一种诊断高度近视的功能基因组区生物标志物组合的制作方法

1.本发明属于生物医学领域，具体涉及一种诊断高度近视的功能基因组区生物标志物组合。


背景技术：

2.高度近视患者由于眼轴增长，容易发生眼底结构性改变，出现病理性近视，包括后巩膜葡萄肿、近视性黄斑病变、牵拉性黄斑病变和青光眼样视神经病变，高度近视及其并发症已成为一类严重的致盲性眼病。大多患者存在发病年龄逐渐低龄化、发病周期长的特点，早发现、早期干预是疾病治疗的关键。然而，在目前的眼病临床体系中，尚缺乏关键的早期诊疗技术，仍然难以做到早期发现和治疗。因此，开发适用于儿童高度近视早期筛查的体外遗传检测试剂盒，提升相关疾病易感人群的早期干预率，对于降低致盲致残率，提升高度近视预后水平具有重大意义。
3.目前中国人群高度近视遗传检测的试剂盒相关位点主要是从欧美近视人群近视或屈光不正遗传学和基因组学研究的结果中挑选的易感基因，然后对这些基因设计探针，进行芯片杂交检测或者飞行时间质谱技术进行检测。但是，欧美人群研究数据的来源主要是位点密度稀疏的芯片数据，大部分位点位于没有功能报道的基因间区；而且，来自于欧美人群近视的易感基因，对中国人群适用性差；近视和高度近视的遗传易感机制有巨大差异，近视易感基因不能代表高度近视易感基因。另外还有少数试剂盒是从中国小家系研究中得到的致病基因，家系研究得到的候选基因多是罕见变异，对高度近视人群的代表性差。


