多配体功能化复合纳米材料及其制备方法与应用

1.本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种多配体功能化复合纳米材料及其制备方法与应用。
背景技术：
：：2.抗体类药物目前已成为治疗各种癌症、传染性疾病和自身免疫性疾病的重磅生物药物[nat.rev.immunol.10(2010)317-327]。其中，单克隆抗体(monoclonalantibody,mab)凭借其疗效高、特异性强等优势，一直以来稳居全球药物销售榜前列[monoclonalantibodies(mabs)globalmarketreport2020.]。尤其是近些年一些新型的抗体类药物由于具有独特的疗效而倍受关注，掀起了新药研发领域的热潮。譬如，抗体偶联药物(antibody-drugconjugate，adc)通过将单克隆抗体药物的高特异性和小分子细胞毒药物的高活性相结合，可显著提高肿瘤药物的靶向性并减少毒副作用，被誉之为“生物导弹”，因而在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景[mabs.10(2018)678-691.]。[0003]尽管抗体类药物在疾病的临床治疗中广受好评，但是，目前抗体类药物的应用却面临着两方面的难题：一是在其制药生产过程中，随着生产体系的建立健全，急剧增加的上游药物滴度给其下游纯化工艺带来了沉重的负担[actabiomaterialia95(2019)73-90.]；二是其体内药物分析，如血药浓度监测、药物动态追踪、体内生物转化等仍然是新药开发和药代动力学研究难点。而解决上述两问题的核心均在于如何对复杂生物体系中的抗体类药物进行高效富集纯化。迄今为止，最常用的抗体类药物纯化技术仍然是蛋白a亲和色谱，但是其存在一些固有的缺陷：(1)蛋白类配基价格昂贵，理化性质不够稳定，严苛洗脱条件下易造成配基脱落继而引起免疫原性反应[biotechnol.prog.32(2016)1193-1202.]；(2)执行体内样品分离时，由于患者体内含有高丰度的人血清免疫球蛋白g(humanimmunoglobuling,higg)，其与抗体的可结晶段(fragmentcrystallizable，fc)有着高度序列同源性，所以仅仅依靠蛋白a对抗体fc段的特异性难以精准辨别higg和mabs；(3)使用的琼脂糖凝胶基质往往还具有吸附容量有限，理化性质不够稳定、机械强度差等不足[j.chromatogr.a.1530(2017)129-137.]；(4)对于结构和组成更为复杂并且在体内呈动态变化的adc来说，传统单一位点识别技术可能会造成部分关键adc物种缺失。[0004]基于上述背景，本发明申请的技术方案是通过在复合纳米材料基质上修饰不同的捕获单元，可以利用不同配体之间的多位点协同识别作用实现对目标物的精准、全方位地捕获，进而能够提高捕获的准确性。这类新型高效、精准、应用范围广阔的体内抗体药物识别技术对于抗体药物的体内分析具有重要意义。技术实现要素：[0005]针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种多配体功能化复合纳米材料的制备方法。[0006]本发明的第二目的在于提供一种通过上述方法制备得到的多配体功能化复合纳米材料。[0007]本发明的第三目的在于提供上述多配体功能化复合纳米材料的应用。[0008]本发明的首要目的通过以下技术方案实现：[0009]一种多配体功能化复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：[0010](1)复合纳米材料(mof@mnps)的制备：将金属纳米颗粒(mnps)利用静电作用原位生长在氨基化金属有机骨架(mof)上，得到金属纳米颗粒修饰的氨基化金属有机骨架材料，即复合纳米材料(mof@mnps)；[0011](2)单一配体修饰的复合纳米材料(mof@mnps@ligand1)的制备：利用组氨酸与过渡态金属离子之间的螯合作用，将具有组氨酸标签的配体1(ligand1)修饰到氨基化金属有机骨架(mof)上，并利用封闭剂1对氨基化金属有机骨架(mof)上多余金属离子反应位点进行封闭，得到单一配体修饰的复合纳米材料(mof@mnps@ligand1)；[0012](3)多配体功能化复合纳米材料(mof@mnps@dual-ligand)的制备：利用金硫键自组装作用，将末端带有巯基修饰的配体2(ligand2)固定到金属纳米颗粒(mnps)上，并利用封闭剂2对金属纳米颗粒(mnps)上多余反应位点进行封闭，最终得到多配体修饰的复合纳米材料(mof@mnps@dual-ligand)。