植物生长促进剂的制造方法、植物生长促进剂及植物生长促进方法与流程

1.本公开涉及作为有助于植物生长增进的天然代谢产物的植物生长促进剂的制造方法、植物生长促进剂及植物生长促进方法。


背景技术：

2.随着伴随世界人口增加的对粮食增产的要求，要求用于在有限的耕地中高效地生产农作物的技术开发。另外，从防止地球变暖和降低环境负荷的观点出发，面向脱化石资源的生物来源的原料的利用增加。其中，期望充分利用制造过程中的化石能源的消耗量少且在施用中环境负荷少的天然来源的物质。
3.例如，作为充分利用了天然来源的物质的作物生产的增进方法，公开了将产生参与植物的生长促进的物质(以下也称为植物生长促进物质)的微生物或微生物的培养液等接种于植物的方法(专利文献1、2和非专利文献1)。另外，例如还公开了将有机酸等天然代谢产物添加到土壤中、将土壤中的金属离子螯合而提高植物对金属离子的利用性的方法(专利文献3)。另外，例如还公开了将含有作为天然代谢产物的腺苷的组合物应用于植物的方法(专利文献4)、以及将含有藻类的细胞提取物的肥料向植物施肥的方法(专利文献5)。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：日本特开2018-11600号公报
7.专利文献2：日本特表昭63-501286号公报
8.专利文献3：日本特开2014-073993号公报
9.专利文献4：日本专利第5943844号公报
10.专利文献5：日本专利第3143872号公报
11.非专利文献
12.非专利文献1：jimenez-gomezetal.,“probioticactivitiesofrhizobiumlaguerreaeongrowthandqualityofspinach”,scientificreports,2018,vol.8,295


技术实现要素：

13.发明所要解决的课题
14.然而，在上述现有技术中，由微生物进行的植物生长促进物质的产生、或植物生长促进物质的纯化或提取等工艺复杂且费力，成本也高。另外，在上述现有技术中，在对植物生长促进物质进行纯化和提取时，会发生该植物生长促进物质的收率降低或活性降低等损失。另一方面，在将微生物本身接种于植物的情况下，根据所使用的微生物种类、作为对象的植物种类、土壤的性质的组合的不同，其效果也不同，因此缺乏通用性，促进植物生长的效果不稳定。
15.因此，本公开提供一种能够简便且高效地制造植物生长促进效果提高了的植物生长促进剂的植物生长促进剂的制造方法。另外，本公开还提供能够有效地促进植物生长的植物生长促进剂、以及使用了该植物生长促进剂的植物生长促进方法。
16.用于解决课题的手段
17.本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法包含：准备修饰蓝细菌的步骤，所述修饰蓝细菌的在蓝细菌中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失；和使所述修饰蓝细菌分泌参与植物的生长促进的分泌物的步骤。
18.发明效果
19.根据本公开的植物生长促进剂的制造方法，能够简便且高效地制造植物生长促进效果提高了的植物生长促进剂。另外，根据本公开的植物生长促进剂，能够有效地促进植物的生长。另外，根据本公开的植物生长促进方法，通过使用本公开的植物生长促进剂，能够有效地促进植物的生长。
附图说明
20.图1是表示实施方式的植物生长促进剂的制造方法的一例的流程图。
21.图2是示意性地示出了蓝细菌的细胞表层的图。
22.图3是实施例1的修饰蓝细菌的超薄切片的透射型电子显微镜观察图像。
23.图4是图3的虚线区域a的放大图像。
24.图5是实施例2的修饰蓝细菌的超薄切片的透射型电子显微镜图像。
25.图6是图5的虚线区域b的放大图像。
26.图7是比较例1的修饰蓝细菌的超薄切片的透射型电子显微镜图像。
27.图8是图7的虚线区域c的放大图像。
28.图9是表示实施例1、实施例2及比较例1的修饰蓝细菌在培养上清液中的蛋白量(n＝3、误差条＝sd)的图表。
29.图10是表示菠菜栽培试验的结果的图。
30.图11是表示矮牵牛花(petunia)栽培试验的结果的图。
31.图12是表示番茄栽培试验的结果的图。
32.图13是表示番茄栽培试验的结果的图。
33.图14是表示草莓栽培试验的结果的图。
34.图15是表示草莓栽培试验的结果的图。
35.图16是表示草莓栽培试验的结果的图。
36.图17是表示莴苣(lettuce)水培栽培试验的结果的图。
37.图18是表示莴苣水培栽培试验的结果的图。
具体实施方式
38.(作为本公开的基础的见解)
39.如背景技术中所述，要求用于在有限的耕地中高效地生产农作物的技术。另外，为了促进作物生产，在施用中要求充分利用环境负荷少的天然来源的物质。其中，期望有在制造该物质时化石能源的消耗量少、进而环境负荷少的物质。
heterologous prot eins in cyanobacteria”,scientific reports,nature research,2014,vol.4,a rticle no.4500)。
50.例如，在上述非专利文献2所记载的技术中，能够在蓝细菌中实现异种基因的高效表达。如果使用该技术，则能够在蓝细菌的细胞内(以下也称为菌体内)产生所希望的蛋白。但是，由于在蓝细菌的细胞内产生的蛋白不易被分泌到细胞外，因此需要将蓝细菌的细胞破碎来提取在细胞内产生的蛋白。
51.因此，本发明者们发现，通过使被覆蓝细菌的细胞壁的外膜部分地从细胞壁脱离，在蓝细菌的菌体内产生的蛋白和菌体内代谢产物变得容易分泌到菌体外。此外，本发明者们还发现，蓝细菌的分泌物具有植物的生长促进效果。由此，能够在不将蓝细菌的菌体破碎的情况下，高效地回收被分泌到菌体外的植物生长促进物质。另外，由于不需要提取等操作，植物生长促进物质的生理活性不易受损，因此通过含有该分泌物的植物生长促进剂，能够有效地促进植物的生长。
52.因此，根据本公开的植物生长促进剂的制造方法，能够简便且高效地制造植物生长促进效果提高了的植物生长促进剂。另外，根据本公开的植物生长促进剂，能够有效地促进植物的生长。另外，根据本公开的植物生长促进方法，通过使用本公开的植物生长促进剂，能够有效地促进植物的生长。
53.(本公开的概要)
54.本公开的一个方式的概要如下。
55.本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法包含：准备修饰蓝细菌的步骤，所述修饰蓝细菌的在蓝细菌中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失；以及使所述修饰蓝细菌分泌参与植物的生长促进的分泌物的步骤。
56.由此，在修饰蓝细菌中，细胞壁与外膜的结合(例如结合量和结合力) 部分地降低，因此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。因此，在菌体内产生的蛋白及代谢产物(以下也称为菌体内产生物质)变得容易漏出到外膜之外、即菌体外。由此，在修饰蓝细菌的菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易分泌到菌体外，因此不需要例如将菌体破碎等菌体内产生物质的提取处理。因此，能够简便且高效地制造含有修饰蓝细菌的分泌物的植物生长促进剂。另外，由于不需要上述的菌体内产生物质的提取处理，因此不易引起菌体内产生物质的生理活性降低和收率降低。因此，也不易引起修饰蓝细菌的菌体内产生物质中参与植物的生长促进的物质(以下也称为植物生长促进物质)的生理活性降低和收率降低。由此，修饰蓝细菌的分泌物的参与植物的生长促进的效果(以下也称为植物生长促进效果)提高。另外，由于不需要上述的菌体内产生物质的提取处理，因此在回收了被分泌到菌体外的菌体内产生物质后，还能够反复使用修饰蓝细菌，使其产生菌体内产生物质。因此，不需要在每次制造植物生长促进剂时准备新的修饰蓝细菌。因此，根据本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法，能够简便且高效地制造植物生长促进效果提高了的植物生长促进剂。
57.例如，本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法中，所述参与外膜与细胞壁的结合的蛋白可以是slh(surface layer homology，表层同源性)结构域保持型外膜蛋白和细胞壁-丙酮酸修饰酶中的至少1个。
58.由此，在修饰蓝细菌中，例如(i)与细胞壁结合的slh结构域保持型外膜蛋白及催化对细胞壁表面的结合糖链进行丙酮酸修饰的反应的酶(即细胞壁-丙酮酸修饰酶)中的至
少1个的功能受到抑制或丧失，或者(ii)s lh结构域保持型外膜蛋白和细胞壁-丙酮酸修饰酶中的至少1个的表达受到抑制。因此，外膜中的slh结构域保持型外膜蛋白的slh结构域与细胞壁表面的共价键型的糖链的结合(即结合量和结合力)降低。由此，在外膜与细胞壁的结合变弱的部分处，外膜变得容易从细胞壁脱离。其结果，修饰蓝细菌中，外膜与细胞壁的结合降低，由此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离，因此如上所述在菌体内产生的蛋白及代谢产物等菌体内产生物质变得容易漏出到菌体外。由此，修饰蓝细菌的将在菌体内产生的植物生长促进物质分泌到菌体外的分泌生产率提高。因此，根据本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法，能够使该修饰蓝细菌高效地分泌植物生长促进物质，因此能够高效地制造植物生长促进剂。
59.例如，在本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法中，所述sl h结构域保持型外膜蛋白可以是由序列号1所示的氨基酸序列构成的slr18 41、由序列号2所示的氨基酸序列构成的nies970_09470、由序列号3所示的氨基酸序列构成的anacy_3458、或者氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个的slh结构域保持型外膜蛋白相同的蛋白。
60.由此，在修饰蓝细菌中，例如(i)上述序列号1～3所示的任一个的s lh结构域保持型外膜蛋白或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个的s lh结构域保持型外膜蛋白相同的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii) 上述序列号1～3所示的任一个的slh结构域保持型外膜蛋白或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个的slh结构域保持型外膜蛋白相同的蛋白的表达受到抑制。因此，在修饰蓝细菌中，(i)外膜中的slh结构域保持型外膜蛋白或与slh结构域保持型外膜蛋白具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii)外膜中的slh结构域保持型外膜蛋白或与slh结构域保持型外膜蛋白具有同等功能的蛋白的表达量降低。其结果，修饰蓝细菌中，由于外膜用于与细胞壁结合的结合结构域(例如slh结构域)与细胞壁结合的结合量和结合力降低，因此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。由此，菌体内产生物质变得容易漏出到菌体外，因此菌体内产生的植物生长促进物质也变得容易漏出到菌体外。因此，根据本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法，在修饰蓝细菌的菌体内产生的植物生长促进物质变得容易被分泌到菌体外，因此能够高效地制造植物生长促进剂。
61.例如，在本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法中，所述细胞壁-丙酮酸修饰酶可以是由序列号4所示的氨基酸序列构成的slr0688、由序列号5所示的氨基酸序列构成的synpcc7942_1529、由序列号6所示的氨基酸序列构成的anacy_1623、或者氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个的细胞壁-丙酮酸修饰酶相同的蛋白。
62.由此，在修饰蓝细菌中，例如(i)上述序列号4～6所示的任一个的细胞壁-丙酮酸修饰酶或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个的细胞壁