技术实现要素：

4.为解决以上技术问题，本发明针对中国人群的高度近视在遗传和发生发展机制方面进行了基于中国高度近视人群的万人队列研究。根据全外显子测序研究结果，获得的突变位点多位于功能基因上，对高度近视人群的代表性和解释性更强，保证风险预测效果。
5.本发明根据全外显子测序数据进行关联分析、筛选p值最显著的88个位点，并进行两个独立队列的易感风险预测，结果表明这些位点能显著有效地区分出正常人群和高度近视人群。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.本发明第一方面提供了一组高度近视易感snp位点组合及其在筛查高度近视易感人群的产品中的应用，所述snp位点组合选自以下snp位点中的至少9个，具体地，9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88(即全部)：
8.rs9513522rs11554776rs72500812rs79483116rs302982rs210162rs2302767rs2071391rs28362580rs11150813
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9.在一个具体实施方式中，所述筛查高度近视易感人群可以是诊断当下受试者是否是高度近视人群，所述筛查高度近视易感人群还可以是预测受试者未来发展成为高度近视的概率(即高度近视的发生风险)。
10.如本发明具体实施例中所验证的，将以上第1-80个snp位点组合即可在两组验证队列中都获得0.7以上的auc值，即体现了以上第1-80个snp位点组合在区分高度近视人群和对照人群中的效果。
11.在一个具体实施方式中，所述snp位点组合是以下全部snp位点的组合：
12.rs9513522rs11554776rs72500812rs79483116rs302982rs210162rs2302767rs2071391rs28362580rs11150813rs1614887rs12363226rs533280354rs35730227rs3797026rs4907588rs72839911rs2806034rs6007500rs2292663rs72633372rs79423227rs2244930rs2074888rs909530rs11553951rs7100474rs72780891rs75057869rs57041981rs3785790rs2234075rs3758526rs75372916rs8177371rs555754rs139186286rs11732887rs3138141rs17051276rs1211939020:2291164:ag:ars17740607rs143175221rs11114581rs76994934rs11544072rs17138865rs1288159678rs16898116rs17883958rs113652806rs10947600rs3806263rs552017077rs191479100rs556216016rs185358392rs74887188rs149264410rs3814205rs148823241rs767763626rs192039756rs7156201rs116672033rs181691910rs80155214rs372216878rs373634470rs537819778rs142367919rs63750114rs201045148rs60185525rs200364229rs116585138rs201556819rs193008240rs777399434
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13.本发明所述“snp”、“snp位点”即本领域技术人员所公知的含义，指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性，在群体中的发生频率不小于1％，包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失等。本发明的snp位点以“rs
‑”
方式命名，本领域技术人员能够根据上文的rs-命名，从适合的数据库和相关的信息系统如单核苷酸多态性数据库(dbsnp)中确定其确切的位置、核苷酸序列。
14.更具体地，本发明提供了检测所述snp位点组合的试剂、根据所述snp位点组合检测结果计算高度近视的发生风险的装置在制备高度近视遗传检测产品(早期筛查高度近视易感人群)中的用途。
15.更具体地，所述检测snp位点组合的试剂是收集来自受试者的样本后，对所述样品进行snp检测的试剂；
16.更具体地，所述snp位点组合检测结果是指的对来自受试者样品进行snp检测(分型)所得到的结果。
17.本发明另一方面还提供了一种高度近视遗传检测的系统，所述系统包括根据所述snp位点组合检测结果计算高度近视的发生风险的计算装置。
18.在一个具体实施方式中，所述系统包括：
19.1)储存装置：用于储存患者在前述snp位点组合上的测序结果；
20.2)计算装置：根据所述snp位点组合检测结果计算高度近视的发生风险；
21.3)发生风险获取装置：用于获取所述计算装置的计算结果，得到高度近视的发生风险。
22.所述计算可以是手动地、自动地、或它们组合地来执行或完成所选任务；可以根据检测结果手动计算结果，或输入计算机自动地得到计算结果。
23.本发明另一方面还提供了一种高度近视遗传检测的试剂盒，所述试剂盒包括检测前述snp位点组合的试剂。
24.更具体地，所述检测snp位点即检测snp位点的分型的步骤，根据分型检测结果即可判断其是否为风险基因型，对所有snp位点检测后，即可根据结果判断该受试者的高度近视发生风险。
25.在一些实施方案中，所述试剂盒中具体地可以包括引物、探针、芯片、试纸、凝胶等。
26.在一个优选的实施方式中，所述检测前述snp位点组合的试剂包括但不限于以下方法检测snp位点时所使用的试剂：taqman探针法、测序法、芯片法、飞行质谱仪(maldi-tofms)检测、限制性片段长度多态性法(pcr-rflp)、单链构象多态性法(pcr-sscp)、等位基因特异性pcr(as-pcr)、snapshot法、snplex分型系统、snpstream分析系统、sequenom分型系统、变性高效液相色谱法(dhplc)、变性梯度凝胶电泳法(dgge)。本领域技术人员可选择任一种或几种方法来检测snp位点，只要可以实现snp位点的检测。
27.更具体地，所述试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。本发明的试剂盒
通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。
28.本发明另一方面还提供了一种高度近视遗传检测的方法，所述方法包括根据受试者在前述snp位点组合上的检测结果判断其当下的高度近视患病情况、或预测其未来患高度近视的风险概率。
29.本发明具有以下有益效果：
30.本发明提供的snp标志物是一种新型基因生物标志物，稳定、微创、易于检测，在早期就可检出结果，提升高度近视易感人群的早期干预率，对于降低致盲致残率，提升高度近视预后水平具有重大意义。
附图说明
31.图1是对发现队列进行关联分析的结果图。
32.图2是88个位点组合时的受试者工作曲线图。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
34.实施例1、全外显子测序及变异位点筛选
35.实验方法：万例高度近视人群和万例对照人群。对2万例人进行口腔拭子采样，遗传物质dna提取，进行全外显子测序，平均测序深度为111.2x。
36.实验结果：
37.1)对测序数据进行质控、比对和变异检测，共检测到3386821变异位点(不包括遗传杂合度高的hla区域)。
38.2)将2万人随机分成三个独立的队列，如下表：
39.独立队列高度近视人群对照人群发现队列62336098验证队列1(cohort1)29963627验证队列2(cohort2)6231650样本总数985211375
40.3)对发现队列进行关联分析，找出在高度近视人群和对照人群频率差异大的变异位点，如图1。
41.4)去除位置上强连锁的位点后选取在发现队列关联分析结果中最显著的88个位点，进行多基因风险评分(polygenic risk score，prs)，检验这些位点组合对验证队列的区分效果。88个位点及其在发现队列关联分析的p值如下表：
42.43.[0044][0045]
对88个位点单独计算区分高度近视人群和对照人群的预测效果如下(按人数相对多的cohort1的区分效果排序)：
[0046]
[0047]
[0048][0049]
对88个位点组合计算区分高度近视人群和对照人群的预测效果如下：
[0050]
[0051]
[0052][0053]
对两个独立验证队列所有88个位点组合时的受试者工作曲线(roc)，分析auc值、敏感性和特异性，如图2。
[0054]
发现队列筛选的最显著的88个位点对两个独立验证队列的高度近视的表型诊断显示出较高的效能，其中cohort1和cohort2的auc分别达到0.70和0.73。敏感性(真阳性率)和特异性(1-假阳性率)分别为0.604和0.702。
[0055]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。