编码目的基因的核酸序列位于编码或包含两个或更多个，优选2至10个，更优选2至6个sirna的至少一个核酸序列的上游(或5’)时，与顺序方式包含至少一个编码目的基因的核酸序列位于编码或包含两个或更多个sirna的至少一个核酸序列的下游(或3’)时相比，目的基因的表达增加。
156.在一些实施方案中，当组合物在编码目的基因的核酸序列的下游(或编码目的基因的核酸序列的3’)包含编码或包含两个或更多个，优选2至10个，更优选2至6个能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列时，与在编码目的基因的核酸序列的上游(或编码目的基因的核酸序列的5’)包含编码或包含两个或更多个能够结合靶rna的sirna的核酸序列的组合物相比，靶rna的下调增强。在一些实施方案中，当组合物在3’至5’方向上包含编码或包含两个或更多个、优选2至10个、更优选2至6个能够结合靶rna的sirna的核酸序列和编码目的基因的核酸序列时，与在5’至3’方向上包含编码或包含两个或更多个能够结合靶rna的sirna的核酸序列和编码目的基因的核酸序列的组合物相比，靶rna的下调增强。在一些实施方案中，当顺序方式包含编码或包含两个或更多个，优选2至10个，更优选2至6个sirna的至少一个核酸序列位于至少一个编码目的基因的核酸序列的下游(或3’)时，与顺序方式包含编码或包含两个或更多个sirna的至少一个核酸序列位于至少一个编码目的基因的核酸序列的上游(或5’)时相比，靶rna的下调增强。
157.在一些实施方案中，当组合物在编码目的基因的核酸序列的上游(或编码目的基因的核酸序列5’)包含编码或包含两个或更多个，优选2至10个，更优选2至6个能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列时，与在编码目的基因的核酸序列的下游(或编码目的基因的核酸序列3’)包含编码或包含两个或更多个能够结合靶rna的sirna的核酸序列的组合物相比，靶rna的下调减少。在一些实施方案中，当组合物在5’至3’方向上包含编码或包含两个或更多个、优选2至10个、更优选2至6个能够结合靶rna的sirna的核酸序列和编码目的基因的核酸序列时，与在3’至5’方向上包含编码或包含两个或更多个能够结合靶rna的sirna的核酸序列和编码目的基因的核酸序列的组合物相比，靶rna的下调减少。在一些实施方案中，当顺序方式包含编码或包含两个或更多个，优选2至10个，更优选2至6个sirna的至少一个核酸序列位于至少一个编码目的基因的核酸序列的上游(或5’)时，与顺序方式包含编码或包含两个或更多个sirna的至少一个核酸序列位于至少一个编码目的基因的核酸序列的下游(或3’)时相比，靶rna的下调减少。
158.在一些实施方案中，当顺序方式包含至少一个编码目的基因的核酸序列位于编码或包含两个或更多个，优选2至10个，更优选2至6个sirna的至少一个核酸序列的上游(或5’)时，与顺序方式包含至少一个编码目的基因的核酸序列位于编码或包含两个或更多个sirna的至少一个核酸序列的下游(或3’)时相比，目的基因的表达增加，且靶rna的下调增强。
159.在一些实施方案中，目的基因表达的相对增加为约2倍至约30倍。在一些实施方案中，目的基因表达的相对增加为约2倍至约30倍。在一些实施方案中，目的基因表达的相对增加为约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约15倍、约2倍至约17倍、约2倍约18倍、约2倍约19倍、约2倍至约20倍、约2倍至约21倍、约2倍至约22倍、约2倍至约25倍、约2倍至约30倍、约5倍至约10倍、约5倍至约15倍、约5倍至约17倍、约5倍至约18倍、约5倍至约19倍、约5倍至约20倍、约5倍至约21倍、约5倍至约22倍、约5倍至约25倍、约5倍至约30倍、约10倍至约15倍、约10倍至约17倍、约10倍至约18倍、约10倍至约19倍、约10倍至约20倍、约10倍至约21倍、约10倍至约22倍、约10倍至约25倍、约10倍至约30倍、约15倍至约17倍、约15倍至约18倍、约15倍至约19倍、约15倍至约20倍、约15倍至约21倍、约15倍约22倍、约15倍至约25倍、约15倍至约30倍、约17倍至约18倍、约17倍至约19倍、约17倍至约20倍、约17倍至约21倍、约
17倍至约22倍、约17倍至约25倍、约17倍至约30倍、约18倍至约19倍、约18倍至约20倍、约18倍至约21倍、约18倍至约22倍、约18倍至约25倍、约18倍至约30倍、约19倍至约20倍、约19倍至约21倍、约19倍至约22倍、约19倍至约25倍、约19倍至约30倍、约20倍至约21倍、约20倍至约22倍、约20倍至约25倍、约20倍至约30倍、约21倍约22倍、约21倍至约25倍、约21倍至约30倍、约22倍至约25倍、约22倍至约30倍、或约25倍至约30倍。在一些实施方案中，目的基因表达的相对增加为约2倍、约5倍、约10倍、约15倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约21倍、约22倍、约25倍或约30倍。在一些实施方案中，目的基因表达的相对增加为至少约2倍、约5倍、约10倍、约15倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约21倍、约22倍或约25倍。在一些实施方案中，目的基因表达的相对增加为至多约5倍、约10倍、约15倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约21倍、约22倍、约25倍或约30倍。
160.在实施方案中，靶rna下调的相对增强为约1.1倍至约5倍。在实施方案中，靶rna下调的相对增强为约1.1倍至约1.75倍、约1.1倍至约2倍、约1.1倍至约2.25倍、约1.1倍至约2.5倍、约1.1倍至约3倍、约1.1倍至约3.5倍、约1.1倍至约4倍、约1.1倍至约4.5倍、约1.1倍至约5倍、约1.5倍至约1.75倍、约1.5倍至约2倍、约1.5倍至约2.25倍、约1.5倍至约2.5倍、约1.5倍至约3倍、约1.5倍至约3.5倍、约1.5倍至约4倍、约1.5倍至约4.5倍、约1.5倍约5倍、约1.75倍至约2倍、约1.75倍至约2.25倍、约1.75倍至约2.5倍、约1.75倍至约3倍、约1.75倍至约3.5倍、约1.75倍至约4倍、约1.75倍至约4.5倍、约1.75倍至约5倍、约2倍至约2.25倍、约2倍至约2.5倍、约2倍至约3倍、约2倍至约3.5倍、约2倍至约4倍、约2倍至约4.5倍、约2倍至约5倍、约2.25倍至约2.5倍、约2.25倍至约3倍、约2.25倍至约3.5倍、约2.25倍至约4倍、约2.25倍至约4.5倍、约2.25倍至约5倍、约2.5倍至约3倍、约2.5倍至约3.5倍、约2.5倍至约4倍、约2.5倍至约4.5倍、约2.5倍至约5倍、约3倍至约3.5倍、约3倍至约4倍、约3倍至约4.5倍、约3倍至约5倍、约3.5倍至约4倍、约3.5倍至约4.5倍、约3.5倍至约5倍、约4倍至约4.5倍、约4倍至约5倍，或约4.5倍至约5倍。在实施方案中，靶rna下调的相对增强为约1.5倍、约1.75倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍。在实施方案中，靶rna下调的相对增强为至少约1.5倍、约1.75倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍或约4.5倍。在实施方案中，靶rna下调的相对增强最多为约1.75倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍。
161.在一些实施方案中，当顺序方式包含至少一个编码目的基因的核酸序列位于至少一个编码或包含两个或更多个sirna的核酸序列的上游(或5')时，相对于当顺序方式包含至少一个编码目的基因的核酸序列位于至少一个编码或包含两个或更多个sirna的核酸序列的下游(或3')时的目的基因的表达，目的基因的表达增加约2倍至约30倍，且靶rna的下调增加约1.1倍至约5倍。
162.在一些实施方案中，包含重组rna构建体的组合物还编码或包含接头。在一些实施方案中，(i)和(ii)通过编码或包含接头的核酸序列连接。在一些实施方案中，能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)和编码目的基因的mrna，通过编码或包含接头的核酸序列连接。在一些实施方案中，接头包含trna接头。在一些实施方案中，trna接头可包含含有aacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgca(seq id no:24)的核酸序列。
163.在一些实施方案中，重组多核酸构建体编码接头。在一些实施方案中，编码的接头
是2a肽接头。在一些方面，重组核酸构建体编码或包含的接头长度为至少6个核酸残基。在一些方面，重组多核酸构建体编码或包含的接头的长度为至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个或至少40个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为不超过50个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为不超过80个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为不超过10个、不超过15个、不超过20个、不超过25个、不超过30个、不超过35个、不超过40个、不超过45个、不超过50个、不超过55个、不超过60个、不超过65个、不超过70个或不超过75个。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6个核酸残基至约50个核酸残基。在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6个核酸残基至约80个核酸残基。在一些方面，接头的长度为约6个核酸残基至约8个核酸残基、约6个核酸残基至约10个核酸残基、约6个核酸残基至约12个核酸残基、约6个核酸残基至约15个核酸残基、约6个核酸残基至约20个核酸残基、约6个核酸残基至约25个核酸残基、约6个核酸残基至约30个核酸残基、约6个核酸残基至约35个核酸残基、约6个核酸残基至约40个核酸残基、约6个核酸残基至约45个核酸残基、约6个核酸残基至约50个核酸残基、约6个核酸残基至60个核酸残基、约6个核酸残基至约70个核酸残基、约6个核酸残基至约80个核酸残基、约8个核酸残基至约10个核酸残基、约8个核酸残基至约12个核酸残基、约8个核酸残基至约15个核酸残基、约8个核酸残基至约20个核酸残基、约8个核酸残基至约25个核酸残基、约8个核酸残基至约30个核酸残基、约8个核酸残基至约35个核酸残基、约8个核酸残基至约40个核酸残基、约8个核酸残基至约45个核酸残基、约8个核酸残基至约50个核酸残基、约10个核酸残基至约12个核酸残基、约10个核酸残基至约15个核酸残基、约10个核酸残基至约20个核酸残基、约10个核酸残基至约25个核酸残基、约10个核酸残基至约30个核酸残基、约10个核酸残基至约35个核酸残基、约10个核酸至约40个核酸残基、约10个核酸残基至约45个核酸残基、约10个核酸残基至约50个核酸残基、约12个核酸残基至约15个核酸残基、约12个核酸残基至约20个核酸残基、约12个核酸残基至约25个核酸残基、约12个核酸残基至约30个核酸残基、约12个核酸残基至约35个核酸残基、约12个核酸残基至约40个核酸残基、约12个核酸残基至约45个核酸残基、约12个核酸残基至约50个核酸残基、约15个核酸残基至约20个核酸残基、约15个核酸残基至约25个核酸残基、约15个核酸残基至约30个核酸残基、约15个核酸残基至约35个核酸残基、约15个核酸残基至约40个核酸残基、约15个核酸残基至约45个核酸残基、约15个核酸残基至约50个核酸残基、约20个核酸残基至约25个核酸残基、约20个核酸残基至约30个核酸残基、约20个核酸残基至约35个核酸残基、约20个核酸残基至约40个核酸残基、约20个核酸残基至约45个核酸残基、约20个核酸残基至约50个核酸残基、约25个核酸残基长至约30个核酸残基、约25个核酸残基至约35个核酸残基、约25个核酸残基至约40个核酸残基、约25个核酸残基至约45个核酸残基、约25个核酸残基至约50个核酸残基、约30个核酸残基至约35个核酸残基、约30个核酸残基至约40个核酸残基、约30个核酸残基至约45个核酸残基、约30个核酸残基至约50个核酸残基、约35个核酸残基至约40个核酸残基、约35个核酸残基至约45个核酸残基、约35个核酸残基至约50个核酸残基、约40个核酸残基至约45个核酸残基、约40个核酸残基至约50个核酸残基、或约45个核酸残基至约50个核酸残基。在一些方面，接头长度为约6个核酸残基、约8个核酸残基、约10个核酸残基、约12个核酸残基、约15个核酸残基、约20个核酸残基、约25个核酸残
基、约30个核酸残基、约35个核酸残基、约40个核酸残基、约45个核酸残基或约50个核酸残基。在一些方面，接头长度为至少约6个核酸残基、约8个核酸残基、约10个核酸残基、约12个核酸残基、约15个核酸残基、约20个核酸残基、约25个核酸残基、约30个核酸残基、约35个核酸残基、约40个核酸残基或约45个核酸残基。在一些方面，接头长度最多为约8个核酸残基、约10个核酸残基、约12个核酸残基、约15个核酸残基、约20个核酸残基、约25个核酸残基、约30个核酸残基、约35个核酸残基、约40个核酸残基、约45个核酸残基或约50个核酸残基。
164.在一些方面，编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约15个核酸残基。在一些方面，接头长度为约6个核酸残基至约7个核酸残基、约6个核酸残基至约8个核酸残基、约6个核酸残基至约9个核酸残基、约6个核酸残基至约10个核酸残基、约6个核酸残基至约11个核酸残基、约6个核酸残基至约12个核酸残基、6个核酸残基至约13个核酸残基、约6个核酸残基至约14个核酸残基长、约6个核酸残基至约15个核酸残基、约7个核酸残基至约8个核酸残基、约7个核酸残基至约9个核酸残基、约7个核酸残基至约10个核酸残基、约7个核酸残基至约11个核酸残基、约7个核酸残基至约12个核酸残基、约7个核酸残基至约长度13个核酸残基、约7个核酸残基至约14个核酸残基、约7个核酸残基至约15个核酸残基、约8个核酸残基至约9个核酸残基、约8个核酸残基至约10个核酸残基、约8个核酸残基至约11个核酸残基、约8个核酸残基至约12个核酸残基、约8个核酸残基至约约13个核酸残基、约8个核酸残基至约14个核酸残基、约8个核酸残基至约15个核酸残基、约9个核酸残基至约10个核酸残基、约9个核酸残基至约11个核酸残基、约9个核酸残基至约12个核酸残基、约9个核酸残基至约13个核酸残基、约9个核酸残基至约14个核酸残基、约9个核酸残基至约15个核酸残基、约10个核酸残基至约11个核酸残基、约10个核酸残基至约12个核酸残基、约10个核酸残基至约13个核酸残基、约10个核酸残基至约14个核酸残基、约10个核酸残基至约15个核酸残基、约11个核酸残基至约12个核酸残基、约11个核酸残基至约13个核酸残基、约11个核酸残基至约14个核酸残基、约11个核酸残基至约15个核酸残基、约12个核酸残基至约13个核酸残基、约12个核酸残基至约14个核酸残基、约12个核酸残基至约15个核酸残基、约13个核酸残基至约14个核酸残基、约13个核酸残基至约15个核酸残基、或约14个核酸残基至约15个核酸残基。在一些方面，接头长度为约6个核酸残基、约7个核酸残基、约8个核酸残基、约9个核酸残基、约10个核酸残基、约11个核酸残基、约12个核酸残基、约13个核酸残基、约14个核酸残基或约15个核酸残基。在一些方面，接头长度为至少约6个核酸残基、约7个核酸残基、约8个核酸残基、约9个核酸残基、约10个核酸残基、约11个核酸残基、约12个核酸残基、约13个核酸残基或约14个核酸残基。在一些方面，接头长度最多为约7个核酸残基、约8个核酸残基、约9个核酸残基、约10个核酸残基、约11个核酸残基、约12个核酸残基、约13个核酸残基、约14个核酸残基或约15个核酸残基。
165.在一些实施方案中，重组多核酸构建体是环状的。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是线性的。在一些实施方案中，重组多核酸是dna。在一些实施方案中，重组多核酸是rna。
166.在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含启动子。在一些实施方案中，启动子位于至少一个编码或包含sirna的核酸序列的上游。启动子的非限制性实例包括t3、t7、sp6、p60、syn5和kp34等。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含t3启动子。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含sp6启动子。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含p60
启动子。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含syn5启动子。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含kp34启动子。在一个优选的实施方案中，重组多核酸构建体包含t7启动子。在一些实施方案中，t7启动子包含含有taatacgactcactata(seq id no:25)的序列。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体还包含kozak序列。
167.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以是密码子优化的。在一些实施方案中，本发明中用于转录本发明的重组rna构建体的重组多核酸和本发明的重组rna构建体是密码子优化的。一般而言，密码子优化是指通过替换天然序列的至少一个密码子(例如，超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子)来修饰用于在目的宿主细胞中表达的核酸序列以过程，其中应用在该宿主细胞的基因中更频繁的或更频繁地使用的密码子进行所述密码子替换，并同时保持天然氨基酸序列。密码子使用表很容易获得，例如，在“密码子使用数据库”中，这些表可以通过多种方式进行适用。还可以获得用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法，例如gene(aptagen,pa)和(thermofischer,ma)。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可不是密码子优化的。
168.在一些方面，本文提供包含重组多核酸或rna构建体的组合物，其中该构建体包含：至少一个编码或包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码目的基因的核酸序列；其中靶mrna不同于由目的基因编码的mrna。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以包含两个或更多个编码或包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列和两个或更多个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸或rna构建体可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码能够结合靶mrna的sirna的核酸序列。在该实施方案中，所述两个或更多个核酸序列各自可编码或包含能够结合相同靶mrna或不同靶mrna的sirna。在一个实施方案中，所述两个或更多个核酸序列各自可编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna。在另一个实施方案中，所述两个或更多个核酸序列各自可编码或包含能够结合不同靶mrna的sirna。在一些实施方案中，重组核酸或rna构建体可以包含两个或更多个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸或rna构建体可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列。在该实施方案中，所述两个或更多个核酸序列各自可编码相同目的基因或不同目的基因，其中由相同目的基因或不同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。在一个实施方案中，所述两个或更多个核酸序列各自可编码相同目的基因，其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。在另一个实施方案中，所述两个或更多个核酸序列各自可编码不同目的基因，其中由不同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
169.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以包含两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，其中编码或包含sirna的两个或更多个核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中至少一个编码目的基因的核酸序列编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
170.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，其中编码或包含sirna的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个
核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中至少一个编码目的基因的核酸序列编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
171.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以包含两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，其中两个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合不同靶mrna的sirna，其中所述至少一个编码目的基因的核酸序列编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
172.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，其中所述3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合不同靶mrna的sirna，其中所述至少一个编码目的基因的核酸序列编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
173.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以包含至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中至少一个编码或包含sirna的核酸序列编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
174.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中至少一个编码或包含sirna的核酸编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中编码目的基因的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核酸序列各自编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
175.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中至少一个编码或包含sirna的核酸序列编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码不同目的基因，并且其中由不同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
176.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中至少一个编码或包含sirna的核酸编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中编码目的基因的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核酸序列各自编码不同目的基因，并且其中由不同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
177.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中两个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
178.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含两个或更多个编码或包含能
够结合靶mrna的sirna的核酸序列和两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中两个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合不同靶mrna的sirna，其中两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
179.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中两个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码不同目的基因，并且其中由不同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
180.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以包含两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中两个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合不同靶mrna的sirna，其中两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码不同目的基因，其中由不同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
181.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
182.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合不同靶mrna的sirna，其中两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
183.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码不同目的基因，并且其中由不同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
184.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合不同靶mrna的sirna，其中两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码不同目的基因，并且其中由不同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
185.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含两个或更多个编码或包含能
够结合靶mrna的sirna的核酸序列和3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中两个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
186.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中两个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合不同靶mrna的sirna，其中3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
187.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中两个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码不同目的基因，并且其中由不同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
188.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中两个或更多个编码或包含sirna的核酸序列各自编码或包含能够结合不同靶mrna的sirna，其中3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列各自编码不同目的基因，并且其中由不同目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
189.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含三个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，其中所述三个或更多个编码或包含sirna的核酸序列中的一个或多个编码或包含能够结合第一靶mrna的sirna，并且所述三个或更多个编码或包含sirna的核酸序列中的一个或多个编码或包含能够结合第二靶mrna的sirna，其中所述第一靶mrna和第二靶mrna不同，其中所述至少一个编码目的基因的核酸序列编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna所能够结合的第一和第二靶mrna。例如，本发明的重组多核酸或rna构建体可包含五个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，其中所述五个编码或包含sirna的核酸序列中的三个编码或包含能够结合第一靶mrna的sirna，并且所述五个编码或包含sirna的核酸序列中的另外两个编码或包含能够结合第二靶mrna的sirna，其中第一靶mrna和第二靶mrna不同，其中所述至少一个编码目的基因的核酸序列编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna所能够结合的第一靶mrna和第二靶mrna。
190.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含三个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，其中所述三个或更多个编码或包含sirna的核酸序列中的一个或多个编码或包含能够结合第一靶mrna的
sirna，所述三个或更多个编码或包含sirna的核酸序列中的另外一个或多个编码或包含能够结合第二靶mrna的sirna，并且所述三个或更多个编码或包含sirna的核酸序列中的其他一个或多个编码或包含能够结合第三靶mrna的sirna，其中第一靶mrna、第二靶mrna和第三靶mrna不同，其中所述至少一个编码目的基因的核酸序列编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna所能够结合的第一靶mrna、第二靶mrna和第三靶mrna。例如，本发明的重组多核酸或rna构建体可包含五个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，其中所述五个编码或包含sirna的核酸序列中的两个编码或包含能够结合第一靶mrna的sirna，所述五个编码或包含sirna的核酸序列中的一个编码或包含能够结合第二靶mrna的sirna，并且所述五个编码或包含sirna的核酸序列中的一个编码或包含能够结合第三靶mrna的sirna，其中第一靶mrna、第二靶mrna和第三靶mrna不同，其中所述至少一个编码目的基因的核酸序列编码相同目的基因，并且其中由相同目的基因编码的mrna不同于sirna所能够结合的第一靶mrna、第二靶mrna和第三靶mrna。
191.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和三个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中所述至少一个编码或包含sirna的核酸序列编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中所述三个或更多个编码目的基因的核酸序列中的一个或多个编码第一目的基因和所述三个或更多个编码目的基因的核酸序列中的一个或多个编码第二目的基因，其中第一目的基因和第二目的基因不同，并且其中由第一目的基因和第二目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。例如，本发明的重组多核酸或rna构建体可包含至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和五个编码目的基因的核酸序列，其中所述至少一个编码或包含sirna的核酸序列编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中所述五个编码目的基因的核酸序列中的三个编码第一目的基因，并且所述五个编码目的基因的核酸序列中的两个编码第二目的基因，其中第一目的基因和第二目的基因不同，并且其中由第一目的基因和第二目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
192.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以包含至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和三个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中所述至少一个编码或包含sirna的核酸序列编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中所述三个或更多个编码目的基因的核酸序列中的一个或多个编码第一目的基因，所述三个或更多个编码目的基因的核酸序列中的一个或多个编码第二目的基因，并且所述三个或更多个编码目的基因的核酸序列中的一个或多个编码第三目的基因，其中第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因不同，并且其中由第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。例如，本发明的重组多核酸或rna构建体可包含至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和五个编码目的基因的核酸序列，其中所述至少一个编码或包含sirna的核酸序列编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna，其中所述五个编码目的基因的核酸序列中的三个编码第一目的基因，所述五个编码目的基因的核酸序列中的一个编码第二目的基因，并且所述五个编码目的基因的核酸序列中的一个编码第三目的基因，其中第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因不同，并且其中由第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因编码的mrna不同于sirna靶mrna。
193.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含三个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和三个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中所述三个或更多个编码或包含sirna的核酸序列中的一个或多个编码或包含能够结合第一靶mrna的sirna并且所述三个或更多个编码或包含sirna的核酸序列中的一个或多个编码或包含能够结合第二靶mrna的sirna，其中第一靶mrna和第二靶mrna不同，其中所述三个或更多个编码目的基因的核酸序列中的一个或多个编码第一目的基因并且所述三个或更多个编码目的基因的核酸序列中的一个或多个编码第二目的基因，其中第一目的基因和第二目的基因不同，并且其中由第一目的基因和第二目的基因编码的mrna不同于sirna所能够结合的第一靶mrna和第二靶mrna。例如，重组多核酸或rna构建体可包含五个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和五个编码目的基因的核酸序列，其中所述五个编码或包含sirna的核酸序列中的三个编码或包含能够结合第一靶mrna的sirna并且所述五个编码或包含sirna的核酸序列中的其他两个编码或包含能够结合第二靶mrna的sirna，其中第一靶mrna和第二靶mrna不同，其中所述五个编码目的基因的核酸序列中的三个编码第一目的基因并且所述五个编码目的基因的核酸序列中的两个编码第二目的基因，其中第一目的基因和第二目的基因不同，并且其中由第一目的基因和第二目的基因编码的mrna不同于sirna所能够结合的第一靶mrna和第二靶mrna。
194.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含三个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和三个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中所述三个或更多个编码或包含sirna的核酸序列中的一个或多个编码或包含能够结合第一靶mrna的sirna，所述三个或更多个编码或包含sirna的核酸序列中的另外一个或多个编码或包含能够结合第二靶mrna的sirna，并且所述三个或更多个编码或包含sirna的核酸序列中的其他一个或多个编码或包含能够结合第三靶mrna的sirna，其中第一靶mrna、第二靶mrna和第三靶mrna不同，其中所述三个或更多个编码目的基因的核酸序列中的一个或多个编码第一目的基因，所述三个或更多个编码目的基因的核酸序列中的一个或多个编码第二目的基因，并且所述三个或更多个编码目的基因的核酸序列中的一个或多个编码第三目的基因，其中第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因不同，并且其中由第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因编码的mrna不同于sirna所能够结合的第一靶mrna、第二靶mrna和第三靶mrna。例如，本发明的重组多核酸或rna构建体可包含五个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和五个编码目的基因的核酸序列，其中所述五个编码或包含sirna的核酸序列中的两个编码或包含能够结合第一靶mrna的sirna，所述五个编码或包含sirna的核酸序列中的一个编码或包含能够结合第二靶mrna的sirna，并且所述五个编码或包含sirna的核酸序列中的一个编码或包含能够结合第三靶mrna的sirna，其中第一靶mrna、第二靶mrna和第三靶mrna不同，并且其中所述五个编码目的基因的核酸序列中的三个编码第一目的基因，所述五个编码目的基因的核酸序列中的一个编码第二目的基因，并且所述五个编码目的基因的核酸序列中的一个编码第三目的基因，其中第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因不同，并且其中由第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因编码的mrna不同于sirna所能够结合的第一靶mrna、第二靶mrna和第三靶mrna。