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丙酮酸修饰酶相同的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii)上述序列号4～ 6所示的任一个的细胞壁-丙酮酸修饰酶或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个的细胞壁-丙酮酸修饰酶相同的蛋白的表达受到抑制。因此，修饰蓝细菌中，(i)细胞壁-丙酮酸修饰酶或与该酶具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii)细胞壁-丙酮酸修饰酶或与该酶具有同等功能的蛋白的表达量降低。由此，细胞壁表面的共价键型的糖链变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁的糖链与外膜中的slh结构域保持型外膜蛋白的slh 结构域结合的结合量和结合力降低。其结果，修饰蓝细菌中，细胞壁表面的共价键型的糖链变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁与外膜的
结合力减弱、外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。由此，菌体内产生物质变得容易漏出到菌体外，因此菌体内产生的植物生长促进物质也变得容易漏出到菌体外。因此，根据本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法，在修饰蓝细菌的菌体内产生的植物生长促进物质变得容易被分泌到菌体外，因此能够高效地制造植物生长促进剂。
63.例如，在本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法中，表达所述参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的基因可以缺失或失活。
64.由此，修饰蓝细菌中，参与细胞壁与外膜的结合的蛋白的表达受到抑制，或者该蛋白的功能受到抑制或丧失，因此细胞壁与外膜的结合(即结合量和结合力)部分地降低。其结果，修饰蓝细菌中，外膜变得容易从细胞壁部分地脱离，因此在菌体内产生的蛋白及代谢产物等菌体内产生物质变得容易漏出到外膜之外、即菌体外。因此，修饰蓝细菌在菌体内产生的植物生长促进物质的分泌生产率提高。由此，不需要将菌体破碎等菌体内产生物质的提取处理，因此不易引起菌体内产生物质的生理活性降低和收率降低。因此，在菌体内产生的植物生长促进物质的生理活性降低和收率降低也变得不易发生，因此能够制造植物生长促进效果提高了的植物生长促进剂。另外，由于不需要上述的菌体内产生物质的提取处理，因此在回收了该物质后，还能够反复使用修饰蓝细菌来产生植物生长促进物质。因此，不需要在每次制造植物生长促进剂时准备新的修饰蓝细菌。因此，根据本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法，能够简便且高效地制造植物生长促进效果提高了的植物生长促进剂。
65.例如，在本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法中，表达所述参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的基因可以是编码slh结构域保持型外膜蛋白的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的基因中的至少1个。
66.由此，修饰蓝细菌中，编码slh结构域保持型外膜蛋白的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的基因中的至少1个基因缺失或失活。因此，修饰蓝细菌中，例如(i)slh结构域保持型外膜蛋白和细胞壁-丙酮酸修饰酶中的至少1个的表达受到抑制，或者(ii)slh结构域保持型外膜蛋白和细胞壁
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丙酮酸修饰酶中的至少1个的功能受到抑制或丧失。因此，外膜中的slh 结构域保持型外膜蛋白的slh结构域与细胞壁表面的共价键型的糖链的结合(即结合量和结合力)降低。由此，在外膜与细胞壁的结合变弱的部分处，外膜变得容易从细胞壁脱离。其结果，修饰蓝细菌中，外膜与细胞壁的结合降低，由此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离，因此在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外。由此，在菌体内产生的植物生长促进物质也变得容易漏出到菌体外。因此，根据本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法，能够使该修饰蓝细菌高效地分泌植物生长促进物质，因此能够高效地制造植物生长促进剂。
67.例如，在本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法中，编码所述slh结构域保持型外膜蛋白的基因可以是由序列号7所示的碱基序列构成的slr1841、由序列号8所示的碱基序列构成的nies970_09470、由序列号 9所示的碱基序列构成的anacy_3458、或者碱基序列的50％以上与这些中的任一个基因相同的基因。
68.由此，修饰蓝细菌中，上述序列号7～9所示的任一个的编码slh结构域保持型外膜蛋白的基因或与这些中的任一个基因的碱基序列的50％以上相同的基因缺失或失活。因此，修饰蓝细菌中，(i)上述中的任一个的sl h结构域保持型外膜蛋白或与这些中的任一个
蛋白具有同等功能的蛋白的表达受到抑制，或者(ii)上述中的任一个的slh结构域保持型外膜蛋白或与这些中的任一个蛋白具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失。其结果，修饰蓝细菌中，由于外膜用于与细胞壁结合的结合结构域(例如sl h结构域)的用于与细胞壁结合的结合量和结合力降低，因此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。由此，在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物生长促进物质也变得容易漏出到菌体外。因此，根据本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法，在修饰蓝细菌的菌体内产生的植物生长促进物质变得容易漏出到菌体外，因此能够高效地制造植物生长促进剂。
69.例如，在本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法中，编码所述细胞壁-丙酮酸修饰酶的基因可以是由序列号10所示的碱基序列构成的s lr0688、由序列号11所示的碱基序列构成的synpcc7942_1529、由序列号1 2所示的碱基序列构成的anacy_1623、或者碱基序列的50％以上与这些中的任一个基因相同的基因。
70.由此，修饰蓝细菌中，上述序列号10～12所示的任一个的编码细胞壁
ꢀ‑
丙酮酸修饰酶的基因或与这些中的任一个的编码酶的基因的碱基序列的5 0％以上相同的基因缺失或失活。因此，修饰蓝细菌中，(i)上述任一个的细胞壁-丙酮酸修饰酶或与这些中的任一个酶具有同等功能的蛋白的表达受到抑制，或者(ii)上述任一个的细胞壁-丙酮酸修饰酶或与这些中的任一个酶具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失。由此，细胞壁表面的共价键型的糖链变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁的糖链与外膜中的slh结构域保持型外膜蛋白的slh结构域结合的结合量和结合力降低。其结果，修饰蓝细菌中，细胞壁用于与外膜结合的糖链被丙酮酸修饰的量减少，因此细胞壁与外膜的结合力减弱，外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。由此，在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物生长促进物质也变得容易漏出到菌体外。因此，根据本公开的一个方式的植物生长促进剂的制造方法，在修饰蓝细菌的菌体内产生的植物生长促进物质变得容易漏出到菌体外，因此能够高效地制造植物生长促进剂。
71.另外，本公开的一个方式的植物生长促进剂包含在蓝细菌中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失的修饰蓝细菌的分泌物。
72.由此，修饰蓝细菌中，细胞壁与外膜的结合(即结合量和结合力)部分地降低，因此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。因此，修饰蓝细菌中，在菌体内产生的蛋白及代谢产物(即菌体内产生物质)变得容易露出到外膜之外(即菌体之外)。由此，在修饰蓝细菌的菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易分泌到菌体外，因此不需要例如将菌体破碎等菌体内产生物质的提取处理。因此，能够简便且高效地制造含有修饰蓝细菌的分泌物的植物生长促进剂。另外，由于不需要上述的菌体内产生物质的提取处理，因此变得不易引起菌体内产生物质的生理活性降低和收率降低。因此，也不易引起修饰蓝细菌的菌体内产生物质中参与植物的生长促进的物质(以下也称为植物生长促进物质)的生理活性降低和收率降低。由此，能够得到植物生长促进效果提高了的植物生长促进剂。因此，本公开的一个方式的植物生长促进剂能够有效地促进植物的生长。
73.另外，本公开的一个方式的植物生长促进方法使用上述的植物生长促进剂。
74.根据本公开的一个方式的植物生长促进方法，由于使用植物生长促进效果提高了的植物生长促进剂，因此能够有效地促进植物的生长。
75.以下，参照附图对实施方式具体地进行说明。
76.需要说明的是，以下说明的实施方式均表示总括性的或具体的例子。在以下的实施方式中示出的数值、材料、步骤、步骤的顺序等是一个例子，并不是为了限定本公开。另外，关于以下实施方式中的构成要素中的在表示最上位概念的独立权利要求中没有记载的构成要素，作为任意的构成要素进行说明。
77.另外，各图不一定是严格地进行图示的图。在各图中，对实质上相同的构成标注相同的附图标记，有时省略或简化重复的说明。
78.另外，下文中，数值范围并不是仅表示严格意义，还包括实质上同等的范围，例如对蛋白的量(例如数或浓度等)或其范围进行测量等。
79.另外，在本说明书中，菌体和细胞均表示1个蓝细菌的个体。
80.(实施方式)
81.本说明书中，碱基序列和氨基酸序列的同源性通过blast(basic lo cal alignment search tool，基于局部比对算法的搜索工具)算法来计算。具体而言，通过用在ncbi(national center for biotechnology information，美国国立生物技术信息中心)(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)的网页中可利用的blast程序进行成对(pair-wise)分析来计算。关于蓝细菌的基因及该基因所编码的蛋白的信息例如在上述ncbi数据库及cyanobase (http：//genome.microbedb.jp/cyanobase/)中有公开。可以从这些数据库中获得目标蛋白的氨基酸序列和编码这些蛋白的基因的碱基序列。
82.[1.植物生长促进剂]
[0083]
首先，对本实施方式的植物生长促进剂进行说明。植物生长促进剂含有参与植物的生长促进的分泌物，具有植物生长促进效果，例如使植物的叶、茎、花蕾、花、或果实的数量增加，使茎或干变粗，使高度伸长的效果。另外，例如植物生长促进剂也可以具有与植物的生长促进相关的各种效果，例如植物的疾病发生的预防、养分的吸收率的提高、或植物的细胞内生理活性的提高等效果。即，参与植物的生长促进是指具有植物生长促进效果，植物生长促进效果也可以包括通过与上述的植物生长促进相关的各种效果来促进植物生长的效果。由此，植物生长促进剂促进植物的生长，增加植物的产量。
[0084]
在本实施方式中，植物生长促进剂含有在蓝细菌(以下也称为亲本蓝细菌)中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失的修饰蓝细菌的分泌物。其中，关于蓝细菌(即亲本蓝细菌)及修饰蓝细菌在后文叙述。
[0085]
如上所述，该分泌物包含参与植物的生长促进的分泌物。该分泌物包含在修饰蓝细菌的菌体内产生的蛋白及代谢产物(即菌体内产生物质)。该菌体内产生物质中包含参与植物的生长促进的物质(以下也称为植物生长促进物质)。
[0086]
植物生长促进物质例如为肽酶、核酸酶、或磷酸酶等有机物分解酶、腺苷或鸟苷等dna代谢相关物质、对氨基苯甲酸或亚精胺等参与核酸(例如dna或rna)合成促进的细胞内分子、3-羟基丁酸等酮体、或葡萄糖酸等有机酸。修饰蓝细菌的分泌物可以是这些植物生长促进物质的混合物。