[0013]优选地，所述多配体功能化复合纳米材料的制备方法，具体包括如下制备步骤：[0014](1)复合纳米材料(mof@mnps)的制备：首先利用水热法合成氨基功能化金属有机骨架(mof)，充分洗涤干净后，往溶液中加入金属酸盐和还原剂，利用原位生长法在金属有机骨架表面生长出金属纳米颗粒(mnps)，最终经过洗涤干净后得到以金属有机骨架和金属纳米颗粒为基础的复合纳米材料(mof@mnps)；[0015](2)单一配体修饰的复合纳米材料(mof@mnps@ligand1)的制备：向步骤(1)中制备好的复合纳米材料溶液加入修饰了组氨酸标签的配体1(ligand1)溶液，第一次混旋孵育后用去离子水洗净，利用组氨酸与mof上过渡态金属离子之间的螯合作用将ligand1固定到mof表面；接着，加入封闭剂1用来封闭mof中多余的金属离子位点，第二次混旋孵育后用去离子水洗净，得到单一配体修饰的复合纳米材料(mof@mnps@ligand1)；[0016](3)多配体功能化复合纳米材料(mof@mnps@dual-ligand)的制备：取修饰了巯基的配体2(ligand2)溶液加入到步骤(2)中mof@mnps@ligand1的溶液中，第三次混旋孵育后用去离子水洗净，利用巯基与mnps表面自组装相互作用将ligand2固定到mnps上；最后，再加入封闭剂2至上步溶液中将mnps上多余反应位点进行封闭，第四次混旋孵育后用去离子水洗净，再置于真空干燥中烘干，最终得到多配体功能化复合纳米材料(mof@mnps@dual-ligand)。[0017]优选地，所述步骤(1中)水热法合成氨基功能化金属有机骨架(mof)具体步骤为：将0.1～1.0g的fecl3·6h2o溶于1～10mldmf中得到溶液a，再将0.1～1.0g2-氨基对苯二甲酸溶于另外的1～10mldmf中得到溶液b；将溶液a与溶液b在室温下充分混合后，最后将溶液a和溶液b的混合液转移到高压反应釜中，于60～200℃下反应12～24小时得到氨基功能化金属有机骨架(mof)。[0018]优选地，所述步骤(1)中氨基功能化金属有机骨架(mof)是指氨基功能化mil系列、氨基功能化zif系列、氨基功能化uio系列、氨基功能化pcn系列、氨基功能化cpl系列、氨基功能化irmof系列金属有机骨架中的至少一种；所述金属纳米颗粒(mnps)为金、银、铜、铂纳米颗粒中的至少一种；所述金属纳米颗粒的粒径为5～50nm；所述金属纳米颗粒(mnps)是在氨基金属有机骨架上(mof)原位生长得到。[0019]优选地，所述步骤(2)中配体1(ligand1)为修饰了组氨酸标签的多肽、核酸适配体、蛋白质、蛋白结构域、小分子化合物中的一种，所述固定方式是通过金属离子螯合作用将ligand1与氨基化金属有机骨架上的过渡态金属离子结合，所述ligand1浓度为0.5～2.0mg/ml，ligand1与mof@mnps的体积比为1:3～3:1，第一次混旋孵育时间为0.5～5h；[0020]所述封闭剂1为能与mof结合的多肽、核酸、蛋白质、小分子化合物中的一种；所述封闭剂1的浓度为0.1～1.0mg/ml，第二次混旋孵育时间为0.5～5h。[0021]优选地，所述步骤(3)中配体2(ligand2)为修饰了巯基的多肽、核酸适配体、蛋白质、蛋白结构域、小分子化合物中的一种；所述ligand2的浓度为0.01～2.0mg/ml；所述ligand2与mof@au@ligand1的体积比为1:3～3:1，第三次混旋孵育时间为0.5～5h；[0022]所述封闭剂2为能与mnps结合的多肽、核酸、蛋白质、小分子化合物中的一种；所述封闭剂2的浓度为0.01～1.0mg/ml，第四次混旋孵育时间为0.5～5h。[0023]本发明的第二目的通过以下技术方案实现：[0024]一种多配体功能化复合纳米材料，通过上述方法制备得到。[0025]本发明的第三目的通过以下技术方案实现：[0026]一种多配体功能化复合纳米材料的应用。