一种碳苷黄酮-山萘酚8-C-葡萄糖苷的制备方法

一种碳苷黄酮-山萘酚8-c-葡萄糖苷的制备方法
技术领域
1.本发明属于基因工程技术及微生物技术领域，具体涉及一种碳苷黄酮-山萘酚8-c-葡萄糖苷的制备方法。


背景技术：

2.黄酮类化合物主要是指基本母核2-苯基色原酮类的化合物，而今则泛指两个苯环通过中央三碳相互连结而形成的一系列的化合物。黄酮类化合物在银杏、槐米、沙棘、桉树、黄芩等多种植物中存在较为广泛。黄酮类化合物在植物的整个生长阶段中都承担着相当重要的作用。大部分黄酮类化合物呈黄色或淡黄色，多具有酮基，故被称之为黄酮。在植物中，黄酮大部分是与糖连在一起成甙，很少以游离态的形式存在。自然界中的黄酮类化合物大约有9000多种，不同的结构具有不同的生物活性，即使是同一母核的黄酮糖苷类化合物，糖基的多少、糖基的有无都影响其生物活性和药用价值。最新研究发现，黄酮糖苷衍生物与黄酮苷元相比具有更好生物利用度、更强生物活性。
3.碳苷黄酮是一种糖基以c-c键直接连接在黄酮母体上的黄酮类化合物，广泛存在于小麦、玉米、大米、绿豆、蓝莓、柠檬、红茶及竹叶提取物中。碳苷黄酮与氧苷黄酮相比，具有结构稳定及能深入病灶部位等特点。近几年来的研究发现碳苷黄酮可以清除自由基，抵御氧化损伤导致的细胞活力损失，且对多种疾病具有防治效果，如改善糖尿病相关指征、抑制炎性疾病、弱化肝纤维化发展、诱导肝癌细胞凋亡、抗病毒以及其他多种效应等，因此具有很好的应用前景。
4.山萘酚属于黄酮类化合物，分子式为c
15h10
o6，分子量为286.23。山萘酚广泛存在于多种植物中，具有抗氧化、抗炎症、抗癌等多种细胞保护功能。虽然已经有一些山萘酚-o-糖苷衍生物在植物中被发现和报道，但还没有山萘酚-c-糖苷衍生物被发现和报道。


技术实现要素：

5.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
6.鉴于上述碳苷黄酮-山萘酚8-c-葡萄糖苷的制备方法和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
7.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种碳苷黄酮-山萘酚8-c-葡萄糖苷的制备方法。
8.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
9.一种能抑制了山萘酚8-c-葡萄糖苷的降解，大幅度提高了重组菌产量的方法。
10.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：将重组菌bl-tccgt-i在含有链霉素(50g/ml)和氯霉素(35g/ml)的lb培养基中过夜培养，转接到添加链霉素(50g/ml)和氯霉素(35g/ml)的lb培养基中，37℃，200rpm振荡培养至od600为0.8时，加入终浓度为
0.02mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，20℃诱导培养12h；
11.随后以5,000g离心10min收获重组菌株细胞，并使用1l添加链霉素(50g/ml)和氯霉素(35g/ml)的m9-gly培养基将重组菌株静息细胞重悬至od600＝40；
12.随后添加4g/l的山萘酚，0.02mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，总体积分数2％的二甲基亚砜(dmso)和10g/l纤维二糖，换用8层纱布后以30℃继续转化培养；
13.在发酵过程中，24h和72h时向培养基中加入4g/l山萘酚和10g/l纤维二糖，24h、48h、72h和96h时向培养基中加入10g/l甘油。
14.本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种能高效转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的重组菌。
15.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：将trollius chinensis来源的c-glycosyltransferase基因，escherichia coliw来源的sucrose permease基因，saccharophagus degradans来源的cellobiose phosphorylase基因和bifidobacterium bifidum来源的utp-glucose-1-phosphate uridylyltransferase基因的重组质粒导入大肠杆菌，获得的重组菌bl-tccgt-i。
16.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述同类重组菌还可以通过以下方法制备：将trollius chinensis来源的c-glycosyltransferase基因导入大肠杆菌，获得重组菌bl-tccgt，bl star-tccgt，jm109-tccgt和er2566-tccgt。
17.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述同类重组菌还可以通过以下方法制备将trollius chinensis来源的c-glycosyltransferase基因，escherichia coliw来源的sucrose permease基因，saccharophagus degradans来源的cellobiose phosphorylase基因和bifidobacterium bifidum来源的utp-glucose-1-phosphate uridylyltransferase基因的重组质粒导入大肠杆菌，获得重组菌bl-tccgt-i，bl star-tccgt-i，jm109-tccgt-i和er2566-tccgt-i。