[0087]
[2.植物生长促进剂的制备方法]
[0088]
接着，参照图1对本实施方式的植物生长促进剂的制造方法进行说明。图1是表示本实施方式的植物生长促进剂的制造方法的一例的流程图。
[0089]
本实施方式的植物生长促进剂的制造方法包含：准备修饰蓝细菌的步骤(步骤s01)，所述修饰蓝细菌的在蓝细菌(即亲本蓝细菌)中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失；以及使所述修饰蓝细菌分泌参与植物的生长促进的分泌物的步骤(步骤s02)。如上所述，修饰蓝细菌的分泌物包含在修饰蓝细菌的菌体内产生的蛋白及代谢产物(即菌体内产生物质)。这些菌体内产生物质包含参与植物的生长促进的物质(即植物生长促进物质)。
[0090]
在步骤s01中，准备上述修饰蓝细菌。准备修饰蓝细菌是指将修饰蓝细菌的状态调整为修饰蓝细菌能够分泌分泌物的状态。准备修饰蓝细菌是指，例如可以通过对亲本蓝细菌进行基因修饰来制作修饰蓝细菌，也可以从修饰蓝细菌的冻结干燥体或甘油菌中复原菌体，也可以在步骤s02中回收结束了分泌植物生长促进物质的修饰蓝细菌。
[0091]
在步骤s02中，使修饰蓝细菌分泌参与植物的生长促进的分泌物。本实施方式中的修饰蓝细菌的在蓝细菌(即亲本蓝细菌)中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失，因此在菌体内产生的蛋白及代谢产物容易被分泌到外膜之外(即菌体外)。这些菌体内产生物质中也包含参与植物的生长促进的物质。因此，在步骤s02中，通过在规定的条件下培养修饰蓝细菌，参与植物的生长促进的菌体内产生物质被分泌到菌体外。
[0092]
蓝细菌的培养一般可以基于使用了bg-11培养基(参照表2)的液体培养或其变法来实施。因此，修饰蓝细菌的培养也可以同样地实施。另外，作为用于制造植物生长促进剂的蓝细菌的培养期间，只要是在菌体充分增殖的条件下蛋白和代谢产物能够以高浓度蓄积的期间即可，例如可以为1～ 3天，也可以为4～7天。另外，培养方法例如可以是通气搅拌培养或振荡培养。
[0093]
通过在上述条件下进行培养，修饰蓝细菌在菌体内产生蛋白及代谢产物(即菌体内产生物质)，将该菌体内产生物质分泌到培养液中。该菌体内产生物质包含参与植物的生长促进的菌体内产生物质(即植物生长促进物质)。在回收被分泌到培养液中的菌体内产生物质物质的情况下，也可以通过对培养液进行过滤或离心分离等，从培养液中除去细胞(即菌体)等固体成分来回收培养上清液。根据本实施方式的植物生长促进剂的制造方法，由于含有参与植物的生长促进的菌体内产生物质(即植物生长促进物质) 的分泌物被分泌到修饰蓝细菌的细胞外，因此不需要为了回收植物生长促进物质而将细胞破碎。因此，能够反复使用在植物生长促进物质回收后残留的修饰蓝细菌，进行植物生长促进剂的制造。
[0094]
另外，被分泌到培养液中的植物生长促进物质的回收方法并不限于上述的例子，也可以一边培养修饰蓝细菌，一边回收培养液中的植物生长促进物质。例如，也可以通过使用使蛋白透过的透过膜来回收从透过膜透过的植物成长促进物质。如此，由于能够一边培养修饰蓝细菌一边回收培养液中的植物生长促进物质，因此不需要从培养液中除去修饰蓝细菌的菌体的处理。因此，能够更简便且高效地制造植物生长促进剂。
[0095]
另外，通过不需要从培养液中回收菌体的处理和菌体的破碎处理，能够降低修饰蓝细菌受到的损伤和应力。因此，修饰蓝细菌的植物生长促进物质的分泌生产率不易降低，能够更长时间地使用修饰蓝细菌。
[0096]
如上所述，通过使用本实施方式中的修饰蓝细菌，能够简便且高效地得到植物生长促进剂。
[0097]
以下，对蓝细菌和修饰蓝细菌进行说明。
[0098]
[3.蓝细菌]
[0099]
蓝细菌也被称为蓝藻或蓝色细菌，是通过叶绿素捕集光能，用得到的能量将水电解而产生氧，同时进行光合作用的原核生物的一组。蓝细菌富有多样性，例如在细胞形状方面，有集胞藻(synechocystis sp.)pcc 680 3那样的单细胞性的种类和鱼腥藻(anabaena sp.)pcc 7120那样的多细胞相连而成的丝状性的种类。在生长环境方面，也有细长嗜热聚球藻(thermosynechococcus elongatus)那样的嗜热性的种类、细长聚球藻(synecho coccus elongatus)那样的海洋性的种类、集胞藻属(synechocystis)那样的淡水性的种类。另外，还可举出许多如铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa) 那样具有气体囊泡并产生毒素的种类、以及不具有类囊体而在细胞膜中具有被称为聚光天线即藻胆体的蛋白的类囊体蓝藻(gloeobacter violaceus) 那样具有独自的特征的种类。
[0100]
图2是示意性地示出了蓝细菌的细胞表层的图。如图2所示，蓝细菌的细胞表层从内侧起依次由细胞膜(也称为内膜1)、肽聚糖2、以及形成细胞最外层的脂质膜即外膜5构成。在肽聚糖2上共价键合有由葡糖胺和甘露糖胺等构成的糖链3，并且在这些共价键型的糖链3上键合有丙酮酸(非专利文献3：jurgens and weckesser，1986，j.bacteriol.，168：568-573)。在本说明书中，将包括肽聚糖2和共价键型的糖链3在内地称为细胞壁4。另外，细胞膜(即内膜1)与外膜5之间的间隙存在被称为胞外质(peripla sm)、参与蛋白的分解或立体结构的形成、脂质或核酸的分解、或者细胞外的营养素的摄入等的各种酶。
[0101]
slh结构域保持型外膜蛋白(例如图中的slr1841)由埋入到脂质膜(也称为外膜5)中的c末端侧区域和从脂质膜突出的n末端侧的slh结构域 7构成，并广泛地分布于属于作为蓝细菌和革兰氏阴性细菌的一组的厚壁菌 (negativicutes)纲的细菌中(非专利文献4：kojima et al.，2016，biosci. biotech.biochem.，10：1954-1959)。埋入到脂质膜(即外膜5)中的区域形成用于使亲水性物质能够透过外膜的通道，另一方面，slh结构域7具有与细胞壁4结合的功能(非专利文献5：kowata et al.，2017，j.bacter iol.，199：e00371-17)。为了使slh结构域7与细胞壁4结合，需要用丙酮酸修饰肽聚糖2中的共价键型的糖链3(非专利文献6：kojima et al.，2 016，j.biol.chem.，291：20198-20209)。作为编码slh结构域保持型外膜蛋白6的基因的例子，可举出集胞藻pcc 6803所保持的slr1841或slr19 08、或鱼腥藻90所保持的oprb等。
[0102]
催化肽聚糖2中的共价键型的糖链3的丙酮酸修饰反应的酶(以下称为细胞壁-丙酮酸修饰酶9)是在属于革兰氏阳性菌的炭疽杆菌(bacillus a nthracis)中鉴定出的，被命名为csab(非专利文献7：mesnage et al.，20 00，embo j.，19：4473-4484)。在公开了基因组碱基序列的蓝细菌中，多数种类保持有编码与csab的氨基酸序列的同源性为30％以上的同源蛋白的基因。作为例子，可举出集胞藻pcc 6803所保持的slr0688或聚球藻(s ynechococcus sp.)7502所保持的syn7502_03092等。
[0103]
在蓝细菌中，通过光合作用固定的co2经过多阶段的酶反应而被转换为各种氨基酸和细胞内分子的前体。将它们作为原料，在蓝细菌的细胞质内合成蛋白和代谢产物。在这些蛋白及代谢产物中，既存在在细胞质内发挥功能的蛋白及代谢产物，也存在从细胞质被输送至胞外质而在胞外质内发挥功能的蛋白及代谢产物。但是，迄今为止在蓝细菌中尚没有报告过将蛋白及代谢产物主动分泌到细胞外的情况。
[0104]
由于蓝细菌具有较高的光合作用能力，因此作为营养成分不一定需要从外部摄入
有机物。因此，蓝细菌在外膜5仅具有非常微少的如图2的有机物通道蛋白8(例如slr1270)那样使有机物透过的通道蛋白。例如，在集胞藻pcc 6803中，使有机物透过的有机物通道蛋白8仅存在外膜5的总蛋白量的约4％。另一方面，为了高效地将生长所需的无机离子类摄入到细胞内，蓝细菌在外膜5中具有大量如图2的slh结构域保持型外膜蛋白6 (例如slr1841)那样仅使无机离子类透过的离子通道蛋白。例如，在集胞藻pcc 6803中，使无机离子透过的离子通道蛋白占外膜5的总蛋白量的约 80％。
[0105]
如此，认为在蓝细菌中，由于外膜5中的使蛋白等有机物透过的通道非常少，因此难以将在菌体内产生的蛋白及代谢产物主动地分泌到菌体外。
[0106]
[4.修饰蓝细菌]
[0107]
接着，参照图2对本实施方式中的修饰蓝细菌进行说明。
[0108]
本实施方式中的修饰蓝细菌的在蓝细菌中参与外膜5与细胞壁4的结合的蛋白(以下也称为结合相关蛋白)的功能受到抑制或丧失。由此，在修饰蓝细菌中，由于外膜5与细胞壁4的结合(例如结合量和结合力)部分地降低，因此外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离。因此，修饰蓝细菌将在菌体内产生的蛋白及代谢产物分泌到菌体外的菌体内产生物质的分泌生产率提高。如上所述，菌体内产生物质中包含参与植物的生长促进的菌体内产生物质(即植物生长促进物质)。因此，修饰蓝细菌将在菌体内产生的植物生长促进物质分泌到菌体外的植物生长促进物质的分泌生产率提高。另外，由于不需要将菌体破碎来回收植物生长促进物质，因此在回收植物生长促进物质后，还能够反复使用修饰蓝细菌。需要说明的是，在本说明书中，将修饰蓝细菌在菌体内产生蛋白及代谢物的情况称为产生，将所产生的蛋白及代谢物分泌到菌体外的情况称为分泌生产。
[0109]
参与外膜5与细胞壁4的结合的蛋白例如可以是slh结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1个。在本实施方式中，修饰蓝细菌的例如slh结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1个蛋白的功能受到抑制或丧失。例如，修饰蓝细菌中，可以是(i)s lh结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1个的功能受到抑制或丧失，也可以是(ii)与细胞壁4结合的slh结构域保持型外膜蛋白6的表达、以及催化细胞壁4的表面的结合糖链的丙酮酸修饰反应的酶(即细胞壁-丙酮酸修饰酶9)的表达中的至少1个受到抑制。由此，外膜5中的slh结构域保持型外膜蛋白6的slh结构域7与细胞壁4的表面的共价键型的糖链3的结合(即结合量和结合力)降低。因此，在这些结合变弱的部分处，外膜5变得容易从细胞壁4脱离。通过外膜5从细胞壁4部分地脱离，修饰蓝细菌的细胞内、特别是存在于胞外质中的蛋白及代谢产物等菌体内产生物质变得容易漏出到细胞之外(外膜5之外)。由此，修饰蓝细菌将在菌体内产生的植物生长促进物质分泌到菌体外的分泌生产率提高。
[0110]
以下，对因slh结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1个结合相关蛋白的功能受到抑制而被修饰为外膜5部分地从细胞壁4脱离的蓝细菌更具体地进行说明。
[0111]
成为本实施方式中的修饰蓝细菌的亲本微生物的、使slh结构域保持型外膜蛋白6的表达和细胞壁-丙酮酸修饰酶9的表达中的至少1个抑制或丧失之前的蓝细菌(即亲本蓝细菌)的种类没有特别限制，可以是任意种类的蓝细菌。例如，亲本蓝细菌可以是集胞藻(synechocystis)属、聚球藻 (synechococcus)属、鱼腥藻(anabaena)属或嗜热聚球藻
(thermosynechococcus)属，其中，可以是集胞藻(synechocystis sp.)pcc 6803、聚球藻(synechococcus sp.)pcc 7942或嗜热聚球藻(thermosynechococcus e longatus)bp-1。
[0112]
这些亲本蓝细菌中的slh结构域保持型外膜蛋白6和催化细胞壁-丙酮酸修饰反应的酶(即细胞壁-丙酮酸修饰酶9)的氨基酸序列、编码这些结合相关蛋白的基因的碱基序列、以及该基因在染色体dna或质粒上的位置可以通过上述的ncbi数据库和cyanobase来确认。
[0113]
需要说明的是，本实施方式的修饰蓝细菌中功能受到抑制或丧失的sl h结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9只要是亲本蓝细菌所保有的，则可以是任意的亲本蓝细菌的蛋白或酶，不受编码它们的基因的存在部位(例如染色体dna上或质粒上)的限制。
[0114]