[0027]优选地，所述应用为多配体功能化复合纳米材料在抗体类药物富集中的应用，具体步骤如下：取多配体功能化复合纳米材料的粉末，加入去离子水充分溶解；再加入含抗体类药物的样品溶液，第五次混旋孵育后，离心后除去上清液；接着加入淋洗缓冲液清除非特异性吸附杂质，离心后除去上清液中的杂质；最后加入洗脱缓冲液洗脱被特异性吸附的抗体药物，离心后取上清液即得到富集纯化后的抗体药物；所述第五次混旋孵育时间为0～12h，所述淋洗缓冲液的组成为10mmtris-hcl，ph＝7.0～8.0；所述洗脱缓冲溶液的组成为10mm甲酸钠，100mm氯化钠，0.5％tween20，ph＝3.0～4.0。[0028]优选地，所述含抗体类药物的样品溶液是指含抗体类药物的蛋白溶液、细胞培养液或血清，所述抗体类药物是指单克隆抗体(mab)和抗体偶联药物(adc)。[0029]优选地，所述应用为多配体功能化复合纳米材料在adc多属性分析中的应用，具体步骤如下：取多配体功能化复合纳米材料的粉末，加入去离子水充分溶解；再加入含adc的样品溶液，混旋孵育后，离心后除去上清液；接着加入淋洗缓冲液洗脱杂质，离心后除去上清液杂质；最后加入洗脱缓冲液洗脱被特异性吸附的adc目标物，离心后取上清液即得到精准捕获后的adc，并用还原剂充分还原后再进行rplc-qtof-ms分析；所述第六次混旋孵育时间为0～12h，所述淋洗缓冲液的组成为10mmtris-hcl，ph＝7.0～8.0；所述洗脱缓冲溶液的组成为0.1％fa,25％acn；所述还原剂为tcep或者dtt，还原温度为4～65℃，还原时间为5～60min。[0030]其中，所述的多属性分析是指药物抗体比(dar)、载样量分布(dld)和生物转化表征。[0031]相对于现有技术，本发明的技术方案具有如下的有益效果：[0032](1)本发明申请的技术方案采用了复合纳米材料作为基质，相比于传统的琼脂糖凝胶色谱或者纤维素膜色谱基质材料，复合纳米材料具有反应位点丰富、比表面积大、稳定性好、生物相容性高的优势，因此能够显著提升配体的键合密度以增加对目标物的吸附容量；[0033](2)本发明申请的技术方案通过在复合纳米材料基质上修饰不同的捕获单元，可以利用配体之间的多位点协同识别作用实现对目标物的精准、全方位地捕获，进而能够提高捕获的准确性；[0034](3)本发明的技术方案通过在基质材料修饰配体后引入了针对性的封闭剂，如此可以对多余反应位点进行有效封闭，以减少基质材料带来的非特异性吸附情况；[0035](4)本发明所得多配体功能化复合纳米材料具有吸附容量大、非特异性吸附少、捕获效率高、理化性质稳定、可工业化生产的优点，可用于复杂生物样本中抗体类药物的捕获。此外，本发明所得多配体功能化复合纳米材料与lc-ms偶联，显示出在adc分析中的巨大潜力。(5)本发明制备的多配体功能化复合纳米材料可应用于蛋白标准溶液、细胞培养液或血清样品中目标抗体类药物的富集，有利于实现产业化，为抗体类药物体内分析以及制药过程的下游纯化工艺提供了一种有潜力的平台。[0036]附图/表说明[0037]图1为实施例1所得mof@aunps复合纳米基质材料的透射电镜(tem)图。[0038]图2为实施例1所得mof@aunps复合纳米基质材料的能量分布面扫描分析(elementalmapping)图。[0039]图3为实施例1所得mof、mof@aunps复合纳米基质材料的粉末x射线衍射(xrd)图。[0040]图4为实施例1所得mof、mof@aunps、mof@au@dual-ligand的x射线光电子能谱(xps)图。[0041]图5为实施例2所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗的静态吸附曲线图。[0042]图6为实施例3所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗的动态吸附曲线图。[0043]图7为实施例4所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗加标的人血清中所收集淋洗/洗脱组分的sds-page分析图。[0044]图8为实施例4所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗加标的人血清中所收集洗脱组分还原后的rplc分析图。[0045]图9为实施例4所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗adc加标的人血清中所收集淋洗/洗脱组分的sds-page分析图。[0046]图10为实施例5所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗adc加标的人血清中所收集淋洗/洗脱组分的sds-page分析图(更换洗脱条件)。