18.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述同类重组菌还可以通过以下方法制备将trollius chinensis来源的c-glycosyltransferase基因，escherichia coliw来源的sucrose permease基因，bifidobacterium adolescentis来源的sucrose phosphorylase基因和bifidobacterium bifidum来源的utp-glucose-1-phosphate uridylyltransferase基因的重组质粒导入大肠杆菌，获得重组菌bl-tccgt-ii，bl star-tccgt-ii，jm109-tccgt-ii和er2566-tccgt-ii。
19.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述trollius chinensis来源的c-glycosyltransferase基因序列为优化后基因，核苷酸序列如seq id no.1所示；
20.所述的escherichia coli w来源的sucrose permease基因序列并携带启动子和核糖体结合位点，核苷酸序列如seq id no.2所示；
21.所述的bifidobacterium adolescentis来源的sucrose phosphorylase基因序列为优化后基因，核苷酸序列如seq id no.3所示；
22.所述的bifidobacterium bifidum来源的utp-glucose-1-phosphate uridylyltransferase基因序列为优化后基因，核苷酸序列如seq id no.4所示；
23.所述的saccharophagus degradans来源的cellobiose phosphorylase基因序列为优化后基因，核苷酸序列如seq id no.5所示。
24.本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种山萘酚8-c-葡萄糖苷的高效制备方法。
25.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：利用大孔树脂hpd100对山萘酚8-c-葡萄糖苷进行吸附，吸附条件为80rpm，25℃，超声功率0w；以25℃，240w超声功率和80％乙醇解吸1小时，获得的样品经真空干燥得到山萘酚8-c-葡萄糖苷制品。
26.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述大孔树脂还可选择nka-9，dm 301，ab-8，d101和hp20。
27.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述吸附条件中超声功率可以选择0-240w。
28.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述吸解条件中超声功率可选择0-280w，可选乙醇的体积分数为：40-100％。
29.本发明有益效果：
30.1、首次实现了重组菌产山萘酚8-c-葡萄糖苷。
31.2、通过转化策略的调整和优化转化条件，解决了底物对转化体系的抑制作用，使得山萘酚转化生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的摩尔转化率达到94.87％，产量达到16.6g/l。
32.3、利用简单的柱层析，实现了高纯度山萘酚8-c-葡萄糖苷的制备。
33.4、本发明所述制备山萘酚8-c-葡萄糖苷的工艺简单。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。其中：
35.图1为本发明实施例1中不同udp-葡萄糖生物合成路径和大肠杆菌宿主对转化的影响图。
36.图2为本发明实施例2中不同碳源对转化的影响图。
37.图3为本发明实施例2中转化温度对转化的影响图。
38.图4为本发明实施例2中诱导剂对转化的影响图。
39.图5为本发明实施例2中纤维二糖对转化的影响图。
40.图6为本发明实施例2中dmso对转化的影响图。
41.图7为本发明实施例2中甘油对转化的影响图。
42.图8为本发明实施例2中底物用量对转化的影响图。
43.图9为本发明实施例2中转化策略对转化的影响图。
44.图10为本发明实施例3中不同培养基、菌体生物量对重组菌静息细胞转化的影响(a)lb培养基，(b)tb-甘油培养基，(c)m9-甘油培养基图。
45.图11为本发明实施例3中m9-甘油培养基中重组菌静息细胞转化反应时间曲线图。
46.图12为本发明实施例3中重组菌静息细胞补料分批发酵转化反应时间曲线图。
47.图13为本发明实施例4中超声辅助大孔树脂纯化山萘酚8-c-葡萄糖苷的研究(a)不同超声功率下hpd100型大孔树脂对山萘酚8-c-葡萄糖苷的吸收动力学曲线图，(b)不同
超声功率下，40％乙醇为解吸剂时对hpd100型大孔树脂解吸山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响，(c)240w超声功率下，不同浓度乙醇解吸剂对hpd100型大孔树脂解吸山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响图。
具体实施方式
48.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
49.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
50.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性地与其他实施例互相排斥的实施例。