例如，slh结构域保持型外膜蛋白6在亲本蓝细菌为集胞藻(synecho cystis)属的情况下，可以是slr1841、slr1908、或slr0042等，在亲本蓝细菌为聚球藻(synechococcus)属的情况下，可以是nies970_09470等，在亲本蓝细菌为鱼腥藻(anabaena)属的情况下，可以是anacy_5815或ana cy_3458等，在亲本蓝细菌为微囊藻(microcystis)属的情况下，可以是a 0a0f6u6f8_micae等，在亲本蓝细菌为蓝丝菌(cyanothece)属的情况下，可以是a0a3b8xx12_9cyan等，在亲本蓝细菌为瘦鞘丝藻(leptolyngby a)属的情况下，可以是a0a1q8ze23_9cyan等，在亲本蓝细菌为眉藻(c alothrix)属的情况下，可举出a0a1z4r6u0_9cyan，在亲本蓝细菌为念珠藻(nostoc)属的情况下，可以是a0a1c0vg86_9noso等，在亲本蓝细菌为固氮蓝藻(crocosphaera)属的情况下，可以是b1wrn6_cros5等，在亲本蓝细菌为宽球藻(pleurocapsa)属的情况下，可以是k9tae4_9cya n等。
[0115]
更具体而言，slh结构域保持型外膜蛋白6可以是例如集胞藻pcc 6 803的slr1841(序列号1)、聚球藻nies-970的nies970_09470(序列号2)、柱孢鱼腥蓝细菌(anabaena cylindrica)pcc 7122的anacy_3458(序列号 3)等。另外，也可以是氨基酸序列的50％以上与这些slh结构域保持型外膜蛋白6相同的蛋白。
[0116]
由此，修饰蓝细菌中，例如可以是(i)上述序列号1～3所示的任一个 slh结构域保持型外膜蛋白6或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个 slh结构域保持型外膜蛋白6相同的蛋白的功能受到抑制或丧失，也可以是(ii)上述序列号1～3所示的任一个slh结构域保持型外膜蛋白6或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个slh结构域保持型外膜蛋白6相同的蛋白的表达受到抑制。因此，修饰蓝细菌中，(i)外膜5中的slh结构域保持型外膜蛋白6或与slh结构域保持型外膜蛋白6具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii)外膜5中的slh结构域保持型外膜蛋白6或与slh结构域保持型外膜蛋白6具有同等功能的蛋白的表达量降低。其结果，修饰蓝细菌中，外膜5用于与细胞壁4结合的结合结构域(例如slh结构域7)与细胞壁4结合的结合量和结合力降低，因此外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离。由此，修饰蓝细菌中，由于菌体内产生物质变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物生长促进物质也变得容易漏出到菌体外。
[0117]
通常认为，如果蛋白的氨基酸序列的30％以上相同，则蛋白的立体结构的同源性高，因此与该蛋白具有同等功能的可能性高。因此，作为功能受到抑制或丧失的slh结构域保持型外膜蛋白6，例如可以是由与上述序列号1～3所示的slh结构域保持型外膜蛋白6中的任一个的氨基酸序列具有40％以上、优选50％以上、更优选60％以上、进一步优选70％以
上、更进一步优选80％以上、再进一步优选90％以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有与细胞壁4的共价键型的糖链3结合的功能的蛋白或多肽。
[0118]
另外，例如细胞壁-丙酮酸修饰酶9在亲本蓝细菌为集胞藻(synechoc ystis)属的情况下，可以是slr0688等，在亲本蓝细菌为聚球藻(synechoc occus)属的情况下，可以是syn7502_03092或synpcc7942_1529等，在亲本蓝细菌为鱼腥藻(anabaena)属的情况下，可以是ana_c20348或ana cy_1623等，在亲本蓝细菌为微囊藻(microcystis)属的情况下，可以是cs ab(ncbi的登录id：tru80220)等，在亲本蓝细菌为蓝丝菌(cyanothe ce)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：wp_107667006.1)等，在亲本蓝细菌为螺旋藻(spirulina)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：wp_026079530.1)等，在亲本蓝细菌为眉藻(calothrix)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：wp_096658142.1)等，在亲本蓝细菌为念珠藻(nostoc)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：wp_09 9068528.1)等，在亲本蓝细菌为固氮蓝藻(crocosphaera)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：wp_012361697.1)等，在亲本蓝细菌为宽球藻(pleurocapsa)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：wp_0367 98735)等。
[0119]
更具体而言，细胞壁-丙酮酸修饰酶9例如可以是集胞藻pcc 6803的slr0688(序列号4)、聚球藻pcc 7942的synpcc7942_1529(序列号5)、或柱孢鱼腥蓝细菌(anabaena cylindrica)pcc 7122的anacy_1623(序列号6)等。另外，也可以是氨基酸序列的50％以上与这些细胞壁-丙酮酸修饰酶9相同的蛋白。
[0120]
由此，修饰蓝细菌中，例如可以是(i)上述序列号4～6所示的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶9或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个细胞壁
ꢀ‑
丙酮酸修饰酶9相同的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者也可以是(ii)上述序列号4～6所示的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶9或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶9相同的蛋白的表达受到抑制。因此，修饰蓝细菌中，(i)细胞壁-丙酮酸修饰酶9或与该酶具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii)细胞壁-丙酮酸修饰酶9或与该酶具有同等功能的蛋白的表达量降低。由此，细胞壁4的表面的共价键型的糖链3变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁4的糖链3与外膜5中的slh 结构域保持型外膜蛋白6的slh结构域7结合的结合量和结合力降低。因此，在本实施方式的修饰蓝细菌中，由于细胞壁4的表面的共价键型的糖链3变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁4与外膜5的结合力减弱，外膜5 变得容易从细胞壁4部分地脱离。由此，在修饰蓝细菌中，由于菌体内产生物质变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物生长促进物质也变得容易漏出到菌体外。
[0121]
另外，如上所述，认为如果蛋白的氨基酸序列的30％以上相同，则与该蛋白具有同等功能的可能性高。因此，作为功能受到抑制或丧失的细胞壁-丙酮酸修饰酶9，例如可以是由与上述序列号4～6所示的细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的任一个的氨基酸序列具有40％以上、优选50％以上、更优选60％以上、进一步优选70％以上、更进一步优选80％以上、再进一步优选90％以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有催化用丙酮酸修饰细胞壁 4的肽聚糖2的共价键型的糖链3的反应的功能的蛋白或多肽。
[0122]
另外，在本说明书中，使slh结构域保持型外膜蛋白6的功能受到抑制或丧失是指使该蛋白与细胞壁4的结合能力受到抑制或丧失、使该蛋白向外膜5的输送受到抑制或丧失、或者使该蛋白嵌入外膜5而发挥功能的能力受到抑制或丧失。
[0123]
需要说明的是，使细胞壁-丙酮酸修饰酶9的功能受到抑制或丧失是指使该蛋白的用丙酮酸修饰细胞壁4的共价键型的糖链3的功能受到抑制或丧失。
[0124]
作为使这些蛋白的功能受到抑制或丧失的手段，只要是通常用于蛋白的功能的抑制或丧失的手段，就没有特别限定。该手段例如可以是使编码s lh结构域保持型外膜蛋白6的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因缺失或失活、抑制这些基因的转录、抑制这些基因的转录产物的翻译、或给予特异性地抑制这些蛋白的抑制剂等。
[0125]
在本实施方式中，修饰蓝细菌通过外膜5与细胞壁4的结合，在修饰蓝细菌中，由于参与细胞壁4与外膜5的结合的蛋白的表达受到抑制，或者该蛋白的功能受到抑制或丧失，因此细胞壁4与外膜5的结合(即结合量和结合力)部分地降低。其结果，修饰蓝细菌中，外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离，因此修饰蓝细菌在菌体内产生的蛋白及代谢产物等菌体内产生物质变得容易漏出到外膜5之外，即菌体外。因此，修饰蓝细菌将在菌体内产生的植物生长促进物质分泌到菌体外的植物生长促进物质的分泌生产率提高。由此，由于不需要将菌体破碎等菌体内产生物质的提取处理，因此不易引起菌体内产生物质的生理活性降低和收率降低。因此，由于也不易引起在菌体内产生的植物生长促进物质的生理活性降低和收率，因此能够制造植物生长促进效果提高了的植物生长促进剂。另外，由于不需要上述的菌体内产生物质的提取处理，因此在回收了该物质后，还能够反复使用修饰蓝细菌、使其产生植物生长促进物质。
[0126]
使参与外膜5与细胞壁4的结合的蛋白表达的基因例如可以是编码sl h结构域保持型外膜蛋白6的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因中的至少1个。修饰蓝细菌中，编码slh结构域保持型外膜蛋白6的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因中的至少1个基因缺失或失活。因此，修饰蓝细菌中，例如(i)slh结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1个的表达受到抑制，或者(ii)slh结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1个的功能受到抑制或丧失。因此，外膜5中的slh结构域保持型外膜蛋白6的slh结构域7与细胞壁4的表面的共价键型的糖链3的结合(即结合量和结合力)降低。由此，在外膜5 与细胞壁4的结合变弱的部分处，外膜5变得容易从细胞壁4脱离。其结果，修饰蓝细菌中，由于外膜5与细胞壁4的结合降低，外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离，因此在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外。由此，修饰蓝细菌在菌体内产生的植物生长促进物质也变得容易漏出到菌体外。
[0127]
在本实施方式中，为了使蓝细菌中的slh结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1个的功能受到抑制或丧失，例如可以使编码slh结构域保持型外膜蛋白6的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因中的至少1个的转录受到抑制。
[0128]
例如，编码slh结构域保持型外膜蛋白6的基因在亲本蓝细菌为集胞藻(synechocystis)属的情况下，可以是slr1841、slr1908或slr0042等，在亲本蓝细菌为聚球藻(synechococcus)属的情况下，可以是nies970_09470 等，在亲本蓝细菌为鱼腥藻(anabaena)属的情况下，可以是anacy_5815 或anacy_3458等，在亲本蓝细菌为微囊藻(microcystis)属的情况下，可以是a0a0f6u6f8_micae等，在亲本蓝细菌为蓝丝菌(cyanothece)属的情况下，可以是a0a3b8xx12_9cyan等，在亲本蓝细菌为瘦鞘丝藻(le ptolyngbya)属的情况下，可以是a0a1q8ze23_9cyan等，在亲本蓝细菌为眉藻(calothrix)属的情况下，可以是a0a1z4r6u0_9cyan等，在亲本蓝细菌为念珠藻(nostoc)属的情况下，可