195.在多核苷酸构建体编码多个目的基因的一些实施方案中，所有目的基因编码相同蛋白质。在一些实施方案中，所有目的基因编码不同蛋白质。在一些实施方案中，多于一个
目的基因编码相同蛋白质并且至少一个目的基因编码不同蛋白质。在多核苷酸构建体编码或包含多个sirna的一些实施方案中，由多核苷酸构建体编码或包含的所有sirna能够结合相同rna。在一些实施方案中，所有sirna分别能够结合不同靶rna。在一些实施方案中，多于一个sirna能够结合相同靶rna并且至少一个sirna能够结合不同靶rna。在一些实施方案中，靶rna是mrna。在一些实施方案中，靶rna是非编码rna。在一些实施方案中，当由多核苷酸构建体编码或包含的多个sirna能够结合相同靶rna时，所有或一些sirna能够结合相同或不同的靶rna结合位点。
196.重组rna构建体
197.在本发明的一个实施方案中，重组多核酸构建体是重组rna构建体。在一些实施方案中，重组rna构建体是裸rna。在一个优选的实施方案中，重组rna构建体包含5'帽(例如，抗反向帽类似物、clean cap、cap 0、cap 1、cap 2或锁核酸帽(lna-帽)等)，内部核糖体进入位点(ires)，和/或3'端的poly(a)尾，特别地以改善翻译。在一些实施方案中，重组rna构建体具有本领域技术人员已知的其他促进翻译的区域。在一些实施方案中，5'帽包括抗反向帽类似物、clean cap、cap 0、cap 1、cap 2或锁核酸帽(lna-帽)。在一些实施方案中，5'帽包含m
27,3'-o
g(5')ppp(5')g、m7g、m7g(5’)g、m7gpppg或m7gpppgm。
198.在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码poly(a)的核酸序列。在一些实施方案中，重组rna构建体包含poly(a)尾。
199.在一些实施方案中，poly(a)尾包含1、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215或220个碱基对的poly(a)(seq id no:192)。在一些实施方案中，poly(a)尾包含1至220碱基对的poly(a)(seq id no:191)。在一些实施方案中，poly(a)尾包含1至20、1至40、1至60、1至80、1至100、1至120、1至140、1至160、1至180、1至200、1至220、20至40、20至60、20至80、20至100、20至120、20至140、20至160、20至180、20至200、20至220、40至60、40至80、40至100、40至120、40至140、40至160、40至180、40至200、40至220、60至80、60至100、60至120、60至140、60至160、60至180、60至200、60至220、80至100、80至120、80至140、80至160、80至180、80至200、80至220、100至120、100至140、100至160、100至180、100至200、100至220、120至140、120至160、120至180、120至200、120至220、140至160、140至180、140至200、140至220、160至180、160至200、160至220、180至200、180至220、或200至220个碱基对的poly(a)(seq id no:194)。在一些实施方案中，poly(a)尾包含1、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200或220个碱基对的poly(a)(seq id no:195)。在一些实施方案中，poly(a)尾包含至少1、20、40、60、80、100、120、140、160、180或200个碱基对的poly(a)(seq id no:199)。在一些实施方案中，poly(a)尾包含至多20、40、60、80、100、120、140、160、180、200或220个碱基对的poly(a)(seq id no:196)。在一个优选的实施方案中，poly(a)尾包含120个碱基对的poly(a)(seq id no:193)。
200.在本发明的一个实施方案中，重组rna构建体可包含修饰的和未修饰的核苷酸的组合。在一个优选的实施方案中，在这种修饰的重组rna构建体中，1至100％，优选地10至100％，更优选地50至100％，甚至更优选地90至100％，最优选地100％的尿苷核苷酸可以被修饰。在一些实施方案中，从本文所述的任何dna构建体转录的重组rna构建体可包含修饰的尿苷。在一个优选的实施方案中，从本文所述的任何dna构建体转录的重组rna构建体中
100％的尿苷核苷酸被修饰。在一些实施方案中，含有腺苷、鸟苷和胞苷的核苷酸是未修饰的或部分修饰的，并且它们优选地以未修饰的形式存在。优选地，重组rna构建体中修饰的尿苷核苷酸的含量可以在5至25％的范围内。修饰的尿苷核苷酸的非限制性实例可包括假尿苷、n
1-甲基假尿苷或n
1-甲基假-utp，并且可以使用本领域已知的任何修饰的尿苷核苷酸。在一些实施方案中，重组rna构建体可以包含修饰的和未修饰的核苷酸的组合，其中在这种修饰的重组rna构建体中，1至100％，优选地10至100％，更优选地50至100％，甚至更优选地90至100％、最优选地100％的尿苷核苷酸可包含假尿苷、n
1-甲基假尿苷、n
1-甲基假-utp、或本领域已知的任何其他修饰的尿苷核苷酸。在一些实施方案中，重组rna构建体可包含修饰的和未修饰的核苷酸的组合，其中在这种修饰的重组rna构建体中，1至100％，优选地10至100％，更优选地50至100％，甚至更优选地90至100％，最优选地100％的尿苷核苷酸可以包含n
1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，从本文所述的任何dna构建体转录的重组rna构建体可包含n
1-甲基假尿苷。在一个优选实施方案中，从本文所述的任何dna构建体转录的重组rna构建体中100％的尿苷核苷酸被修饰为n
1-甲基假尿苷。
201.在一些实施方案中，重组rna构建体可以是密码子优化的。密码子优化是指通过替换天然序列的至少一个密码子(例如，超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子)来修饰用于在目的宿主细胞中表达的核酸序列的过程，其中应用在该宿主细胞的基因中是更频繁的或更频繁地使用的密码子来进行所述密码子替换，同时保持天然氨基酸序列。密码子使用表很容易获得，例如，在“密码子使用数据库”中，这些表可以通过多种方式进行适用。还可以获得用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法，例如优选gene(aptagen,pa)和(thermofischer,ma)。在一些实施方案中，重组rna构建体可不是密码子优化的。
202.在一个优选的实施方案中，本发明提供包含重组rna构建体的组合物，其中该构建体包含：(i)能够结合白细胞介素8(il-8)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码胰岛素样生长因子1(igf-1)的mrna。
203.在另一个优选的实施方案中，本发明提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合白细胞介素1β(il-1β)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码胰岛素样生长因子1(igf-1)的mrna。
204.在另一个优选的实施方案中，本发明提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合白细胞介素17(il-17)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码白细胞介素4(il-4)的mrna。
205.在另一个优选的实施方案中，本发明提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合肿瘤坏死因子α(tnf-alpha或tnf-α)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码白细胞介素4(il-4)的mrna。
206.在另一个优选的实施方案中，本发明提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合肿瘤坏死因子α(tnf-α)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)和能够结合白细胞介素17(il-17)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码白细胞介素4(il-4)的mrna。
207.在另一个优选的实施方案中，本发明是一种组合物，其包含多核酸构建体，该多核酸构建体包含选自由seq id no:1-8组成的组的核酸序列。
208.在另一个优选的实施方案中，本发明是一种组合物，其包含多核酸构建体，例如重组rna构建体，该构建体包含选自由seq id no:29-47组成的组的核酸序列。
209.在另一个优选的实施方案中，本发明是一种组合物，其包含多核酸构建体，该构建体包含选自由seq id no:1-8和seq id nos:29-47组成的组的核酸序列。
210.在另一个优选的实施方案中，本发明提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合激活素受体样激酶-2(alk2)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码胰岛素样生长因子1(igf-1)的mrna。
211.在另一个优选的实施方案中，本发明提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合超氧化物歧化酶-1(sodl)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码胰岛素样生长因子1(igf-1)的mrna。
212.在另一个优选的实施方案中，本发明提供包含重组rna构建体的组合物，其中该重组rna构建体包含：(i)能够结合超氧化物歧化酶-1(sodl)信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)编码促红细胞生成素(epo)的mrna。
213.在另一个优选的实施方案中，本发明是一种组合物，其包含多核酸构建体，该多核酸构建体包含选自由seq id no:152-158组成的组的核酸序列。
214.在一些实施方案中，本文所述的重组多核酸构建体包含与seq id no:177-189中的任一个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的重组多核酸构建体包含与seq id no:190具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的序列。
215.在另一个优选实施方案中，本发明是一种组合物，其包含多核酸构建体，该多核酸构建体包含选自由seq id no:177-189组成的组的核酸序列。
216.在另一个优选的实施方案中，本发明是组合物，其包含多核酸构建体，该多核酸构建体包含seq id no:190的核酸序列。
217.在一些方面，本文提供产生rna构建体的方法，该rna构建体包含能够结合靶mrna的sirna和编码目的基因的mrna。在一些实施方案中，rna构建体通过体外转录产生。在该实施方案中，通过体外(“无细胞”)转录提供：(i)包含启动子、至少一个编码能够结合靶mrna的sirna的核酸序列、至少一个编码目的基因的核酸序列和编码poly(a)尾的核酸序列的多核酸构建体；(ii)rna聚合酶；和(iii)三磷酸核苷酸(ntp)的混合物。使用体外转录产生rna以及分离和纯化转录的rna的细节在本领域中是众所周知的，并且可以在例如beckert&masquida((2011)synthesis of rna by in vitro transcription.rna.methods in molecular biology(methods and protocols),第703卷.humana press)中找到。体外转录试剂盒的非限制性列表包括megascript
tm t3转录试剂盒、megascript t7试剂盒、megascript
tm sp6转录试剂盒、maxiscript
tm t3转录试剂盒、maxiscript
tm t7转录试剂盒、maxiscript
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tm t7转录试剂盒、mmessage mmachine
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tm t7转录试剂盒、hiscribe
tm t7高产rna合成试剂盒、hiscribe
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tm
转录试剂盒、ampliscribe
tm t7高产转录试剂盒、ampliscribe
tm t7-flash
tm
生物素-rna转录试剂盒、
t7转录试剂盒、高产t7 rna合成试剂盒、t7转录试剂盒等。
218.在一些实施方案中，多核酸构建体可以是线性的。体外转录反应可以进一步包括转录缓冲系统、三磷酸核苷酸(ntp)和rnase抑制剂。在一些实施方案中，转录缓冲系统可包含二硫苏糖醇(dtt)和镁离子。ntp可以是天然存在的或非天然存在的(修饰的)ntp。非天然存在的(修饰的)ntp的非限制性实例包括n
1-甲基假尿苷、假尿苷、n
1-乙基假尿苷、n
1-甲氧基甲基假尿苷、n
1-丙基假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、5-羧甲基酯尿苷、5-甲酰尿苷、5-羧基尿苷、5-羟基尿苷、5-溴尿苷、5-碘尿苷、5,6-二氢尿苷、6-氮杂尿苷、噻吩尿苷(thienouridine)、3-甲基尿苷、1-羧甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-甲基胞苷、5-甲氧基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、5-羟基胞苷、5-碘胞苷、5-溴胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、假异胞苷、3-甲基胞苷、n
4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、n
4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、n
1-甲基腺苷、n
6-甲基腺苷、n
6-甲基-2-氨基腺苷、n
6-异戊烯基腺苷、n6,n
6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。dna依赖性rna聚合酶的非限制性实例包括t3、t7、sp6、p60、syn5和kp34rna聚合酶。在一些实施方案中，rna聚合酶选自由以下组成的组：t3 rna聚合酶、t7rna聚合酶、sp6 rna聚合酶、p60 rna聚合酶、syn5 rna聚合酶和kp34 rna聚合酶。在一些实施方案中，rna聚合酶是t3 rna聚合酶。在一些实施方案中，rna聚合酶是sp6rna聚合酶。在一些实施方案中，rna聚合酶是p60 rna聚合酶。在一些实施方案中，rna聚合酶是syn5 rna聚合酶。在一些实施方案中，rna聚合酶是kp34 rna聚合酶。在一个优选的实施方案中，rna聚合酶是t7 rna聚合酶。
219.在进一步的实施方案中，转录的rna可以从体外转录反应混合物中分离和纯化。在该实施方案中，可以使用柱纯化来分离和纯化转录的rna。从体外转录反应混合物中分离和纯化转录的rna的细节在本领域是众所周知的并且可以使用任何市售的试剂盒。rna纯化试剂盒的非限制性列表包括megaclear试剂盒、rna cleanup试剂盒、rna纯化试剂盒、rna clean-up等。
220.用于治疗病毒性疾病或病况的重组多核酸构建体
221.本发明的重组多核酸构建体可以针对与病毒感染相关的疾病和病况的治疗。在这些实施方案中，重组多核酸构建体通过提供编码或包含能够结合特定靶标(一个或多个)的单个或多个小干扰rna(sirna)的核酸序列、以及编码单个或多个用于过表达的蛋白质的核酸序列，可以同时下调一种或多种蛋白质的表达和上调一种或多种蛋白质的表达。在一些实施方案中，重组多核酸是dna。在一些实施方案中，重组多核酸是rna。
222.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组多核酸或rna构建体，该重组多核酸或rna构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够特异性结合靶rna(例如，mrna或非编码rna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码目的基因的核酸序列；其中靶rna不同于目的基因编码的mrna。
223.在一些实施方案中，(i)和(ii)以5'至3'方向取向((i)的元件位于(ii)的元件的上游)。在一些实施方案中，(i)和(ii)不以5'至3'方向取向(例如，(ii)的元件(一个或多个)位于(i)的元件的上游)。在一些实施方案中，至少一个编码或包含能够特异性结合靶
rna(例如，mrna或非编码rna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列位于至少一个编码目的基因的核酸序列的上游。在一些实施方案中，至少一个编码或包含能够特异性结合靶rna(例如，mrna或非编码rna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列位于至少一个编码目的基因的核酸序列的下游。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码或包含接头的核酸序列。在一些实施方案中，编码或包含接头的核酸序列连接(i)和(ii)。在一些实施方案中，编码或包含接头的核酸序列连接至少一个编码或包含能够特异性结合靶rna(例如，mrna或非编码rna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，接头包含trna接头。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是环状的。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是线性的。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是dna。在一些实施方案中，重组多核酸构建体是rna。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含如seq id no:1-8或29-47之一所示的核酸序列。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含如seq id no:152-158之一所示的核酸序列。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含如seq id no:177-190之一所示的核酸序列。
224.在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码或包含poly(a)尾的核酸序列。在一些实施方案中，poly(a)尾包含1-220个a残基(seq id no:191)。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含5'帽。在一些实施方案中，5'帽包括抗反向帽类似物、clean cap、cap 0、cap 1、cap 2或锁核酸帽(lna-帽)。在一些实施方案中，5'帽包含m
27,3'-o
g(5')ppp(5')g、m7g,m7g(5’)g、m7gpppg或m7gpppgm。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含启动子。在一些实施方案中，启动子选自由t3、t7、sp6、p60、syn5和kp34组成的组。在一些实施方案中，启动子是t7启动子。在一些实施方案中，t7启动子位于至少一个编码或包含sirna的核酸序列的上游。在一些实施方案中，t7启动子位于至少一个编码或包含目的基因的核酸序列的上游。在一些实施方案中，t7启动子包含序列taatacgactcactata(seq id no:25)。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含kozak序列。在一些实施方案中，kozak序列是gccacc(seq id no:26)。
225.在一些实施方案中，重组多核酸构建体编码或包含1-10个sirna。在一些实施方案中，这些sirna相同。在一些实施方案中，这些sirna不同。在一些实施方案中，一些sirna相同而一些不同。在一些实施方案中，sirna包含有义sirna链。在一些实施方案中，sirna包含反义sirna链。在一些实施方案中，sirna包含有义和反义sirna链。在一些实施方案中，sirna不影响目的基因的表达。在一些实施方案中，sirna不抑制目的基因的表达。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列。在一些实施方案中，重组多核酸构建体还包含编码或包含接头的核酸序列。在一些实施方案中，通过编码或包含接头的核酸序列，连接两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列之每一个。在一些实施方案中，接头包含trna接头。在一些实施方案中，所述的两个或更多个核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶mrna的sirna。在一些实施方案中，所述的两个或更多个核酸序列各自编码或包含能够结合不同靶mrna的sirna。
226.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组多核酸构建体，该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够特异性结合il-6mrna的sirna；和(ii)编码干扰素β(ifn-β)的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，该组合物包含或编码一个针对
il-6mrna的sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对il-6mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:29或30(化合物b1或b2)所示的序列。
227.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组多核酸构建体，该重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够特异性结合白细胞介素6r(il-6r)mrna的sirna；(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码1个针对il-6r mrna的sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对il-6r mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:31(化合物b3)所示的序列。
228.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组多核酸构建体，该重组多核酸构建体编码或包含(i)至少一个能够特异性结合白细胞介素6rα(il-6r-α)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码1个针对il-6r-αmrna的sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对il-6r-αmrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:32(化合物b4)所示的序列。
229.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组多核酸构建体，该重组多核酸构建体编码或包含(i)至少一个能够特异性结合白细胞介素6rβ(il-6r-β)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码1个针对il-6r-βmrna的sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对il-6r-βmrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:33(化合物b5)所示的序列。
230.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组多核酸构建体，该重组多核酸构建体编码或包含(i)至少一个能够特异性结合ace2 mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码1个针对ace2 mrna的sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对ace2 mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:34或35(化合物b6或b7)所示的序列。
231.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组多核酸构建体，其中所述构建体：编码或包含(i)至少一个能够特异性结合sars cov-2 orf1ab mrna的小干扰rna(sirna)，至少一个能够特异性结合sars cov-2 s mrna的sirna，至少一个能够特异性结合sars cov-2n mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，重组多核酸构建体在(ii)中编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，一个针对sars cov-2 orf1ab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，以及一个针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在某些方面，考虑此类组合物，例如包含化合物b8(seq id no:36)的组
mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，一个针对orf1ab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，以及一个针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:46(化合物b18)所示的序列。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:190(化合物b18)所示的序列。
237.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组多核酸构建体，所述构建体：编码或包含(i)至少一个能够特异性结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，组合物包含或编码至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含或编码1个针对sars cov-2 s mrna的sirna。在相关方面，组合物包含或编码3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:47(化合物b19)所示的序列。
238.在一些方面，ifn-β构建体包含如本文所述的修饰的信号肽。在一些方面，本发明提供组合物，其包含重组多核酸构建体，该重组多核酸构建体包含选自由seq id no:29-47组成的组的核酸序列。在一些方面，本发明提供组合物，其包含重组多核酸构建体，该重组多核酸构建体包含seq id no:190所示的核酸序列。在一些方面，包含重组多核酸构建体的组合物可用于治疗病毒感染、疾病或病况。在一些方面，组合物以足以治疗或预防病毒感染、疾病或病况的量存在或施用。
239.在一些实施方案中，本发明提供组合物和相关方法，其中该组合物包含重组多核酸构建体，该重组多核酸构建体编码或包含：至少一个能够结合靶rna的sirna；和编码目的基因的mrna；其中：sirna靶向选自以下的rna：il-8mrna、il-1βmrna、il-17mrna、tnf-αmrna、sars cov-2 orf1ab rna(多蛋白pp1ab，例如在非编码区或在编码选自以下的蛋白质的部位：sars cov-2非结构蛋白(nsp)、nsp1、nsp3(nsp3b、nsp3c、plpro和nsp3e)、nsp7_nsp8复合物、nsp9-nsp10和nsp14-nsp16、3clpro、e-通道(e蛋白)、orf7a、c端rna结合结构域(crbd)、n端rna结合结构域(nrbd)、解螺旋酶和rdrp)、sars cov-2刺突蛋白(s)mrna、sars cov-2核衣壳蛋白(n)mrna、肿瘤坏死因子α(tnf-α)mrna、白细胞介素mrna(包括但不限于白细胞介素1(例如il-1α、il-1β)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6r(il-6r)、白细胞介素6rα(il-6r-α)、白细胞介素6rβ(il-6r-β)、白细胞介素18(il-18)、白细胞介素36-α(il-36-α)、白细胞介素36-β(il-36-β)、白细胞介素36-γ(il-36-γ)、白细胞介素33(il-33))、血管紧张素转化酶-2(ace2)mrna、跨膜蛋白酶、丝氨酸2(tmprss2)mrna和编码nsp12和13rna；目的基因，该目的基因编码选自以下的蛋白质：igf-1、il-4、igf-1(包括如本文其他地方所述的其衍生物)、羧肽酶(例如ace、ace2、cndp1、cpa1、cpa2、cpa4、cpa5、cpa6、cpb1、cpb2、cpe、cpn1、cpq、cpxm1、cpz、scpep1)；细胞因子(例如bmp1、bmp10、bmp15、bmp2、bmp3、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8a、bmp8b、c1qtnf4、ccl1、ccl11、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、ccl3、ccl3l1、ccl3l3、ccl4、ccl4l、ccl4l2、ccl5、ccl7、ccl8、cd40lg、cer1、cklf、clcf1、cntf、csf1、csf2、csf3、ctf1、cx3cl1、cxcl1、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl17、cxcl2、cxcl3、cxcl5、cxcl8、cxcl9、dkk1、dkk2、dkk3、dkk4、eda、ebi3、fam3b、fam3c、faslg、flt3lg、gdf1、gdf10、gdf11、gdf15、gdf2、gdf3、gdf5、gdf6、gdf7、gdf9、gpi、grem1、grem2、grn、ifna1、ifna13、ifna10、ifna14、ifna16、ifna17、ifna2、
ifna21、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifnb1、ifne、ifng、ifnk、ifnl1、ifnl2、ifnl3、ifnl4、ifnw1、il10、il11、il12a、il12b、il13、il15、il16、il17a、il17b、il17c、il17d、il17f、il18、il19、il1a、il1b、il1f10、il2、il20、il21、il22、il23a、il24、il25、il26、il27、il3、il31、il32、il33、il34、il36a、il36b、il36g、il36rn、il37、il4、il5、il6、il7、il9、lefty1、lefty2、lif、lta、mif、mstn、nampt、nodal、osm、pf4、pf4v1、scgb3a1、sectm1、slurp1、spp1、thnsl2、thpo、tnf、tnfsf10、tnfsf11、tnfsf12、tnfsf13、tnfsf13b、tnfsf14、tnfsf15、tslp、vstm1、wnt1、wnt10a、wnt10b、wnt11、wnt16、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、xcl1和xcl2)；细胞外配体及转运蛋白(例如apcs、chi3l1、chi3l2、clec3b、dmbt1、dmkn、eddm3a、eddm3b、efna4、emc10、enam、epyc、ervh48-1、f13b、fcn1、fcn2、gldn、gpld1、heg1、itfg1、kazald1、kcp、lacrt、leg1、metrn、notch2nl、npnt、olfm1、olfml3、prb2、psap、psapl1、psg1、psg6、psg9、ptx3、ptx4、rbp4、rnase10、rnase12、rnase13、rnase9、rspry1、rtbdn、s100a12、s100a13、s100a7、s100a8、saa2、saa4、scg1、scg2、scg3、scgb1c1、scgb1c2、scgb1d1、scgb1d2、scgb1d4、scgb2b2、scgb3a2、scgn、scrg1、scube1、scube2、scube3、sdcbp、selenop、sfta2、sfta3、sftpa1、sftpa2、sftpc、sftpd、shbg、slurp2、smoc1、smoc2、smr3a、smr3b、snca、spata20、spata6、soga1、sparc、sparcl1、spata20、spata6、srpx2、ssc4d、stx1a、susd4、svbp、tcn1、tcn2、tctn1、tf、tulp3、tff2、tff3、thsd7a、tinag、tinagl1、tmeff2、tmem25、vwc2l)；细胞外基质蛋白(例如abi3bp、agrn、ccbe1、chl1、col15a1、col19a1、colec11、dmbt1、draxin、edil3、eln、emid1、emilin1、emilin2、emilin3、epdr1、fbln1、fbln2、fbln5、flrt1、flrt2、flrt3、frem1、gldn、ibsp、kera、kiaa0100、kirrel3、krt10、lamb2、mgp、rptn、sbspon、sdc1、sdc4、sema3a、sema3b、sema3c、sema3d、sema3e、sema3f、sema3g、siglec1、siglec10、siglec6、slit1、slit2、slit3、slitrk1、sned1、snorc、spaca3、spaca7、spon1、spon2、stath、svep1、tecta、tectb、tnc、tnn、tnr、tnxb)；葡萄糖苷酶(amy1a、amy1b、amy1c、amy2a、amy2b、cemip、chia、chit1、fuca2、glb1l、glb1l2、hpse、hyal1、hyal3、kl、lyg1、lyg2、lyzl1、lyzl2、man2b2、smpd1、smpdl3b、spaca5、spaca5b)；糖基转移酶(例如art5、b4galt1、extl2、galnt1、galnt2、glt1d1、mgat4a、st3gal1、st3gal2、st3gal3、st3gal4、st6gal1、xylt1)；生长因子(例如amh、artn、btc、cdnf、cfc1、cfc1b、chrdl1、chrdl2、clec11a、cnmd、efemp1、egf、egfl6、egfl7、egfl8、epgn、ereg、eys、fgf1、fgf10、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19、fgf2、fgf20、fgf21、fgf22、fgf23、fgf3、fgf4、fgf5、fgf6、fgf7、fgf8、fgf9、frzb、gdnf、gfer、gkn1、hbegf、hgf、igf-1、igf2、inha、inhba、inhbb、inhbc、inhbe、ins、kitlg、manf、mdk、mia、ngf、nov、nrg1、nrg2、nrg3、nrg4、nrtn、ntf3、ntf4、ogn、pdgfa、pdgfb、pdgfc、pdgfd、pgf、prok1、pspn、ptn、sdf1、sdf2、sfrp1、sfrp2、sfrp3、sfrp4、sfrp5、tdgf1、tff1、tgfa、tgfb1、tgfb2、tgfb3、thbs4、timp1、vegfa、vegfb、vegfc、vegfd、wisp3)；生长因子结合蛋白(例如chrd、cyr61、esm1、fgfbp1、fgfbp2、fgfbp3、htra1、ghbp、igfals、igfbp1、igfbp2、igfbp3、igfbp4、igfbp5、igfbp6、igfbp7、ltbp1、ltbp2、ltbp3、ltbp4、sostdc1、nog、twsg1和wif1)；肝素结合蛋白(例如，ada2、adamtsl5、angptl3、apob、apoe、apoh、col5a1、comp、ctgf、fbln7、fn1、fstl1、hrg、lamc2、lipc、lipg、liph、lipi、lpl、pcolce2、postn、rspo1、rspo2、rspo3、rspo4、saa1、slit2、sost、thbs1、vtn)；激素(例如adcyap1、adipoq、adm、adm2、angptl8、apela、apln、avp、c1qtnf12、c1qtnf9、calca、calcb、cck、cga、