51.实施例1
52.1、重组质粒pcdfduet-tccgt的构建
53.对trollius chinensis来源的c-glycosyltransferase基因(tccgt，mk644229)按照大肠杆菌k12优势密码子表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)对其进行优化，选择氨基酸同义密码子使用频率高的密码子作为优势密码子，最终获得优化后的碳苷糖基转移酶基因序列信息，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并在基因的n端和c端分别添加nco i和bamh i酶切位点，获得优化后的tccgt基因，基因序列如seq id no:1所示。
54.将优化后的tccgt基因用nco i和bamh i双酶切，同时将重组质粒pcdfduet-1也用nco i和bamh i双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌jm109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pcdfduet-tccgt。
55.2、重组质粒pacycduet-cscb-basp-ugpa的构建
56.将携带启动子的escherichia coli w来源的sucrose permease基因(cscb，adt76024.1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成，合成的同时携带启动子序列和核糖体结合位点序列，并在该序列的两端添加econ i酶切位点。携带启动子序列和核糖体结合位点的基因序列如seq id no:2所示。将合成获得的基因片段用econ i酶切，同时将重组质粒pacycduet-1也用econ i酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌jm109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pacycduet-cscb。
57.将bifidobacterium adolescentis来源的sucrose phosphorylase基因(basp,wp_011742626.1)，按照大肠杆菌k12优势密码子表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)对上述基因序列进行优化，选择氨基酸同义密码子使用频率高的密码子作为优势密码子，最终获得优化后的基因序列信息，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并在基因的n端和c端分别添加nco i和ecor i酶切位点，获得优化后的basp基因，基因序列如seq id no:3所示。
58.将优化后的basp基因用nco i和ecor i双酶切，同时将重组质粒pacycduet-cscb也用nco i和ecor i双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠
tccgt和重组质粒pacycduet-cscb-cep-ugpa共转化大肠杆菌bl21(de3)宿主菌获得的重组菌bl-tccgt-i为最佳宿主，其产量达到1103mg/l。
68.实施例2
69.1、不同碳源对重组菌转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响
70.将重组菌bl-tccgt-i在含有链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的lb培养基中过夜培养，转接到5ml添加链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)lb、tb(甘油、葡萄糖、糊精、麦芽糊精和菊粉)培养基中，37℃，200rpm振荡培养至od600为0.8时，加入终浓度为0.1mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，800mg/l的山萘酚和5g/l纤维二糖，换用8层纱布30℃转化培养24h；取样测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量。如图2所示，tb-gly培养基诱导培养效果最佳，其产量达到1034mg/l。
71.2、转化温度对重组菌转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响
72.将重组菌bl-tccgt-i在含有链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的lb培养基中过夜培养，转接到5ml添加链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)tb-gly培养基中，37℃，200rpm振荡培养至od600为0.8时，加入终浓度为0.1mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，800mg/l的山萘酚和5g/l纤维二糖，换用8层纱布以不同温度(16，25，30和37℃)转化培养24h；取样测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量。如图3所示，30℃继续诱导培养效果最佳，其产量达到1095mg/l。
73.3、诱导剂iptg对重组菌转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响