以是a0a1c0vg86_9noso 等，在亲本蓝细菌为固氮蓝藻(crocosphaera)属的情况下，可以是b1wr n6_cros5等，在亲本蓝细菌为宽球藻(pleurocapsa)属的情况下，可以是k9tae4_9cyan等。这些基因的碱基序列可以从上述的ncbi数据库或 cyanobase获得。
[0129]
更具体而言，编码slh结构域保持型外膜蛋白6的基因可以是集胞藻 pcc 6803的slr1841(序列号7)、聚球藻nies-970的nies970_09470(序列号8)、柱孢鱼腥蓝细菌(anabaena cylindrica)pcc 7122的anacy_3458 (序列号9)、或者氨基酸序列的50％以上与这些基因相同的基因。
[0130]
由此，修饰蓝细菌中，编码上述序列号7～9所示的任一个slh结构域保持型外膜蛋白6的基因或与这些中的任一个基因的碱基序列的50％以上相同的基因缺失或失活。因此，修饰蓝细菌中，(i)上述任一个slh结构域保持型外膜蛋白6或与这些中的任一个蛋白具有同等功能的蛋白的表达受到抑制，或者(ii)上述任一个slh结构域保持型外膜蛋白6或与这些中的任一个蛋白具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失。其结果，修饰蓝细菌中，外膜5用于与细胞壁4结合的结合结构域(例如slh结构域 7)与细胞壁4结合的结合量和结合力降低，因此外膜5变得容易从细胞壁 4部分地脱离。由此，在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物生长促进物质也变得容易漏出到菌体外。
[0131]
如上所述，认为如果蛋白的氨基酸序列的30％以上相同，则与该蛋白具有同等功能的可能性高。因此，认为如果编码蛋白的基因的碱基序列的3 0％以上相同，则表达与该蛋白具有同等功能的蛋白的可能性高。因此，作为功能受到抑制或丧失的编码slh结构域保持型外膜蛋白6的基因，例如可以是由与上述序列号7～9所示的编码slh结构域保持型外膜蛋白6的基因中的任一个的碱基序列具有40％以上、优选50％以上、更优选60％以上、进一步优选70％以上、更进一步优选80％以上、再进一步优选90％以上的同源性的碱基序列构成、且编码具有与细胞壁4的共价键型的糖链3结合的功能的蛋白或多肽的基因。
[0132]
另外，例如编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因在亲本蓝细菌为集胞藻 (synechocystis)属的情况下，可以是slr0688等，在亲本蓝细菌为聚球藻 (synechococcus)属的情况下，可以是syn7502_03092或synpcc7942_1529 等，在亲本蓝细菌为鱼腥藻(anabaena)属的情况下，可以是ana_c20348 或anacy_1623等，在亲本蓝细菌为微囊藻(microcystis)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：tru80220)等，在亲本蓝细菌为蓝丝菌(c yanothece)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：wp_107667006.1) 等，在亲本蓝细菌为螺旋藻(spirulina)属的情况下，可以是csab(ncbi 的登录id：wp_026079530.1)等，在亲本蓝细菌为眉藻(calothrix)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：wp_096658142.1)等，在亲本蓝细菌为念珠藻(nostoc)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：wp _099068528.1)等，在亲本蓝细菌为固氮蓝藻(crocosphaera)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：wp_012361697.1)等，在亲本蓝细菌为宽球藻(pleurocapsa)属的情况下，可以是csab(ncbi的登录id：wp_036 798735)等。这些基因的碱基序列可以从上述的ncbi数据库或cyanobase 获得。
[0133]
更具体而言，编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因可以是集胞藻pcc 6 803的slr0688(序列号10)、聚球藻pcc 7942的synpcc 7942_1529(序列号11)、或柱孢鱼腥蓝细菌(anabaena cylindrica)pcc 7122的anacy_162 3(序列号12)。另外，也可以是碱基序列的
50％以上与这些基因相同的基因。
[0134]
由此，修饰蓝细菌中，上述序列号10～12所示的任一个的编码细胞壁
ꢀ‑
丙酮酸修饰酶9的基因或与编码这些中的任一个酶的基因的碱基序列的50％以上相同的基因缺失或失活。因此，修饰蓝细菌中，(i)上述任一个的细胞壁-丙酮酸修饰酶9或与这些中的任一个酶具有同等功能的蛋白的表达受到抑制，或者(ii)上述任一个的细胞壁-丙酮酸修饰酶9或与这些中的任一个酶具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失。由此，细胞壁4的表面的共价键型的糖链3变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁4的糖链3与外膜5 中的slh结构域保持型外膜蛋白6的slh结构域7结合的结合量和结合力降低。因此，在本实施方式的修饰蓝细菌中，细胞壁4用于与外膜5结合的糖链3被丙酮酸修饰的量减少，因此细胞壁4与外膜5的结合力减弱，外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离。由此，在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物生长促进物质也变得容易漏出到菌体外
[0135]
如上所述，认为如果编码蛋白的基因的碱基序列的30％以上相同，则表达与该蛋白具有同等功能的蛋白的可能性高。因此，作为功能受到抑制或丧失的编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因，例如可以是由与上述序列号 10～12所示的编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因中的任一个的碱基序列具有40％以上、优选50％以上、更优选60％以上、进一步优选70％以上、更进一步优选80％以上、再进一步优选90％以上的同源性的碱基序列构成，且编码具有催化用丙酮酸修饰细胞壁4的肽聚糖2的共价键型的糖链3的反应的功能的蛋白或多肽的基因。
[0136]
[5.修饰蓝细菌的制造方法]
[0137]
接着，对本实施方式中的修饰蓝细菌的制造方法进行说明。修饰蓝细菌的制造方法包含使在蓝细菌中参与外膜5与细胞壁4的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失的步骤。
[0138]
在本实施方式中，参与外膜5与细胞壁4的结合的蛋白例如可以是slh结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1个。
[0139]
需要说明的是，作为使蛋白的功能受到抑制或丧失的手段，没有特别限定，例如可以是使编码slh结构域保持型外膜蛋白6的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因缺失或失活、抑制这些基因的转录、抑制这些基因的转录产物的翻译、或给予特异性地抑制这些蛋白的抑制剂等。
[0140]
使上述基因缺失或失活的手段例如可以是针对该基因的碱基序列上的 1个以上碱基的突变的导入、针对该碱基序列的向其他碱基序列的替换或其他碱基序列的插入、或者该基因的碱基序列的一部分或全部的删除等。
[0141]
抑制上述基因的转录的手段例如可以是针对该基因的启动子区域的突变导入、向其他碱基序列的替换或其他碱基序列的插入所导致的该启动子的失活、或crispr干扰法(非专利文献8：yao et al.，acs synth.biol.， 2016，5：207-212)等。上述突变导入、或碱基序列的替换或插入的具体方法例如可以是紫外线照射、部位特异性突变导入、或同源重组法等。
[0142]
另外，抑制上述基因的转录产物的翻译的手段例如可以是rna(核糖核酸)干扰法等。
[0143]
通过使用以上的任一手段，可以使蓝细菌中的参与外膜5与细胞壁4 的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失，从而制造修饰蓝细菌。
[0144]
由此，通过上述的制造方法制造的修饰蓝细菌的细胞壁4与外膜5的结合(即结合量和结合力)部分地降低，因此外膜5变得容易从细胞壁4 部分地脱离。其结果，修饰蓝细菌中，在菌体内产生的蛋白及代谢产物等菌体内产生物质变得容易漏出到外膜5之外(即菌体之外)，因此参与植物的生长促进的物质(即植物生长促进物质)也变得容易漏出到菌体外。因此，根据本实施方式的修饰蓝细菌的制造方法，能够提供植物生长促进物质的分泌生产率提高了的修饰蓝细菌。
[0145]
另外，在通过本实施方式的制造方法制造的修饰蓝细菌中，在菌体内产生的植物生长促进物质漏出到菌体外，因此不需要为了回收该物质而将菌体破碎。例如，只要在适当的条件下培养修饰蓝细菌，接着回收被分泌到培养液中的植物生长促进物质即可，因此还能够一边培养修饰蓝细菌一边回收培养液中的植物生长促进物质。因此，如果使用通过本制造方法得到的修饰蓝细菌，则能够实施高效的微生物学上的植物生长促进物质的生产。因此，根据本实施方式的修饰蓝细菌的制造方法，能够提供在回收植物生长促进物质后还能够重复使用的利用效率高的修饰蓝细菌。
[0146]
[6.植物生长促进方法]
[0147]
本实施方式的植物生长促进方法使用上述的植物生长促进剂。如上所述，本实施方式的植物生长促进剂是植物生长促进效果提高了的植物生长促进剂，因此通过使用上述的植物生长促进剂，能够有效地促进植物的生长。
[0148]
上述的植物生长促进剂当然可以直接使用、浓缩或稀释后使用。在将该植物生长促进剂应用于植物时，也可以根据植物的种类、土壤的性质以及目的等，适当地确定植物生长促进剂的浓度以及应用方法。植物生长促进剂例如可以是修饰蓝细菌的培养液本身，也可以是从该培养液中除去了修饰蓝细菌的菌体的溶液，也可以是通过膜技术等从该培养液中提取所希望的物质而得到的提取物。所期望的物质可以是分解土壤中的养分的酶，也可以是使土壤中的不溶物质(例如铁等金属)变为可溶的物质(例如具有螯合效果的物质)，也可以是提高植物的细胞内生理活性的物质。另外，植物生长促进剂对植物的应用方法例如可以是对植物或土壤进行喷雾、灌溉或混合等。更具体而言，可以每1个体植物体数毫升、每周1次左右地添加到植物体的根部。
[0149]
实施例
[0150]
以下，用实施例对本公开的修饰蓝细菌、修饰蓝细菌的制造方法以及植物生长促进剂的制造方法具体地进行说明，但本公开并不仅仅限定于以下的实施例。
[0151]
在以下的实施例中，作为使蓝细菌的外膜从细胞壁部分地脱离的方法，进行编码slh结构域保持型外膜蛋白的slr1841基因的表达抑制(实施例1)、以及编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的slr0688基因的表达抑制(实施例2)，制造2种修饰蓝细菌。然后，进行这些修饰蓝细菌的蛋白的分泌生产率的测定和所分泌的菌体内产生物质(在此为蛋白及细胞内代谢产物)的鉴定。其中，本实施例中使用的蓝细菌种类为集胞藻pcc 6803(以下简称为“蓝细菌”)。
[0152]
(实施例1)
[0153]
在实施例1中，制造了编码slh结构域保持型外膜蛋白的slr1841基因的表达受到抑制的修饰蓝细菌。
[0154]
(1)slr1841基因的表达受到抑制的蓝细菌修饰株的构建
[0155]
作为基因表达抑制法，使用了crispr(clustered regularly interspace d short palindromic repeat，规律间隔的短回文重复序列)干扰法。在本方法中，通过将编码dcas9蛋白的基因(以下称为dcas9基因)和slr1841_sgrna(single-guide ribonucleic acid，单导核糖核酸)基因导入到蓝细菌的染色体dna中，能够抑制slr1841基因的表达。
[0156]