[0047]图11为实施例5中曲妥珠单抗adc标准品还原后的qtof-ms分析图。[0048]图12为实施例5所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗adc加标的人血清中富集到的目标adc还原后的qtof-ms分析图。[0049]图13为实施例5所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗adc加标的人血清中所收集洗脱组分还原后的rplc分析图。具体实施方式[0050]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。[0051]实施例1[0052]取200mg的nh2-mil-101(fe)悬浮在60ml的0.1％(w/v)haucl4·3h2o水溶液中，45℃下持续搅拌2.5h。然后加热溶液到剧烈沸腾，再快速注入880μl的30％(w/v)柠檬酸钠，进一步搅拌40分钟至沸腾。冷却后收集mof@aunps，水洗数次直至上清液变澄清。4500rpm下离心收集所得产物，最后将产物溶于1ml去离子水中，储存于4℃冰箱中备用。[0053]取上述mof@aunps水溶液200μl，加入2mg/ml的hhhhhhgsgsgsqlgpyelwelsh(hh24)肽溶液2ml，混旋中孵育过夜，水洗3次。再加入1mg/mlhhhhhhgsgsgs(his6gs3)肽封闭剂1ml用来封闭多余的金属离子位点，混旋中孵育3h，水洗3次，得到mof@au@hh24peptide。[0054]将序列为ttttttgtgtccagggttccaaggtgcttcgtggacac且末端修饰了巯基的核酸适体(ch1s-6t)溶液配置成0.05mg/ml的溶液，取800μl加入到mof@au@hh24peptide中，-20℃下冷冻2h，再在4℃下孵育1h，然后用去离子水洗3次。再加入200μl(浓度为0.25mg/ml)的polya30至上步溶液中，4℃下孵育2h，对多余的au位点进行封闭，去离子水洗3次后得到mof@au@dual-ligand，真空干燥箱中烘干备用。[0055]本实施例中得到的mof、mof@aunps的扫描电镜(sem)和透射电镜(tem)及mof@aunps能量分布面扫描分析图(edsmapping)分别如图1、2所示。其中图1表明，制备得到的mof形貌均一，大小约为200-400nm。修饰上aunps后，可以观察到mof表面也出现了一些颗粒状的金纳米粒子，大小为10-30nm。因此电镜观察结果表明mof@aunps材料大小均一，分散性较好，且尺寸范围适用于配体的修饰与生物样本中单抗的捕获。图2显示出各元素的存在，表面金纳米颗粒成功在mof上生长。[0056]通过xrd测量mof和mof@aunps材料的晶形结构，可以对其进行定性表征。如图3所示，nh2-mil-101(fe)的xrd谱中的10度和20度左右的峰属于nh2-mil-101(fe)的特征峰，表明该mof成功合成。此外，mof@aunps在37度、45度、65度以及78度的特征峰可以对应于aunps的特征峰，表明aunps成功嵌合到nh2-mil-101(fe)中，即mof@aunps成功合成。[0057]根据xps谱图上的特征峰可以判断样品中不同元素的存在。如图4所示，在mof的xps谱图中，存在fe、o、n、c特征谱线，表明nh2-mil-101(fe)成功合成。且修饰了aunps后，mof@aunps的谱图中也出现了au的特征谱线，也表明金纳米颗粒成功嵌合上去，mof@aunps成功合成。在修饰了配体后，mof@au@dual-ligand的xps谱图中n元素的特征谱线强度增加，也可表明配体已经成功修饰上去。[0058]实施例2[0059]对实施例1制备的mof@au@dual-ligand材料进行静态吸附性能测试。[0060](1)静态吸附能力测试：[0061]用洗涤缓冲液将曲妥珠单抗稀释至一系列浓度(0.0625-10.0mg/ml)。然后，将1mg干燥的mof@au@dual-ligand粉末与200μl上述的曲妥珠单抗溶液混合，并在振荡器中以剧烈搅拌1h。随后，将混合物在10000rpm下离心5min，吸取上清液，并用酶标仪测量其中曲妥珠单抗的浓度。最后，根据langmuir方程计算出材料对曲妥珠单抗的吸附能力。