cgb1、cgb2、cgb3、cgb5、cgb8、copa、cort、crh、csh1、csh2、cshl1、enho、epo、erfe、fbn1、fndc5、fshb、gal、gast、gcg、gh、gh1、gh2、ghrh、ghrl、gip、gnrh1、gnrh2、gpha2、gphb5、iapp、ins、insl3、insl4、insl5、insl6、lhb、metrnl、mln、nppa、nppb、nppc、ostn、oxt、pmch、ppy、prl、prlh、pth、pthlh、pyy、retn、retnlb、rln1、rln2、rln3、sct、spx、sst、stc1、stc2、tg、tor2a、trh、tshb、ttr、ucn、ucn2、ucn3、uts2、uts2b和vip)；水解酶(例如，aadacl2、abhd15、acp7、acpp、ada2、adamtsl1、aoah、arsf、arsi、arsj、arsk、btd、chi3l2、enpp1、enpp2、enpp3、enpp5、entpd5、entpd6、gbp1、ggh、gpld1、hpse、lipc、lipf、lipg、liph、lipi、lipk、lipm、lipn、lpl、pglyrp2、pla1a、pla2g10、pla2g12a、pla2g1b、pla2g2a、pla2g2d、pla2g2e、pla2g2f、pla2g3、pla2g5、pla2g7、pnlip、pnliprp2、pnliprp3、pon1、pon3、ppt1、smpdl3a、them6、thsd1和thsd4)；免疫球蛋白(例如，igsf10、igkv1-12、igkv1-16、igkv1-33、igkv1-6、igkv1d-12、igkv1d-39、igkv1d-8、igkv2-30、igkv2d-30、igkv3-11、igkv3d-20、igkv5-2、iglc1、iglc2、iglc3)；异构酶(例如，naxe、ppia、ptgds)；激酶(例如，adck1、adpgk、fam20c、icos、pkdcc)；裂合酶(例如，pm20d1、pam、ca6)；金属酶抑制剂(例如，fetub、spock3、timp2、timp3、timp4、wfikkn1、wfikkn2)；金属蛋白酶(例如，adam12、adam28、adam9、adamdec1、adamts1、adamts10、adamts12、adamts13、adamts14、adamts15、adamts16、adamts17、adamts18、adamts19、adamts2、adamts20、adamts3、adamts4、adamts5、adamts6、adamts7、adamts8、adamts9、clca1、clca2、clca4、ide、mep1b、mmel1、mmp1、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp16、mmp17、mmp19、mmp2、mmp20、mmp21、mmp24、mmp25、mmp26、mmp28、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、pappa、pappa2、tll1、tll2)；乳蛋白(例如csn1s1、csn2、csn3、lalba)；神经活性蛋白(例如cartpt、nms、nmu、npb、npff、nps、npvf、npw、npy、pcsk1n、pdyn、penk、pnoc、pomc、prok2、pth2、pyy2、pyy3、qrfp、tac1和tac3)；蛋白酶(例如，adamts6、c1r、c1rl、c2、casp4、cela1、cela2a、cela2b、cfb、cfd、cfi、cma1、corin、ctrb1、ctrb2、ctsb、ctsd、dhh、f10、f11、f12、f2、f3、f7、f8、f9、fap、furin、gzma、gzmk、gzmm、habp2、hgfac、htra3、htra4、ihh、klk10、klk11、klk12、klk13、klk14、klk15、klk3、klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk9、klkb1、masp1、masp2、mst1l、napsa、ovch1、ovch2、pcsk2、pcsk5、pcsk6、pcsk9、pga3、pga4、pga5、pgc、plat、plau、plg、proc、prss1、prss12、prss2、prss22、prss23、prss27、prss29p、prss3、prss33、prss36、prss38、prss3p2、prss42、prss44、prss47、prss48、prss53、prss57、prss58、prss8、prtn3、reln、ren、tmprss11d、tmprss11e、tmprss2、tpsab1、tpsb2、tpsd1)；蛋白酶抑制剂(例如a2m、a2ml1、ambp、anos1、col28a1、col6a3、col7a1、cpamd8、cst1、cst2、cst3、cst4、cst5、cst6、cst7、cst8、cst9、cst9l、cst9lp1、cstl1、eppin、gpc3、hmsd、itih1、itih2、itih3、itih4、itih5、itih6、kng1、oprpn、ovos1、ovos2、papln、pi15、pi16、pi3、pzp、r3hdml、serpina1、serpina10、serpina11、serpina12、serpina13p、serpina3、serpina4、serpina5、serpina7、serpina9、serpinb2、serpinb5、serpinc1、serpine1、serpine2、serpine3、serpinf2、serping1、serpini1、serpini2、spink1、spink13、spink14、spink2、spink4、spink5、spink6、spink7、spink8、spink9、spint1、spint3、spint4、spock1、spock2、spp2、sspo、tfpi、tfpi2、wfdc1、wfdc10a、wfdc13、wfdc2、wfdc3、wfdc5、wfdc6、wfdc8)；蛋白磷酸酶(例如acp7、acpp、pten、ptprz1)；酯酶(例如bche、cel、ces4a、ces5a、notum、siae)；转移酶(例如mettl24、fkrp、chsy1、chst9、b3gat1)；血管活性蛋白(例如aggf1、agt、angpt1、angpt2、angptl4、angptl6、edn1、edn2、
edn3、nts)、i型干扰素(例如ifn-α，包括但不限于干扰素α-n3、干扰素α-2a和干扰素α-2b、ifn-β、ifn-δ、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ν、ifn-τ和ifn-ω)、ii型干扰素(例如ifn-γ)、iii型干扰素(例如ifn-λ)、白细胞介素(例如il-37、il-38)和可溶性ace2受体。在一些方面，包含重组多核酸构建体的组合物可用于治疗病毒感染、疾病或病况。在一些方面，组合物以足以治疗或预防病毒感染、疾病或病况的量存在或施用。在一些实施方案中，疾病或病况选自由椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎和银屑病组成的组。
240.用于治疗病毒性疾病或病况的重组rna构建体
241.如上所述，在一些方面，重组多核酸构建体是重组rna构建体。在一些方面，重组多核酸构建体或重组rna构建体在用于治疗或预防病毒感染、疾病或病况的组合物中是有用的。在一些方面，本发明提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)能够结合靶rna(例如，mrna)的小干扰rna(sirna)；和(ii)目的基因的mrna；其中靶mrna不同于编码目的基因的mrna。
242.在一些实施方案中，重组rna构建体包含1-10个sirna。在一些实施方案中，这些sirna相同，例如，能够结合相同靶mrna。在一些实施方案中，这些sirna不同，例如，能够结合不同靶mrna。在一些实施方案中，一些sirna相同而一些不同。在一些实施方案中，sirna包含有义sirna链。在一些实施方案中，sirna包含反义sirna链。在一些实施方案中，sirna包含有义和反义sirna链。在一些实施方案中，sirna不影响目的基因的表达。在一些实施方案中，sirna不抑制目的基因的表达。在一些实施方案中，重组rna构建体包含两个或更多个包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列。在一些实施方案中，重组rna构建体还包含或编码接头。在一些实施方案中，所述的两个或更多个包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列之每一个，通过编码或包含接头的核酸序列连接。在一些实施方案中，接头包含trna接头。在一些实施方案中，接头包含2a肽接头。在一些实施方案中，所述的两个或更多个核酸序列各自包含能够结合相同靶mrna的sirna。在一些实施方案中，所述的两个或更多个核酸序列各自包含能够结合不同靶mrna的sirna。
243.在一些实施方案中，靶mrna的表达由能够结合靶mrna的sirna调节。在一些实施方案中，靶mrna的表达由能够特异性结合靶mrna的sirna下调。
244.在一些实施方案中，重组rna构建体包含核酸序列，该核酸序列包含目的基因(并由此编码目的mrna和/或对应于目的基因的目的蛋白质)。在一些实施方案中，重组rna构建体包含两个或更多个核酸序列，其各自包含目的基因，并因此各自编码目的mrna和/或对应于该基因的目的蛋白质。
245.在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列各自包含相同目的基因。在一些实施方案中，两个或更多个核酸序列各自编码相同目的mrna和/或目的蛋白质。在一些实施方案中，重组rna构建体包含三个或更多个核酸序列，其各自包含目的基因并且因此各自编码目的mrna和/或对应于基因的目的蛋白质。在一些实施方案中，所述的三个或更多个核酸序列各自可以包含相同目的基因、编码相同目的mrna和/或编码相同目的蛋白质。在一些实施方案中，所述的三个或更多个核酸序列各自可以包含不同目的基因，编码不同目的mrna，和/或编码不同目的蛋白质。在一些实施方案中，所述的三个或更多个核酸序列中的两个或更多个可以包含相同目的基因、编码相同目的mrna和/或编码相同目的蛋白质，而与所述的三个或更多个核酸序列中的该两个或更多个相比，所述的三个或更多个核酸中的一个或多个
核酸序列包含不同目的基因，编码不同目的mrna，和/或编码不同的目的蛋白质。
246.在一些实施方案中，目的基因或蛋白质的表达水平通过表达目的基因编码的mrna或蛋白质来调节。在一些实施方案中，目的基因的表达水平通过表达目的基因编码的mrna或蛋白质而上调。在一些实施方案中，重组rna构建体是密码子优化的。在一些实施方案中，重组rna构建体不是密码子优化的。
247.在一些实施方案中，重组rna构建体还包含编码靶基序(也称为靶向基序)的核酸序列。在一些实施方案中，编码靶基序的核酸序列有效地连接到至少一个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，靶基序包含信号肽、核定位信号(nls)、核仁定位信号(nols)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管端定位信号(mtls)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(er)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号或中心体定位信号(cls)。在一些实施方案中，靶基序选自由以下组成的组：(a)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；和(d)不具有天然靶基序功能的天然存在的氨基酸序列，其中该天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。
248.在一些实施方案中，信号肽选自(a)与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该信号肽通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰，条件是该蛋白质不是氧化还原酶；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该信号肽通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；(d)不具有天然信号肽功能的天然存在的氨基酸序列，其中该天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。在一些实施方案中，信号肽n端的氨基酸1-9的平均疏水性评分在2以上。
249.在一些方面，本文提供细胞，其包含本文所述的任何重组多核酸或rna构建体的组合物。在一些方面，本文提供药物组合物，其包含本文所述的任何重组多核酸或rna构建体的组合物和药学上可接受的赋形剂。在一些方面，本文提供治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，包括向受试者施用本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，疾病或病况是covid-19。在一些实施方案中，疾病或病况是由sars-cov-1感染或sars-cov-2感染引起的sars(严重急性呼吸综合征)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是成人、儿童或婴儿。在一些实施方案中，受试者是伴侣动物。在一些实施方案中，受试者是猫科动物、犬科动物或啮齿动物。在一些实施方案中，受试者是狗或猫。
250.在一些方面，本文提供在细胞中自单个rna转录本同时表达sirna和mrna的方法，包括将本文所述的任何重组多核酸或rna构建体的组合物引入细胞。在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞中，该重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个目的基因的核酸序列；其中靶mrna不同于由目的基因编码的mrna，并且其中同时调节靶mrna和目的基因的表达。
251.在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞中，该重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个目的基因的核酸序列；其中靶mrna不同于由目的基因编码的mrna，并且其中同时下调该靶mrna的表达并且上调该目的基因的表达。在一些实施方案中，靶mrna的表达通过能够结合靶mrna的sirna下调。在一些实施方案中，目的基因的表达通过表达目的基因编码的mrna或蛋白质而上调。
252.在一些方面，本文提供了一种产生rna构建体的方法，该构建体包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)和编码目的基因的mrna，其中该靶mrna不同于编码该目的基因的mrna，该方法包括：(a)提供以下用于体外转录反应：(i)多核酸构建体，其包含启动子、至少一个编码能够结合靶mrna的sirna的核酸序列、至少一个编码目的基因的核酸序列和编码poly(a)尾的核酸序列；(ii)rna聚合酶；和(iii)三磷酸核苷酸(ntp)的混合物；和(b)从体外转录反应混合物中分离并纯化转录的rna，由此产生rna构建体。在一些实施方案中，rna聚合酶选自由以下组成的组：t3 rna聚合酶、t7 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶、p60 rna聚合酶、syn5 rna聚合酶和kp34 rna聚合酶。在一些实施方案中，rna聚合酶是t7 rna聚合酶。在一些实施方案中，ntp混合物包含未修饰的ntp。在一些实施方案中，ntp混合物包含修饰的ntp。在一些实施方案中，修饰的ntp包含n
1-甲基假尿苷、假尿苷、n
1-乙基假尿苷、n
1-甲氧基甲基假尿苷、n
1-丙基假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、5-羧甲基酯尿苷、5-甲酰基尿苷、5-羧基尿苷、5-羟基尿苷、5-溴尿苷、5-碘尿苷、5,6-二氢尿苷、6-氮杂尿苷、噻吩尿苷、3-甲基尿苷、1-羧甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-甲基胞苷、5-甲氧基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、5-羟基胞苷、5-碘胞苷、5-溴胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、n
4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、n
4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、n
1-甲基腺苷、n
6-甲基腺苷、n
6-甲基-2-氨基腺苷、n
6-异戊烯基腺苷、n6,n
6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。
253.在一些实施方案中，步骤(a)还包括提供加帽酶。在一些实施方案中，分离和纯化转录的rna包括柱纯化。
254.在一些实施方案中，sirna与其mrna靶标的特异性结合导致干扰靶标mrna的正常功能以引起功能和/或活性的调节，例如下调，并且其中存在足够程度的互补性，以避免在需要特异性结合的条件下，即在体内测定或治疗处理的情况下的生理条件下和在体外测定的情况下进行测定的条件下，sirna与非靶核酸序列的非特异性结合。
255.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够特异性结合il-6mrna的sirna；(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含1个针对il-6mrna的sirna。在相关方面，组合物包含3个sirna，各自针对il-6mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组rna构建体包含由如seq id no:29或30(化合物b1或b2)所示的序列编码的序列。
256.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够特异性结合白细胞介素6r(il-6r)mrna的sirna；(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含1个针对il-6r mrna的sirna。在相关方面，组合物包含3个sirna，各自针对il-6r mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组rna构建体包含由如seq id no:31(化合物b3)所示的序列编码的序列。
257.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够特异性结合白细胞介素6rα(il-6r-α)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-βmrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，该组合物包含1个针对il-6r-αmrna的sirna。在相关方面，该组合物包含3个sirna，各自针对il-6r-αmrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组rna构建体包含由如seq id no:32(化合物b4)所示的序列编码的序列。
258.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够特异性结合白细胞介素6rβ(il-6r-β)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含1个针对il-6r-βmrna的sirna。在相关方面，组合物包含3个sirna，各自针对il-6r-βmrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组rna构建体包含由如seq id no:33(化合物b5)所示的序列编码的序列。
259.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够特异性结合ace2 mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含1个针对ace2 mrna的sirna。在相关方面，该组合物包含3个sirna，各自针对ace2 mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组rna构建体包含由如seq id no:34或35(化合物b6或b7)所示的序列编码的序列。
260.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够特异性结合sars cov-2 orf1ab mrna的小干扰rna(sirna)，至少一个能够特异性结合sars cov-2 s mrna的sirna，以及至少一个能够特异性结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含3个sirna，一个针对sars cov-2 orf1ab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，一个针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在某些方面，考虑此类组合物，例如包含化合物b8(seq id no:36)的组合物，以用于本文所述的方法中，例如用于调节或调控与sars cov感染、sars cov-2感染或两者相关的基因表达。在相关方面，重组rna构建体包含如seq id no:36所示的序列。
261.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)
至少一个能够特异性结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含1个针对sars cov-2 s mrna的sirna。在相关方面，组合物包含3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组rna构建体包含由如seq id no:37或39(化合物b9或b11)所示的序列编码的序列。
262.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够特异性结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含1个针对sars cov-2 n mrna的sirna。在相关方面，该组合物包含3个sirna，各自针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组rna构建体包含由如seq id no:38(化合物b10)所示的序列编码的序列。
263.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够特异性结合sars cov-2 orf1ab mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含1个针对sars cov-2 orf1ab mrna的sirna。在相关方面，组合物包含3个sirna，各自针对sars cov-2 orf1ab mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在某些方面，考虑此类组合物，包括包含化合物b12(seq id no:40)的组合物，以用于本文所述的方法中，例如用于调节或调控与sars cov感染、mers感染或两者相关的基因表达。在某些方面，考虑此类组合物，包括包含化合物b13(seq id no:41)的组合物，以用于本文所述的方法中，例如用于调节或调控与sars cov感染、sars cov-2感染和/或mers感染相关的基因表达。在相关方面，重组rna构建体包含由如seq id no:40、41和42(化合物b12、b13和b14)中任一项所示的序列编码的序列。
264.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够特异性结合il-6mrna的sirna，至少一个能够特异性结合ace2 mrna的sirna，至少一个能够特异性结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，组合物包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含3个sirna，一个针对il-6mrna，一个针对ace2 mrna，以及一个针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，编码ifn-β的mrna编码天然ifn-β信号肽或修饰的信号肽。在相关方面，修饰的ifn-β信号肽是如本文所述的sp1或sp2(分别为seq id no:52和54)。在相关方面，重组rna构建体包含由如seq id no:43、44和45(化合物b15、b16和b17)中任一项所列的序列编码的序列。
265.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够特异性结合sars cov-2 orf1ab mrna的小干扰rna，至少一个能够特异性结合sars cov-2 s mrna的sirna，至少一个能够特异性结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，组合物包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含3个sirna，一个针对orf1ab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，以及一个针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，重组rna构建体包含由如seq id no:46(化合物b18)
所示的序列编码的序列。在相关方面，重组rna构建体包含如seq id no:190所示的序列。
266.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：(i)至少一个能够特异性结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，组合物包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，组合物包含1个针对sars cov-2 s mrna的sirna。在相关方面，组合物包含3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组rna构建体包含由如seq id no:47(化合物b19)所示的序列编码的序列。
267.在一些方面，ifn-β构建体包含如本文所述的修饰的信号肽。
268.在一些方面，本发明提供组合物，其包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含由选自由seq id no:29-47组成的组的序列编码的核酸序列。在一些方面，本发明提供包含重组rna构建体的组合物，该重组rna构建体包含如seq id no:190所示的核酸序列。
269.在一些实施方案中，本发明提供组合物和相关方法，其中该组合物包含重组rna构建体，该重组rna构建体包含：至少一个能够结合靶rna的sirna；和编码目的基因的mrna；其中：sirna靶向选自以下的rna：il-8mrna、il-1βmrna、il-17mrna、tnf-αmrna、sars cov-2 orf1ab rna(多蛋白pp1ab，例如在非编码区或在编码选自以下的蛋白质的部位：sars cov-2非结构蛋白(nsp)、nsp1、nsp3(nsp3b、nsp3c、plpro和nsp3e)、nsp7_nsp8复合物、nsp9-nsp10和nsp14-nsp16、3clpro、e-通道(e蛋白)、orf7a、c端rna结合结构域(crbd)、n端rna结合结构域(nrbd)、解螺旋酶和rdrp)、sars cov-2刺突蛋白(s)mrna、sars cov-2核衣壳蛋白(n)mrna、肿瘤坏死因子α(tnf-α)mrna、白细胞介素mrna(包括但不限于白细胞介素1(例如il-1α、il-1β)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6r(il-6r)、白细胞介素6rα(il-6r-α)、白细胞介素6rβ(il-6r-β)、白细胞介素18(il-18)、白细胞介素36-α(il-36-α)、白细胞介素36-β(il-36-β)、白细胞介素36-γ(il-36-γ)、白细胞介素33(il-33))、血管紧张素转化酶-2(ace2)mrna、跨膜蛋白酶、丝氨酸2(tmprss2)mrna和编码nsp12和13rna；并且目的基因编码选自以下的蛋白质：igf-1、il-4、igf-1(包括如本文其他地方所述的其衍生物)、羧肽酶(例如ace、ace2、cndp1、cpa1、cpa2、cpa4、cpa5、cpa6、cpb1、cpb2、cpe、cpn1、cpq、cpxm1、cpz、scpep1)；细胞因子(例如bmp1、bmp10、bmp15、bmp2、bmp3、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8a、bmp8b、c1qtnf4、ccl1、ccl11、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、ccl3、ccl3l1、ccl3l3、ccl4、ccl4l、ccl4l2、ccl5、ccl7、ccl8、cd40lg、cer1、cklf、clcf1、cntf、csf1、csf2、csf3、ctf1、cx3cl1、cxcl1、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl17、cxcl2、cxcl3、cxcl5、cxcl8、cxcl9、dkk1、dkk2、dkk3、dkk4、eda、ebi3、fam3b、fam3c、faslg、flt3lg、gdf1、gdf10、gdf11、gdf15、gdf2、gdf3、gdf5、gdf6、gdf7、gdf9、gpi、grem1、grem2、grn、ifna1、ifna13、ifna10、ifna14、ifna16、ifna17、ifna2、ifna21、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifnb1、ifne、ifng、ifnk、ifnl1、ifnl2、ifnl3、ifnl4、ifnw1、il10、il11、il12a、il12b、il13、il15、il16、il17a、il17b、il17c、il17d、il17f、il18、il19、il1a、il1b、il1f10、il2、il20、il21、il22、il23a、il24、il25、il26、il27、il3、il31、il32、il33、il34、il36a、il36b、il36g、il36rn、il37、il4、il5、il6、il7、il9、lefty1、lefty2、lif、lta、mif、mstn、nampt、nodal、osm、pf4、pf4v1、scgb3a1、sectm1、slurp1、spp1、thnsl2、thpo、tnf、tnfsf10、tnfsf11、tnfsf12、tnfsf13、tnfsf13b、tnfsf14、tnfsf15、tslp、vstm1、wnt1、
wnt10a、wnt10b、wnt11、wnt16、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、xcl1和xcl2)；细胞外配体及转运蛋白(例如apcs、chi3l1、chi3l2、clec3b、dmbt1、dmkn、eddm3a、eddm3b、efna4、emc10、enam、epyc、ervh48-1、f13b、fcn1、fcn2、gldn、gpld1、heg1、itfg1、kazald1、kcp、lacrt、leg1、metrn、notch2nl、npnt、olfm1、olfml3、prb2、psap、psapl1、psg1、psg6、psg9、ptx3、ptx4、rbp4、rnase10、rnase12、rnase13、rnase9、rspry1、rtbdn、s100a12、s100a13、s100a7、s100a8、saa2、saa4、scg1、scg2、scg3、scgb1c1、scgb1c2、scgb1d1、scgb1d2、scgb1d4、scgb2b2、scgb3a2、scgn、scrg1、scube1、scube2、scube3、sdcbp、selenop、sfta2、sfta3、sftpa1、sftpa2、sftpc、sftpd、shbg、slurp2、smoc1、smoc2、smr3a、smr3b、snca、spata20、spata6、soga1、sparc、sparcl1、spata20、spata6、srpx2、ssc4d、stx1a、susd4、svbp、tcn1、tcn2、tctn1、tf、tulp3、tff2、tff3、thsd7a、tinag、tinagl1、tmeff2、tmem25、vwc2l)；细胞外基质蛋白(例如abi3bp、agrn、ccbe1、chl1、col15a1、col19a1、colec11、dmbt1、draxin、edil3、eln、emid1、emilin1、emilin2、emilin3、epdr1、fbln1、fbln2、fbln5、flrt1、flrt2、flrt3、frem1、gldn、ibsp、kera、kiaa0100、kirrel3、krt10、lamb2、mgp、rptn、sbspon、sdc1、sdc4、sema3a、sema3b、sema3c、sema3d、sema3e、sema3f、sema3g、siglec1、siglec10、siglec6、slit1、slit2、slit3、slitrk1、sned1、snorc、spaca3、spaca7、spon1、spon2、stath、svep1、tecta、tectb、tnc、tnn、tnr、tnxb)；葡萄糖苷酶(amy1a、amy1b、amy1c、amy2a、amy2b、cemip、chia、chit1、fuca2、glb1l、glb1l2、hpse、hyal1、hyal3、kl、lyg1、lyg2、lyzl1、lyzl2、man2b2、smpd1、smpdl3b、spaca5、spaca5b)；糖基转移酶(例如art5、b4galt1、extl2、galnt1、galnt2、glt1d1、mgat4a、st3gal1、st3gal2、st3gal3、st3gal4、st6gal1、xylt1)；生长因子(例如amh、artn、btc、cdnf、cfc1、cfc1b、chrdl1、chrdl2、clec11a、cnmd、efemp1、egf、egfl6、egfl7、egfl8、epgn、ereg、eys、fgf1、fgf10、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19、fgf2、fgf20、fgf21、fgf22、fgf23、fgf3、fgf4、fgf5、fgf6、fgf7、fgf8、fgf9、frzb、gdnf、gfer、gkn1、hbegf、hgf、igf-1、igf2、inha、inhba、inhbb、inhbc、inhbe、ins、kitlg、manf、mdk、mia、ngf、nov、nrg1、nrg2、nrg3、nrg4、nrtn、ntf3、ntf4、ogn、pdgfa、pdgfb、pdgfc、pdgfd、pgf、prok1、pspn、ptn、sdf1、sdf2、sfrp1、sfrp2、sfrp3、sfrp4、sfrp5、tdgf1、tff1、tgfa、tgfb1、tgfb2、tgfb3、thbs4、timp1、vegfa、vegfb、vegfc、vegfd、wisp3)；生长因子结合蛋白(例如chrd、cyr61、esm1、fgfbp1、fgfbp2、fgfbp3、htra1、ghbp、igfals、igfbp1、igfbp2、igfbp3、igfbp4、igfbp5、igfbp6、igfbp7、ltbp1、ltbp2、ltbp3、ltbp4、sostdc1、nog、twsg1和wif1)；肝素结合蛋白(例如，ada2、adamtsl5、angptl3、apob、apoe、apoh、col5a1、comp、ctgf、fbln7、fn1、fstl1、hrg、lamc2、lipc、lipg、liph、lipi、lpl、pcolce2、postn、rspo1、rspo2、rspo3、rspo4、saa1、slit2、sost、thbs1、vtn)；激素(例如adcyap1、adipoq、adm、adm2、angptl8、apela、apln、avp、c1qtnf12、c1qtnf9、calca、calcb、cck、cga、cgb1、cgb2、cgb3、cgb5、cgb8、copa、cort、crh、csh1、csh2、cshl1、enho、epo、erfe、fbn1、fndc5、fshb、gal、gast、gcg、gh、gh1、gh2、ghrh、ghrl、gip、gnrh1、gnrh2、gpha2、gphb5、iapp、ins、insl3、insl4、insl5、insl6、lhb、metrnl、mln、nppa、nppb、nppc、ostn、oxt、pmch、ppy、prl、prlh、pth、pthlh、pyy、retn、retnlb、rln1、rln2、rln3、sct、spx、sst、stc1、stc2、tg、tor2a、trh、tshb、ttr、ucn、ucn2、ucn3、uts2、uts2b和vip)；水解酶(例如，aadacl2、abhd15、acp7、acpp、ada2、adamtsl1、aoah、arsf、arsi、arsj、arsk、btd、chi3l2、enpp1、enpp2、enpp3、enpp5、
entpd5、entpd6、gbp1、ggh、gpld1、hpse、lipc、lipf、lipg、liph、lipi、lipk、lipm、lipn、lpl、pglyrp2、pla1a、pla2g10、pla2g12a、pla2g1b、pla2g2a、pla2g2d、pla2g2e、pla2g2f、pla2g3、pla2g5、pla2g7、pnlip、pnliprp2、pnliprp3、pon1、pon3、ppt1、smpdl3a、them6、thsd1和thsd4)；免疫球蛋白(例如，igsf10、igkv1-12、igkv1-16、igkv1-33、igkv1-6、igkv1d-12、igkv1d-39、igkv1d-8、igkv2-30、igkv2d-30、igkv3-11、igkv3d-20、igkv5-2、iglc1、iglc2、iglc3)；异构酶(例如，naxe、ppia、ptgds)；激酶(例如，adck1、adpgk、fam20c、icos、pkdcc)；裂合酶(例如，pm20d1、pam、ca6)；金属酶抑制剂(例如，fetub、spock3、timp2、timp3、timp4、wfikkn1、wfikkn2)；金属蛋白酶(例如，adam12、adam28、adam9、adamdec1、adamts1、adamts10、adamts12、adamts13、adamts14、adamts15、adamts16、adamts17、adamts18、adamts19、adamts2、adamts20、adamts3、adamts4、adamts5、adamts6、adamts7、adamts8、adamts9、clca1、clca2、clca4、ide、mep1b、mmel1、mmp1、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp16、mmp17、mmp19、mmp2、mmp20、mmp21、mmp24、mmp25、mmp26、mmp28、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、pappa、pappa2、tll1、tll2)；乳蛋白(例如csn1s1、csn2、csn3、lalba)；神经活性蛋白(例如cartpt、nms、nmu、npb、npff、nps、npvf、npw、npy、pcsk1n、pdyn、penk、pnoc、pomc、prok2、pth2、pyy2、pyy3、qrfp、tac1和tac3)；蛋白酶(例如，adamts6、c1r、c1rl、c2、casp4、cela1、cela2a、cela2b、cfb、cfd、cfi、cma1、corin、ctrb1、ctrb2、ctsb、ctsd、dhh、f10、f11、f12、f2、f3、f7、f8、f9、fap、furin、gzma、gzmk、gzmm、habp2、hgfac、htra3、htra4、ihh、klk10、klk11、klk12、klk13、klk14、klk15、klk3、klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk9、klkb1、masp1、masp2、mst1l、napsa、ovch1、ovch2、pcsk2、pcsk5、pcsk6、pcsk9、pga3、pga4、pga5、pgc、plat、plau、plg、proc、prss1、prss12、prss2、prss22、prss23、prss27、prss29p、prss3、prss33、prss36、prss38、prss3p2、prss42、prss44、prss47、prss48、prss53、prss57、prss58、prss8、prtn3、reln、ren、tmprss11d、tmprss11e、tmprss2、tpsab1、tpsb2、tpsd1)；蛋白酶抑制剂(例如a2m、a2ml1、ambp、anos1、col28a1、col6a3、col7a1、cpamd8、cst1、cst2、cst3、cst4、cst5、cst6、cst7、cst8、cst9、cst9l、cst9lp1、cstl1、eppin、gpc3、hmsd、itih1、itih2、itih3、itih4、itih5、itih6、kng1、oprpn、ovos1、ovos2、papln、pi15、pi16、pi3、pzp、r3hdml、serpina1、serpina10、serpina11、serpina12、serpina13p、serpina3、serpina4、serpina5、serpina7、serpina9、serpinb2、serpinb5、serpinc1、serpine1、serpine2、serpine3、serpinf2、serping1、serpini1、serpini2、spink1、spink13、spink14、spink2、spink4、spink5、spink6、spink7、spink8、spink9、spint1、spint3、spint4、spock1、spock2、spp2、sspo、tfpi、tfpi2、wfdc1、wfdc10a、wfdc13、wfdc2、wfdc3、wfdc5、wfdc6、wfdc8)；蛋白磷酸酶(例如acp7、acpp、pten、ptprz1)；酯酶(例如bche、cel、ces4a、ces5a、notum、siae)；转移酶(例如mettl24、fkrp、chsy1、chst9、b3gat1)；血管活性蛋白(例如aggf1、agt、angpt1、angpt2、angptl4、angptl6、edn1、edn2、edn3、nts)、i型干扰素(例如ifn-α，包括但不限于干扰素α-n3、干扰素α-2a和干扰素α-2b、ifn-β、ifn-δ、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ν、ifn-τ和ifn-ω)、ii型干扰素(例如ifn-γ)、iii型干扰素(例如ifn-λ)、白细胞介素(例如il-37、il-38)和可溶性ace2受体。在一些方面，包含重组多核酸构建体的组合物可用于治疗病毒感染、疾病或病况。在一些方面，组合物以足以治疗或预防病毒感染、疾病或病况的量存在或施用。在一些实施方案中，疾病或病况选自由椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎和银屑病组成的组。