74.将重组菌bl-tccgt-i在含有链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的lb培养基中过夜培养，转接到5ml添加链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)tb-gly培养基中，37℃，200rpm振荡培养至od600为0.8时，加入不同终浓度(0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.1和0.4mm)异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，800mg/l的山萘酚和5g/l纤维二糖，换用8层纱布30℃转化培养24h；取样测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量。如图4所示，添加0.02mmiptg诱导培养效果最佳，其产量达到1220mg/l。
75.4、纤维二糖对重组菌转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响
76.将重组菌bl-tccgt-i在含有链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的lb培养基中过夜培养，转接到5ml添加链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)tb-gly培养基中，37℃，200rpm振荡培养至od600为0.8时，加入终浓度为0.02mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，800mg/l的山萘酚和不同终浓度纤维二糖(2.5、5、10、15和20g/l)，换用8层纱布30℃转化培养24h；取样测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量。如图5所示，添加10g/l纤维二糖诱导培养效果最佳，其产量达到1355mg/l。
77.5、dmso对重组菌转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响
78.将重组菌bl-tccgt-i在含有链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的lb培养基中过夜培养，转接到5ml添加链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)tb-gly培养基中，37℃，200rpm振荡培养至od600为0.8时，加入终浓度为0.02mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，800mg/l的山萘酚，10g/l纤维二糖和dmso至不同终体积(1、2、4、6、8和10％)换用8层纱布30℃转化培养24h；取样测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量。如图6所示，添加dmso至终体积为2-6％时诱导培养效果最佳。
79.6、甘油对重组菌转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响
80.将重组菌bl-tccgt-i在含有链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的lb培养基中过夜培养，转接到5ml添加链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的不同甘油浓度(5、10、15、20和25g/l)的tb-gly培养基中，37℃，200rpm振荡培养至od600为0.8时，加入终浓度为0.02mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，800mg/l的山萘酚，2％的dmso和10g/l纤维二糖，换用8层纱布30℃转化培养24h；取样测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量。如图7所示，培养基中甘油添加浓度对诱导培养效果无明显作用。
81.7、底物用量对重组菌转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响
82.将重组菌bl-tccgt-i在含有链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的lb培养基中过夜培养，转接到5ml添加链霉素(50μg/ml)，氯霉素(35μg/ml)和10g/l甘油的tb-gly培养基中，37℃，200rpm振荡培养至od600为0.8时，加入终浓度为0.02mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，添加不同终浓度的山萘酚(0.8、1.6、2.4、3.0和3.6g/l)，2％的dmso和10g/l纤维二糖，换用8层纱布30℃转化培养24h；取样测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量。如图8所示，山萘酚添加量为3g/l时诱导培养效果最佳。
83.8、转化策略对重组菌转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响
84.山萘酚具有抑菌作用，能抑制大肠杆菌的生长。因此山萘酚的添加时间对重组菌的生长具有重要影响。以重组菌bl-tccgt-i为研究对象，通过不同的诱导转化策略，研究山萘酚的添加时间对山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响。