[0062][0063]其中，q是聚合物的平衡吸附容量(mg/g聚合物)，c*是溶液中的平衡蛋白质浓度(mg/ml)。qm是最大结合容量(mg/g聚合物)，kd是表观解离常数(mg/ml)。[0064]所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗的静态吸附能力如图5所示。随着曲妥珠单抗浓度增加至4mg/ml左右，材料对其吸附容量逐渐趋于饱和，并且通过朗缪尔公式拟合得到最大吸附容量qm约为1216.7mg/g，明显优于先前报道过的其他类型的纯化材料。[0065]实施例3[0066]对实施例1制备的mof@au@dual-ligand材料进行动态吸附性能测试。[0067](1)动态吸附能力测试：[0068]将0.5mg干燥的mof@au@dual-ligand粉末分别与若干4mg/ml，200μl上述曲妥珠单抗溶液混合，置于振荡器中剧烈搅拌。不同时间下测量上清液中曲妥珠单抗的浓度，并计算出其捕获量。绘制孵育时间与曲妥珠单抗吸附量的曲线，并用下列一阶动力学方程拟合出动态吸附容量：[0069][0070]其中，q和qt(mg/g)分别为平衡时和时间t(min)对蛋白质的吸附量，k1为一阶动力学反应速率常数。[0071]所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗的动态吸附能力如图6所示。通过计算不同孵育时间下材料对曲妥珠单抗的吸附量绘制了动力学吸附曲线，并使用一阶动力学方程计算出材料的饱和动态吸附容量q约为1350.1mg/g。该材料的高吸附容量不仅归因于纳米材料大量活性表面带来的高配体密度，也是由于多位点识别作用增加了材料的特异性识别能力。[0072]实施例4[0073]对实施例1制备的mof@au@dual-ligand材料进行单抗药物加标人血清中目标物的纯化。[0074](1)考察实施例1所得mof@au@dual-ligand对空白人血清中非特异性吸附的情况：[0075]将人血清用去离子水稀释10倍后，取100μlmof@au@dual-ligand溶液，加入200μl上述人血清样本，混悬下孵育1h，用淋洗缓冲液(0.01mtris-hcl，ph7.0)洗涤3-5次，再用洗脱缓冲液(0.01m甲酸钠，含0.1mnacl，0.5％tween20，ph3.6)洗脱3-5次。收集所有组分进行sds-page和rplc分析。[0076]sds-page结果如图7(a)中所示，所有的蛋白在上样和淋洗时就被除去，洗脱组分中没有蛋白出现。表明mof@au@dual-ligand材料在人血清中非特异性吸附较低，这对目标单抗的捕获是十分有利的。[0077](2)以实施例1所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗加标的人血清中曲妥珠单抗的纯化：[0078]将人血清用去离子水稀释10倍后，加入曲妥珠单抗标准样品，配置成含有1.0mg/ml曲妥珠单抗的加标人血清。取50μlmof@au@dual-ligand溶液，加入200μl上述加标人血清样本，混悬下孵育1h，用淋洗缓冲液(0.01mtris-hcl，ph7.0)洗涤3-5次，再用洗脱缓冲液(0.01m甲酸钠，含0.1mnacl，0.5％tween20，ph3.6)洗脱3-5次。收集所有组分进行sds-page和rplc分析。sds-page结果如图7(b)中所示，大部分杂蛋白在上样和淋洗中就被除去，而只有加入的曲妥珠单抗可以被特异性捕获并在e1中被洗脱下来，且洗脱液中也没有出现明显的其他蛋白的条带，因此洗脱的纯度也较高。[0079]rplc结果如图8所示，对比还原水平下加标血清经材料纯化后得到的组分、曲妥珠单抗标样、空白人血清经材料纯化得到的组分可知：加标血清经材料纯化后，曲妥珠单抗可以被特异性的捕获并且高效地洗脱下来，相比于曲妥珠单抗标样，其峰形不会受到受影响，表明材料具有优异的特异性。此外，空白血清洗脱组分的图谱中也不存在明显的杂质峰，证明该材料非特异性吸附较少。上述结果表明mof@au@dual-ligand材料对曲妥珠单抗有着高度特异选择性，可以实现血清中目标单抗的精准捕获。[0080](3)以实施例1所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗adc加标的人血清中曲妥珠单抗adc的纯化：[0081]将人血清用去离子水稀释10倍后，加入曲妥珠单抗的adc标准样品，配置成含有1.0mg/ml曲妥珠单抗的adc加标人血清。