270.在一些方面，包含重组rna构建体的组合物可用于治疗皮肤疾病或病况。在一些方面，组合物以足以治疗或预防皮肤疾病或病况的量存在或施用。在一些实施方案中，皮肤疾病或病况包括炎性皮肤病。在一些实施方案中，炎性皮肤病包括银屑病。在一些方面，包含重组rna构建体的组合物可用于治疗肌肉疾病或病况。在一些方面，组合物以足以治疗或预防肌肉疾病或病症的量存在或施用。在一些实施方案中，肌肉疾病或病症包括骨骼肌疾病。在一些实施方案中，骨骼肌疾病包括进行性骨化性纤维发育不良(fop)。在一些方面，包含重组rna构建体的组合物可用于治疗神经退行性疾病或病况。在一些方面，组合物以足以治疗或预防神经退行性疾病或病况的量存在或施用。在一些实施方案中，神经退行性疾病或病况包括运动神经元病症。在一些实施方案中，运动神经元病症包括肌萎缩侧索硬化(als)。在一些方面，包含重组rna构建体的组合物可用于治疗关节疾病或病况。在一些方面，组合物以足以治疗或预防关节疾病或病况的量存在或施用。在一些实施方案中，关节疾病或病况包括关节退行性变(joint degeneration)。在一些实施方案中，关节退行性变包括椎间盘疾病(ivdd)或骨关节炎(oa)。
271.rna干扰和小干扰rna(sirna)
272.rna干扰(rnai)或rna沉默是rna分子通过中和靶mrna分子来抑制基因表达或翻译的过程。rnai过程描述于mello和conte(2004)nature 431,338-342,meister和tuschl(2004)nature 431,343-349,hannon和rossi(2004)nature 431,371-378,和fire(2007)angew.chem.int.第46版,6966-6984。简而言之，在自然过程中，反应起始于通过dsrna特异性核酸内切酶dicer将长双链rna(dsrna)切割成小dsrna片段或具有发夹或环结构的sirna。然后这些小dsrna片段或sirna整合到rna诱导的沉默复合体(risc)中，并引导risc至靶mrna序列。在干扰过程中，sirna双链体解开，反义链与risc保持复合，以将risc引导至靶mrna序列，从而诱导降解并随后抑制蛋白质翻译。与市售的合成sirna(例如patisiran等)不同，本发明的sirna在细胞质中利用内源性dicer和risc途径从本发明的mrna转录本构建体中切割下来并遵循上文详述的自然过程。此外，由于本发明的mrna转录本的其余部分在dicer切割sirna后保持完整，因此，自本发明mrna转录本的目的基因可以获得期望的蛋白质表达。
273.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组多核酸或rna构建体，该重组多核酸或rna构建体包含至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体包含编码或包含有义sirna链的核酸序列。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体包含编码或包含反义sirna链的核酸序列。在一个优选的实施方案中，重组多核酸或rna构建体包含编码或包含有义sirna链的核酸序列和编码或包含反义sirna链的核酸序列。可包含在本发明中的sirna的细节描述于cheng,等人(2018)j.mater.chem.b.,6,4638-4644，通过引用将其并入本文。
274.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体具有至少1个拷贝的sirna，即编码或包含sirna有义链的核酸序列和编码或包含sirna反义链的核酸序列。如本文所述，1个拷贝的sirna可以指1个拷贝的有义链sirna和1个拷贝的反义链sirna。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体具有多于1个拷贝的sirna，即多于1个拷贝的编码或包含sirna有义链的核酸序列和多于1个拷贝的编码或包含sirna反义链的核酸序列。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体具有1至10个拷贝的sirna，即1至10个拷贝的编码或包含sirna有义
链的核酸序列和1至10个拷贝的编码或包含sirna反义链的核酸序列。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体具有1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、2至3、2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、3至4、3至5、3至6、3至7、3至8、3至9、3至10、4至5、4至6、4至7、4至8、4至9、4至10、5至6、5至7、5至8、5至9、5至10、6至7、6至8、6至9、6至10、7至8、7至9、7至10、8至9、8至10、或9至10个拷贝的sirna。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝的sirna。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或9个拷贝的sirna。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体具有至多2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝的sirna。
275.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体还包含编码或包含接头的核酸序列。在一些实施方案中，编码或包含接头的核酸序列可以连接两个或更多个编码sirna的核酸序列中的每一个。在一些实施方案中，接头可以是不可切割的接头。在一个优选的实施方案中，接头可以是可切割接头。在一些实施方案中，接头可以是自切割接头。在一些实施方案中，接头可以是trna接头。trna系统在活生物中是进化保守的，并利用内源性rnase p和z来处理多顺反子构建体(dong等人，2016)。在一些实施方案中，trna接头可包含含有aacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgca(seq id no:24)的核酸序列。
276.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组多核酸或rna构建体，该重组多核酸或rna构建体包含至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列。sirna能够结合的靶mrna的非限制性实例列表包括编码白细胞介素8(il-8)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素17(il-17)和肿瘤坏死因子α(tnf-α，或tnf-α)的mrna。sirna能够结合的靶rna的其他示例列表包括编码激活素受体样激酶-2(alk2)和超氧化物歧化酶-1(sod1)的mrna。
277.在一些方面，sirna能够结合靶rna，该靶rna是冠状病毒rna。在一些实施方案中，冠状病毒rna是编码冠状病毒蛋白的靶mrna。在一些实施方案中，冠状病毒rna是靶非编码rna。在一些实施方案中，冠状病毒是α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒或δ冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒靶mrna编码选自以下的蛋白质：sars cov-2 orf1ab(多蛋白pp1ab)；sars cov-2刺突蛋白(s)和sars cov-2核衣壳蛋白(n)。在一些实施方案中，sirna能够在一个区域或在其编码选自以下的蛋白质的区域结合orf1ab mrna：sars cov-2非结构蛋白(nsp)、nsp1、nsp3(nsp3b、nsp3c、plpro和nsp3e)、nsp7_nsp8复合物、nsp9
–
nsp10和nsp14
–
nsp16、3clpro、e通道(e蛋白)、orf7a、c末端rna结合结构域(crbd)、n末端rna结合结构域(nrbd)、解螺旋酶和rdrp。在一些实施方案中，靶编码rna是sars cov-2 nsp12和13。在一些实施方案中，靶mrna编码在冠状病毒如sars-cov、sars-cov-2和/或mers-cov中保守的冠状病毒蛋白，并且相应的sirna用于可用于治疗两种或更多种不同疾病或病况例如由一种以上冠状病毒引起或与一种以上冠状病毒相关的两种或更多种疾病或病况的组合物和方法。在一些实施方案中，靶mrna编码sars-cov-2 nsp15，其与sars-cov的类似蛋白有89％的同一性，多核酸构建体可用于治疗sars-cov和sars-cov-2感染。在一些实施方案中，sirna能够结合一种以上冠状病毒共有的mrna靶或非编码rna靶。在一些实施方案中，编码rna靶是nsp12-nsp13，与sars-cov-2、sars-cov和mers-cov有关。在一些实施方案中，冠状病毒靶rna和任何相应编码的蛋白质是本领域技术人员已知的或在文献中描述的任何一种，例如wu,等人,2020年2月27日,acta pharmaceutica sinica,在doi.org/10.1016/
j.apsb.2020.02.008预校，通过引用并入本文。在一些实施方案中，靶mrna编码宿主蛋白。在一些实施方案中，靶mrna编码细胞因子。在一些实施方案中，靶mrna编码选自由以下组成的组的细胞因子：肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素(包括但不限于白细胞介素1(例如，il-1α、il-1β)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6r(il-6r)、白细胞介素6rα(il-6r-α)、白细胞介素6rβ(il-6r-β)、白细胞介素18(il-18)、白细胞介素36-α(il-36-α)、白细胞介素36-β(il-36-β))、白细胞介素36-γ(il-36-γ)和白细胞介素33(il-33))。在文献中讨论了tnf-α在covid-19中的作用，例如feldmann,等人，2020年4月9日，the lancet s0140-6736(20)30858-8，通过引用并入本文。在一些实施方案中，靶mrna编码炎性细胞因子。在一些实施方案中，靶mrna编码宿主的病毒进入蛋白。在一些实施方案中，宿主的病毒进入蛋白是血管紧张素转换酶-2(ace2)。在一些实施方案中，靶mrna编码宿主酶。在一些实施方案中，酶是跨膜蛋白酶丝氨酸2(tmprss2)。
278.在一些实施方案中，重组核酸构建体包含两个或更多个编码能够结合靶rna的sirna的核酸序列。在一些实施方案中，靶rna是mrna。在一些实施方案中，靶rna是非编码rna。在一些实施方案中，重组核酸构建体包含三个编码能够结合靶mrna的sirna的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸构建体包含四个编码能够结合靶mrna的sirna的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸构建体包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码能够结合靶mrna的sirna的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸构建体包含2至10个编码能够结合靶mrna的sirna的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸构建体包含2至6个编码能够结合靶mrna的sirna的核酸序列。在一些实施方案中，所述的两个或更多个核酸序列各自编码能够结合相同靶mrna的sirna。在一些实施方案中，所述的两个或更多个核酸序列各自编码能够结合不同靶mrna的sirna。
279.在一些实施方案中，靶mrna的表达由能够结合靶mrna的sirna调节。在一些实施方案中，sirna能够在其5'非翻译区结合靶mrna。在一些实施方案中，sirna能够在其3'非翻译区结合靶mrna。在一些实施方案中，sirna能够在翻译区中结合靶mrna。在一些实施方案中，靶mrna的表达由能够结合靶mrna的sirna下调。在一些实施方案中，靶mrna的表达由能够结合靶mrna的sirna抑制。如本文所述，靶mrna表达的抑制或下调可以指，但不限于，干扰靶mrna以干扰蛋白质从重组多核酸或rna构建体所编码或包含的靶mrna翻译；因此，靶mrna表达的抑制或下调可以指，但不限于，与不存在包含能够结合靶mrna的sirna的重组多核酸或rna构建体的情况下从靶mrna表达的蛋白质的水平相比，从靶mrna表达的蛋白质水平降低。可以通过使用本领域熟知的任何方法测量蛋白质表达水平，这些方法包括但不限于蛋白质印迹、流式细胞术、elisa、ria和各种蛋白质组学技术。测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定，例如elisa。这种类型的蛋白质定量可以基于能够捕获特定抗原的抗体和能够检测捕获的抗原的第二抗体。用于检测和/或测量多肽的示例性测定描述于harlow,e.和lane,d.antibodies:a laboratory manual,(1988),cold spring harbor laboratory press。
280.在一些方面，本文提供组合物，其包含重组多核酸或rna构建体，该重组多核酸或rna构建体包含至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，其中靶mrna不同于由目的基因编码的mrna。在一些实施方案中，sirna不影响目的基因的表达。在一些实施方案中，sirna不能够结合编码目的基因的核酸。在优选的实施方案中，sirna不抑制目的基因的表达。在另一个优选的实施方案中，sirna不
下调目的基因的表达。如本文所述，目的基因表达的抑制或下调可指，但不限于，干扰自重组多核酸或rna构建体的dna转录和/或蛋白质翻译；因此，目的基因表达的抑制或下调可以指但不限于，与不存在包含能够结合靶mrna的sirna的重组多核酸或rna构建体的情况下蛋白质表达的水平相比，蛋白质水平下降。可以通过使用本领域熟知的任何方法测量蛋白质表达水平，这些方法包括但不限于蛋白质印迹、流式细胞术、elisa、ria和各种蛋白质组学技术。测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定，例如elisa。这种类型的蛋白质定量可以基于能够捕获特定抗原的抗体和能够检测捕获的抗原的第二抗体。用于检测和/或测量多肽的示例性测定描述于harlow,e.and lane,d.antibodies:a laboratory manual,(1988),cold spring harbor laboratory press。
281.在一些方面，sirna包含由选自seq id no:80-109的序列编码的有义链。在一些方面，sirna包含由选自seq id no:80-109的序列编码的有义链、以及由选自seq id no:110-139的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是il-8mrna，并且sirna包含由选自seq id no:80-83的序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是il-8mrna，并且sirna包含分别由选自seq id no:80-83的序列编码的有义链以及由选自seq id no:110-113的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是il-1βmrna，并且sirna包含由选自seq id no:84-86的序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是il-1βmrna，并且sirna包含分别由选自seq id no:84-86的序列编码的有义链以及由选自seq id no:114-116的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是tnf-αmrna，并且sirna包含由选自seq id no:87-89的序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是tnf-αmrna，并且sirna包含分别由选自seq id no:87-89的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:117-119的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是il-17mrna，并且sirna包含由选自seq id no:90-92的序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是il-17mrna，并且sirna包含分别由选自seq id no:90-92的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:120-122的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是il-6mrna，并且sirna包含由选自seq id no:93-95的序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是il-6mrna，并且sirna包含分别由选自seq id no:93-95的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:123-125的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是il-6rαmrna，并且sirna包含由选自seq id no:96和97的序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是il-6rαmrna，并且sirna包含分别由选自seq id no:96和97的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:125和127的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是il-6rβmrna，并且sirna包含由seq id no:98所示序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是il-6rβmrna，并且sirna包含由seq id no:98所示序列编码的有义链和由seq id no:128所示序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是ace2 mrna，sirna包含由选自seq id no:99-101的序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是ace2 mrna，并且sirna包含分别由选自seq id no:99-101的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:129-131的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是sars cov-2 orf1ab mrna，并且sirna包含由选自seq id no：102-105的序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是sars cov-2 orf1ab mrna，并且sirna包含分别由选自seq id no:102-105的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:132-135的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是sars cov-2刺突蛋白
mrna，并且sirna包含由选自seq id no:106-108的序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是sars cov-2刺突蛋白mrna，并且sirna包含由选自seq id no:106-108的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:136-138的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是sars cov-2核衣壳蛋白mrna，并且sirna包含由seq id no:109所示序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是sars cov-2核衣壳蛋白mrna，并且sirna包含由seq id no:109所示序列编码的有义链和由seq id no:139所示序列编码的相应反义链。在一些方面，sirna包含由选自seq id no:140-145的序列编码的有义链。在一些方面，sirna包含分别由选自seq id no:140-145的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:146-151的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是alk2 mrna，并且sirna包含由选自seq id no：140-142的序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是alk2 mrna，并且sirna包含分别由选自seq id no:140-142的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:146-148的序列编码的相应反义链。在一些实施方案中，靶rna是sod1 mrna，并且sirna包含由选自seq id no：143-145的序列编码的有义链。在一些实施方案中，靶rna是sod1 mrna，并且sirna包含分别由选自seq id no:143-145的序列编码的有义链，以及由选自seq id no:149-151的序列编码的相应反义链。
282.目的基因
283.在一些实施方案中，本发明的重组核酸或rna构建体可以包含两个或更多个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的重组核酸或rna构建体可以包含三个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的重组核酸或rna构建体可以包含四个编码目的基因的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的重组核酸或rna构建体可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列。在一个实施方案中，所述的两个或更多个核酸序列各自可以编码相同目的基因。在另一个实施方案中，所述的两个或更多个核酸序列各自编码不同目的基因。在一些实施方案中，所述的两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自包含编码分泌蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，所述的两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自可以包含编码细胞内蛋白质的核酸序列。在一些实施方案中，所述的两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自包含编码细胞器内蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，所述的两个或更多个编码目的基因的核酸序列各自包含编码膜蛋白的核酸序列。
284.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可进一步包含编码或包含接头的核酸序列。在一些实施方案中，可以通过编码或包含接头的核酸序列，连接两个或更多个编码目的基因的核酸序列中的每一个。在一些实施方案中，接头可以是不可切割的接头。在优选的实施方案中，接头可以是可切割的接头。在一些实施方案中，接头可以是自切割接头。接头的非限制性实例包括2a肽接头(或2a自切割肽)，例如t2a、p2a、e2a或f2a，或trna接头等。在一些实施方案中，接头是t2a肽接头。在一些实施方案中，接头可以是p2a肽接头。在一些实施方案中，接头可以是e2a肽接头。在一些实施方案中，接头可以是f2a接头。在一些实施方案中，接头可以是trna接头。trna系统在活生物中是进化保守的，并利用内源性rnase p和z来处理多顺反子构建体(dong等人，2016)。在一些实施方案中，trna接头可包含含有
285.aacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgca(seq id no:24)的核酸序列。
286.在一些实施方案中，目的基因的表达通过表达由目的基因编码的mrna或蛋白质来调节。在一些实施方案中，通过表达由目的基因编码的mrna或蛋白质来上调目的基因的表达。如本文所用，由目的基因编码的mrna或蛋白质表达的上调可以指，但不限于，由目的基因编码的蛋白质的水平增加。可以通过使用本领域熟知的任何方法测量蛋白质表达水平，这些方法包括但不限于蛋白质印迹、流式细胞术、elisa、ria和各种蛋白质组学技术。测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定，例如elisa。这种类型的蛋白质定量可以基于能够捕获特定抗原的抗体和能够检测捕获的抗原的第二抗体。用于检测和/或测量多肽的示例性测定描述于harlow,e.and lane,d.antibodies:a laboratory manual,(1988),cold spring harbor laboratory press。
287.在一些实施方案中，目的基因编码蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是治疗性蛋白质。在本发明的优选实施方案中，蛋白质是人类来源的，即是人蛋白质。由目的基因编码的蛋白质的非限制性实例包括：羧肽酶；细胞因子；细胞外配体和转运蛋白；细胞外基质蛋白；葡糖苷酶；糖基转移酶；生长因子；生长因子结合蛋白；肝素结合蛋白；激素；水解酶；免疫球蛋白；异构酶；激酶；裂合酶；金属酶抑制剂；金属蛋白酶；乳蛋白；神经活性蛋白；蛋白酶；蛋白酶抑制剂；蛋白磷酸酶；酯酶；转移酶；和血管活性蛋白，均为人类来源的。在本发明的更优选的实施方案中，本发明的蛋白质是选自由以下组成的组的人蛋白质：人羧肽酶；人细胞因子；人细胞外配体和转运蛋白；人细胞外基质蛋白；人葡糖苷酶；人糖基转移酶；人生长因子；人生长因子结合蛋白；人肝素结合蛋白；人激素；人水解酶；人免疫球蛋白；人异构酶；人激酶；人裂合酶；人金属酶抑制剂；人金属蛋白酶；人乳蛋白；人神经活性蛋白；人蛋白酶；人蛋白酶抑制剂；人蛋白磷酸酶；人酯酶；人转移酶；或人血管活性蛋白。
288.在一个实施方案中，蛋白质选自由以下组成的组：羧肽酶，其中羧肽酶选自由以下组成的组：ace、ace2、cndp1、cpa1、cpa2、cpa4、cpa5、cpa6、cpb1、cpb2、cpe、cpn1、cpq、cpxm1、cpz和scpep1；细胞因子，其中细胞因子选自由以下组成的组：bmp1、bmp10、bmp15、bmp2、bmp3、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8a、bmp8b、c1qtnf4、ccl1、ccl11、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、ccl3、ccl3l1、ccl3l3、ccl4、ccl4l、ccl4l2、ccl5、ccl7、ccl8、cd40lg、cer1、cklf、clcf1、cntf、csf1、csf2、csf3、ctf1、cx3cl1、cxcl1、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl17、cxcl2、cxcl3、cxcl5、cxcl8、cxcl9、dkk1、dkk2、dkk3、dkk4、eda、ebi3、fam3b、fam3c、faslg、flt3lg、gdf1、gdf10、gdf11、gdf15、gdf2、gdf3、gdf5、gdf6、gdf7、gdf9、gpi、grem1、grem2、grn、ifna1、ifna13、ifna10、ifna14、ifna16、ifna17、ifna2、ifna21、ifna4,ifna5,ifna6,ifna7,ifna8,ifnb1,ifne,ifng,ifnk,ifnl1,ifnl2,ifnl3,ifnl4,ifnw1,il10,il11,il12a,il12b,il13,il15,il16,il17a,il17b,il17c,il17d,il17f、il18、il19、il1a、il1b、il1f10、il2、il20、il21、il22、il23a、il24、il25、il26、il27、il3、il31、il32、il33、il34、il36a、il36b、il36g、il36rn、il37、il4、il5、il6、il7、il9、lefty1、lefty2、lif、lta、mif、mstn、nampt、nodal、osm、pf4、pf4v1、scgb3a1、sectm1、slurp1、spp1、thnsl2、thpo、tnf、tnfsf10、tnfsf11、tnfsf12、tnfsf13、tnfsf13b、tnfsf14、tnfsf15、tslp、vstm1、wnt1、wnt10a、wnt10b、wnt11、wnt16、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、xcl1和xcl2；胞外配体和转运蛋白，其中胞外配体和转运蛋白选自由以下组成的组：apcs、chi3l1、chi3l2、clec3b、
dmbt1、dmkn、eddm3a、eddm3b、efna4、emc10、enam、epyc、ervh48-1、f13b、fcn1、fcn2、gldn、gpld1、heg1、itfg1、kazald1、kcp、lacrt、leg1、metrn、notch2nl、npnt、olfm1、olfml3、prb2、psap、psapl1、psg1、psg6、psg9、ptx3、ptx4、rbp4、rnase10、rnase12、rnase13、rnase9、rspry1、rtbdn、s100a12、s100a13、s100a7、s100a8、saa2、saa4、scg1、scg2、scg3、scgb1c1、scgb1c2、scgb1d1、scgb1d2、scgb1d4、scgb2b2、scgb3a2、scgn、scrg1、scube1、scube2、scube3、sdcbp、selenop、sfta2、sfta3、sftpa1、sftpa2、sftpc、sftpd、shbg、slurp2、smoc1、smoc2、smr3a、smr3b、snca、spata20、spata6、soga1、sparc、sparcl1、spata20、spata6、srpx2、ssc4d、stx1a、susd4、svbp、tcn1、tcn2、tctn1、tf、tulp3、tff2、tff3、thsd7a、tinag、tinagl1、tmeff2、tmem25和vwc2l；胞外基质蛋白，其中胞外基质蛋白选自由以下组成的组：abi3bp、agrn、ccbe1、chl1、col15a1、col19a1、colec11、dmbt1、draxin、edil3、eln、emid1、emilin1、emilin2、emilin3、epdr1、fbln1、fbln2、fbln5、flrt1、flrt2、flrt3、frem1、gldn、ibsp、kera、kiaa0100、kirrel3、krt10、lamb2、mgp、rptn、sbspon、sdc1、sdc4、sema3a、sema3b、sema3c、sema3d、sema3e、sema3f、sema3g、siglec1、siglec10、siglec6、slit1、slit2、slit3、slitrk1、sned1、snorc、spaca3、spaca7、spon1、spon2、stath、svep1、tecta、tectb、tnc、tnn、tnr和tnxb；葡糖苷酶、其中葡糖苷酶选自amy1a、amy1b、amy1c、amy2a、amy2b、cemip、chia、chit1、fuca2、glb1l、glb1l2、hpse、hyal1、hyal3、kl、lyg1、lyg2、lyzl1、lyzl2、man2b2、smpd1、smpdl3b、spaca5和spaca5b；糖基转移酶，其中糖基转移酶选自由以下组成的组：art5、b4galt1、extl2、galnt1、galnt2、glt1d1、mgat4a、st3gal1、st3gal2、st3gal3、st3gal4、st6gal1和xylt1；生长因子，其中生长因子选自由以下组成的组：amh、artn、btc、cdnf、cfc1、cfc1b、chrdl1、chrdl2、clec11a、cnmd、efemp1、egf、egfl6、egfl7、egfl8、epgn、ereg、eys、fgf1、fgf10、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19、fgf2、fgf20、fgf21、fgf22、fgf23、fgf3、fgf4、fgf5、fgf6、fgf7、fgf8、fgf9、frzb、gdnf、gfer、gkn1、hbegf、hgf、igf-1、igf2、inha、inhba、inhbb、inhbc、inhbe、ins、kitlg、manf、mdk、mia、ngf、nov、nrg1、nrg2、nrg3、nrg4、nrtn、ntf3、ntf4、ogn、pdgfa、pdgfb、pdgfc、pdgfd、pgf、prok1、pspn、ptn、sdf1、sdf2、sfrp1、sfrp2、sfrp3、sfrp4、sfrp5、tdgf1、tff1、tgfa、tgfb1、tgfb2、tgfb3、thbs4、timp1、vegfa、vegfb、vegfc、vegfd和wisp3；生长因子结合蛋白，其中生长因子结合蛋白选自由以下组成的组：chrd、cyr61、esm1、fgfbp1、fgfbp2、fgfbp3、htra1、ghbp、igfals、igfbp1、igfbp2、igfbp3、igfbp4、igfbp5、igfbp6、igfbp7、ltbp1、ltbp2、ltbp3、ltbp4、sostdc1、nog、twsg1和wif；肝素结合蛋白，其中肝素结合蛋白选自ada2、adamtsl5、angptl3、apob、apoe、apoh、col5a1、comp、ctgf、fbln7、fn1、fstl1、hrg、lamc2、lipc、lipg、liph、lipi、lpl、pcolce2、postn、rspo1、rspo2、rspo3、rspo4、saa1、slit2、sost、thbs1和vtn；激素，其中激素选自adcyap1、adipoq、adm、adm2、angptl8、apela、apln、avp、c1qtnf12、c1qtnf9、calca、calcb、cck、cga、cgb1、cgb2、cgb3、cgb5、cgb8、copa、cort、crh、csh1、csh2、cshl1、enho、epo、erfe、fbn1、fndc5、fshb、gal、gast、gcg、gh、gh1、gh2、ghrh、ghrl、gip、gnrh1、gnrh2、gpha2、gphb5、iapp、ins、insl3、insl4、insl5、insl6、lhb、metrnl、mln、nppa、nppb、nppc、ostn、oxt、pmch、ppy、prl、prlh、pth、pthlh、pyy、retn、retnlb、rln1、rln2、rln3、sct、spx、sst、stc1、stc2、tg、tor2a、trh、tshb、ttr、ucn、ucn2、ucn3、uts2、uts2b和vip；水解酶，其中水解酶选自由以下组成的组：aadacl2、abhd15、acp7、acpp、ada2、adamtsl1、aoah、arsf、arsi、arsj、arsk、btd、chi3l2、