85.将重组菌bl-tccgt-i在含有链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的lb培养基中过夜培养，转接到5ml添加链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)tb-gly培养基中，37℃，200rpm振荡培养至od600为0.8时，加入终浓度为0.02mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，30℃诱导培养0h，2h，4h，6h，8h，10h和12h；随后添加3g/l的山萘酚，2％的dmso和10g/l纤维二糖，换用8层纱布继续转化培养24h，取样测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量。如图9所示，30℃继续诱导培养10h效果最佳，在tb-gly培养基中转化24h后山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量达到2321mg/l，是30℃诱导培养0h的2.11倍(图9)。
86.实施例3
87.1、不同培养基、菌体生物量对重组菌静息细胞转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的影响
88.实施例2中的结论可知山萘酚添加量为3.6g/l时出现底物抑制作用(图8)，为了消除底物抑制作用的影响，后续实验选用重组菌静息细胞生物转化策略以继续扩大山萘酚8-c-葡萄糖苷产量。以重组菌bl-tccgt-i为研究对象，通过选用重组菌静息细胞生物转化策略，研究不同培养基及菌体生物量对山萘酚8-c-葡萄糖苷产量的影响。
89.将重组菌bl-tccgt-i在含有链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的lb培养基中过夜培养，转接到250ml添加链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的lb培养基中，37℃，200rpm振荡培养至od600为0.8时，加入终浓度为0.02mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，20℃诱导培养12h。随后以5,000g离心10min收获重组菌株细胞，并用lb、tb-gly或m9-gly培养基重悬重组菌株细胞。将重组菌株细胞重悬液转接至5ml添加链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的lb、tb-gly或m9-gly培养基中并稀释至相应的菌体生物量，随后添加4g/l的山萘酚，0.02mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，2％的dmso和10g/l纤维二糖，换用8层纱布后以30℃继续转化培养24h，取样测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的
产量。
90.如图10所示，山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量随着lb、tb-gly和m9-gly培养基中静息细胞浓度的增加而提高，在m9-gly培养基中od600＝40时山萘酚8-c－葡萄糖苷的产量最高为4062mg/l(图10c)。每od600单位产量随着lb和m9-gly培养基中静息细胞浓度的增加而降低，而tb-gly培养基中在静息细胞浓度不超过od600＝30时，每od600单位产量没有显著差异(图10a,b)。图11为在m9-gly培养基，od600＝40时，重组菌静息细胞转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷的反应时间曲线。在发酵时间为33h时山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量达到最大值7027mg/l，在0-3h的发酵过程中比生产速率达到551mg/l/h，在3-21h的发酵过程中比生产速率保持在263mg/l/h(图11)。
91.2、重组菌静息细胞补料分批发酵转化山萘酚生成山萘酚8-c-葡萄糖苷
92.为了进一步提高山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量，将生物转化模式从分批发酵调整为补料分批发酵，即在底物和甘油消耗完全后再添加。
93.使用实施例3中步骤1所述方法接种重组菌株静息细胞，使用1l添加链霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/ml)的m9-gly培养基将重组菌株静息细胞重悬至od600＝40。随后添加4g/l的山萘酚，0.02mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，2％的dmso和10g/l纤维二糖，换用8层纱布后以30℃继续转化培养。在发酵过程中，24h和72h时向培养基中加入4g/l山萘酚和10g/l纤维二糖，24h、48h、72h和96h时向培养基中加入10g/l甘油。每24h取样测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的产量。
94.根据底物和甘油添加的时间，可将生物转化过程分为以下三个部分：0-24、24-72和72-120h。在发酵初期的0-24h内，山萘酚8-c-葡萄糖苷的比生产速率达到217mg/l/h，而随着山萘酚8-c-葡萄糖苷浓度的增加，比生产速率逐渐降低(图12)。在发酵的24-72和72-120h期间，山萘酚8-c-葡萄糖苷的比生产速率分别为120和115mg/l/h。最终通过120h的补料分批发酵，山萘酚8-c-葡萄糖苷的最大产量达到16.6g/l，相应的摩尔转化率为94.87％(图12)。