取50μlmof@au@dual-ligand溶液，加入200μl上述加标人血清样本，混悬下孵育1h，用淋洗缓冲液(0.01mtris-hcl，ph7.0)洗涤3-5次，再用洗脱缓冲液(0.01m甲酸钠，含0.1mnacl，0.5％tween20，ph3.6)洗脱3次，收集所有组分进行sds-page。[0082]sds-page结果如图9所示。洗脱组分中只出现了曲妥珠单抗adc的条带，没有明显的其他蛋白的条带，表明adc可以被特异性捕获并被洗脱下来。[0083]实施例5[0084]对实施例1所得mof@au@dual-ligand偶联rplc-qtofms对加标人血清中的adc进行亚基水平的多属性分析。[0085](1)以实施例1所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗adc加标的人血清中曲妥珠单抗adc的富集：[0086]将人血清用去离子水稀释3倍后，加入曲妥珠单抗的adc标准样品，配置成含有1.0mg/ml曲妥珠单抗的adc加标人血清。取50μlmof@au@dual-ligand溶液，加入200μl上述加标人血清样本，混悬下孵育1h，用淋洗缓冲液(0.01mtris-hcl，ph7.0)洗涤3-5次，再用洗脱缓冲液(0.1％fa,25％acn)洗脱3次，收集所有组分进行sds-page(图10)。洗脱组分中只出现了曲妥珠单抗adc的条带，没有明显的其他蛋白的条带，表明adc可以被特异性捕获并被洗脱下来。[0087](2)以实施例1所得mof@au@dual-ligand对曲妥珠单抗adc加标的人血清中富集到的曲妥珠单抗adc进行亚基水平的多属性分析：[0088]将上述实施例5实验(1)中洗脱得到的adc目标物用tcep在50℃下还原30min,11000rpm离心10min，取上清液进行rplc-qtofms分析。液相条件：流动相a为0.1％fa-h2o，流动相b为0.1％fa-acn；色谱柱watersbioresolvetmrpmabpolyphenyl,2.7μm,2.1×100mmcolumn,1/pk；柱温60℃；进样体积20μl；流速0.3ml/min；流动相梯度为0min,10％b；3min,10％b；4min,30％b；30min,36％b；31min,80％b；31.5min,80％b；32min,10％b；35min,10％b。质谱条件如表1。[0089]表1：adc亚基水平分析的ms参数设置。[0090]table1.msparametersettingofadcbasedonsubmitanalysis.[0091][0092][0093]dar计算公式如下[0094][0095]其中n代表附着的连接子药物个数，lc和hc分别为轻重链的峰面积。由于adc药物的异质性以及所带药物具有疏水性，常用rplc来进行还原水平上dar值研究以及药物在轻重链水平上的分布情况。通过化学降解/还原，会产生6个亚基，分别为轻链不带药(lc0)，轻链带一个药物(lc1)，重链不带药(hc0)，重链带1-3个药(hc1,hc2,hc3)，rplc能够轻松实现对adc各个还原片段的分离，根据反相原理，所带药物越多，保留时间越长。此外，通过质谱联用技术，对各个峰进行鉴定(图11,12)。通过紫外吸收光谱和解卷积质谱计算各峰的峰面积百分比，最终得到adc的加权平均dar。如下表2为材料富集前后还原型adc的dar值比较。[0096]表2：材料富集前后还原型adc的dar值比较[0097]table2.comparisonofdarvaluesofthereducedadcbeforeandaftermaterialenrichment.[0098][0099]theparenthesesrepresentthepercentageofpeakarea.[0100]对比还原水平下的adc标样、加标人血清经材料纯化后组分、空白人血清经材料纯化后组分的rplc图谱(图13)以及dar(表2)可知:mof@au@dual-ligand材料可以有效地从加标人血清中捕获adc，且经过材料吸附-解吸附后，目标物没有发生改变或者引入其他修饰，dar和药物分布相一致；空白血清中洗脱组分的图谱也证明了该材料非特异性吸附较少，对adc的分析的干扰小。因此该材料有对adc实现精准捕获，并分析dar，药物分布等关键质量属性的巨大潜力。当前第1页12当前第1页12