enpp1、enpp2、enpp3、enpp5、entpd5、entpd6、gbp1、ggh、gpld1、hpse、lipc、lipf、lipg、liph、lipi、lipk、lipm、lipn、lpl、pglyrp2、pla1a、pla2g10、pla2g12a、pla2g1b、pla2g2a、pla2g2d、pla2g2e、pla2g2f、pla2g3、pla2g5、pla2g7、pnlip、pnliprp2、pnliprp3、pon1、pon3、ppt1、smpdl3a、them6、thsd1和thsd4；免疫球蛋白，其中免疫球蛋白选自由以下组成的组：igsf10、igkv1-12、igkv1-16、igkv1-33、igkv1-6、igkv1d-12、igkv1d-39、igkv1d-8、igkv2-30、igkv2d-30、igkv3-11、igkv3d-20、igkv5-2、iglc1、iglc2和iglc3；异构酶，其中异构酶选自由以下组成的组：naxe、ppia和ptgds；激酶，其中激酶选自由以下组成的组：adck1、adpgk、fam20c、icos和pkdcc；裂合酶，其中裂合酶选自由以下组成的组：pm20d1、pam和ca6；金属酶抑制剂，其中金属酶抑制剂选自由以下组成的组：fetub、spock3、timp2、timp3、timp4、wfikkn1和wfikkn2；金属蛋白酶，其中金属蛋白酶选自由以下组成的组：adam12、adam28、adam9、adamtec1、adamts1、adamts10、adamts12、adamts13、adamts14、adamts15、adamts16、adamts17、adamts18、adamts19、adamts2、adamts20、adamts3、adamts4、adamts5、adamts6、adamts7、adamts8、adamts9、clca1、clca2、clca4、ide、mep1b、mmel1、mmp1、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp16、mmp17、mmp19、mmp2、mmp20、mmp21、mmp24、mmp25、mmp26、mmp28、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、pappa、pappa2、tll1和tll2；乳蛋白，其中乳蛋白选自由以下组成的组：csn1s1、csn2、csn3和lalba；神经活性蛋白，其中神经活性蛋白选自cartpt、nms、nmu、npb、npff、nps、npvf、npw、npy、pcsk1n、pdyn、penk、pnoc、pomc、prok2、pth2、pyy2、pyy3、qrfp、tac1和tac3；蛋白酶，其中蛋白酶选自由以下组成的组：adamts6、c1r、c1rl、c2、casp4、cela1、cela2a、cela2b、cfb、cfd、cfi、cma1、corin、ctrb1、ctrb2、ctsb、ctsd、dhh、f10、f11、f12、f2、f3、f7、f8、f9、fap、furin、gzma、gzmk、gzmm、habp2、hgfac、htra3、htra4、ihh、klk10、klk11、klk12、klk13、klk14、klk15、klk3、klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk9、klkb1、masp1、masp2、mst1l、napsa、ovch1、ovch2、pcsk2、pcsk5、pcsk6、pcsk9、pga3、pga4、pga5、pgc、plat、plau、plg、proc、prss1、prss12、prss2、prss22、prss23、prss27、prss29p、prss3、prss33、prss36、prss38、prss3p2、prss42、prss44、prss47、prss48、prss53、prss57、prss58、prss8、prtn3、reln、ren、tmprss11d、tmprss11e、tmprss2、tpsab1、tpsb2和tpsd1；蛋白酶抑制剂，其中蛋白酶抑制剂选自由以下组成的组：a2m、a2ml1、ambp、anos1、col28a1、col6a3、col7a1、cpamd8、cst1、cst2、cst3、cst4、cst5、cst6、cst7、cst8、cst9、cst9l、cst9lp1、cstl1、eppin、gpc3、hmsd、itih1、itih2、itih3、itih4、itih5、itih6、kng1、oprpn、ovos1、ovos2、papln、pi15、pi16、pi3、pzp、r3hdml、serpina1、serpina10、serpina11、serpina12、serpina13p、serpina3、serpina4、serpina5、serpina7、serpina9、serpinb2、serpinb5、serpinc1、serpine1、serpine2、serpine3、serpinf2、serping1、serpini1、serpini2、spink1、spink13、spink14、spink2、spink4、spink5、spink6、spink7、spink8、spink9、spint1、spint3、spint4、spock1、spock2、spp2、sspo、tfpi、tfpi2、wfdc1、wfdc10a、wfdc13、wfdc2、wfdc3、wfdc5、wfdc6和wfdc8；蛋白磷酸酶，其中蛋白磷酸酶选自由以下组成的组：acp7、acpp、pten和ptprz1；酯酶，其中酯酶选自由以下组成的组：bche、cel、ces4a、ces5a、notum和siae；转移酶，其中转移酶选自由以下组成的组：mettl24、fkrp、chsy1、chst9和b3gat1；和血管活性蛋白，其中所述血管活性蛋白选自由以下组成的组：aggf1、agt、angpt1、angpt2、angptl4、angptl6、edn1、edn2、edn3和nts。在一些实施方案中，蛋白质选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)、白细胞介素
4(il-4)、干扰素β(ifnβ)、干扰素α(ifnα)、ace2可溶性受体、白细胞介素37(il-37)和白细胞介素38(il-38)。在一些实施方案中，蛋白质选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)、白细胞介素4(il-4)、干扰素β(ifnβ)和ace2可溶性受体。在一些实施方案中，蛋白质选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)、白细胞介素4(il-4)、干扰素β(ifnβ)、ace2可溶性受体和促红细胞生成素(epo)。在一些实施方案中，蛋白质选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)和白细胞介素4(il-4)。在一些实施方案中，蛋白质是igf-1。在一些实施方案中，蛋白质是il-4。在一些实施方案中，蛋白质是干扰素β(ifnβ)。在一些实施方案中，蛋白质是ace2可溶性受体。在一些实施方案中，蛋白质是促红细胞生成素(epo)。
289.在本发明的一个实施方案中，包含编码目的基因的核酸序列或mrna的重组多核酸或rna构建体可以包含编码人胰岛素样生长因子1(igf-1)的核酸序列。在另一个实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以是包含编码igf-1的核酸序列的裸dna或rna。在本发明的这个实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以包含编码成熟人igf-1的核酸序列。在本发明优选的实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以包含编码igf-1的前肽，优选地人igf-1的前肽的核酸序列，和编码igf-1成熟蛋白，或优选地人igf-1的成熟蛋白的核酸序列，并且不包含编码igf-1的e-肽的核酸序列，优选地不包含编码人igf-1的e-肽(即,具有羧基末端延伸的igf-1)的核酸序列。在本发明的更优选的实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以包含编码igf-1的前肽、优选地人igf-1的前肽的核酸序列、编码igf-1成熟蛋白，或优选地人igf-1成熟蛋白的核酸序列。优选地，重组多核酸或rna构建体不包含编码igf-1的e-肽的核酸序列，或更优选地不包含编码人igf-1的e-肽的核酸序列。在本发明的另一个优选实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以包含编码igf-1的前肽、优选地人igf-1的前肽的核酸序列、编码igf-1成熟蛋白，或优选地人igf-1的成熟蛋白的核酸序列和编码脑源性神经营养因子(bdnf)信号肽的核酸序列。优选地，重组多核酸或rna构建体不包含编码igf-1的e-肽的核酸序列，更优选地不包含编码人igf-1的e-肽的核酸序列。
290.在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可以包含编码igf-1的前肽，优选地具有27个氨基酸的人igf-1的前肽(也称为前结构域)的核酸序列，和编码成熟igf-1，优选地具有70个氨基酸的成熟人igf-1的核酸序列，并且优选地不包含编码igf-1的e-肽的核苷酸序列，并且优选地不包含编码人igf-1的e-肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核酸或rna构建体可包含编码igf-1的前肽，优选地具有27个氨基酸的人igf-1的前肽(也称为前结构域)的核酸序列，编码成熟igf-1，优选地具有70个氨基酸的成熟人igf-1的核酸序列，和编码脑源性神经营养因子(bdnf)信号肽的核酸序列。优选地，重组多核酸或rna构建体不包含编码igf-1的e-肽的核酸序列，更优选地不包含编码人igf-1的e-肽的核酸序列。
291.在一些实施方案中，本发明的重组多核酸或rna构建体可以包含编码具有27个氨基酸的人igf-1的前肽(也称为前结构域)的核酸序列，和编码具有70个氨基酸的成熟人igf-1的核酸序列，并且优选地不包含编码人igf-1的e-肽(也称为e-结构域)的核酸序列，其中编码具有27个氨基酸的人igf-1前肽(也称为前结构域)的核酸序列、编码具有70个氨基酸的成熟人igf-1的核酸序列和编码e-肽的核酸序列分别可见于uniprot数据库的uniprotkb-p05019和genbank数据库的nm_000618.4、nm_001111285.2和nm_001111283.2。
292.在一些实施方案中，目的基因(其可以编码例如目的mrna和/或对应于目的基因的
目的蛋白质)编码目的蛋白质，其中目的蛋白质是抗炎细胞因子。在一些实施方案中，抗炎细胞因子是干扰素或白细胞介素。在一些实施方案中，干扰素是i型干扰素(例如，ifn-α、ifn-β、ifn-δ、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ν、ifn-τ和ifn-ω)、ii型干扰素(ifn-γ)或iii型干扰素(ifn-λ)。在一些实施方案中，α干扰素选自干扰素α-n3、干扰素α-2a和干扰素α-2b。干扰素的抗病毒感染活性已被描述于例如wo 2004/096852(chen，等人)，其中，描述了ifn-ω的抗sars作用；和wo 2005/097165(klucher，等人)，其中描述了ifn-λ变体的抗病毒作用，两者通过引用并入本文。在一些实施方案中，细胞因子是白细胞介素。在一些实施方案中，白细胞介素是白细胞介素1f家族成员。在一些实施方案中，白细胞介素是白细胞介素37(il-37，以前称为白细胞介素1家族成员7或il-1f7，并且由yan等人，2018,mediators of inflammation volume 2019,article id 2650590,和conti等人,2020年3月-4月,journal of biological regulators and homeostatic agents 34(2),doi:10.23812/conti-e[出版前epub],两者通过引用并入本文)。在一些实施方案中，白细胞介素是白细胞介素38(以前称为il-1hy2，并由例如xu等人，2018年6月，frontiers in immunology第9卷，article.1462描述，通过引用并入本文)。在一些实施方案中，目的基因编码诱饵蛋白。在一些实施方案中，诱饵蛋白是病毒的宿主细胞受体的可溶形式。在一些实施方案中，诱饵蛋白是可溶性ace2受体。在一些实施方案中，目的基因编码选自以下的蛋白质：i型干扰素、ii型干扰素、iii型干扰素、白细胞介素和诱饵蛋白。在一些实施方案中，目的基因编码选自以下的蛋白质：ifn-α，例如干扰素α-n3、干扰素α-2a或干扰素α-2b、ifn-β、ifn-δ、ifn-ε、ifn-κ、ifn-ν、ifn-τ、ifn-ω、ifn-γ、ifn-λ、il-37、il-38和可溶性ace2受体。
[0293]
靶基序
[0294]
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含含有靶基序的重组多核酸或rna构建体。如本文所用，术语“靶基序”或“靶向基序”可以指，存在于定位于细胞膜、细胞外区室或细胞内区室的任何部分的新合成的多肽或蛋白质中的任何短肽。细胞内区室包括但不限于细胞内细胞器，例如细胞核、核仁、内体、蛋白酶体、核糖体、染色质、核膜、核孔、外泌体、黑素体、高尔基体、过氧化物酶体、内质网(er)、溶酶体、中心体、微管、线粒体、叶绿体、微丝、中间丝或质膜。其他术语包括但不限于信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽。在一些实施方案中，靶基序有效地连接到至少一个编码目的基因的核酸序列。靶基序的非限制性实例包括信号肽、核定位信号(nls)、核仁定位信号(nols)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管端定位信号(mtls)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(er)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号、中心体定位信号(cls)、或将蛋白质靶向细胞膜、细胞外区室或细胞内区室的某个部分的任何其他信号。
[0295]
在一些实施方案中，靶基序选自由以下组成的组：(a)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；和(d)不具有天然靶基序功能的天然存在的氨基酸序列，其中该天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。
[0296]
在一些实施方案中，靶基序是信号肽。在一些实施方案中，信号肽选自由以下组成
的组：(a)与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽；(b)与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该信号肽通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰，条件是该蛋白质不是氧化还原酶；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该信号肽通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；和(d)不具有天然信号肽功能的天然存在的氨基酸序列，其中该天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。在一些实施方案中，信号肽n端的氨基酸1-9的平均疏水性评分在2以上。
[0297]
如本文所用，术语“与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序”或“与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽”是指天然存在的靶基序或信号肽，所述靶基序或信号肽不同于所述蛋白质的天然存在的靶基序或信号肽，即所述靶基序或信号肽与所述蛋白质不来源于相同基因。通常，与给定蛋白质异源的靶基序或信号肽是来自与给定蛋白质不相关的另一种蛋白质的靶基序或信号肽，即具有与给定蛋白质的靶基序或信号肽不同的氨基酸序列，例如，所述靶基序或信号肽具有不同于给定蛋白质的靶基序或信号肽的氨基酸序列，且所述差异超过50％，优选地超过60％，更优选地超过70％，甚至更优选地超过80％，最优选地超过90％，或特别地超过95％。优选地，与给定蛋白质异源的靶基序或信号肽与给定蛋白质的天然存在(同源)的靶基序或信号肽具有小于95％，优选地小于90％，更优选地小于80％，甚至更优选地小于70％，最优选地小于60％，或者特别地小于50％的序列同一性。尽管异源序列可源自相同的生物体，但它们天然地(天然)不出现在相同的核酸分子中，例如相同的mrna中。与蛋白质异源的靶基序或信号肽和与靶基序或信号肽异源的蛋白质可以是相同或不同来源，并且通常是相同来源，优选地真核来源，更优选地相同真核生物的真核来源，甚至更优选地哺乳动物来源，特别是相同哺乳动物生物的哺乳动物来源，或更特别地人来源。例如，公开了包含编码人bdnf信号肽和人igf-1基因(即，与信号肽异源的蛋白质)的核酸序列的重组多核酸或rna构建体，其中所述的信号肽和所述蛋白质为相同来源，即人来源。
[0298]
如本文所用，术语“与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序”或“与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽”是指蛋白质的天然存在的靶基序或信号肽。与蛋白质同源的靶基序或信号肽是在天然情况下由蛋白质的基因编码的靶基序或信号肽。与蛋白质同源的靶基序或信号肽通常是真核来源的，例如真核蛋白质的天然存在的靶基序或信号肽，优选地哺乳动物来源，例如哺乳动物蛋白质的天然存在的靶基序或信号肽，或更优选地人来源的，例如人蛋白质的天然存在的靶基序或信号肽。
[0299]
如本文所用，术语“不具有天然靶基序功能的天然存在的氨基酸序列”或“不具有天然信号肽功能的天然存在的氨基酸序列”是指，天然存在的且与天然存在的任何靶基序或信号肽的氨基酸序列都不相同的氨基酸序列。本发明中，不具有天然靶基序或信号肽功能的天然存在的氨基酸序列优选地长度在10-50个氨基酸之间，更优选地在11-45个氨基酸之间，甚至更优选地在12-45个氨基酸之间，最优选地在13-45个氨基酸之间，特别地在14-45个氨基酸之间，更特别地在15-45个氨基酸之间，或者甚至更特别地在16-40个氨基酸之间。优选地，本发明中，不具有天然靶基序或信号肽功能的天然存在的氨基酸序列是真核来源的并且与真核来源的任何靶基序或信号肽都不同，更优选地是哺乳动物来源的并且与哺乳动物来源的任何靶基序或信号肽都不同，或更优选地是人来源的并且与天然存在的人来源的任何靶基序或信号肽都不同。不具有天然靶基序或信号肽功能的天然存在的氨基酸序
列通常是蛋白质编码序列的氨基酸序列。根据本发明，不具有天然靶基序或信号肽功能的天然存在的氨基酸序列通常是真核来源的，优选地哺乳动物来源的，或更优选地人来源的。如本文所用，术语“天然存在的”、“天然的”和“天然”具有等同的含义。
[0300]
如本文所用，术语“信号肽n端的氨基酸1-9”是指信号肽的氨基酸序列的n末端的前九个氨基酸。类似地，本文使用的术语“信号肽n端的氨基酸1-7”是指信号肽的氨基酸序列的n末端的前七个氨基酸；术语“信号肽n端的氨基酸1-5”是指信号肽的氨基酸序列的n末端的前5个氨基酸。
[0301]
如本文所用，术语“通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰的氨基酸序列”是指这样的氨基酸序列，在所述氨基酸序列中包括至少一个氨基酸的取代、插入和/或缺失。如本文所用，术语“与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰”或“与目的基因编码的蛋白质异源的信号肽通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰”是指，与蛋白质异源的天然存在的靶基序或信号肽的氨基酸序列，在其天然存在的氨基酸序列中包括至少一个氨基酸的氨基酸取代、插入和/或缺失。如本文所用，术语“与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰”或“与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰”是指，与蛋白质同源的天然存在的靶基序或信号肽，在其天然存在的氨基酸序列内包括至少一个氨基酸的氨基酸取代、插入和/或缺失。术语“天然存在的氨基酸序列通过至少一个氨基酸的插入、缺失和/或取代而修饰”是指，在其天然存在的氨基酸序列内包括至少一个氨基酸的氨基酸取代、插入和/或缺失的天然存在的氨基酸序列。本文中的“氨基酸取代”或“取代”可指用另一种氨基酸取代亲本蛋白质序列中特定位置的氨基酸。例如，取代r34k是指其中用赖氨酸取代第34位的精氨酸的多肽。对于前面的例子，34k表示用赖氨酸取代第34位的氨基酸。出于本文的目的，多个取代通常由斜线分隔。例如，r34k/l78v是指包含取代r34k和l38v的双重变体。如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”可指在亲本蛋白质序列中特定位置的氨基酸添加。例如，插入-34表示在位置34的插入。如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”可指在亲本蛋白质序列中特定位置的氨基酸的去除。例如，r34-表示第34位精氨酸的缺失。
[0302]
优选地，缺失的氨基酸是疏水性评分低于0.8，优选地低于1.9的氨基酸。优选地，取代氨基酸是疏水性评分高于被取代的氨基酸的疏水性评分的氨基酸，更优选地，取代氨基酸是疏水性评分为2.8或更高，或更优选地疏水性评分为3.8或更高的氨基酸。优选地，插入的氨基酸是疏水性评分为2.8或更高，或更优选地疏水性评分为3.8或更高的氨基酸。
[0303]
通常在给定的氨基酸序列中插入、缺失和/或取代1至15个氨基酸，优选地1至11个氨基酸，更优选地1至10个氨基酸，甚至更优选地1至9个氨基酸，特别地1至8个氨基酸，更特别地1至7个氨基酸，甚至更特别地1至6个氨基酸，特别优选地1至5个氨基酸，更特别优选地1至4个氨基酸，或者甚至更特别地优选1至2个氨基酸。通常，在给定的蛋白质序列中，在靶基序或信号肽的氨基酸序列n末端的氨基酸1-11内，优选地在氨基酸1-10内，更优选地在氨基酸1-9内，甚至更优选地在氨基酸1-8内，特别地在氨基酸1-7，更特别地在氨基酸1-6内，甚至更特别地在氨基酸1-5内，特别优选地在氨基酸1-4内，更特别优选地在氨基酸1-3内或甚至更特别优选地在氨基酸1-2内，插入、缺失和/或取代1至15个氨基酸，优选地1至11个氨基酸，更优选地1至10个氨基酸，甚至更优选地1至9个氨基酸，特别地1至8个氨基酸，更特别
地1至7个氨基酸，甚至更特别地1-6个氨基酸，特别优选地1-5个氨基酸，更特别优选地1-4个氨基酸，或者甚至更特别优选地1-2个氨基酸。优选地，氨基酸序列任选地通过缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。
[0304]
优选地，与未修饰的信号肽相比，修饰的信号肽的氨基酸序列的n末端的前九个氨基酸的平均疏水性评分增加1.0个单位或以上。
[0305]
如本文所用，术语“胰岛素样生长因子1”、“胰岛素样生长因子1(igf1或igf-1)”、“igf1”或“igf-1”通常指没有信号肽的igf-1蛋白的天然序列，可以包含前肽和/或e肽，优选地是指没有信号肽和没有e肽的igf-1蛋白的天然序列。如本文所用，术语“人胰岛素样生长因子1(igf-1)”是指人igf-1的天然序列(pro-igf-1，在uniprot数据库中为uniprotkb-p05019，在genbank数据库中为nm_000618.4、nm_001111285.2和nm_001111283.2或其片段)。编码人胰岛素样生长因子1的天然dna序列可以是密码子优化的。人igf-1的天然序列由具有21个氨基酸(核苷酸1-63)的人信号肽，具有27个氨基酸(核苷酸64-144)的人前肽(也称为前结构域)，具有70个氨基酸(核苷酸145-354)的成熟人igf-1以及人igf-1的c端结构域(即,所谓的e-肽或e-结构域)组成。人igf-1的c端结构域(所谓的e-肽或e-结构域)包含由可变剪接事件产生的ea、eb或ec结构域。ea结构域由35个氨基酸(105个核苷酸)组成，eb结构域由77个氨基酸(231个核苷酸)组成，ec结构域由40个氨基酸(120个核苷酸)组成(参见例如，wallis m(2009)new insulin-like growth factor(igf)-precursor sequences from mammalian genomes:the molecular evolution of igfs and associated peptides in primates.growth horm igf res 19(1):12-23.doi:10.1016/j.ghir.2008.05.001)。如本文所用，术语“人胰岛素样生长因子1(igf-1)”通常是指没有信号肽的人igf-1蛋白的天然序列，并且可以包含前肽和/或e肽，优选地指没有信号肽和没有e-肽的人igf-1蛋白的天然序列。如本文所用，术语“人胰岛素样生长因子1(igf-1)”通常包含成熟人igf-1。术语“成熟蛋白质”是指在表达和分泌所述蛋白质的细胞中在内质网中合成并通过高尔基体分泌的蛋白质。术语“成熟igf-1”是指在表达和分泌igf-1的细胞中在内质网中合成并通过高尔基体分泌的蛋白质。术语“成熟人igf-1”是指在表达和分泌人igf-1的人细胞中在内质网中合成并通过高尔基体分泌的蛋白质，通常含有seq id no:19所示核苷酸编码的氨基酸。
[0306]
seq id no:19
[0307]
ggacctgagacactttgtggcgctgaactggtggacgccctgcagtttgtgtgtggcgacagaggcttctacttcaacaagcccacaggctacggcagcagctctagaagggctcctcagaccggaatcgtggacgagtgctgtttcagaagctgcgacctgcggcggctggaaatgtattgtgcccctctgaagcctgccaagagcgcc
[0308]
如本文所用，术语“修饰的胰岛素生长因子1(igf-1)的信号肽”、“修饰的igf-1的信号肽”或“igf-1修饰的信号肽”是指igf-1的修饰的信号肽，其中，在uniprot数据库中作为p05019和在genbank数据库中作为nm_000618.4、nm_001111284.1和nm_001111285.2的igf-1的天然信号肽，通过取代g2l/s5l/t9l/q10l和缺失k3-和c15-而修饰，并且优选地具有如seq id no:20所示的氨基酸序列和/或优选地由如seq id no:21所示的dna序列编码。
[0309]
seq id no:20
[0310]
met-leu-ile-leu-leu-leu-pro-leu-leu-leu-phe-lys-cys-phe-cys-asp-phe-leu-lys
[0311]
seq id no:21
[0312]
atgctgattctgctgctgcccctgctgctgttcaagtgcttctgcgacttcctgaaa
[0313]
如本文所用，术语“修饰的胰岛素生长因子1(igf-1)前结构域”、“修饰的igf-1前结构域”或“igf-1-pro-修饰的”是指，(在uniprot数据库中称为p05019，在genbank数据库中称为nm_000618.4、nm_001111284.1和nm_001111285.2的)igf-1的前肽，作为不具有天然信号肽的功能的天然存在的氨基酸序列，通过缺失前肽n末端跨氨基酸22-31的10个氨基酸残基(vkmhtmsssh(seq id no:198))而修饰，并且优选具有如seq id no:22所示的氨基酸序列和/或优选地由如seq id no:23所示的dna序列编码。
[0314]
seq id no:22
[0315]
met-leu-phe-tyr-leu-ala-leu-cys-leu-leu-thr-phe-thr-ser-ser-ala-thr-ala
[0316]
seq id no:23
[0317]
atgctgttctatctggccctgtgcctgctgacctttaccagctctgctaccgcc
[0318]
如本文所用，术语“mrna包含编码igf-1的前肽的核酸序列和编码成熟igf-1的核酸序列并且不包含编码igf-1的e-肽的核酸序列”，通常指所述mrna包含编码具有27个氨基酸的人igf-1的前肽(也称为前结构域)的核苷酸序列和编码具有70个氨基酸的成熟人igf-1的核苷酸序列，不包含编码人igf-1的e-肽(也称为e-结构域)的核苷酸序列，即，不包含编码ea-、eb-或ec-结构域的核苷酸序列。编码具有27个氨基酸的人igf-1的前肽(也称为前结构域)的核苷酸序列和编码具有70个氨基酸的成熟人igf-1的核苷酸序列可以进行密码子优化。
[0319]
术语“疏水性评分”或“疏水评分”与本文中的术语“亲水性评分”同义使用，是指根据kyte-doolittle kyte-doolittle量表(kyte j.,doolittle r.f.；j.mol.biol.157:105-132(1982))计算的氨基酸的疏水性程度。根据kyte-doolittle量表的氨基酸疏水性评分如下：
[0320]
[0321][0322]
氨基酸序列的“平均疏水性评分”，例如信号肽的氨基酸序列的n末端的氨基酸1-9的平均疏水性评分，是通过将氨基酸序列的每个氨基酸根据kyte-doolittle量表的疏水性评分相加，例如，将n末端氨基酸1-9的九个氨基酸的疏水性评分相加，除以氨基酸的个数，例如，除以九，来计算的。
[0323]
极性根据zimmerman极性指数(zimmerman j.m.,eliezer n.,simha r.；j.theor.biol.21:170-201(1968))计算。氨基酸序列的“平均极性”，例如信号肽氨基酸序列n末端氨基酸1-9的平均极性，是通过将氨基酸序列的每个氨基酸根据zimmerman极性指数计算的极性值相加，例如n末端氨基酸1-9的九个氨基酸的极性值相加，除以氨基酸的数目，例如除以九相加来计算的。根据zimmerman极性指数，氨基酸的极性如下：
[0324]
[0325][0326]
疾病与治疗
[0327]
在一些方面，本文提供细胞，其包含本文所述的任何重组多核酸或rna构建体的组合物。在一些方面，本文提供药物组合物，其包含本文所述的任何重组多核酸或rna构建体的组合物和药学上可接受的赋形剂。可以使用一种或多种药学上可接受的非活性成分以常规方式配制药物组合物，这些非活性成分有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径，并且药物组合物的概述可以在例如remington:the science and practice of pharmacy,第十九版(easton,pa.:mack publishing company,1995)；hoover,john e.,remington’s pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pennsylvania 1975；liberman,h.a.和lachman,l.,编辑,pharmaceutical dosage forms,marcel decker,new york,n.y.,1980；和pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,第七版(lippincott williams&wilkins 1999)中找到，通过引用并入本文。在一些实施方案中，药物组合物有助于将化合物施用于生物体。
[0328]
在一些方面，本文提供了本文所述的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体用作药物。在一些方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，包括向受试者施用本文所述的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在一些方面，本文提供本文所述的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体用于治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法。在一些方面，本文提供本文所述的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体在制备用于治疗有需要的受试者的疾病或病况的药物中的用途。在一些实施方案中，疾病或病况选自由以下组成的组：sars(严重急性呼吸综合征)、急性呼吸窘迫综合征(ards)、静脉血栓栓塞症、心血管并发症、急性肾损伤、急性肝损伤、神经系统并发症、细胞因子释放综合征、小儿多系统炎症综合征、感染性休克、弥散性血管内凝血、急性呼吸衰竭及其任何组合、椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎、银屑病、进行性骨化性纤维发育不良(fop)和肌萎缩侧索硬化(als)。在一些实施方案中，疾病或病况选自由以下组成的组：sars(严重急性呼吸综合征)、急性呼吸窘迫综合征(ards)、静脉
血栓栓塞症、心血管并发症、急性肾损伤、急性肝损伤、神经系统并发症、细胞因子释放综合征、小儿多系统炎症综合征、感染性休克、弥散性血管内凝血、急性呼吸衰竭及其任何组合、椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎和银屑病。在一些实施方案中，疾病或病况选自由以下组成的组：sars(严重急性呼吸综合征)、椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎、银屑病、进行性骨化性纤维发育不良(fop)和肌萎缩侧索硬化(als)。在一些实施方案中，疾病或病况选自由以下组成的组：sars(严重急性呼吸综合征)、椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎和银屑病。
[0329]
在一些实施方案中，疾病或病况选自由以下组成的组：椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎、银屑病、进行性骨化性纤维发育不良(fop)和肌萎缩侧索硬化(als)。在一些实施方案中，疾病或病况选自由以下组成的组：椎间盘疾病(ivdd)、骨关节炎和银屑病。在一些实施方案中，疾病或病况包括皮肤疾病或病况。在一些实施方案中，皮肤疾病或病况包括炎性皮肤病。在一些实施方案中，炎性皮肤病包括银屑病。在一些实施方案中，疾病或病况包括肌肉疾病或病况。在一些实施方案中，肌肉疾病或病况包括骨骼肌疾病。在一些实施方案中，骨骼肌疾病包括进行性骨化性纤维发育不良(fop)。在一些实施方案中，疾病或病况包括神经退行性疾病或病况。在一些实施方案中，神经退行性疾病或病况包括运动神经元病症。在一些实施方案中，运动神经元病症包括肌萎缩侧索硬化(als)。在一些实施方案中，疾病或病况包括关节疾病或病况。在一些实施方案中，关节疾病或病况包括关节退行性变。在一些实施方案中，关节退行性变包括椎间盘疾病(ivdd)或骨关节炎(oa)。
[0330]
椎间盘疾病(ivdd)是一种估计在发达国家每年影响约5％人口的病况，其特征在于分隔脊柱的每个椎骨的一个或多个椎间盘的退化。椎间盘在椎骨之间提供缓冲并吸收施加在脊柱上的压力。尽管脊柱下部的椎间盘在ivdd中最常受到影响，但脊柱的任何部分都可出现椎间盘退变，因此这种情况会导致背部、颈部、腿部和手臂疼痛。此外，根据受累椎间盘的位置，ivdd会引起周期性或慢性疼痛，在坐着、弯曲、扭转或举起物体时会更严重。ivdd是遗传和环境因素相结合的结果，其中大部分因素仍然未知。一些基因已被确定具有可影响ivdd风险的变异，其中包括与胶原蛋白、免疫功能和在椎间盘和椎骨的发育和维持中发挥作用的蛋白质相关的基因。非遗传因素包括衰老、吸烟、肥胖、慢性炎症和长时间驾驶。其中两个基因是胰岛素样生长因子1(igf-1)及其受体(胰岛素样生长因子1受体，igf-1r)，它们可以调节细胞外基质的合成，对维持椎间盘的正常功能起关键作用。
[0331]
骨关节炎是一种常见的关节疾病，其特征在于关节软骨的进行性退化，随着病情恶化导致疼痛、僵硬和运动受限。不再被软骨缓冲的骨骼区域相互摩擦并开始分解，在免疫系统试图修复和重建这些组织时造成进一步的损伤，例如炎症。此外，也可以出现骨赘(或骨骼和其他组织的异常生长)，这些可表现为关节增大。据认为骨关节炎患者的分解代谢和合成代谢的平衡丧失，导致软骨损伤和完全分解。其表达影响骨关节炎风险的基因通常涉及骨和软骨的形成和维持。
[0332]
在ivdd和骨关节炎中，减少炎症(例如，减少il-1β、il-8等)同时增加合成代谢信号(例如，igf-1等)可具有治疗效果。在一些方面，本文提供治疗受试者椎间盘疾病(ivdd)的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合靶mrna的sirna和编码目的基因的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在优选的实施方案中，sirna能够结合il-1βmrna。在另一个优选的实施方案中，sirna能够结合il-8mrna。在优选的实施方案中，编码目的基因的mrna编码igf-1。
[0333]
在一些方面，本文提供治疗受试者的关节疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合il-1βmrna的sirna和编码igf-1的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在一些方面，本文提供治疗受试者的关节疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含重组多核酸构建体的药物组合物，该重组多核酸构建体包含编码能够结合il-1βmrna的sirna的核酸序列和编码igf-1的核酸序列。在一些方面，本文提供治疗受试者的关节疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含重组rna构建体的药物组合物，该重组rna构建体包含能够结合il-1βmrna的sirna和编码igf-1的mrna。在一些实施方案中，关节疾病或病况是关节退行性变。在一些实施方案中，关节退行性变是椎间盘疾病(ivdd)或骨关节炎(oa)。
[0334]
在一些方面，本文提供治疗受试者椎间盘疾病(ivdd)的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合il-1βmrna的sirna和编码igf-1的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体，在一些方面，本文提供治疗受试者椎间盘疾病(ivdd)的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合il-8mrna的sirna和编码igf-1的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。
[0335]
在一些方面，本文提供治疗受试者椎间盘疾病(ivdd)的方法，该方法包括向受试者施用包含重组多核酸构建体的药物组合物，所述重组多核酸构建体包含编码能够结合il-1βmrna的sirna的核酸序列和编码igf-1的核酸。在一些方面，本文提供了一种治疗受试者椎间盘疾病(ivdd)的方法，该方法包括向受试者施用包含重组多核酸构建体的药物组合物，该重组多核酸构建体包含编码能够结合il-8mrna的sirna的核酸序列和编码igf-1的核酸序列。
[0336]
在一些方面，本文提供治疗受试者椎间盘疾病(ivdd)的方法，该方法包括向受试者施用包含重组rna构建体的药物组合物，该重组rna构建体包含能够结合il-1βmrna的sirna和编码igf-1的mrna。在一些方面，本文提供治疗受试者椎间盘疾病(ivdd)的方法，该方法包括向受试者施用包含重组rna构建体的药物组合物，该重组rna构建体包含能够结合il-8mrna的sirna和编码igf-1的mrna。
[0337]
在一些方面，本文提供治疗受试者骨关节炎的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合靶mrna的sirna和编码目的基因的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在优选的实施方案中，sirna能够结合il-1βmrna。在另一个优选的实施方案中，sirna能够结合il-8mrna。在优选的实施方案中，编码目的基因的mrna编码igf-1。
[0338]
在一些方面，本文提供治疗受试者骨关节炎的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合il-1βmrna的sirna和编码igf-1的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在一些方面，本文提供治疗受试者骨关节炎的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合il-8mrna的sirna和编码igf-1的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。
[0339]
在一些方面，本文提供治疗受试者骨关节炎的方法，该方法包括向受试者施用包含重组多核酸构建体的药物组合物，该重组多核酸构建体包含编码能够结合il-βmrna的sirna的核酸和编码igf-1的核酸。在一些方面，本文提供了治疗受试者骨关节炎的方法，该方法包括向受试者施用包含重组多核酸构建体的药物组合物，所述重组多核酸构建体包含编码能够结合il-8mrna的sirna的核酸序列和编码igf-1的核酸序列。
[0340]
在一些方面，本文提供了治疗受试者骨关节炎的方法，该方法包括向受试者施用包含重组rna构建体的药物组合物，该重组rna构建体包含能够结合il-1βmrna的sirna和编码igf-1的mrna。在一些方面，本文提供了治疗受试者骨关节炎的方法，该方法包括向受试者施用包含重组rna构建体的药物组合物，该重组rna构建体包含能够结合il-8mrna的sirna和编码igf-1的mrna。
[0341]
银屑病是一种慢性炎性皮肤病，其特征在于通常被片状白色鳞片覆盖的红色、受刺激的皮肤斑块。银屑病患者也可能发展为银屑病关节炎，这是一种涉及关节炎症的病况。尽管目前尚不清楚这种疾病的确切原因，但该疾病被认为是由t细胞(例如，t细胞攻击健康皮肤细胞)和其他白细胞如中性粒细胞的免疫系统问题引起的自身免疫性疾病。
[0342]
在一些方面，本文提供治疗受试者皮肤疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合il-1βmrna的sirna和编码igf-1的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在一些方面，本文提供治疗受试者的关节疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含重组多核酸构建体的药物组合物，该重组多核酸构建体包含编码能够结合il-1βmrna的sirna的核酸序列和编码igf-1的核酸。在一些方面，本文提供治疗受试者的皮肤疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含重组rna构建体的药物组合物，该重组rna构建体包含能够结合il-1βmrna的sirna和编码igf-1的mrna。在一些实施方案中，皮肤疾病或病况是炎性皮肤病。在一些实施方案中，炎性皮肤病是银屑病。