由本方法进行的基因表达抑制的机制如下所述。
[0157]
首先，核酸酶活性缺陷的cas9蛋白(dcas9)和与slr1841基因的碱基序列互补结合的sgrna(slr1841_sgrna)形成复合物。
[0158]
接着，该复合物识别蓝细菌的染色体dna上的slr1841基因，与slr18 41基因特异性地结合。由于该结合成为空间位阻，因此slr1841基因的转录受到抑制。其结果，蓝细菌的slr1841基因的表达受到抑制。
[0159]
以下，对将上述2个基因分别导入蓝细菌的染色体dna的方法具体地进行说明。
[0160]
(1-1)dcas9基因的导入
[0161]
以集胞藻(synechocystis)ly07株(以下也称为ly07株)(参照非专利文献8)的染色体dna为模板，使用表1中记载的引物psba1-fw(序列号13)和psba1-rv(序列号14)通过pcr(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)法对dcas9基因和用于控制dcas9基因的表达的操纵基因、以及成为基因导入的标记的大观霉素抗性标记基因进行扩增。其中，ly07 株中，上述3个基因以连接的状态插入到染色体dna上的psba1基因中，因此可以作为1个dna片段通过pcr法进行扩增。在此，将得到的dna 片段记为“psba1：：dcas9盒”。使用in-fusion pcr克隆法(注册商标)，将 psba1：：dcas9盒插入到puc19质粒中，得到puc19-dcas9质粒。
[0162]
表1
[0163]
引物名碱基序列序列号psba1-fw5
′‑
cagtgaattcgagctcggtatatagcgttgcagtccctgg-3
′
13psba1-rv5
′‑
gattacgccaagcttgcatgaccgcggtcacttcataacc-3
′
14slr2030-fw5
′‑
cagtgaattcgagctcggtaataaccgttgtcccttttgtttcatcg-3
′
15sgrna_slr1841-rv5
′‑
tgttagtgagccctgctgttagctcccagtatctctatcactgat-3
′
16sgrna_slr1841-fw5
′‑
acagcagggctcactaacagttttagagctagaaatagcaagttaaaataa-3
′
17slr2031-rv5
′‑
gattacgccaagcttgcatggggaacaagctgaatctgggcatc-3
′
18sgrna_slr0688-rv5
′‑
ttttagtctgtttgctgcatagctcccagtatctctatcactgat-3
′
19sgrna_slr0688-fw5
′‑
tgcagcaaacagactaaaagttttagagctagaaatagcaagttaaaataa-3
′
20
[0164]
将得到的puc19-dcas9质粒1μg与蓝细菌培养液(菌体浓度od730＝ 0.5左右)混合，通过自然转化将puc19-dcas9质粒导入到蓝细菌的细胞内。通过使转化后的细胞在含有20μg/ml的大观霉素的bg-11琼脂培养基上生长来进行筛选。在所筛选的细胞中，染色体dna上的psba1基因与puc1 9-dcas9质粒上的psba1上游片段区域和psba1下游片段区域之间发生同源重组。由此，得到在psba1基因区域插入有dcas9盒的集胞藻dcas9株。其中，所使用的bg-11培养基的组成如表2所示。
[0165]
表2
[0166]
成分含量(mg/l)edta-na1柠檬酸铁铵6nano31500
mgso475k2hpo439cacl228.6h3bo42.8mncl21.8znso40.2cuso40.08na2moo40.02co(no3)20.005tes-koh(ph 7.5)4580
[0167]
(1-2)slr1841_sgrna基因的导入
[0168]
在crispr干扰法中，通过向sgrna基因上的被称为前间隔序列(pr otospacer)的区域导入与靶序列互补的约20个碱基的序列，sgrna与靶基因特异性结合。将本实施例中使用的前间隔序列示于表3。
[0169]
表3
[0170]
前间隔序列靶基因碱基序列序列号slr18415
′‑
acagcagggctcactaaca-3
′
21slr06885
′‑
tgcagcaaacagactaaaa-3
′
22
[0171]
集胞藻ly07株中，sgrna基因(前间隔序列区域除外)与卡那霉素抗性标记基因以连接的形式插入到染色体dna上的slr2030-slr2031基因中。因此，通过对利用pcr法扩增该sgrna基因时使用的引物赋予与slr1841 基因(序列号7)互补的前间隔序列(序列号21)，能够容易地得到特异性识别slr1841的sgrna(slr1841_sgrna)。
[0172]
首先，以ly07株的染色体dna为模板，使用表1中记载的引物slr2 030-fw(序列号15)和sgrna_slr1841-rv(序列号16)的组、以及sgrna_slr1841-fw(序列号17)和slr2031-rv(序列号18)的组，通过pcr法对2个dna片段进行扩增。
[0173]
接着，以上述dna片段的混合溶液为模板，使用表1中记载的引物sl r2030-fw(序列号15)和slr2031-rv(序列号18)通过pcr法进行扩增，由此得到(i)slr2030基因片段、(ii)slr1841_sgrna、(iii)卡那霉素抗性标记基因、(iv)slr2031基因片段依次连接而成的dna片段(slr2030-2031：： slr1841_sgrna)。使用in-fusion pcr克隆法(注册商标)，将slr2030-203 1：：slr1841_sgrna插入到puc19质粒中，得到puc19-slr1841_sgrna质粒。
[0174]
通过与上述(1-1)同样的方法将puc19-slr1841_sgrna质粒导入到集胞藻dcas9株中，在含有30μg/ml卡那霉素的bg-11琼脂培养基上对转化后的细胞进行筛选。由此，得到在染色体dna上的slr2030-slr2031基因中插入有slr1841_sgrna的转化体集胞藻dcas9slr1841_sgrna株(以下也称为slr1841抑制株)。
[0175]
(1-3)slr1841基因的抑制
[0176]
上述dcas9基因和slr1841_sgrna基因的启动子序列被设计为可在无水四环素(atc)的存在下被表达诱导。本实施例中，通过在培养基中添加终浓度为1μg/ml的atc，抑制了slr1841基因的表达。
[0177]
(实施例2)
[0178]
实施例2中，通过下述的步骤，得到编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的slr06 88基因的表达受到抑制的修饰蓝细菌。
[0179]
(2)slr0688基因的表达受到抑制的蓝细菌修饰株的构建
[0180]
通过与上述(1-2)同样的步骤，将包含与slr0688基因(序列号4)互补的前间隔序列(序列号22)的sgrna基因导入到集胞藻dcas9株中，得到集胞藻dcas9slr0688_sgrna株。其中，使用表1中记载的引物slr2030
‑ꢀ
fw(序列号15)和sgrna_slr0688-rv(序列号19)的组、以及sgrna_sl r0688-fw(序列号20)和slr2031-rv(序列号18)的组；和使用in-fusionpcr克隆法(注册商标)将(i)slr2030基因片段、(ii)slr0688_sgrna、 (iii)卡那霉素抗性标记基因、(iv)slr2031基因片段依次连接而成的dn a片段(slr2030-2031：：slr0688_sgrna)插入到puc19质粒中，得到pu c19-slr0688_sgrna质粒，除此以外，在与上述(1-2)同样的条件下进行。
[0181]
进而，通过与上述(1-3)同样的步骤，抑制了slr0688基因的表达。
[0182]
(比较例1)
[0183]
比较例1中，通过与实施例1的(1-1)同样的步骤，得到集胞藻dcas 9株。
[0184]
接着，对于实施例1、实施例2和比较例1中得到的菌株，分别进行细胞表层的状态的观察和蛋白的分泌生产率试验。以下，对详细情况进行说明。
[0185]
(3)菌株细胞表层的状态的观察
[0186]
分别制作实施例1中得到的修饰蓝细菌集胞藻dcas9slr1841_sgrna 株(即slr1841抑制株)、实施例2中得到的修饰蓝细菌集胞藻dcas9slr06 88_sgrna株(以下也称为slr0688抑制株)、以及比较例1中得到的修饰蓝细菌集胞藻dcas9株(以下称为对照株)的超薄切片，使用电子显微镜观察细胞表层的状态(换言之，外膜结构)。
[0187]
(3-1)菌株的培养
[0188]
以初始菌体浓度od730＝0.05的方式，将实施例1的slr1841抑制株接种于含有1μg/ml atc的bg-11培养基，在光量为100μmol/m2/s、30℃的条件下振荡培养5天。另外，实施例2的slr0688抑制株和比较例1的对照株也在与实施例1同样的条件下进行培养。
[0189]
(3-2)菌株的超薄切片的制作
[0190]
将上述(3-1)中得到的培养液在室温下以2,500g离心分离10分钟，回收实施例1的slr1841抑制株的细胞。接着，将细胞用-175℃的液体丙烷急速冷冻后，使用含有2％戊二醛和1％单宁酸的乙醇溶液在-80℃下固定2 天。利用乙醇对固定后的细胞进行脱水处理，使脱水后的细胞浸透到氧化丙烯中后，沉入树脂(quetol-651)溶液中。然后，在60℃下静置48小时，使树脂固化，用树脂将细胞包埋。使用超薄切片机(ultracut)将树脂中的细胞薄切成70nm的厚度，制成超薄切片。使用2％乙酸铀和1％柠檬酸铅溶液对该超薄切片进行染色，准备实施例1的slr1841抑制株的透射型电子显微镜的试样。另外，对于实施例2的slr0688抑制株和比较例1的对照株也分别进行同样的操作，准备透射型电子显微镜的试样。
[0191]
(3-3)利用电子显微镜进行观察
[0192]
使用透射型电子显微镜(jeol jem-1400plus)在100kv的加速电压下进行上述(3-2)中得到的超薄切片的观察。将观察结果示于图3～图8。
[0193]
首先，对实施例1的slr1841抑制株进行说明。图3是实施例1的slr1 841抑制株的tem(transmission electron microscope，透射型电子显微镜) 图像。图4是图3的虚线区
域a的放大图像。图4的(a)是图3的虚线区域a的放大tem图像，图4的(b)是描绘了图4的(a)的放大tem图像的图。
[0194]
如图3所示，在实施例1的slr1841抑制株中，外膜从细胞壁部分地剥离(即外膜部分地剥落)，且外膜部分地弯曲。
[0195]
为了更详细地确认细胞表层的状态，对虚线区域a进行放大观察，结果如图4的(a)和图4的(b)所示，确认到外膜部分地剥落的部分(图中的点划线区域a1和a2)。另外，在点划线区域a1的旁边确认到外膜大幅弯曲的部分。考虑该部分是外膜与细胞壁的结合减弱的部分，由于培养液从外膜浸透到胞外质内，因此外膜向外侧膨胀而弯曲。
[0196]
接着，对实施例2的slr0688抑制株进行说明。图5是实施例2的slr0 688抑制株的tem图像。图6是图5的虚线区域b的放大图像。图6的(a) 是图5的虚线区域b的放大tem图像，图6的(b)是描绘了图6的(a) 的放大tem图像的图。
[0197]
如图5所示，在实施例2的slr0688抑制株中，外膜从细胞壁部分地剥离，且外膜部分地弯曲。另外，在slr0688抑制株中，确认到外膜部分地从细胞壁脱离。
[0198]
为了更详细地确认细胞表层的状态，对虚线区域b进行放大观察，结果如图6的(a)和图6的(b)所示，确认到外膜大幅弯曲的部分(图中的点划线区域b1)和外膜部分地剥落的部分(图中的点划线区域b2和b3)。另外，在点划线区域b1、b2及b3的附近还分别确认到外膜从细胞壁脱离的部分。
[0199]
接着，对比较例1的对照株进行说明。图7是比较例1的对照株的te m图像。图8是图7的虚线区域c的放大图像。图8的(a)是图7的虚线区域c的放大tem图像，图8的(b)是描绘了图8的(a)的放大tem 图像的图。
[0200]
如图7所示，比较例1的对照株的细胞表层整齐，保持了依次层叠有内膜、细胞壁、外膜和s层的状态。即，在对照株中，没有发现如实施例1 和2那样外膜从细胞壁脱离的部分、外膜从细胞壁剥离(即剥落)的部分、以及外膜弯曲的部分。
[0201]
(4)蛋白的分泌生产率试验
[0202]
分别对实施例1的slr1841抑制株、实施例2的slr0688抑制株和比较例1的对照株进行培养，测定被分泌到细胞外的蛋白量(以下也称为分泌蛋白量)。根据培养液中的蛋白量，分别评价上述菌株的蛋白的分泌生产率。其中，蛋白的分泌生产率是指通过将在细胞内产生的蛋白分泌到细胞外来生产蛋白的能力。以下，对具体的方法进行说明。