95.实施例4
96.1、不同种类大孔树脂对山萘酚8-c-葡萄糖苷吸附量的比较
97.选取一种强极性(nka-9)、一种中极性(dm301)、一种弱极性(ab-8)和三种非极性(d101、hpd100和hp20)共6种大孔树脂，分别称取一定量的大孔树脂，用乙醇浸泡24小时，用蒸馏水反复清洗至无味，备用。选择上述预处理好的6种大孔树脂各1g，分别置于100ml锥形瓶中，各加入30ml的发酵液，25℃、80rpm下恒温恒速振荡吸附3h，抽滤，取滤液测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度，按照下列公式计算吸附量、吸附率：
98.吸附量(mg/g树脂干质量)＝(原液中山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度
–
吸附后滤液中山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度)
×
原液体积/树脂干质量
99.吸附率(％)＝(原液中山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度-吸附后滤液中山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度)/原液中山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度
×
100％
100.如表1所示，hpd100型大孔树脂对山萘酚8-c-葡萄糖苷的吸附量(22.28mg/g)和吸附率(72.83％)均高于其他大孔树脂。
101.2、不同种类大孔树脂对山萘酚8-c-葡萄糖苷解吸量的比较
102.将上述用于吸附实验的大孔树脂经抽滤后用蒸馏水清洗3次，用滤纸将树脂表面
的水分吸干，转入100ml锥形瓶中，加入50％的乙醇30ml，于25℃、80rpm下恒温恒速振荡解吸2h，取上清液测定山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度，按照下列公式计算解吸量、解吸率、回收率：
103.解吸量(mg/g树脂干质量)＝(洗脱液中山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度
×
洗脱液体积)/树脂干质量
104.解吸率(％)＝(洗脱液中山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度
×
洗脱液体积)/(原液中山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度
–
吸附后滤液中山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度)
×
原液体积
×
100％
105.回收率(％)＝洗脱液中山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度/原液中山萘酚8-c-葡萄糖苷的浓度
×
100％
106.如表1所示，hpd100型大孔树脂对山萘酚8-c-葡萄糖苷的解吸量(17.04mg/g)、解吸率(76.49％)和回收率(55.71％)均高于其他大孔树脂。因此，后续对山萘酚8-c-葡萄糖苷的纯化将选用hpd100型大孔树脂。
107.3、超声辅助大孔树脂纯化山萘酚8-c-葡萄糖苷的研究
108.在吸附实验中，控制温度为25℃，研究超声功率(p＝0、240和280w)对大孔树脂吸附能力的影响。在解吸实验中，控制温度为25℃，研究超声功率(p＝0、240和280w)和乙醇浓度(40％-100％)对大孔树脂解吸能力的影响。对照组(p＝0w)表示样品于25℃、80rpm下恒温恒速振荡吸附/解吸。
109.超声处理对hpd100型大孔树脂吸附动力学的影响如图13a所示。在吸附开始时，hpd100对山萘酚8-c-葡萄糖苷的吸附能力迅速增加，然后缓慢增加直至达到平衡状态。然而，在不同的超声功率下山萘酚8-c-葡萄糖苷的吸附能力并没有表现出显着差异。因此，最佳吸附条件为25℃、80rpm恒温恒速振荡吸附120min，最高吸附量达到28.57mg/g(图13a)。
110.超声处理对hpd100型大孔树脂解吸动力学的影响如图13b所示。结果表明，hpd100对山萘酚8-c-葡萄糖苷的解吸能力随着超声功率的增加而迅速增加，并在30min内达到平衡(图13b)。由于高功率超声波可能会对大孔树脂表面结构造成破坏，影响大孔树脂的解吸能力，因此后续解吸实验采用超声功率p＝240w进行。如图13c所示，在以80％乙醇为解吸剂时，hpd100对山萘酚8-c-葡萄糖苷的解吸能力达到最高值24.15mg/g。因此，最佳解吸条件为超声功率240w、乙醇浓度80％、温度25℃、时间60min(图13b、c)。
111.4、大孔树脂纯化制备山萘酚8-c-葡萄糖苷
112.为了溶解产物，需将2l含有5％dmso的超纯水添加到1l静息细胞转化发酵液中，并在8,000g条件下离心15min以除去菌体。然后向600ghpd100型大孔树脂中加入上清液，于80rpm和25℃条件下恒温恒速震荡吸附3小时，接着在25℃和240w超声功率作用下用同等体积80％乙醇解吸1小时。收集解吸液经真空蒸发至干便可得到山萘酚8-c-葡萄糖苷。最终研究结果表明，1l静息细胞转化发酵液中可通过大孔树脂纯化得到山萘酚8-c-葡萄糖苷(15.4g)，回收率为93％。
113.表1不同大孔树脂对山萘酚8-c-葡萄糖苷的吸附/解吸能力和回收率
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应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。