[0343]
在一些方面，本文提供治疗受试者银屑病的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合靶mrna的sirna和编码目的基因的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在优选的实施方案中，sirna能够结合il-17mrna。在另一个实施方案中，sirna能够结合tnf-αmrna。在优选的实施方案中，编码目的基因的mrna编码il-4。
[0344]
在一些方面，本文提供治疗受试者银屑病的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合il-17mrna的sirna和编码il-4的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在一些方面，本文提供治疗受试者银屑病的方法，该方法包括向受试者施用包含重组多核酸构建体的药物组合物，所述重组多核酸构建体包含编码能够结合il-17mrna的sirna的核酸序列和编码il-4的核酸。在一些方面，本文提供治疗受试者银屑病的方法，该方法包括向受试者施用包含重组rna构建体的药物组合物，该重组rna构建体包含能够结合il-17mrna的sirna和编码il-4的mrna。
[0345]
在一些方面，本文提供治疗受试者银屑病的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合tnf-αmrna的sirna和编码il-4的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在一些方面，本文提供治疗受试者银屑病的方法，该方法包括向受试者施用包含重组多核酸构建体的药物组合物，该重组多核酸构建体包含编码能够结合tnf-αmrna的sirna的核酸序列和编码il-4的核酸。在一些方面，本文提供治疗受试者银屑病的方法，该方法包括向受试者施用包含重组rna构建体的药物组合物，该重组rna构建体包含能够结合tnf-αmrna的sirna和编码il-4的mrna。
[0346]
进行性骨化性纤维发育不良(fop)是一种骨骼肌疾病，其中肌肉组织和结缔组织如肌腱和韧带逐渐骨化，形成限制运动的骨骼外的或异位的骨骼。在关节受累时，骨骼外骨骼的形成导致活动性逐渐丧失。任何对fop患者肌肉的创伤，例如跌倒或侵入性医疗程序，都可引发肌肉肿胀和炎症发作，随后受伤区域的肌肉和结缔组织会更快地骨化。
[0347]
在一些方面，本文提供了治疗受试者的肌肉疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合alk2 mrna的sirna和编码igf-1的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在一些方面，本文提供了一种治疗受试者的肌肉疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含重组多核酸构建体的药物组合物，所述重组多核酸构建体包含编码能够结合alk2 mrna的sirna的核酸序列和编码igf-1的核酸。在一些方面，本文提供了治疗受试者的肌肉疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含重组rna构建体的药物组合物，该重组rna构建体包含能够结合alk2 mrna的sirna和编码igf-1的mrna。在一些实施方案中，肌肉疾病或病况是骨骼肌疾病。在一些实施方案中，骨骼肌疾病是进行性骨化性纤维发育不良(fop)。
[0348]
肌萎缩侧索硬化(als)或lou gehrig病是一种进行性神经退行性疾病，它会影响大脑和脊髓中的神经细胞，导致肌肉损失。它是一种运动神经元疾病，其特征是上下运动神经元退化，导致肌肉无力并最终瘫痪。als的病因尚不清楚，然而，一些与als相关的生物标志物和基因包括超氧化物歧化酶1(sod1)已经被发现。有2种类型的als由遗传学区分：家族性和散发性(特发性)。
[0349]
在一些方面，本文提供治疗受试者的神经退行性疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合sod1 mrna的sirna和编码igf-1的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在一些方面，本文提供了治疗受试者的神经退行性疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含重组多核酸构建体的药物组合物，该重组多核酸构建体包含编码能够结合sod1 mrna的sirna的核酸序列和编码igf-1的核酸。在一些方面，本文提供治疗受试者的神经退行性疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含重组rna构建体的药物组合物，该重组rna构建体包含能够结合sod1 mrna的sirna和编码igf-1的mrna。在一些实施方案中，神经退行性疾病或病症是运动神经元病症。在一些实施方案中，运动神经元病症是肌萎缩侧索硬化(als)。
[0350]
在一些方面，本文提供治疗受试者的神经退行性疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含能够结合sod1 mrna的sirna和编码epo的mrna的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在一些方面，本文提供治疗受试者的神经退行性疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含重组多核酸构建体的药物组合物，该重组多核酸构建体包含编码能够结合sod1 mrna的sirna的核酸序列和编码epo的核酸。在一些方面，本文提供治疗受试者的神经退行性疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用包含重组rna构建体的药物组合物，该重组rna构建体包含能够结合sod1 mrna的sirna和编码epo的mrna。在一些实施方案中，神经退行性疾病或病况是运动神经元病症。在一些实施方案中，运动神经元病症是肌萎缩侧索硬化(als)。
[0351]
在一些方面，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗与冠状病毒感染有关的疾病或病况的方法，包括向受试者施用本文所述的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。在一些实施方案中，疾病或病况是由sars相关冠状病毒感染引起的sars(严重急性呼吸系统综合症)。在一些实施方案中，本发明可用于治疗由冠状病毒感染引起或与之相关的疾病或病况，包括但不限于冠状病毒感染的并发症。在一些实施方案中，疾病或病况是呼吸综合征，例如由sars相关冠状病毒感染引起的sars(严重急性呼吸综合征)。在一些实施方案中，疾病或病况选自例如急性呼吸窘迫综合征(ards)、静脉血栓栓塞、心血管并
发症、急性肾损伤、急性肝损伤、神经系统并发症、细胞因子释放综合征、小儿多系统炎症综合征、脓毒性休克、弥散性血管内凝血、急性呼吸衰竭及其任何组合。在一些实施方案中，使用本发明的组合物或方法治疗的与冠状病毒感染相关的疾病或病况是本领域技术人员已知的并且在文献中描述。在一些实施方案中，平行地通过sirna控制和/或下调特定生理机制以及通过过表达治疗性蛋白质来激活和/或增加另一种生理机制，例如炎症，本发明可用于治疗此类疾病或病况。在一些实施方案中，冠状病毒是sars-cov(也称为sars-cov-1；负责2002-2003年sars流行的病毒)、sars-cov-2(导致新型冠状病毒疾病2019或covid-19的病毒)或mers-cov(中东呼吸综合征病毒)。在一些实施方案中，使用本发明治疗sars-cov、sars-cov-2和mers中的一个或多个。这些和相关病毒由例如国际病毒分类委员会冠状病毒研究小组，2020年3月，nature microbiology 5:536-44)描述，通过引用并入本文。
[0352]
在一些方面，本文提供了在有需要的受试者中治疗与冠状病毒感染有关的疾病或病况的方法，包括向受试者施用本文所述的药物组合物、细胞、重组多核酸构建体或重组rna构建体。
[0353]
在一些方面，施用于受试者的组合物包含多核酸构建体，所述多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合il-6mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体包含1个针对il-6mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体包含3个sirna，各自针对il-6mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:29或30(化合物b1或b2)所示的序列。
[0354]
在一些方面，施用于受试者的组合物包含多核酸构建体，所述多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白介素6r(il-6r)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体包含1个针对il-6r mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体包含3个sirna，各自针对il-6r mrna。在相关方面，所述至少的3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:31(化合物b3)所示的序列。
[0355]
在一些方面，施用于受试者的组合物包含多核酸构建体，所述多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白介素6rα(il-6r-α)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体包含1个针对il-6r-αmrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对il-6r-αmrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:32(化合物b4)所示的序列。
[0356]
在一些方面，施用于受试者的组合物包含多核酸构建体，所述多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白介素6rβ(il-6r-β)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对il-6r-βmrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对il-6r-βmrna。在
no:40)的组合物，以用于本文所述的方法，例如，用于调节或调控与sars cov感染、mers感染或两者相关的基因表达。在某些方面，考虑此类组合物，包括包含化合物b13(seq id no:41)的组合物，以用于本文所述的方法，例如，用于调节或调控与sars cov感染、sars cov-2感染、和/或mers感染相关的基因表达。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:40、41和42(化合物b12、b13和b14)中任一项所示的序列。
[0362]
在一些方面，施用于受试者的组合物包含多核酸构建体，所述多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合il-6mrna的sirna，至少一个能够结合ace2 mrna的sirna，以及至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，(ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，其中一个针对il-6mrna，一个针对ace2 mrna，一个针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，编码ifn-β的mrna编码天然ifn-β信号肽或修饰的信号肽。在相关方面，修饰的ifn-β信号肽是如本文所述的sp1或sp2(分别为seq id no:52和54)。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:43、44和45(化合物b15、b16和b17)中任一项所示的序列。
[0363]
在一些方面，施用于受试者的组合物包含多核酸构建体，所述多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orflab mrna的小干扰rna，至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna，以及至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，一个针对orflab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，以及一个针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:46(化合物b18)所示的序列。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:190(化合物b18)所示的序列。
[0364]
在一些方面，施用于受试者的组合物包含多核酸构建体，所述多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对sars cov-2 s mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:47(化合物b19)所示的序列。
[0365]
在一些方面，本发明提供包含重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体包含选自由seq id no:29-47组成的组的核酸序列。在一些方面，本发明提供包含重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体包含seq id no:190的核酸序列。
[0366]
本发明的组合物可以使用本领域已知的任何合适的方法施用于受试者。用于本发明的合适制剂和递送方法在本领域中通常是熟知的。例如，本文所述的组合物可以多种方式施用于受试者，包括肠胃外、静脉内、皮内、肌内、结肠、直肠或腹膜内。在一些实施方案中，本文所述的组合物通过受试者的腹膜内注射、肌肉内注射、皮下注射或静脉内注射来施用。在一些实施方案中，本文所述的组合物可以肠胃外、静脉内、肌内或口服施用。
[0367]
本发明的任何组合物可以与使用说明书一起提供。使用说明书可以包括对技术人员或主治医师如何根据本发明治疗(或预防)如本文所述的疾病或病症(例如ivdd、骨关节
炎、银屑病或骨骼肌损伤)的指导。在一些实施方案中，使用说明书可包括关于本文所述的递送/施用模式和递送/施用方案的指导(例如，递送/施用途径、剂量方案、递送/施用时间、递送/施用频率等)。在一些实施方案中，使用说明书可以包括如何施用或注射本发明的组合物和/或如何配制以用于施用或注射的说明。原则上，本文别处关于递送/施用方式和递送/施用方案描述的内容可以作为相应的说明部分包含在使用说明书中。
[0368]
本发明的组合物可用于基因治疗。在某些实施方案中，包含本文所述的重组多核酸或rna构建体的组合物可以在基因治疗载体中递送至细胞。基因治疗载体和基因递送方法是本领域熟知的。这些方法的非限制性实例包括病毒载体递送系统，包括dna和rna病毒，其在递送到细胞后作为附加体或整合在基因组中；非病毒载体递送系统，包括dna质粒、裸核酸和与递送运载体复合的核酸、转座子系统(用于递送和整合到宿主基因组中；moriarity,等人(2013)nucleic acids res 41(8),e92,aronovich,等人(2011)hum.mol.genet.20(r1)、r14-r20)、逆转录病毒介导的dna转移(例如，莫洛尼小鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒诸如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒等，腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒；参见例如kay等人(1993)science 262,117-119,anderson(1992)science 256,808-813)，以及dna病毒介导的dna转移，包括腺病毒，疱疹病毒、细小病毒和腺相关病毒(例如，ali等人.(1994)gene therapy 1,367-384)。病毒载体还包括但不限于腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒和单纯疱疹病毒载体。能够整合到宿主基因组中的载体包括但不限于逆转录病毒或慢病毒。
[0369]
在一些实施方案中，包含本文所述的重组多核酸或rna构建体的组合物可通过直接dna转移递送到细胞(wolff等人(1990)science 247,1465-1468)。可以在轻微机械破坏细胞膜、短暂透化细胞后，将重组多聚核酸或rna构建体递送至细胞。这种温和的膜机械破坏可以通过轻轻地迫使细胞通过一个小孔来完成(sharei等人plos one(2015)10(4),e0118803)。在另一个实施方案中，包含本文所述的重组多核酸或rna构建体的组合物可以通过脂质体介导的dna转移来递送到细胞(例如，gao&huang(1991)biochem.biophys.res.comm.179,280-285,crystal(1995)nature med.1,15-17,caplen等人(1995)nature med.3,39-46)。术语“脂质体”可以涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质载体。重组多核酸或rna构建体可以封装在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层中，通过与脂质体和寡核苷酸两者连接的连接分子连接到脂质体，包埋在脂质体中，或与脂质体复合。
[0370]
基因表达的调节
[0371]
在一些方面，本文提供在细胞中自单个rna转录本同时表达sirna和mrna的方法，包括将本文所述的任何重组多核酸构建体的组合物引入细胞。
[0372]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码目的基因的核酸序列；其中靶mrna不同于由目的基因编码的mrna，并且其中靶mrna和目的基因的表达同时受到调节。
[0373]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将
重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合il-1βmrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码igf-1的核酸序列；其中il-1βmrna和igf-1的表达同时受到调节。
[0374]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合il-8mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码igf-1的核酸序列；其中il-8mrna和igf-1的表达同时受到调节。
[0375]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞中，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合il-17mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码il-4的核酸序列；其中il-17mrna和il-4的表达同时受到调节。
[0376]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞中，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合tnf-αmrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码il-4的核酸序列；其中tnf-αmrna和il-4的表达同时受到调节。
[0377]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞中，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合tnf-αmrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列和至少一个编码或包含能够结合il-17mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码il-4的核酸序列；其中tnf-αmrna、il-17mrna和il-4的表达同时受到调节。
[0378]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞中，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合alk2mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码igf-1的核酸序列；其中alk2mrna和igf-1的表达同时受到调节。
[0379]
在一些方面，本文提供了同时调节细胞中两个或更多个基因表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞中，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合sod1mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码igf-1的核酸序列；其中sod1mrna和igf-1的表达同时受到调节。
[0380]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞中，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合sod1mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码epo的核酸序列；其中sod1mrna和epo的表达同时受到调节。
[0381]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合il-6mrna的sirna；和(ii)mrna ifn-β。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体包含1个针对il-6mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体包含3个sirna，各自针对il-6mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:29或30(化合物b1或b2)所示的序列。
[0382]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6r(il-6r)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体包含1个针对il-6r mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体包含3个sirna，各自针对il-6r mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:31(化合物b3)所示的序列。
[0383]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6rα(il-6r-α)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体包含1个针对il-6r-αmrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对il-6r-αmrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:32(化合物b4)所示的序列。
[0384]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6rβ(il-6r-β)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对il-6r-βmrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对il-6r-βmrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:33(化合物b5)所示的序列。
[0385]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合ace2 mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对ace2 mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对ace2 mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:34或35(化合物b6或b7)所示的序列。
[0386]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orf1ab mrna的小干扰rna(sirna)，至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna，至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，一个针对sars cov-2 orf1ab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，一个针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在某些方面，考虑此类组合物，包括
包含化合物b8(seq id no:36)的组合物，以用于本文所述的方法中，例如用于调节或调控与sars cov感染、sars cov-2感染或两者相关的基因表达。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:36所示的序列。
[0387]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对sars cov-2 s mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:37或39(化合物b9或b11)所示的序列。
[0388]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，(ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对sars cov-2 n mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:38(化合物b10)所示的序列。
[0389]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞中，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orf1ab mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对sars cov-2orf1ab mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对sars cov-2 orf1ab mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在某些方面，考虑此类组合物，包括包含化合物b12(seq id no:40)的组合物，以用于本文所述的方法，例如，用于调节或调控与sars cov感染、mers感染或两者相关的基因表达。在某些方面，考虑此类组合物，包括包含化合物b13(seq id no:41)的组合物，以用于本文所述的方法中，例如用于调节或调控与sars cov感染、sars cov-2感染和/或mers感染相关的基因表达。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:40、41和42(化合物b12、b13和b14)中任一项所示的序列。
[0390]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合il-6mrna的sirna、至少一个能够结合ace2 mrna的sirna，至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，一个针对il-6mrna，一个针对ace2 mrna，一个针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，编码ifn-β的mrna编码天然ifn-β信号肽或修饰的信号肽。在相关方面，修饰的ifn-β信号肽是如本文所述的sp1或sp2(分别为seq id no:52和54)。在相关方
面，多核酸构建体包含如seq id no:43、44和45(化合物b15、b16和b17)中任一项所示的序列。
[0391]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orf1ab mrna的小干扰rna，至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna，至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，一个针对orf1ab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，一个针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:46(化合物b18)所示的序列。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:190(化合物b18)所示的序列。
[0392]
在一些方面，本文提供同时调节细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对sars cov-2 s mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:47(化合物b19)所示的序列。
[0393]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合靶信使rna(mrna)的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码目的基因的核酸序列；其中靶mrna不同于由目的基因编码的mrna，并且其中靶mrna的表达下调并且同时目的基因的表达上调。在一些实施方案中，靶mrna的表达由能够结合靶mrna的sirna下调。在一些实施方案中，通过表达或过表达目的基因编码的mrna或蛋白质来上调目的基因的表达。
[0394]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合il-1βmrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码igf-1的核酸序列；其中il-1βmrna的表达下调且同时igf-1的表达上调。在一些实施方案中，il-1βmrna的表达由能够结合il-1βmrna的sirna下调。在一些实施方案中，igf-1的表达通过表达或过表达igf-1mrna或igf-1蛋白而上调。
[0395]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞中，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合il-8mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码igf-1的核酸序列；其中il-8mrna的表达下调且同时igf-1的表达上调。在一些实施方案中，il-8mrna的表达由能够结合il-8mrna的sirna下调。在一些实施方案中，igf-1的表达通过表达或过表达igf-1mrna或igf-1蛋白而上调。
[0396]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合il-17mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码il-4的核酸序
列；其中il-17mrna的表达下调且同时il-4的表达上调。在一些实施方案中，il-17mrna的表达由能够结合il-17mrna的sirna下调。在一些实施方案中，通过表达或过表达il-4mrna或il-4蛋白来上调il-4的表达。
[0397]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合tnf-αmrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码il-4的核酸序列；其中tnf-αmrna的表达下调且同时il-4的表达上调。在一些实施方案中，tnf-αmrna的表达由能够结合tnf-αmrna的sirna下调。在一些实施方案中，通过表达或过表达il-4mrna或il-4蛋白来上调il-4的表达。
[0398]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合tnf-αmrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列和至少一个编码或包含能够结合il-17mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码il-4的核酸序列；其中tnf-αmrna的表达和/或il-17mrna的表达下调，且同时il-4的表达上调。在一些实施方案中，tnf-αmrna的表达和il-17mrna的表达由能够结合tnf-αmrna的sirna和能够结合il-17mrna的sirna下调。在一些实施方案中，通过表达或过表达il-4mrna或il-4蛋白来上调il-4的表达。
[0399]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合alk2 mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码igf-1的核酸序列；其中alk2 mrna的表达下调，且同时igf-1的表达上调。在一些实施方案中，alk2 mrna的表达由能够结合alk2 mrna的sirna下调。在一些实施方案中，igf-1的表达通过表达或过表达igf-1mrna或igf-1蛋白而上调。
[0400]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合sod1 mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码igf-1的核酸序列；其中sod1 mrna的表达下调，且同时igf-1的表达上调。在一些实施方案中，sod1 mrna的表达由能够结合sod1 mrna的sirna下调。在一些实施方案中，igf-1的表达通过表达或过表达igf-1mrna或igf-1蛋白而上调。
[0401]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体包含：(i)至少一个编码或包含能够结合sod1 mrna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和(ii)至少一个编码epo的核酸序列；其中sod1 mrna的表达下调，且同时epo的表达上调。在一些实施方案中，sod1 mrna的表达由能够结合sod1 mrna的sirna下调。在一些实施方案中，epo的表达通过表达或过表达epo mrna或epo蛋白而上调。
[0402]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合il-6mrna的sirna；和(ii)mrna ifn-β。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核
酸构建体包含1个针对il-6mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体包含3个sirna，各自针对il-6mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:29或30(化合物b1或b2)所示的序列。
[0403]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6r(il-6r)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体包含1个针对il-6r mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体包含3个sirna，各自针对il-6r mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:31(化合物b3)所示的序列。
[0404]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6rα(il-6r-α)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体包含1个针对il-6r-αmrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对il-6r-αmrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:32(化合物b4)所示的序列。
[0405]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合白细胞介素6rβ(il-6r-β)mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对il-6r-βmrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对il-6r-βmrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:33(化合物b5)所示的序列。
[0406]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合ace2mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对ace2 mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对ace2 mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:34或35(化合物b6或b7)所示的序列。
[0407]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orf1ab mrna的小干扰rna(sirna)，至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna，至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码
或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，一个针对sars cov-2 orf1ab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，一个针对sars cov-2n mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在某些方面，考虑此类组合物，包括包含化合物b8(seq id no:36)的组合物，以用于本文所述的方法中，例如用于调节或调控与sars cov感染、sars cov-2感染或两者相关的基因表达。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:36所示的序列。