[0203]
(4-1)菌株的培养
[0204]
用与上述(3-1)同样的方法培养实施例1的slr1841抑制株。培养独立地进行3次。另外，对于实施例2和比较例1的菌株，也在与实施例1的菌株同样的条件下进行培养。
[0205]
(4-2)分泌到细胞外的蛋白的定量
[0206]
将上述(4-1)中得到的培养液在室温下以2,500g离心分离10分钟，得到培养上清液。使用孔径为0.22μm的膜过滤器对得到的培养上清液进行过滤，完全除去实施例1的slr1841抑制株的细胞。通过bca(bicinchoni nic acid，二喹啉甲酸)法对过滤后的培养上清液中所含的总蛋白量进行定量。对独立培养得到的3个培养液分别进行这一系列操作，求出实施例1 的slr1841抑制株分泌到细胞外的蛋白量的平均值和标准偏差。另外，对于实施例2和比较例1的菌株，分别在同样的条件下进行3个培养液的蛋白的定量，求出3个培养液中的蛋白量的平均值和标准偏差。
[0207]
将结果示于图9。图9是表示实施例1、实施例2和比较例1的修饰蓝细菌的培养上清液中的蛋白量(n＝3、误差条＝sd)的图表。
[0208]
如图9所示，实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688抑制株与比较例1的对照株相比，分泌到培养上清液中的蛋白量(mg/l)均提高了约25倍。
[0209]
省略数据的记载，测定培养液的吸光度(730nm)，计算每1g菌体干燥重量的分泌蛋白量(mg蛋白/g菌体干燥重量)，结果实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688抑制株的每1g菌体干燥重量的分泌蛋白量(mg 蛋白/g菌体干燥重量)与比较例1的对照株相比均提高了约36倍。
[0210]
另外，如图9所示，与抑制了编码slh结构域保持型外膜蛋白的基因 (slr1841)的表达的实施例1的slr1841抑制株相比，抑制了编码细胞壁
‑ꢀ
丙酮酸修饰酶的基因(slr0688)的表达的实施例2的slr0688抑制株分泌到培养上清液中的蛋白量更多。考虑这与细胞壁表面的共价键型的糖链的数量比外膜中的slh结构域保持型外膜蛋白(slr1841)的数量多有关。即，考虑实施例2的slr0688抑制株与实施例1的slr1841抑制株相比，外膜与细胞壁的结合量和结合力进一步降低，因此所分泌的蛋白量比实施例1的s lr1841抑制株多。
[0211]
由以上结果确认到，由于抑制了与外膜和细胞壁的结合相关的蛋白的功能，蓝细菌的外膜与细胞壁的结合部分地变弱，外膜从细胞壁部分地脱离。还确认到，由于外膜与细胞壁的结合变弱，在蓝细菌的细胞内产生的蛋白变得容易漏出到细胞外。因此，根据本实施方式的修饰蓝细菌及其制造方法，显示出蛋白的分泌生产率大幅提高。
[0212]
(5)所分泌的蛋白的鉴定
[0213]
接着，通过lc-ms/ms对上述(4-2)中得到的培养上清液中所含的分泌蛋白进行鉴定。以下对方法进行说明。
[0214]
(5-1)试样制备
[0215]
加入相对于培养上清液的液量为8倍量的冷丙酮，在20℃下静置2小时后，在20,000g下离心分离15分钟，得到蛋白的沉淀物。在该沉淀物中加入100mm tris ph为8.5、0.5％十二烷酸钠(sdod)，利用密闭式超声波破碎机使蛋白溶解。调整至蛋白浓度为1μg/ml后，添加终浓度为10mm 的二硫苏糖醇(dtt)，在50℃下静置30分钟。接着，添加终浓度为30m m的碘乙酰胺(iaa)，在室温(遮光)下静置30分钟。为了停止iaa的反应，添加终浓度为60mm的半胱氨酸，在室温下静置10分钟。添加胰蛋白酶400ng，在37℃下静置一晚，将蛋白进行肽片段化。加入5％tfa(tr ifluoroacetic acid，三氟乙酸)后，在室温下以15,000g离心分离10分钟，得到上清液。通过该操作除去sdod。使用c18旋转柱进行脱盐后，利用离心蒸发器使试样干固。然后，加入3％乙腈、0.1％甲酸，使用密闭式超声波破碎机将试样溶解。以肽浓度达到200ng/μl的方式进行制备。
[0216]
(5-2)lc-ms/ms分析
[0217]
使用lc-ms/ms装置(ultimate 3000rslcnano lc system)在以下的条件下对上述(5-1)中得到的试样实施分析。
[0218]
试样注入量：200ng
[0219]
柱：capcell core mp 75μm
×
250mm
[0220]
溶剂：a溶剂为0.1％甲酸水溶液，b溶剂为0.1％甲酸 80％乙腈
[0221]
梯度程序(gradient program)：试样注入4分钟后使b溶剂为8％、27 分钟后使b溶剂为44％、28分钟后使b溶剂为80％、34分钟后测定结束 (5-3)数据分析
[0222]
得到的数据在以下的条件下进行分析，进行蛋白和肽的鉴定以及定量值的计算。
[0223]
软件：scaffold dia
[0224]
数据库：uniprotkb/swiss prot database(集胞藻pcc 6803)
[0225]
破碎(fragmentation)：hcd
[0226]
前体公差(precursor tolerance)：8ppm
[0227]
片段公差(fragment tolerance)：10ppm
[0228]
数据采集类型(data acquisition type)：重叠dia
[0229]
肽长度(peptide length)：8-70
[0230]
肽电荷(peptide charge)：2-8
[0231]
最大漏切数量(max missed cleavages)：1
[0232]
固定修饰(fixed modification)：半胱氨酸碘乙酰胺化(carbamidomet hylation)
[0233]
肽fdr(peptide fdr)：1％以下
[0234]
将从所鉴定的蛋白中相对定量值最大的30种蛋白中预想具有明确的酶活性的蛋白示于表4。
[0235]
表4
[0236] 蛋白名uniprot登录id基因名1羧基末端蛋白酶p73458prc2铁摄入蛋白a2q55835futa23细胞外核酸酶p72938nuch4碱性磷酸酶p72939sll06545n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸酰胺酶p73736amia6脯氨酸-顺反-异构酶p73037ytfc
[0237]
这些6种蛋白全部分别包含在实施例1的slr1841抑制株和实施例2的 slr0688抑制株的培养上清液中。在这些蛋白中全部保持有胞外质(指外膜与内膜的间隙)转移信号。根据该结果确认了，在实施例1和实施例2的修饰株中，外膜从细胞壁部分地脱离，由此胞外质内的蛋白变得容易漏出到外膜之外(即菌体外)。因此，显示出本实施方式的修饰蓝细菌的蛋白的分泌生产率大幅提高。
[0238]
(6)所分泌的细胞内代谢产物的鉴定
[0239]
(6-1)试样制备
[0240]
向修饰蓝细菌的培养上清液80μl中加入将内部标准物质的浓度调整为 1,000μm的20μl的水溶液并搅拌，超滤后，供于测定。
[0241]
(6-2)ce(capillary electrophoresis，毛细管电泳)-tofms(time
‑ꢀ
of-flight mass spectrometry，飞行时间质谱)分析
[0242]
在本试验中，在以下所示的条件下进行阳离子模式和阴离子模式的测定。
[0243]
[阳离子模式]
[0244]
装置：agilent ce-tofms system
[0245]
毛细管：熔融石英毛细管(fused silica capillary)i.d.50μm
×
80cm
[0246]
测量条件：
[0247]
电泳缓冲液(run buffer)：阳离子缓冲液(cation buffer solution) (p/n：h3301-1001)
[0248]
ce电压(ce voltage)：positive，30kv
[0249]
ms电离(ms ionization)：esi positive
[0250]
ms扫描范围(ms scan range)：m/z 50-1,000
[0251]
[阴离子模式]
[0252]
装置：agilent ce-tofms system
[0253]
毛细管：熔融石英毛细管(fused silica capillary)i.d.50μm
×
80cm
[0254]
测量条件：
[0255]
电泳缓冲液(run buffer)：阴离子缓冲液(anion buffer solution) (p/n：h3301-1001)
[0256]
ce电压(ce voltage)：positive，30kv
[0257]
ms电离(ms ionization)：esi negative
[0258]
ms扫描范围(ms scan range)：m/z 50-1,000
[0259]
(6-3)数据处理
[0260]
使用自动积分软件masterhands(注册商标)ver.2.17.1.11，自动检测由 ce-tofms检测到的峰的信噪比为3以上的峰。对于检测出的峰，根据各代谢产物固有的质荷比(m/z)和泳动时间的值，与在hmt(human meta bolome technologies(株式会社))的代谢物质库中登记的全部物质的值进行对照，检索修饰蓝细菌的培养上清液中所含的代谢产物。用于检索的容许误差设为泳动时间为 /-0.5min、m/z为 /-10ppm。关于所鉴定的各代谢产物，进行100μm的单点校准，算出浓度。将鉴定出的主要代谢产物示于表5。
[0261]
表5
[0262]
[0263]
这12种细胞内代谢产物全部包含在实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688抑制株的培养上清液中。虽然没有记载数据，但比较例1的对照株的培养上清液中不包含这些代谢产物。根据该结果确认了，在实施例1和实施例2的修饰株中，外膜从细胞壁部分地脱离，由此细胞内代谢产物变得容易漏出到外膜之外(即菌体外)。
[0264]
(7)植物栽培试验
[0265]
接着，为了评价修饰蓝细菌的分泌物(在此为修饰蓝细菌的培养上清液)的植物生长促进效果，实施了以下的植物栽培试验。具体而言，为了评价对营养生长的效果，实施了菠菜栽培试验。另外，为了评价对生殖生长的效果，实施了矮牵牛花栽培试验。此外，为了评价对结果的植物和水培栽培的植物的生长的效果，进行番茄、草莓、以及莴苣的栽培试验。以下，对这些栽培试验分别进行说明。
[0266]
(7-1)菠菜栽培试验
[0267]
在菠菜栽培试验中，通过以下的实施例3和比较例2～7评价修饰蓝细菌分泌物对植物仅生长茎、叶和根等营养器官的营养生长的植物生长促进效果。
[0268]
首先，在栽培用盆(12cm
×
10cm)中加入市售的培养土，每盆播种3 粒菠菜的种子。栽培在室内温度为23℃、白色光源的光量子通量密度为10 0μmol/m2/s、亮条件为10小时和暗条件为14小时的条件下进行40天。在此期间，每隔1天向各盆供给50ml的蒸馏水。从栽培开始起约1周后，子叶在展开的阶段进行间隔剔除，使各盆中的个体尺寸一致。
[0269]
(实施例3)
[0270]
如上所述，在使各盆的个体尺寸一致后，将修饰蓝细菌的培养上清液 (以下称为修饰蓝细菌的分泌物)每1株5ml、1周1次添加到菠菜的根部。然后，在栽培40天后收获菠菜，测定总叶长和地上部干重。总叶长是将包括叶身和叶柄部在内的长度加上全部叶数长度的值。地上部干重是在露出到地上的叶茎部的干重。需要说明的是，修饰蓝细菌为实施例1的slr1841 抑制株和实施例2的slr0688抑制株，实施例3中使用实施例1和实施例2 的修饰蓝细菌的培养上清液。然后，对栽培40天后的13盆菠菜分别测定总叶长和地上部干重，求出它们的平均值和标准偏差(sd)。
[0271]
(比较例2)
[0272]
除了使用水代替修饰蓝细菌的分泌物以外，与实施例3同样地进行。然后，对栽培40天后的13盆菠菜分别测定总叶长和地上部干重，求出它们的平均值和标准偏差。
[0273]
(比较例3)
[0274]
除了使用蓝细菌用培养基bg-11代替修饰蓝细菌的分泌物以外，与实施例3同样地进行。然后，对栽培40天后的6盆菠菜分别测定总叶长和地上部干重，求出它们的平均值和标准偏差。
[0275]
(比较例4)
[0276]
除了使用亲本蓝细菌(集胞藻pcc6803)的培养上清液代替修饰蓝细菌的分泌物以外，与实施例3同样地进行。然后，对栽培40天后的4盆菠菜分别测定总叶长和地上部干重，求出它们的平均值和标准偏差。
[0277]
(比较例5)
[0278]
使用含有100ppm的根据专利文献5的公开制备的亲本蓝细菌(集胞藻 pcc6803)的细胞提取液(热水提取)的水溶液(以下称为亲本蓝细菌的热水提取物)代替修饰蓝细菌的