[0408]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：((i)至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对sars cov-2 s mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:37或39(化合物b9或b11)所示的序列。
[0409]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对sars cov-2 n mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:38(化合物b10)所示的序列。
[0410]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orf1ab mrna的sirn；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对sars cov-2 orf1ab mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对sars cov-2 orf1ab mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在某些方面，考虑此类组合物，包括包含化合物b12(seq id no:40)的组合物，以用于本文所述的方法，例如用于调节或调控与sars cov感染、mers感染或两者相关的基因表达。在某些方面，考虑此类组合物，包括包含化合物b13(seq id no:41)的组合物，以用于本文所述的方法，例如用于调节或调控与sars cov感染、sars cov-2感染和/或mers感染相关的基因表达。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:40、41和42(化合物b12、b13和b14)中任一项所示的序列。
[0411]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合il-6mrna的sirna、至少一个能够结合ace2 mrna的sirna，至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ifn-β的mrna。在相关方面，ii)的mrna编码或进一步编码ace2可溶性受体。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方
面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，一个针对il-6mrna，一个针对ace2 mrna，一个针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，编码ifn-β的mrna编码天然ifn-β信号肽或修饰的信号肽。在相关方面，修饰的ifn-β信号肽是如本文所述的sp1或sp2(分别为seq id no:52和54)。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:43、44和45(化合物b15、b16和b17)中任一项所述的序列。
[0412]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，所述重组多核酸构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 orf1ab mrna的小干扰rna，至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna，至少一个能够结合sars cov-2 n mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，一个针对orf1ab mrna，一个针对sars cov-2 s mrna，一个针对sars cov-2 n mrna。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:46(化合物b18)所示的序列。在相关方面，多核酸构建体包含如seq id no:190(化合物b18)所示的序列。
[0413]
在一些方面，本文提供同时上调和下调细胞中两个或更多个基因的表达的方法，包括将重组多核酸构建体引入细胞，该构建体编码或包含：(i)至少一个能够结合sars cov-2 s mrna的sirna；和(ii)编码ace2可溶性受体的mrna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3个sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含1个针对sars cov-2s mrna的sirna。在相关方面，多核酸构建体编码或包含3个sirna，各自针对sars cov-2 s mrna。在相关方面，所述的至少3个sirna彼此相同、彼此不同或是其组合。在相关方面，重组多核酸构建体包含如seq id no:47(化合物b19)所示的序列。
[0414]
示例性实施方案
[0415]
实施方案1.组合物，其包含重组多核酸构建体，所述重组多核酸构建体包含：
[0416]
(i)至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和
[0417]
(ii)至少一个编码目的基因的核酸序列；
[0418]
其中靶rna不同于目的基因编码的mrna。
[0419]
实施方案2.实施方案1的组合物，其中重组多核酸构建体包含两个或更多个编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列，其中所述两个或更多个核酸序列各自编码或包含能够结合相同靶rna或不同靶rna的sirna。
[0420]
实施方案3.实施方案1或2的组合物，其中靶rna是mrna。
[0421]
实施方案4.实施方案1或2的组合物，其中靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：白细胞介素8(il-8)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素17(il-17)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)。
[0422]
实施方案5.实施方案1-4中任一项所述的组合物，其中重组多核酸构建体包含两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中所述两个或更多个核酸序列各自编码相同目的基因或不同目的基因。
[0423]
实施方案6.实施方案1-5中任一项的组合物，其中目的基因包含编码选自由以下组成的组的蛋白质的核酸序列：分泌蛋白、细胞内蛋白质、细胞器内蛋白质和膜蛋白。
[0424]
实施方案7.实施方案1-3中任一项的组合物，其中目的基因选自由以下组成的组：胰岛素样生长因子1(igf-1)和白细胞介素4(il-4)。
[0425]
实施方案8.实施方案1-7中任一项的组合物，其中重组多核酸构建体还包含编码靶基序的核酸序列，所述靶基序有效地连接到所述至少一个编码目的基因的核酸序列，其中靶基序包括信号肽、核定位信号(nls)、核仁定位信号(nols)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管端定位信号(mtls)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(er)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号或中心体定位信号(cls)。
[0426]
实施方案9.实施方案8的组合物，其中靶基序选自由以下组成的组：
[0427]
(a)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序；
[0428]
(b)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；
[0429]
(c)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；和
[0430]
(d)不具有天然靶基序功能的天然存在的氨基酸序列，其中所述天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。
[0431]
实施方案10.实施方案1-9中任一项的组合物，其中重组多核酸构建体进一步包含编码或包含poly(a)尾的核酸序列、编码或包含5'帽的核酸序列、编码或包含启动子的核酸序列或编码或包含kozak序列的核酸序列。
[0432]
实施方案11.实施方案1-9中任一项的组合物，其中重组多核酸构建体还包含编码或包含接头的核酸序列。
[0433]
实施方案12.实施方案1-11中任一项的组合物，其中通过编码或包含接头的核酸序列，连接(a)所述至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和所述至少一个编码目的基因的核酸序列，(b)所述两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列中的每一个，和/或(c)所述两个或更多个编码目的基因的核酸序列中的每一个。
[0434]
实施方案13.实施方案11或12的组合物，其中接头包含trna接头、2a肽接头或柔性接头。
[0435]
实施方案14.实施方案11-13中任一项的组合物，其中编码或包含接头的核酸序列的长度为至少6个核酸残基。
[0436]
实施方案15.实施方案11-13中任一项的组合物，其中编码或包含接头的核酸序列的长度为不超过50个核酸残基。
[0437]
实施方案16.实施方案11-13中任一项的组合物，其中编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约50个核酸残基。
[0438]
实施方案17.实施方案11-13中任一项的组合物，其中编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约15个核酸残基。
[0439]
实施方案18.组合物，其包含重组多核酸构建体，所述重组多核酸构建体包含选自由seq id no:1-8组成的组的核酸序列。
[0440]
实施方案19.组合物，其包含重组rna构建体，所述重组rna构建体包含：
[0441]
(i)能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)；和
[0442]
(ii)编码目的基因的mrna；
[0443]
其中靶rna不同于编码目的基因的mrna。
[0444]
实施方案20.实施方案19的组合物，其中靶rna是mrna。
[0445]
实施方案21.实施方案1-20中任一项的组合物，用于同时调节细胞中两个或更多个基因的表达。
[0446]
实施方案22.实施方案1-21中任一项的组合物，其中以顺序方式包含所述至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)核酸序列(i)和所述至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)。
[0447]
实施方案23.实施方案22的组合物，其中编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游。
[0448]
实施方案24.实施方案22的组合物，其中编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的下游。
[0449]
实施方案25.实施方案22的组合物，其中编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游或下游。
[0450]
实施方案26.实施方案1-25中任一项的组合物，其中能够结合靶rna的sirna结合靶mrna的外显子。
[0451]
实施方案27.实施方案1-26中任一项的组合物，其中能够结合靶rna的sirna特异性结合一个靶rna。
[0452]
实施方案28.实施方案1-27中任一项的组合物，其中能够结合靶rna的sirna不由目的基因的内含子序列编码或由其组成。
[0453]
实施方案29.实施方案1-28中任一项的组合物，其中目的基因在没有rna剪接的情况下表达。
[0454]
实施方案30.包含重组多核酸构建体的组合物用于治疗或预防受试者的病毒性疾病或病症，所述重组多核酸构建体包含：
[0455]
(i)至少一个编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列；和
[0456]
(ii)至少一个编码目的基因的核酸序列；
[0457]
其中靶rna不同于目的基因编码的mrna。
[0458]
实施方案31.实施方案30的组合物，其中重组多核酸构建体包含两个或更多个编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列，其中所述两个或更多个核酸序列各自编码或包括能够结合相同靶rna或不同靶rna的sirna。
[0459]
实施方案32.实施方案30的组合物，其中重组多核酸构建体包含三个或更多个编码或包含能够结合靶rna的sirna的核酸序列，其中至少两个核酸序列编码或包含能够结合相同靶rna的sirna并且至少一个核酸序列编码或包含能够结合不同靶rna的sirna。
[0460]
实施方案33.实施方案30-32中任一项的组合物，其中靶rna是mrna。
[0461]
实施方案34.实施方案30-32中任一项的组合物，其中靶rna是非编码rna。
[0462]
实施方案35.实施方案30-32中任一项的组合物，其中靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：白细胞介素、血管紧张素转换酶-2(ace2)；sars cov-2 orf1ab；sars cov-2 s和sars cov-2 n。
[0463]
实施方案36.实施方案35的组合物，其中白细胞介素选自由以下组成的组：il-1α、il-1β、il-6、il-6r、il-6r-α、白细胞介素il-6r-β、il-18、il-36-α、il-36-β；il-36-γ和il-33。
[0464]
实施方案37.实施方案30-32中任一项的组合物，其中靶rna是编码选自由以下组成的组的蛋白质的mrna：il-6、il-6r、il-6r-α、il-6r-β，血管紧张素转换酶-2(ace2)；sars cov-2 orf1ab；sars cov-2 s和sars cov-2 n。
[0465]
实施方案38.实施方案30-37中任一项的组合物，其中重组多核酸构建体包含两个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中所述两个或更多个核酸序列各自编码相同目的基因或不同目的基因。
[0466]
实施方案39.实施方案30-38中任一项的组合物，其中(ii)的目的基因选自由编码以下的基因组成的组：ifnα-n3、ifnα-2a、ifnα-2b、ifnβ-1a、ifnβ-1b、ace2可溶性受体、il-37和il-38。
[0467]
实施方案40.实施方案30-38中任一项的组合物，其中(ii)的目的基因选自由编码以下的基因组成的组：ifnβ和ace2可溶性受体。
[0468]
实施方案41.实施方案30-40中任一项的组合物，其中重组多核酸构建体进一步包含编码靶基序的核酸序列，所述靶基序有效地连接到至少一个编码目的基因的核酸序列，其中靶基序包括信号肽、核定位信号(nls)、核仁定位信号(nols)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管端定位信号(mtls)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(er)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号或中心体定位信号(cls)。
[0469]
实施方案42.实施方案41的组合物，其中靶基序选自由以下组成的组：
[0470]
(a)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序；
[0471]
(b)与目的基因编码的蛋白质异源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质异源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；
[0472]
(c)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序，其中与该目的基因编码的蛋白质同源的该靶基序通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰；和
[0473]
(d)不具有天然靶基序功能的天然存在的氨基酸序列，其中天然存在的氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或取代至少一个氨基酸而修饰。
[0474]
实施方案43.实施方案30-42中任一项的组合物，其中重组多核酸构建体进一步包含编码或包含poly(a)尾的核酸序列、编码或包含5'帽的核酸序列、编码或包含启动子的核酸序列或编码或包含kozak序列的核酸序列。
[0475]
实施方案44.实施方案30-43中任一项的组合物，其中重组多核酸构建体还包含编码或包含接头的核酸序列。
[0476]
实施方案45.实施方案44的组合物，其中通过编码或包含接头的核酸序列，连接(a)所述至少一个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列和所述至少一个编码目的基因的核酸序列，(b)所述两个或更多个编码或包含能够结合靶mrna的sirna的核酸序列中的每一个，和/或(c)所述两个或更多个编码目的基因的核酸序列中的每一个。
[0477]
实施方案46.实施方案44或45的组合物，其中接头包含trna接头、2a肽接头或柔性接头。
[0478]
实施方案47.实施方案44-46中任一项的组合物，其中编码或包含接头的核酸序列长度为至少6个核酸残基。
[0479]
实施方案48.实施方案44-46中任一项的组合物，其中编码或包含接头的核酸序列
的长度为至多50个核酸残基。
[0480]
实施方案49.实施方案44-46中任一项的组合物，其中编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约50个核酸残基。
[0481]
实施方案50.实施方案44-46中任一项的组合物，其中编码或包含接头的核酸序列的长度为约6至约15个核酸残基。
[0482]
实施方案51.组合物，其包含重组多核酸构建体，所述重组多核酸构建体包含选自由seq id no:29-47组成的组的核酸序列。
[0483]
实施方案55.包含重组rna构建体的组合物用于治疗或预防受试者的病毒性疾病或病症，所述构建体包含：
[0484]
(i)能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)；和
[0485]
(ii)编码目的基因的mrna；
[0486]
其中靶rna不同于编码目的基因的mrna。
[0487]
实施方案53.实施方案30-52中任一项的组合物，用于同时调节细胞中两个或更多个基因的表达。
[0488]
实施方案54.实施方案30-53中任一项的组合物，其中组合物以足以治疗或预防受试者的病毒性疾病或病症的量存在。
[0489]
实施方案55.实施方案30-54中任一项的组合物，其中以顺序方式包含所述至少一个编码或包含能够与结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)和所述至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)。
[0490]
实施方案56.实施方案55的组合物，其中编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的上游。
[0491]
实施方案57.实施方案55的组合物，其中编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因的核酸序列(ii)的下游。
[0492]
实施方案58.实施方案55的组合物，其中编码或包含能够结合靶rna的小干扰rna(sirna)的核酸序列(i)位于至少一个编码目的基因核酸序列(ii)的上游或下游。
[0493]
实施方案59.实施方案30-58中任一项的组合物，其中能够结合靶rna的sirna结合靶mrna的外显子。
[0494]
实施方案60.实施方案30-59中任一项的组合物，其中能够结合靶rna的sirna特异性结合一个靶rna。
[0495]
实施方案61.实施方案30-60中任一项的组合物，其中能够结合靶rna的sirna不由目的基因的内含子序列编码或由其组成。
[0496]
实施方案62.实施方案30-61中任一项的组合物，其中目的基因在没有rna剪接的情况下表达。
[0497]
实施方案63.实施方案30-62中任一项的组合物，其中sirna包含选自seq id no:93-109的有义链序列。
[0498]
实施方案64.实施方案1-29中任一项的组合物，其中sirna包含选自seq id no:80-92的有义链序列。
[0499]
实施方案65.实施方案1-29中任一项的组合物，其中重组多核酸构建体包含与seq id no:177-189中任一项具有至少85％序列同一性的序列。
[0500]
实施方案66.实施方案1-29中任一项的组合物，其中重组多核酸构建体包含选自由seq id no:177-189组成的组的序列。
[0501]
实施方案67.实施方案30-63中任一项的组合物，其中重组多核酸构建体包含与seq id no:190具有至少85％序列同一性的序列。
[0502]
实施方案68.实施方案30-63中任一项的组合物，其中重组多核酸构建体包含seq id no:190的序列。
[0503]
实施例
[0504]
提供这些实施例仅用于举例说明目的，而不是限制本文提供的权利要求的范围。
[0505]
实施例1：构建体设计、序列和合成
[0506]
构建体设计
[0507]
本发明公开了可以从通过体外转录产生的单一转录本同时表达sirna和任何目的蛋白质。本文公开的rna构建体被设计为包括如cheng,等人(2018)j.mater.chem.b.,6,4638-4644所述的sirna设计，在sirna序列的下游或上游具有一个或多个目的基因(图1)。本发明的构建体可以顺序包含一个以上靶向相同或不同基因的sirna序列。同样，本发明的构建体可以包含两个或更多个目的基因的核酸序列，其间具有接头序列或接头编码序列(例如，2a肽接头或trna接头)。
[0508]
构建体进一步包括位于sirna序列上游的t7启动子(5’taatacgactcactata 3’；seq id no:25)序列，用于rna聚合酶结合和成功体外转录sirna和目的基因。可以使用替代启动子，替代启动子包括sp6、t3、p60、syn5和kp34启动子，它们对于体外转录具有同等功能。
[0509]
构建体合成
[0510]
设计的构建体(表1，化合物id编号a1-a8)从geneart,germany(thermo fisher scientific)合成。将构建体合成为pma-rq载体，其含有t7 rna聚合酶启动子，并使用geneoptimizer算法进行密码子优化。表1总结了在本公开的实施例中使用的化合物及其各自的用于下调蛋白质表达的sirna靶标和用于上调蛋白质表达的蛋白质靶标。将在本文描述的实施例中使用的化合物a1-a8中的所有尿苷都修饰为n
1-甲基假尿苷。对于各化合物，sirna序列的位置相对于目的基因进行了指示。例如，“5'sirna位置”表示在所述化合物中sirna序列位于靶基因的上游或靶基因的5'。a1-a8构建体的序列显示在表2中并且如下表所示注释。
[0511]
表1.化合物a1-a8的总结
[0512]
[0513]
oa：骨关节炎；ivdd：椎间盘疾病；*：仅研究tnf-α的sirna效果
[0514]
表2.化合物a1-a8的序列
[0515]
[0516]
[0517][0518]
粗体＝有义sirna链
[0519]
粗体和斜体＝反义sirna链
[0520]
下划线＝信号肽
[0521]
斜体＝kozak序列
[0522]
表3.化合物a1-a8的质粒序列
[0523]
[0524]
[0525]
[0526]
[0527]
[0528]
[0529]
[0530]
[0531]
[0532][0533]
粗体和下划线＝化合物序列
[0534]
实施例2：rna构建体的体外转录和数据分析
[0535]
编码化合物a1-a8的pma-rq载体和同源引物对(表4)用于基于pcr的体外转录mrna产生。使用表4中的正向和反向引物通过pcr生成转录模板。poly(a)尾在模板中编码；得到的pcr产物编码一个120bp的poly(a)尾(seq id no:193)。由于sirna侧翼区域的重复序列(参见表2和表3)，进行了一些优化以实现特异性扩增。这些优化包括：1)低量的载体的质粒dna；2)使用特殊的dna聚合酶(q5热启动聚合酶，new england biolabs)；3)缩短每个pcr循环的变性(30秒至10秒)和延伸(45秒/kb至10秒/kb)时间；4)增加每个pcr循环的退火时间(10秒至30秒)，和；5)增加每个pcr循环的最终延伸时间(最多15分钟)。此外，为避免非特异性引物结合，pcr反应混合物在冰上制备，包括解冻试剂，pcr循环数减少至25个。
[0536]
对于体外转录，在37℃下使用t7 rna聚合酶(megascript试剂盒，thermo fisher scientific)2小时，合成的rna用100％n
1-甲基假utp进行化学修饰，在5'末端(jena bioscience)用抗反向帽类似物(arca；[m
27,3'-o
g(5')ppp(5')g])共转录加帽。在体外转录后，使用megaclear试剂盒(thermo fisher scientific)对mrna进行柱纯化，并使用nanophotometer-n60(implen)进行定量。
[0537]
表4.用于模板生成的引物
[0538][0539]
使用体外转录，在50-200μg范围内产生化合物a1-a5，并在hek-293(实施例3)和thp-1细胞(实施例4)的过表达模型中测试il-8下调和igf-1表达，其中使用相应mrna过表达il-8。此外，化合物a6和a7在50-200μg范围内产生，并在thp-1细胞中测试内源性il-1β下调和igf-1表达，所述thp-1细胞由lps和dsdna刺激用于il-1β的内源性分泌(实施例4)。在50-200μg范围内产生化合物a8，并在thp-1细胞中测试内源性tnf-α下调和il-4表达，其中用lps和r848处理刺激内源性tnf-α表达(实施例4)。同样，在hek-293细胞的过表达模型中测试化合物a8的tnf-α下调和il-4表达，其中使用编码tnf-α的mrna过表达tnf-α(实施例3)。
[0540]
使用graphpad prism 8(san diego,usa)分析数据。为了使用elisa在标准品或样品中评估蛋白质(igf-1、il-4、il-8、il-1β或tnf-α)水平，从标准品或样品的平均吸光度中减去空白的平均吸光度值。根据制造商的方案，使用四参数非线性回归生成并绘制标准曲线。为了确定每个样品中蛋白质(igf-1、il-4、il-8、il-1β或tnf-α)的浓度，从标准曲线通过内插法确定蛋白质的浓度。通过乘以稀释因子计算样品的最终蛋白质浓度。使用student t检验进行统计分析。
[0541]
实施例3：hek-293的体外转染和hek-293细胞中的il-8过表达模型
[0542]
hek-293的体外转染
[0543]
将人胚胎肾细胞293(hek-293；atcc crl-1573)维持在补充有10％(v/v)胎牛血清(fbs)和青霉素-链霉素-两性霉素b混合物(882087,biozym scientific)的dulbecco改良eagle氏培养基(dmem,biochrom)中。将细胞以20,000个细胞/孔接种在96孔培养板中，并在转染前在37℃下在含有5％co2的湿润气氛中培养24小时。细胞在含有10％fbs的不含抗生素的dmem生长培养基中生长，以在转染前达到汇合度《60％。此后，按照制造商的说明书，使用lipofectamine 2000(invitrogen)用不同浓度(100-900ng)的特定mrna构建体转染hek-293细胞，mrna与lipofectamine的比例为1:1w/v。取出100μl dmem，并用50μl opti-mem和50μl在opti-mem(thermo fisher scientific)中的mrna和lipofectamine 2000复合物替换。5小时后，用新鲜培养基替换培养基，将板在37℃下在含有5％co2的湿润气氛中培养24小时。
[0544]
hek-293细胞中的il-8过表达模型
[0545]
为了评估在hek-293细胞中rna构建体(化合物a1-a5)的il-8rna干扰(rnai)和igf-1表达的同时效果，使用il-8mrna转染建立了il-8过表达模型(300ng/孔)。为了评估含有靶向il-8的sirna的mrna构建体(化合物a1-a5)干扰il-8表达并同时表达igf-1的能力，mrna构建体(化合物a1-a5；300-900ng/孔)与il-8mrna(300ng/孔)共转染。转染后，将细胞在含有5％co2的湿润气氛中在37℃下孵育24小时，然后通过elisa对细胞培养上清液中的il-8(下调的靶基因)和igf-1(过表达的目的基因)进行定量。
[0546]
hek-293细胞中的tnf-α过表达模型
[0547]
为了评估在hek-293细胞中化合物a8的tnf-αrna干扰(rnai)和il-4表达的同时效
果，使用tnf-αmrna转染(600ng/孔)建立了tnf-α过表达模型。为了评估含有靶向tnf-α的sirna的化合物a8在下调tnf-α和同时表达il-4中的能力，用化合物a8(600ng/孔)和tnf-αmrna(600ng/孔)共转染细胞。转染后，将细胞在含有5％co2的湿润气氛中在37℃下孵育24小时，然后通过elisa对相同的细胞培养上清液中的tnf-α(下调的靶基因)和il-4(过表达的目的基因)进行定量。
[0548]
结果
[0549]
在hek-293细胞中测试包含靶向il-8的sirna和igf-1蛋白编码序列的化合物a1的il-8下调和同时igf-1表达(100-900ng/孔)。数据表明，化合物a1的igf-1蛋白表达水平与对照igf-1mrna表达的水平相同或更高，如图2a所示(空心圆圈-来自对照igf-1mrna的igf-1表达；实心圆圈-化合物a1 igf-1表达)。在相同实验中，化合物a1(300ng/孔)针对il-8表达的rna干扰用il-8过表达构建体(300ng/孔)并随后用il-8elisa评估。如图2b所示，与未处理的对照(左柱)相比，化合物a1(右柱)下调了il-8水平(p《0.01)。这些测定显示化合物a1将il-8下调至少约3倍(65％)，而不降低igf-1的表达。
[0550]
为了评估化合物a1在hek-293il-8过表达模型中干扰il-8表达的剂量依赖性能力，用增加剂量的化合物a1(300-900ng化合物a1/孔)和恒定的il-8mrna(300ng/孔)共转染hek-293细胞，并通过elisa评估il-8表达。如图3所示，在hek-293细胞中，包含靶向il-8的sirna和igf-1蛋白编码序列的化合物a1 mrna构建体以剂量依赖性方式抑制了il-8表达。图3显示在300ng/孔时，化合物a1使il-8表达降低至少约3.5倍(70％)，在600或900ng/孔时，化合物a1使il-8表达降低至少约4.25倍(75％)。
[0551]
测试分别包含靶向il-8的1
×
和3
×
sirna以及igf-1蛋白编码序列的化合物a2和化合物a3以评估相同构建体中sirna序列的存在是否影响igf-1表达。hek-293细胞用igf-1mrna(600ng/孔)转染。图4b(化合物a2)和5b(化合物a3)中的结果表明igf-1由化合物a2和a3表达。
[0552]
测试分别包含靶向il-1β的1
×
和3
×
sirna以及igf-1蛋白编码序列的化合物a6和化合物a7以评估相同构建体中sirna的存在是否影响igf-1表达。hek-293细胞用igf-1mrna(600ng/孔)转染。图8c(化合物a6)和9c(化合物a7)中的结果表明igf-1由化合物a6和a7表达。
[0553]
在具有外源递送的tnf-αmrna(600ng/孔)的hek-293细胞中，同时测试包含靶向tnf-α的sirna和il-4蛋白编码序列的化合物a8的tnf-α下调和il-4表达(600ng/孔)。数据表明化合物a8表达il-4，如图10c所示。在具有相同细胞培养上清液的相同实验中，通过tnf-αelisa评估化合物a8(600ng/孔)针对来自tnf-α过表达构建体(600ng/孔)的tnf-α表达的rna干扰。如图10a所示，与未处理的对照(左柱)相比，化合物a8(右柱)下调了tnf-α水平(p《0.05)。在该测定中，化合物a8将tnf-α水平下调至少约50％。这些数据表明化合物a8下调tnf-α而不影响il-4表达。
[0554]
接下来，对分别包含靶向il-8的1
×
和3
×
sirna但不包含igf-1编码序列的化合物a4和化合物a5，评估了在hek-293细胞中干扰il-8表达的剂量依赖性能力。用不同浓度(300-900ng/孔)的化合物a4(1
×
sirna)和化合物a5(3
×
sirna)转染过表达il-8(600ng il-8mrna)的hek-293细胞。如图7所示，化合物a4和化合物a5以剂量依赖性方式抑制hek-293细胞中的il-8表达。
[0555]
实施例4：thp-1细胞的体外转染、thp-1细胞中的内源性il-1β/tnf-α表达模型和thp-1细胞中的il-8过表达模型
[0556]
thp-1细胞的体外转染
[0557]
将人单核细胞白血病细胞系thp-1(sigma-aldrich,cat.#88081201)维持在生长培养基(补充有10％fbs和2mm谷氨酰胺的rpmi 1640)中。在转染前72小时，将细胞以30,000thp-1细胞接种在96孔细胞培养板中，并用在生长培养基中稀释的50nm佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)(sigma-aldrich,目录号p8139)进行活化。使用lipofectamine 2000(thermo fisher scientific)以单转染或共转染(300-1200ng/孔)的形式用特定mrna转染细胞。从每个孔中取出100μl dmem，并替换为50μl opti-mem(thermo fisher scientific)和50μl在opti-mem中的mrna和lipofectamine 2000复合物。5小时后，将培养基更换为补充有50nm pma的新鲜生长培养基，并将平板在37℃下在含有5％co2的湿润气氛中培养24小时。
[0558]
thp-1细胞中的内源性il-1β表达模型
[0559]
对于thp-1细胞中il-1β的内源性分泌，thp-1细胞用大肠杆菌来源的脂多糖(lps-l4391；sigma aldrich，10μg/ml最终浓度)和dsdna(特异性pcr扩增子,50ng/孔)刺激并孵育90分钟。il-1β的诱导产生对应于在骨关节炎和ivdd中观察到的生理条件。刺激后，取出50μl培养基，并替换为在opti-mem中含有与lipofectamine 2000复合的特定mrna构建体(化合物a6和a7)的转染复合物，并在37℃下在含有5％co2的湿润气氛中孵育24小时，然后通过elisa对il-1β进行定量。
[0560]
thp-1细胞中的内源性tnf-α表达模型
[0561]
对于thp-1细胞中tnf-α的内源性分泌，thp-1细胞用最终浓度为10μg/ml的大肠杆菌来源的脂多糖(lps-l4391；sigma aldrich)和最终浓度为1μg/ml的r848(tlr7/8激动剂；invivogen)刺激，并孵育90分钟。tnf-α的诱导产生对应于在银屑病中观察到的生理条件。刺激后，取出50μl培养基，并替换为在opti-mem中含有与lipofectamine 2000复合的特定mrna构建体(化合物a8)的转染复合物，并在37℃下在含有5％co2的湿润气氛中孵育24小时。转染后，收集细胞培养上清液并通过elisa对tnf-α(下调的靶基因)和il-4(过表达的目的基因)进行定量。
[0562]
thp-1细胞中的il-8过表达模型
[0563]
为了评估thp-1细胞中mrna构建体的rna干扰(rnai)，使用il-8mrna转染(300ng/孔)建立il-8过表达模型。为了评估含有靶向il-8的sirna的mrna构建体(化合物a1-a5)干扰il-8表达的能力，将mrna构建体(300-900ng/孔)与il-8mrna(300ng/孔)共转染。转染后，将细胞在37℃下在含有5％co2的湿润气氛中孵育24小时，然后通过elisa对il-8和igf-1进行定量。
[0564]
结果
[0565]
设计化合物a2和化合物a3以分别具有靶向il-8的1
×
和3
×
sirna以及igf-1编码序列(表1和2)，进行测试以评估具有一个以上的sirna是否可以使靶向rnai的效果最大化。化合物a4和化合物a5设计为内部对照，它们分别仅包含靶向il-8的1
×
和3
×
sirna，没有igf-1编码序列(表1和表2)。如图4a、5a、6a和6b所示，化合物a2-a5抑制thp-1细胞中的il-8表达，无论该化合物是否具有igf-1编码序列。化合物a2抑制了至少约30％的il-8表达(图
4a)。化合物a3抑制了至少约45％的il-8表达(图6b)。化合物a4抑制了约40％的il-8表达(图6a)。化合物a5抑制了至少约70％的il-8表达(图6a和6b)。因此，应用具有三个sirna(化合物a3和a5)的化合物，il-8表达被抑制了至少约45％到至少约70％；而应用具有一个sirna的化合物(化合物a2和a4)，il-8表达被抑制了至少约30％到至少约40％。
[0566]
接下来，在thp-1细胞中评估化合物a6(靶向il-1β的1
×
sirna igf-1编码序列)和化合物a7(靶向il-1β的3
×
sirna igf-1编码序列)在干扰il-1β表达中的作用，所述thp-1细胞用10μg/ml lps和50ng/孔dsdna刺激，以诱导内源性il-1β分泌。建立的thp-1模型模拟了骨关节炎和ivdd的生理免疫状况。如图8a、8b、9a和9b所示，化合物a6和化合物a7下调内源性il-1β在thp-1细胞中的表达(p《0.001)。化合物a6将il-1β表达下调了至少约40％(图8a和8b)。化合物a7将il-1β表达下调了至少约45％到至少约50％(分别为图9a和9b)。
[0567]
在用10μg/ml lps和1μg/ml r848刺激以诱导内源性tnf-α分泌的thp-1细胞中，评估化合物a8(包含靶向tnf-α的sirna和il-4编码序列)在下调tnf-α中的作用。建立的thp-1模型模拟了银屑病的生理免疫状况。如图10b所示，化合物a8下调内源性tnf-α在thp-1细胞中的表达(p《0.05)。在该测定中，化合物a8将tnf-α表达下调了至少约20％。测量相同细胞培养上清液的il-4表达，证实il-4表达未受损(图10d)。
[0568]
实施例5：抗病毒构建体设计、序列和合成
[0569]
抗病毒构建体设计
[0570]
从通过体外转录产生的单一转录本同时表达sirna和目的蛋白质。工程化多核苷酸或rna构建体以包括如cheng,等人(2018)j.mater.chem.b.,6,4638-4644所述的sirna设计，并且进一步包含位于sirna序列下游或上游的一个或多个目的基因(图1中的示意图)。构建体可以编码或包含一个以上靶向相同或不同靶mrna的sirna序列。同样，构建体可以包含两个或更多个目的基因的核酸序列。接头序列可以存在于构建体的任何两个元件之间(例如，2a肽接头或trna接头)。
[0571]
如图1所示，多核酸构建体可在目的基因序列上游包含t7启动子序列(5’taatacgactcactata 3’；seq id no:25)，用于rna聚合酶结合以及目的基因和sirna两者在一个转录本中的成功体外转录。可以使用备选启动子，例如sp6、t3、p60、syn5和kp34。使用设计为位于t7启动子、ifn-β和sirna序列侧翼的引物，通过pcr生成转录模板以产生mrna。反向引物包括一段t(120)(seq id no:197)，以将120bp长度的poly(a)尾(seq id no:193)添加到mrna。
[0572]
抗病毒构建体合成
[0573]
如表5所示的构建体由geneart，germany(thermo fisher scientific)合成为含有t7 rna聚合酶启动子的载体(pmx，例如pma-t或pma-rq)，具有优化的密码子(geneoptimizer算法)。表5显示，对于每种化合物，通过sirna与相应mrna结合旨在下调的蛋白质、构建体的sirna数量(例如，靶向相同mrna的多个sirna，或各自靶向不同mrna的多个sirna)、和旨在上调的蛋白质靶标，即目的基因的产物。在本文描述的实施例中使用的化合物b1-b19中，所有尿苷都被修饰为n
1-甲基假尿苷。每个构建体的序列显示在表6中并如下表所示进行注释。
[0574]
表5.化合物b1-b19的总结
[0575][0576][0577]
*ifn-β(1)和ifn-β(2)代表修饰的信号肽(sp)以增强分泌
[0578]
表6.化合物b1-b9的序列
[0579]
[0580]
[0581]
[0582]
[0583]
[0584]
[0585][0586][0587]
粗体＝有义sirna链
[0588]
粗体和斜体＝反义sirna链
[0589]
下划线＝信号肽
[0590]
斜体＝kozak序列
[0591]
*下划线序列中的粗体表示修饰的ifn-β信号肽
[0592]
实施例6:抗病毒rna构建体的体外转录和数据分析
[0593]
使用编码化合物b1-b19的pmx载体进行基于pcr的体外转录以产生mrna。使用表4中的正向和反向引物通过pcr产生转录模板。在模板中编码poly(a)尾，产生120bp的poly(a)尾(seq id no:193)。鉴于sirna侧翼区域的重复序列，根据需要进行优化以实现特异性扩增。优化包括：1)减少载体dna的量，2)改变dna聚合酶(q5热启动聚合酶，new england biolabs)，3)对于每个pcr循环减少变性时间(30秒至10秒)和延伸时间(45秒/kb至10秒/kb)，4)对于每个pcr循环增加退火时间(10秒至30秒)，以及5)对于每个pcr循环增加最终延伸时间(最多15分钟)。此外，为避免非特异性引物结合，pcr反应混合物在冰上制备，包括解冻试剂，pcr循环数减少至25个。
[0594]
对于体外转录，在37℃下使用t7 rna聚合酶(megascript试剂盒，thermo fisher scientific)2小时。合成的rna用100％n
1-甲基假utp进行化学修饰，在5'末端用抗反向帽类似物(arca；[m
27,3'-o
g(5')ppp(5')g])(jena bioscience)共转录加帽。在体外转录后，使用megaclear试剂盒(thermo fisher scientific)对mrna进行柱纯化，并使用nanophotometer-n60(implen)进行定量。
[0595]
使用体外转录，产生化合物b1-b17并测试靶mrna/蛋白质下调和目的基因/目的蛋白质表达，并与其中目的基因/目的蛋白质过表达的过表达模型进行比较。
[0596]
使用graphpad prism 8(san diego,usa)分析数据。对于使用elisa评估标准品或样品中的蛋白质水平，从标准品或样品的平均吸光度中减去空白的平均吸光度值。根据制造商的方案，使用四参数非线性回归生成并绘制标准曲线。为了确定每个样品中蛋白质的浓度，从标准曲线通过内插法确定各蛋白质的浓度。通过乘以稀释因子计算样品的最终蛋白质浓度。使用student t检验进行统计分析。使用softmax pro工具计算gfp阳性细胞的百分比。使用rest 2009软件，通过成对固定再分配随机化测试(pair-wised fixed reallocation randomization tests)，分析通过qpcr对病毒rna的相对定量。
[0597]
实施例7：a549细胞ifn-β过表达模型
[0598]
用ifn-β过表达化合物体外转染a549细胞
[0599]
a549细胞是源自人肺癌的典型肺泡ii型(atii)细胞。由于宿主atii细胞中病毒进入受体(ace2)的高表达，导致covid-19死亡率主要与呼吸系统疾病有关，因此使用a549细胞来模拟临床情况。a549细胞(sigma-aldrich,buchs switzerland目录号6012804)维持在补充有10％fbs(thermofischer,basel,switzerland目录号10500-064)的dulbecco改良eagle氏培养基-高葡萄糖(dmem,sigma-aldrich,buchs switzerland目录号d0822)中。为了评估ifn-β表达，在转染前24小时，将a549细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在常规生长培养基中。此后，按照制造商的说明书，使用lipofectamine 2000(www.invitrogen.com)用化合物b1-19(0.3-0.6微克)转染细胞。取出100μl dmem，将50μl opti-mem(www.thermofisher.com)添加到每个孔中，然后添加在opti-mem中的50μl mrna和lipofectamine 2000复合物。孵育5小时后，将培养基更换为新鲜的生长培养基，将平板在
37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时，然后通过elisa(人ifn-β生物发光elisa试剂盒2.0，目录号：luex-hifnbv2，invivogen)对ifn-β进行定量。
[0600]
实施例8：a549细胞中的内源性il-6刺激模型
[0601]
用il-6抑制性化合物体外转染a549细胞
[0602]
对于a549细胞中il-6的内源性分泌，a549细胞用重组人il1-β(20ng/ml；目录编号:rcyec-hil1b；invivogen)和重组人tnf-α(20ng/ml；目录编号：rcyc-htnfa；invivogen)刺激，并孵育120分钟。il-6的诱导产生对应于在covid-19中观察到的生理条件。刺激后，取出50μl培养基，并替换为在opti-mem中含有与lipofectamine 2000复合的特定mrna构建体(化合物b1、b2、b15、b16和b17)的转染复合物，在含有5％co2的潮湿气氛中在37℃下孵育24小时，然后通过elisa(thermofisher scientific，目录号88-7066-22)对il-6进行定量。证实与未处理的样品相比，il-6减少。为了验证il-6的功能抑制，使用了稳定转染了il-6r和stat3诱导型seap报告基因的hek-blue
tm il-6报告细胞(目录代码：hkb-hil6，invivogen)。测量经或未经处理的il-6刺激样品的细胞培养上清液的生物活性人il-6，以确定由于sirna介导的干扰，经化合物b1、b2、b15、b16和b17处理的细胞培养上清液与未处理的对照相比，导致生物活性人il-6降低。使用细胞上清液，通过elisa(人ifn-β生物发光elisa试剂盒2.0，目录编号：luex-hifnbv2，invivogen)定量测量ifn-β。
[0603]
实施例9:thp-1细胞中的内源性il-6r抑制模型
[0604]
用il-6r抑制性化合物体外转染thp-1细胞
[0605]
a549细胞不内源性表达il-6r，因此使用thp-1细胞，因为thp-1细胞具有该受体的高内源性表达(54x,www.proteinatlas.org)。人单核细胞白血病细胞系thp-1(sigma-aldrich,目录号88081201)维持在生长培养基(补充有10％fbs和2mm谷氨酰胺的rpmi 1640)中。细胞在转染前72小时以30,000个thp-1细胞接种在96孔细胞培养板中，并用在生长培养基中稀释的50nm佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)(sigma-aldrich,目录号p8139)激活。使用lipofectamine 2000(thermo fisher scientific)用化合物b3-b5(300-1200ng/孔)转染细胞。从每个孔中取出100μl dmem，并用50μl opti-mem(thermo fisher scientific)和50μl在opti-mem中的mrna和lipofectamine 2000复合物替换。5小时后，将培养基更换为补充有50nm pma的新鲜生长培养基，并将平板在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中培养24小时。感染后，处理细胞培养上清液(thermofisher scientific，目录号bms214)和细胞裂解物(lsbio，目录号ls-f1001)以通过elisa定量检测il-6r。为了验证il-6r的功能抑制，使用稳定转染了il-6r和stat3诱导型seap报告基因的hek-blue
tm il-6报告细胞(目录代码：hkb-hil6，invivogen)。由于化合物b3-b5的转染导致hek-blue
tm
细胞中sirna介导的il-6r抑制，因此添加重组人il-6(目录代码：rcyec-hil6，invivogen)不激活stat-3诱导型seap报告基因。这是验证il-6r信号通路阻断的有效功能测定试验。使用细胞上清液，通过elisa(人ifn-β生物发光elisa试剂盒2.0，目录编号：luex-hifnbv2，invivogen)定量测量ifn-β。
[0606]
实施例10：a549细胞中的ace2过表达模型
[0607]
用ace2 mrna和ace2抑制/ifn-β过表达化合物体外转染a549细胞
[0608]
使用ace2过表达模型，评估a549细胞中由mrna化合物b6、b7、b15、b16和b17导致的同时ace2 rna干扰(rnai)和ifn-β过表达。通过用ace2 mrna(来自seq id no:57)转染，建
立模型。每个细胞样品都用mrna化合物b6、b7、b15、b16和b17(300-900ng/孔)中的一种和ace2 mrna(300ng/孔)进行共转染。转染后，将细胞在37c下在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时，然后通过elisa对细胞培养上清液(aviva systems biology，目录号okbb00649)中的ace2(要下调的靶mrna)和ifn-β(要过表达的目的基因)进行定量。
[0609]
实施例11：a549细胞中的sars cov-2刺突蛋白过表达模型
[0610]
用sars cov-2刺突蛋白mrna和sars cov-2刺突蛋白抑制/ifn-β过表达化合物体外转染a549细胞
[0611]
使用sars cov-2刺突(s)蛋白过表达模型，评估a549细胞中由mrna化合物b8、b9、b11、b15、b16和b17导致的同时sars cov-2刺突蛋白rna干扰(rnai)和ifn-β过表达。该模型通过用编码sars cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)(s-rbd,seq id no:60)的mrna转染来建立。每个细胞样品用mrna化合物b8、b9、b11、b15、b16和b17(300-900ng/孔)之一和s-rbd mrna(300ng/孔)共转染。转染后，将细胞在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时，然后通过elisa(sino bio，目录号kit40591)对s-rbd进行定量。同时，通过elisa测量细胞培养上清液中的ifn-β表达(人ifn-β生物发光elisa试剂盒2.0，目录号：luex-hifnbv2，invivogen)。
[0612]
实施例12：a549细胞中sars cov-2核衣壳蛋白过表达模型
[0613]
用sars cov-2核衣壳蛋白mrna和sars cov-2核衣壳蛋白抑制/ifn-β过表达化合物体外转染a549细胞
[0614]
使用sars cov-2刺突蛋白过表达模型，评估a549细胞中由mrna化合物b8和b10导致的同时sars cov-2核衣壳(n)蛋白rnai抑制和ifn-β过表达。该模型通过用编码sars cov-2 n蛋白的完整编码结构域(seq id no:62)的mrna转染来建立，其中该蛋白带有3'egfp标记。在另一种单独的附加方法中，sars cov-2 n蛋白从质粒(pcdna3 载体)中过表达，从而提供了两个独立的系统来评估化合物b8和b10的rnai抑制效果。靶向sars cov-2 n蛋白的化合物b8和b10的rnai，将破坏egfp的翻译和表达。
[0615]
细胞的各个样品(mrna转染的细胞或携带质粒的细胞)，用mrna化合物b8和b10(300-900ng/孔)之一和sars cov-2 n mrna(300ng/孔)进行共转染。
[0616]
转染后，将细胞在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时，然后通过elisa(sino bio,目录号kit40588)对sars cov-2 n蛋白进行定量。同时，通过elisa测量细胞培养上清液中的ifn-β表达(人ifn-β生物发光elisa试剂盒2.0，目录号：luex-hifnbv2，invivogen)。为了确定化合物b8和b10的rnai抑制是否会导致破坏egfp的翻译，使用spectramax i3x多模式酶标仪(molecular devices)显微镜检查用egfp标记的sars cov-2核衣壳蛋白(来自质粒和mrna的表达)以确定egfp的表达。在处理和对照未处理样品中计算egfp阳性细胞的百分比。
[0617]
实施例13：a549细胞中的sars cov-2 nspl过表达模型
[0618]
用sars cov-2非结构蛋白mrna和sars cov-2非结构蛋白抑制/ifn-β过表达化合物体外转染a549细胞
[0619]
sars cov-2与sars cov和mers-cov在rna水平上的基因组序列比对显示出比氨基酸比较更少的保守性。系统发育树分析(遗传距离模型：tamura-nei；树构建方法：upgma)显示mers-cov具有高水平的相异rna序列(》45％)，而sars cov和sars cov-2表现出低水平的
相异性(不超过21％)(参见图11)。我们分开比对了sars cov与sars cov-2，并寻找保守的最小20bp基因座用于sirna设计。我们在病毒基因组的起始部位附近(235
–
281bp)鉴定了一个47bp的同源性，我们用它来设计sirna(化合物b8和b14)。sirna定位于非结构蛋白1(nsp1)的第一个密码子(atg)。理想情况下，靶向病毒基因组的第一个密码子(甲硫氨酸；aug)将对病毒复制产生巨大影响，因为启动可变翻译的下一个甲硫氨酸(aug)碱基位于84个氨基酸的远处。
[0620]
使用sars cov-2 nsp1过表达模型，评估a549细胞中由mrna化合物b8和b14引起的同时sars cov-2 nsp1 rnai抑制和ifn-β过表达。
[0621]
该模型通过用编码3’egfp标记的sars cov-2 nspl(seq id no:64)的部分结构域(前100个氨基酸)的mrna转染来建立。在另一种单独的附加方法中，sars cov-2 nsp1从质粒(pcdna3 载体)中过表达，从而提供了两个独立的系统来评估化合物b8和b14的rnai抑制作用。靶向sars cov-2 nsp1的化合物b8和b14的rnai将破坏egfp的翻译和表达。
[0622]
细胞(mrna转染的细胞或携带质粒的细胞)的每个样品，用mrna化合物b8和b14(300-900ng/孔)之一和sars cov-2 nsp1 mrna(300ng/孔)进行共转染。
[0623]
转染后，将细胞在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时。为了确定化合物b8和b14的rnai抑制作用是否会破坏egfp翻译，使用spectramax i3x多模式微孔酶标仪(molecular devices)，在显微镜下检查用egfp标记的sars cov-2 nsp1以确定egfp表达。在处理和对照未处理样品中计算egfp阳性细胞的百分比。同时，通过elisa测量细胞培养上清液中的ifn-β表达(人ifn-β生物发光elisa试剂盒2.0，目录号：luex-hifnbv2，invivogen)。为了确定化合物b8和b14的rnai抑制是否会破坏egfp翻译，用显微镜检查了用egfp标记的sars cov-2核衣壳蛋白(来自质粒和mrna的表达)以确定egfp表达。在处理和对照未处理样品中计算egfp阳性细胞的百分比。
[0624]
实施例14：靶向sars-cov-2、sars-cov和mers-cov mrna的nsp12-nsp13 sirna设计，以及a549细胞中nsp12-nsp13过表达模型
[0625]
设计靶向sars cov-2、sars-cov和mers-cov mrna的nsp12-nsp13 sirna
[0626]
为了设计靶向sars cov-2、sars-cov和mers-cov三者的sirna，我们鉴定了短至17bp的sirna，容忍序列之间多达1个的错配。使用这种宽松的方法，我们设计了一个长度为17bp的sirna(在14299
–
14318之间，参考sars cov-2基因组)和两个额外sirna(15091
–
15107和17830
–
17849，参考sars cov-2基因组)，每个sirna各自在三个基因组序列中具有一个bp的错配容忍，将它们组合在具有ifn-β过表达的构建体中。
[0627]
使用sars cov-2 nsp12-13过表达模型，评估a549细胞中由mrna化合物b12和b13引起的同时sars cov-2 nsp12-13 rnai抑制和ifn-β过表达。该模型通过用编码3'egfp标记的sars cov-2基因组(seq id no:67)的nsp12和nsp13非编码结构域(14202-17951bp；3749bp)的mrna转染来建立。每个细胞样品(转染mrna的细胞或携带质粒的细胞)，用mrna化合物b12和b13之一(300-900ng/孔)以及sars cov-2 nsp12和nsp-13部分基因组rna(300ng/孔)进行共转染。
[0628]
转染后，将细胞在37℃在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时，然后进行基于taqman-qpcr的测定，并与未转染的对照相比，评估病毒rna降解。同时，通过elisa测量细胞培养上清液中的ifn-β表达(人ifn-β生物发光elisa试剂盒2.0，目录号：luex-hifnbv2，
invivogen)。
[0629]
实施例15：a549细胞ace2可溶性受体过表达模型
[0630]
用ace2可溶性受体过表达化合物体外转染a549细胞
[0631]
a549细胞是源自人肺癌的典型肺泡ii型(atii)细胞。由于宿主atii细胞中病毒进入受体(ace2)的高表达，导致covid-19死亡率主要与呼吸系统疾病有关，因此使用a549细胞来模拟临床情况。a549细胞(sigma-aldrich,buchs switzerland目录号6012804)维持在补充有10％fbs(thermofischer,basel,switzerland目录号10500-064)的dulbecco改良eagle氏培养基-高葡萄糖(dmem,sigma-aldrich,buchs switzerland目录号d0822)中。为了评估ace2可溶性受体的表达，在转染前24小时，将a549细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在常规生长培养基中。此后，按照制造商的说明书，使用lipofectamine 2000(www.invitrogen.com)用化合物b18和b19(0.3-0.6微克)转染细胞。取出100μl dmem，将50μl opti-mem(www.thermofisher.com)添加到每个孔中，然后添加50μl在opti-mem中的mrna和lipofectamine 2000复合物。孵育5小时后，将培养基更换为新鲜生长培养基，将板在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时，然后通过elisa(aviva systems biology，目录号okbb00649)对ace2进行定量。在实施例11-13中研究化合物b18和化合物b19的抗病毒活性。
[0632]
实施例16:其他构建体
[0633]
构建体设计、序列和合成
[0634]
实施例1中描述了构建体设计和合成的细节。表8总结了在本公开的实施例中使用的另外的化合物以及其相应的旨在下调蛋白质表达的sirna靶标和旨在上调蛋白质表达的蛋白质靶标。a9-a15构建体的序列示于表9中并如下表所示注释。在本文描述的实施例中使用的化合物a9-a15中，所有尿苷都被修饰为n
1-甲基假尿苷。对于每种化合物，sirna序列的位置相对于目的基因指出。例如，“5'sirna位置”表示sirna序列在所述化合物中位于目的基因的上游或5'。相反，“3'sirna位置”表示sirna序列在化合物中位于目的基因的下游或3'。a9-a15构建体的质粒序列见表10。
[0635]
表8.化合物a9-a15的总结
[0636][0637]
fop:进行性骨化性纤维发育不良；als:肌萎缩侧索硬化；oa:骨关节炎；ivdd:椎间盘疾病
[0638]
表9.化合物a9-a15的序列
[0639]
[0640]
[0641]
[0642][0643]
粗体＝有义sirna链
[0644]
粗体和斜体＝反义sirna链
[0645]
下划线＝信号肽
[0646]
斜体＝kozak序列
[0647]
表10.化合物a9-a15的质粒序列
[0648]
[0649]
[0650]
[0651]
[0652]
[0653]
[0654]
[0655]
[0656]
[0657]
[0658]
[0659][0660]
粗体和下划线＝化合物序列
[0661]
rna构建体的体外转录和数据分析
[0662]
实施例2中提供了体外转录的细节。使用体外转录，产生了50-200μg范围的化合物a9和化合物a10，并测试了在thp-1中的内源性tnf-α下调和il-4表达，其中通过lps和r848处理刺激内源性tnf-α表达(实施例17)。同样，在使用tnf-α编码mrna过表达tnf-α的hek-293细胞过表达模型中，测试了化合物a9和化合物a10的tnf-α下调和il-4表达(实施例18)。
[0663]
此外，产生50-200μg范围的化合物a11，并测试在a549细胞中的内源性alk2下调和igf-1表达(实施例19)。此外，化合物a12和化合物a13在50-200μg范围内产生，并分别在imr32细胞中测试内源性sod1下调以及igf-1和促红细胞生成素(epo)的表达(实施例20)。化合物a15和a16在50-200μg范围内产生，并在使用hek293细胞的过表达模型中测试了igf-1的表达和il-1β下调。使用编码il-1β的mrna过表达il-1-β蛋白(实施例21)。
[0664]
化合物b18在50-200μg范围内产生，并在使用a549细胞的过表达模型中测试可溶性ace2受体的表达和egfp标记的sars cov-2核衣壳蛋白的下调，在所述过表达模型中egfp标记的sars cov-2核衣壳蛋白质从pcdna3
载体过表达(实施例22)。
[0665]
使用graphpad prism 8(san diego,usa)分析数据。为了使用elisa估计标准品或样品中的蛋白质(igf-1、il-4、il-1β、alk2、sod1、epo和tnf-α)水平，从标准品或样品的平均吸光度中减去空白的平均吸光度值。根据制造商的方案，使用四参数非线性回归生成并绘制标准曲线。为了确定每个样品中蛋白质(igf-1、il-4、il-1β、alk2、sod1、epo和tnf-α)的浓度，从标准曲线通过内插法确定蛋白质的浓度。通过乘以稀释因子计算样品的最终蛋白质浓度。使用student t检验或单向方差分析进行统计分析，然后相对于对照进行dunnet多重比较检验。在实施例22中使用softmax pro工具计算gfp阳性细胞的百分比。在研究组
之间使用2-δδct
方法对用化合物处理后剩余的靶mrna进行相对定量。显著性水平设置为《0.05的p值。化合物a11的分子量按如下进行确定。化合物a11的分子量，根据其mrna序列，通过将每种碱基的数量乘以碱基的分子量来计算(例如，a：347.2g/mol；c 323.2g/mol；g363.2g/mol；n1-utp：338.2g/mol)。通过将获得的所有碱基的总重量与817.4g/mol的arca分子量相加来确定化合物分子量。使用构建体的分子量，将孔中转染的mrna的量转换为nm浓度。
[0666]
实施例17：thp-1细胞中的内源性tnf-α表达模型
[0667]
测定化合物a9和化合物a10在thp-1细胞中下调tnf-α表达和过表达il-4的能力。对于thp-1细胞中tnf-α的内源性分泌，thp-1细胞用最终浓度为10μg/ml的大肠杆菌来源的脂多糖(lps-l4391；sigma aldrich)和最终浓度为1μg/ml的r848(tlr7/8激动剂；invivogen)刺激，并孵育90分钟。tnf-α的诱导产生对应于在银屑病中观察到的生理条件。刺激后，取出50μl培养基，并替换为在opti-mem中含有与lipofectamine 2000复合的特定mrna构建体(化合物a9和a10)或乱序sirna(sc-sirna)的转染复合物，并在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时。sc-sirna用于排除转染相关的细胞死亡(universal sirna，sigma；目录sic002)。转染后，收集细胞培养上清液并通过elisa对tnf-α(下调的靶基因)和il-4(过表达的目的基因)进行定量。仅用tnf-αmrna转染的样品中的tnf-α水平作为对照并设置为100％，并计算tnf-α敲低的百分比。
[0668]
结果
[0669]
化合物a9(包含位于il-4编码序列5'的靶向tnf-α的sirna)和化合物a10(包含位于il-4编码序列3'的靶向tnf-α的sirna)对tnf-α的下调作用，在用10μg/ml lps和1μg/ml r848刺激以诱导内源性tnf-α分泌的thp-1细胞中评估。该建立的thp-1模型模拟银屑病的生理免疫状况。如图12a所示，化合物a9和化合物a10，相对于对照，将thp-1细胞中的内源性tnf-α表达下调了至少约80％(p《0.001)。有趣的是，与化合物a9相比，化合物a10诱导了显著更强的tnf-α下调，化合物a9具有位于il-4orf上游(或5')的sirna(图12a；p《0.05)。相对于对照，化合物a10诱导了至少约85％的tnf-α下调，并且比化合物a9多了大约5-10％。测量相同细胞培养上清液的il-4表达，数据显示化合物a10的il-4表达比化合物a9的il-4表达高2.5倍，如图12b所示(p《0.01)。该测定表明，与化合物a9(靶向tnf-α的sirna位于il-4基因的5')相比，化合物a10(靶向tnf-α的sirna位于il-4基因的3')具有高5-10％的靶向(下调)tnf-α的sirna活性和高2.5倍的il-4表达(增加70％)。
[0670]
实施例18：hek-293细胞中的tnf-α过表达模型
[0671]
测定化合物a9和化合物a10在hek-293细胞中下调tnf-α表达和过表达il-4的能力。为了评估tnf-αrna干扰(rnai)和il-4表达的同时作用，使用tnf-αmrna转染(600ng/孔)建立tnf-α过表达模型。如所述，化合物a9包含位于il-4编码序列5'(il-4基因上游)的靶向tnf-α的sirna，化合物a10包含位于il-4编码序列3'(il-4基因下游)的靶向tnf-α的sirna。为了评估含有靶向tnf-α的sirna的化合物a9和化合物a10在下调tnf-α和同时表达il-4中的能力，用化合物a9或化合物a10(900ng/孔)和tnf-αmrna(600ng/孔)共转染细胞。转染后，将细胞在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时，然后通过elisa在相同的细胞培养上清液对tnf-α(下调的靶基因)和il-4(过表达的目的基因)进行定量。仅用tnf-αmrna转染的样品中的tnf-α水平作为对照并设置为100％，并计算tnf-α敲低的百分比。
[0672]
结果
[0673]
在具有外源递送的tnf-αmrna(600ng/孔)的hek-293细胞中，测试由化合物a9和化合物a10引起的同时tnf-α下调和il-4表达(900ng/孔)。数据显示化合物a10的il-4表达比化合物a9高20倍，如图13b所示(p《0.001)。在使用相同细胞培养上清液的相同实验中，使用tnf-α过表达构建体(600ng/孔)，然后使用tnf-αelisa，评估化合物a9和化合物a10(900ng/孔)对tnf-α表达的rna干扰。如图13a所示，与未处理的对照相比，化合物a9和化合物a10均使tnf-α水平下调了高达80％(p《0.01)。图13a和13b的测定数据显示，化合物a10(其包含位于il-4编码序列3'的靶向tnf-α的sirna)至少与化合物a9(其包含位于il-4编码序列5'的靶向tnf-α的sirna)一样地下调tnf-α，下调了约80％。此外，相对于化合物a9，化合物a10诱导了至少20倍的il-4表达增加。
[0674]
实施例19：a549细胞中的内源性alk2表达模型
[0675]
用化合物a11体外转染a549细胞
[0676]
a549细胞是源自人肺癌的典型肺泡ii型(atii)细胞。由于a549细胞以中等水平表达内源性alk2 rna转录本，因此使用a549细胞，在测量igf-1表达的同时，研究化合物a11在降解alk2 mrna中的作用。a549细胞(sigma-aldrich,buchs switzerland目录号6012804)维持在补充有10％fbs(thermofischer,basel,switzerland目录号10500-064)的dulbecco改良eagle氏培养基-高葡萄糖(dmem,sigma-aldrich,buchs switzerland目录号d0822)中。为了评估化合物a11的活性，在转染前24小时，将a549细胞以10,000个细胞/孔的密度铺板在常规生长培养基中。此后，使用lipofectamine 2000(www.invitrogen.com)按照制造商的说明书，以增加浓度的化合物a11(0、0.61、1.25、2.54、5.08、10.16和20.33nm，分别对应于0、19、38、75、150、300或600ng/孔)转染细胞。取出100μl dmem，将50μl opti-mem(www.thermofisher.com)添加到每个孔中，然后添加50μl在opti-mem中的mrna和lipofectamine 2000复合物。孵育5小时后，将培养基更换为新鲜生长培养基，将平板在37
°
℃下在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时，然后通过elisa定量igf-1，并使用sybr1-step cells to ct试剂盒(thermo fisher scientific，basel，switzerland；目录号a25599)和qpcr相对定量alk2 mrna，所述qpcr使用靶向人alk2 mrna的引物(正向引物：5
’‑
gacgtggagtatggcactatcg-3’和反向引物：5
’‑
cactccaacagtgtaatctggcg-3’；分别为seq id no:171和172)。人18s rrna用作参考对照(正向引物：5
’‑
acccgttgaaccccattcgtga-3’和反向引物：gcctcactaaaccatccaatcgg-3’；分别为seq id no:173和174)。
[0677]
结果
[0678]
评估化合物a11(包含位于igf-1蛋白质编码序列3'的靶向alk2的3x sirna)在a549细胞中下调alk-2和同时表达igf-1的作用及剂量反应(0.6nm至20.33nm)。数据表明化合物a11剂量依赖性地表达igf-1蛋白，达到高于150ng/ml的水平，如图14所示。在相同的细胞培养上清液中，评估了化合物a11对剩余alk-2表达的rna干扰。如图14所示，化合物a11下调内源性alk2 rna转录本的表达，下调了多达约75％。该测定表明，化合物a11以剂量依赖性方式下调alk2的表达(达到75％)并同时表达igf-1(达到至少150ng/ml)。
[0679]
实施例20：imr32细胞中的内源性sodl表达模型
[0680]
测定了化合物a12和化合物a13在高加索人神经母细胞瘤(imr32)细胞中下调sod-1表达和过表达igf-1(化合物a12)或epo(化合物a13)的能力。将imr32细胞(目录号
86041809，ecacc,uk)以每孔20,000个细胞的密度铺板在96孔预包被的brand微量滴定板(目录号782082)中，板孔中包含补充有10％(v/v)热灭活胎牛血清(fbs)、l-谷氨酰胺(2mm)和非必需氨基酸(neaa,1x)的最小必需培养基eagle(emem，bioconcept目录号1-31s01-i,www.bioconcept.ch)。细胞在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中生长过夜。按照制造商的说明书，使用jetmessenger(www.polyplus-transfection.com)用三个剂量的化合物a12或化合物a13构建体(150、300或900ng/孔)转染细胞。乱序sirna(sc-sirna)用于排除转染相关的细胞死亡(universal sirna,sigma；目录sic002)。简而言之，按照0.25μl jetmessenge试剂与每0.1g mrna构建体混合来形成mrna/jetmessenger复合物。在室温下孵育15分钟后，加入10μl jetmessenger复合物，转染5小时后从孔中取出培养基/mrna/jetmessenger并更换为新鲜的100μl生长培养基，然后将板在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时。在用化合物a12和化合物a13转染24小时后，通过qpcr在细胞裂解物中测量剩余sod1 mrna，其中通过使用qpcr和靶向人sod1 mrna的引物(正向引物：5'-ctcactctcaggagaccattgc-3'和反向引物：5'-ccacaagccaaacgacttccag-3'；分别为seq id no:175和176)，使用sybr 1-step cells to ct试剂盒(thermo fischer scientific，basel，switzerland；目录号a25599)进行相对定量。人18s rrna用作参考对照，使用实施例19中指定的相同引物。使用相同的细胞培养上清液通过elisa测量igf-1和epo(thermo fisher scientific，basel，switzerland；目录号bms2035)。
[0681]
结果
[0682]
评估化合物a12(包含靶向sod1的3x sirna和igf-1蛋白质编码序列)和化合物a13(包含靶向sod1的3x sirna和epo蛋白质编码序列)的系列递增的三个剂量(150、300和900ng/孔)，在imr32细胞中的sod1下调作用。该测定显示，化合物a12和化合物a13以剂量依赖性方式减少了sod1转录本(高达至少约70％)(图15a，分别为空心圆和实心圆)。乱序sirna没有显示作用(图15a，阴影圆圈)。在相同的细胞培养上清液(imr32细胞)中，评估了化合物a13的epo蛋白的表达。如图15b所示，化合物a13以剂量依赖性方式诱导epo表达。同样地，在相同的imr32细胞培养上清液中评估了来自化合物a12的igf-1蛋白表达。如图15c所示，化合物a12同时表达igf-1。
[0683]
实施例21：hek-293细胞中的il-1β过表达模型
[0684]
测定化合物a14和化合物a15在hek-293细胞中下调il-1β表达和过表达igf-1的能力。使用il-1βmrna转染(300ng/孔)在hek-293细胞中建立il-1β过表达模型。化合物a14包含位于igf-1编码序列5'(igf-1基因上游)的il-1β靶向性sirna，化合物a15包含位于igf-1编码序列3'(igf-1基因下游)的il-1β靶向性sirna。为了评估含有靶向il-1β的sirna的化合物a14和化合物a15在下调il-1β和同时表达igf-1中的能力，用化合物a14或化合物a15(900ng/孔)和il-1βmrna(300ng/孔)共转染hek-293细胞。转染后，将细胞在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中孵育24小时，然后通过elisa在相同的细胞培养上清液对tnf-β(下调的靶基因)和il-1(过表达的目的基因)进行定量。
[0685]
结果
[0686]
化合物a14和化合物a15分别包含位于igf-1编码序列5'或3'的靶向il-1β的sirna。在具有外源递送的il-1βmrna(300ng/孔)的hek-293细胞中，测试这些构建体导致的同时il-1β下调和igf-1表达(900g/孔)。数据表明，化合物a15表达的igf-1比化合物a14高
约13倍，如图16b所示(p《0.001)。在使用相同细胞培养上清液的相同实验中，通过il-1βelisa测量，评估化合物a14和化合物a15(900ng/孔)对来自il-1β过表达构建体(300ng/孔)的il-1β表达的rna干扰。如图16a所示，与未处理的对照相比，化合物a14和化合物a15分别将il-1β水平下调超过约150倍和290倍(p《0.001)。与化合物a14相比，化合物a15诱导了至少约2倍的il-1β下调，在化合物14中sirna位于igf-1orf的上游(5')(图16a；p《0.05)。这些数据表明，化合物a15(具有位于igf-1基因3'的靶向il-1β的sirna)将il-1β下调了290倍，并增加了igf-1表达，由此同时显著增加igf-1表达。化合物a14(具有位于igf-1基因5'的靶向il-1β的sirna)将il-1β下调了150倍，并增加igf-1表达，由此同时显著增加igf-1表达。因此，化合物a15对il-1β的下调比在化合物a14中观察到的高了2倍。此外，化合物a15引起的igf-1表达比在化合物a14中观察到的高了13倍。
[0687]
实施例22：a549细胞中的sars cov-2核衣壳蛋白过表达模型
[0688]
用具有egfp标记的sars cov-2核衣壳蛋白的pcdna3
载体和sars cov-2核衣壳蛋白抑制/可溶性ace2过表达化合物体外转染a549细胞
[0689]
使用sars cov-2核衣壳蛋白过表达模型，评估a549细胞中由化合物b18引起的同时sars cov-2核衣壳(n)蛋白rnai抑制和可溶性ace2过表达。该模型通过转染含有egfp标记的sars cov-2 n蛋白的质粒pcdna3 载体(300ng/孔)来建立。靶向sars cov-2 n蛋白的化合物b18的rnai将破坏下游egfp的翻译和表达。化合物b18包含可溶性ace2的编码orf和位于该ace2 orf的3'(下游)的靶向sars cov-2的3x sirna(1x靶orf1ab区域、1x靶刺突蛋白和1x靶核衣壳蛋白)。用化合物b18(600ng/孔)和sars cov-2核衣壳蛋白过表达质粒构建体(300ng/孔)共转染细胞。转染后，将细胞在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中温育24小时，然后确定化合物b18引起的rnai抑制是否会破坏egfp翻译。使用spectramax i3x多模式酶标仪(molecular devices)，对标记有egfp的sars cov-2核衣壳蛋白(来自质粒的表达)进行显微镜检查以确定egfp表达。计算处理和对照未处理样品中egfp阳性细胞的百分比。
[0690]
结果
[0691]
评估化合物b18(包含位于可溶性ace2蛋白编码序列3'的靶向sars cov-2的3x sirna)对a549细胞中sars cov-2 n-蛋白的下调作用。观察到egfp阳性细胞数量减少，表明化合物b18对编码sars cov-2 n-蛋白的mrna的靶向作用(图17a和17b)。来自不同样品的累积分析显示，与未处理的对照相比，化合物b18使egfp阳性细胞减少约8倍(图17c)。
[0692]
本文描述的实施例和实施方案仅用于举例说明目的，并且向本领域技术人员建议的各种修改或改变将包括在本技术的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。
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表7：所列序列的表格
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再多了解一些
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