分泌物，除此以外，与实施例3同样地进行。然后，对栽培40天后的5盆菠菜分别测定总叶长和地上部干重，求出它们的平均值和标准偏差。
[0279]
(比较例6)
[0280]
使用化肥(含有氮总量为6％、水溶性磷酸为10％、水溶性钾为5％、水溶性氧化镁为0.05％、水溶性锰为0.001％、水溶性硼为0.005％的原液的500倍稀释液)代替修饰蓝细菌的分泌物，除此以外，与实施例3同样地进行。然后，对栽培40天后的6盆菠菜分别测定总叶长和地上部干重，求出它们的平均值和标准偏差。
[0281]
(比较例7)
[0282]
使用有机肥料(副产动物质肥料，其是含有植物发酵产物的原液的50 0倍稀释液)代替修饰蓝细菌的分泌物，除此以外，与实施例3同样地进行。然后，对栽培40天后的6盆菠菜分别测定总叶长和地上部干重，求出它们的平均值和标准偏差。
[0283]
(结果)
[0284]
将实施例3和比较例2～7的结果示于图10。图10是表示菠菜栽培试验的结果的图。
[0285]
图10所示的总叶长和地上部干重量是将比较例2(图中的添加成分为水)中得到的菠菜的总叶长和地上部干重的数值(平均值 /-sd)分别标准化为1而得到的值。另外，在图10中，为了在视觉上显示叶的附着方式和茎的粗细等生长状态的差异，分别记载了实施例3和比较例2～7的代表性的个体的照片。
[0286]
(1)首先，对总叶长的结果进行说明。
[0287]
与比较例2(水)的总叶长为同等的个体是比较例3(蓝细菌用培养基) 和比较例6(化肥)的个体。
[0288]
低于比较例2(水)的总叶长的个体是比较例4(亲本蓝细菌的培养液) 和比较例7(有机肥料)的个体。
[0289]
高于比较例2(水)的总叶长的个体是比较例5(亲本蓝细菌的热水提取物)和实施例3(修饰蓝细菌的分泌物)的个体。更具体而言，比较例5 (亲本蓝细菌的热水提取物)的总叶长为比较例2(水)的约1.1倍，但实施例3(修饰蓝细菌的分泌物)的总叶长为比较例2(水)的约1.3倍。即，给予了修饰蓝细菌分泌物的实施例3的个体与给予了亲本蓝细菌的热水提取物的比较例5的个体相比，观察到显著的生长效果。
[0290]
(2)接着，对地上部干重的结果进行说明。
[0291]
与比较例2(水)的地上部干重为同等的个体是比较例7(有机肥料) 的个体。
[0292]
低于比较例2(水)的地上部干重的个体是比较例3(蓝细菌用培养基)、比较例4(亲本蓝细菌的培养液)、以及比较例5(亲本蓝细菌的热水提取物)的个体。
[0293]
高于比较例2(水)的地上部干重的个体是比较例6(化肥)和实施例 3(修饰蓝细菌的分泌物)的个体。更具体而言，比较例6(化肥)的地上部干重为比较例2(水)的约1.1倍，但实施例3(修饰蓝细菌的分泌物) 的地上部干重为比较例2(水)的约1.5倍。即，给予了修饰蓝细菌分泌物的实施例3的个体与给予了化肥的比较例6相比，观察到显著的增体效果。
[0294]
接着，对比较个体的生长状态的结果进行说明。
[0295]
比较例4的给予了亲本蓝细菌的培养液的个体与比较例3的给予了蓝细菌用培养基的个体相比，生长状态较差。即使将这些代表性的个体的照片进行比较，比较例4的个体与比较例3的个体相比，也是茎细，茎、叶均整体上没有张力。
[0296]
比较例5的给予了亲本蓝细菌的热水提取物的个体与比较例4的给予了亲本蓝细菌的培养液的个体相比，生长状态良好。即使比较这些代表性的个体的照片，比较例5的个体与比较例4的个体相比，也是茎粗，叶有厚度，茎、叶均整体上有张力。由该结果考虑，在亲本蓝细菌的菌体内产生了参与植物的生长促进的物质，该物质通过用热水对亲本细菌的菌体进行处理而漏出到菌体外，参与菠菜的生长促进。
[0297]
实施例3的给予了修饰蓝细菌分泌物的个体与比较例5的给予了亲本蓝细菌的热水提取物的个体相比，生长状态良好。即使比较这些代表性的个体的照片，比较例5的个体与比较例3的个体相比，也是茎粗，叶有厚度，叶的片数也多，茎、叶均整体上有张力。更具体而言，实施例3的个体的总叶长及地上部干重分别为比较例5的个体的约1.2倍及约1.6倍。由该结果考虑，在亲本蓝细菌和修饰蓝细菌双方的菌体内产生的物质中，例如含有如蛋白那样因热而变性、其功能容易丧失的物质。
[0298]
另外，实施例3的给予了修饰蓝细菌分泌物的个体与比较例6的给予了化肥(氮总量为6％、水溶性磷酸为10％、水溶性钾为5％)的个体相比，生长状态良好。即使比较这些代表性的个体的照片，实施例3的个体与比较例6的个体相比，也是茎粗，叶有厚度，叶数也多，茎、叶均整体上有张力。其结果考虑，修饰蓝细菌分泌物中所含的物质参与了菠菜的生长促进。
[0299]
另外，实施例3的给予了修饰蓝细菌分泌物的个体与比较例7的给予了有机肥料(副产动物质肥料，其包含植物发酵产物)的个体相比，生长状态良好。即使比较这些代表性的个体的照片，实施例3的个体与比较例7 的个体相比，也是茎粗，叶有厚度，叶数也多，茎、叶均整体上有张力。其结果，考虑修饰蓝细菌分泌物中所含的物质参与了菠菜的生长促进。
[0300]
根据以上可知，在修饰蓝细菌的分泌物中包含多个参与植物(在此为菠菜)的生长促进的物质，这些物质中也包含在热作用下会失活的物质。另外，在修饰蓝细菌的培养上清液中观察到植物的生长促进效果，在亲本蓝细菌的培养液中没有发现该效果，由此可知，参与植物的生长促进的物质被分泌到菌体外，对植物发挥生长促进的作用。由此推测，植物的生长促进需要该分泌物与土或植物体本身接触而使某种生理活性发挥作用。事实上，在亲本蓝细菌的提取物中，如果在该过程中使用热水提取等伴有生物成分的改性的方法，则植物生长促进效果受到显著损害，因此启示植物生长促进作用需要某种生理活性。
[0301]
(7-2)矮牵牛花栽培试验
[0302]
在矮牵牛花栽培试验中，通过以下的实施例4和比较例8评价修饰蓝细菌分泌物对植物长出花芽、开花、结果、产生种子的生殖生长的植物生长促进效果。
[0303]
首先，在栽培用盆(12cm
×
10cm)中加入市售的培养土，每盆播种3 粒矮牵牛花子的种子。栽培在室内温度为23℃、白色光源的光量子通量密度为200μmol/m2/s、亮条件为16小时和暗条件为8小时的条件下进行60 天。在此期间，每隔1天供给50ml的蒸馏水。从栽培开始起约1周后，在子叶展开的阶段进行间隔剔除，使各盆中的个体尺寸一致。
[0304]
(实施例4)
[0305]
如上所述，在使各盆的个体尺寸一致后，将修饰蓝细菌分泌物每1株5 ml、1周1次添加到矮牵牛花的根部。其中，修饰蓝细菌分泌物是实施例2 的slr0688抑制株的培养上清液。然后，对栽培40天后和60天后的3盆矮牵牛花分别计数花和花蕾的数量，求出它们的平均值和标准偏差。
[0306]
(比较例8)
[0307]
将上述比较例6中使用的化肥(稀释500倍)每1株50ml、每2周1 次添加到矮牵牛花的根部。然后，对栽培40天后和60天后的3盆矮牵牛花分别计数花和花蕾的数量，求出它们的平均值和标准偏差。
[0308]
(结果)
[0309]
将实施例4和比较例8的结果示于图11。图11是表示矮牵牛花栽培试验的结果的图。在图11中记载了代表性的个体的照片，示出了花数和花蕾数(平均值 /-sd)。
[0310]
(1)首先，对实施例4和比较例8的栽培40天后的生长状态的比较结果进行说明。
[0311]
在实施例4的个体中，栽培40天后的花数为6.3 /-2.5(n＝3)，与此相对，在比较例8的个体中，花数为0(n＝3)。另外，在实施例4的个体中，花蕾数为8.7 /-3.1(n＝3)，与此相对，在比较例8的个体中，花蕾数为2.7 /-3.8(n＝3)。即，栽培40天后的实施例4的个体的花蕾数是比较例8的个体的花蕾数的约3倍。即使比较这些代表性的个体的照片，也能够确认实施例4的个体与比较例8的个体相比促进了生长。更具体而言，在实施例4的个体中，能够确认花为12个、花蕾为4个，与此相对，在比较例8的个体中，仅能够确认花数为0个、花蕾数为1个。根据这些结果考虑，修饰蓝细菌分泌物中所含的物质参与了矮牵牛花的生长促进。
[0312]
(2)接着，对实施例4和比较例8的栽培60天后的生长状态的比较结果进行说明。
[0313]
在实施例4的个体中，栽培60天后的花数为17.3 /-3.1(n＝3)，与此相对，在比较例8的个体中，花数为5.7 /-5.1(n＝3)。即，栽培60天后的实施例4的个体的花数为比较例8的个体的花数的约3倍。另外，在实施例4的个体中，花蕾数为17.6 /-3.8(n＝3)，与此相对，在比较例8的个体中，花蕾数为11.7 /-3.1(n＝3)。即，栽培60天后的实施例4的个体的花蕾数是比较例8的个体的花蕾数的约1.5倍。即使比较这些代表性的个体的照片，也能够确认实施例4的个体与比较例8的个体相比促进了生长。更具体而言，在实施例4的个体中，能够确认花为24个、花蕾为18个，与此相对，比较例8的个体中，仅能够确认花为6个、花蕾为11个。根据这些结果考虑，修饰蓝细菌分泌物中所含的物质参与了矮牵牛花的生长促进。
[0314]
(3)接着，对实施例4和比较例8各自的生长状态的推移进行说明。
[0315]
在实施例4的个体中，栽培60天后的花数增加至栽培40天后的花数的约3倍，栽培60天后的花蕾数增加至栽培40天后的花蕾数的约2倍。
[0316]
另一方面，在比较例8的个体中，花数从栽培40天后的花数为0增加至栽培60天后的花数为5.7 /-5.1(n＝3)，花蕾数在栽培60天后增加至栽培40天后的花蕾数的约4倍。
[0317]
比较例8的个体与实施例3的个体相比，至形成花芽为止的期间长。即考虑，比较例8的个体没有如实施例3的个体那样生长得到促进，因此营养生长所花费的时间长，生殖生长的开始时期晚。
[0318]
另外，在实施例4的给予了修饰蓝细菌分泌物的个体中，与比较例8 的给予了化肥的个体相比，可见显著的开花促进，由此确认了在该分泌物中含有参与植物的生长促进的物质。
[0319]
(7-3)番茄栽培试验
[0320]
首先，在栽培用种植器(22cm
×
16cm)中加入市售的培养土，每个种植器种植3粒番茄的种子。栽培在室内温度为23℃、白色光源的光量子通量密度为250μmol/m2/s、亮条件为16小时和暗条件为10小时的条件下进行150天。在此期间，每隔2天向各种植器供给500ml的
蒸馏水。从栽培开始起约1周后，在子叶展开的阶段进行间隔剔除，使各种植器中的个体尺寸一致。另外，50天时向各种植器施用1次500ml市售的化肥(含有氮总量为6％、水溶性磷酸为10％、水溶性钾为5％、水溶性氧化镁为0.05％、水溶性锰为0.001％、水溶性硼为0.005％的原液的500倍稀释液)。
[0321]
(实施例5)
[0322]
如上所述，在使各种植器的个体尺寸一致后，将修饰蓝细菌的分泌物每1株5ml、1周1次地添加到根部。栽培150天，在此期间，从番茄果实变红成熟的果实开始依次进行收获，记录到收获日为止的累计收获数(也称为果实数)。另外，测定所收获的果实的重量，求出平均值和标准偏差(sd)。其中，修饰蓝细菌为实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688 抑制株。
[0323]
(比较例9)
[0324]
除了使用水代替修饰蓝细菌的分泌物以外，与实施例5同样地进行。
[0325]
(结果)
[0326]
将实施例5及比较例9的结果示于图12及图13。图12及图13是表示番茄栽培试验的结果的图。
[0327]
如图12所示，实施例5中栽培的植株与比较例9中栽培的植株相比，果实的收获时期提前。此外，实施例5中收获的果实数与比较例9中收获的果实数相比，增加了约67％。
[0328]
另外，如图13所示，在实施例5和比较例9中收获的每1个果实的平均重量几乎相同。
[0329]
(7-4)草莓栽培试验
[0330]
将叶数为约9片、植株长为约7cm的草莓苗定植于装有市售的培养土的栽培用盆(12cm
×
10cm)中。栽培在亮期温度为20℃、暗期温度为15℃、白色光源的光量子通量密度为200μmol/m2/s、亮条件为14小时和暗条件为 10小时的条件下进行150天。在此期间，每隔1天向各盆供给50ml的蒸馏水。另外，50天时向各盆施用1次100ml市售的化肥(含有氮总量为6％、水溶性磷酸为10％、水溶性钾为5％、水溶性氧化镁为0.05％、水溶性锰为0.001％和水溶性硼为0.005％的原液的500倍稀释液)。
[0331]
(实施例6)
[0332]
在上述栽培期间中，将修饰蓝细菌的分泌物每1株5ml、1周1次地添加到根部。从草莓果实变红成熟的草莓开始依次进行收获，记录到收获日为止的累计收获数(即果实数)。另外，测定所收获的果实的重量，求出平均值和标准偏差(sd)。其中，修饰蓝细菌为实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688抑制株。
[0333]
(比较例10)
[0334]
除了使用水代替修饰蓝细菌的分泌物以外，与实施例6同样地进行。
[0335]
(结果)
[0336]
将实施例6和比较例10的结果示于图14～图16。图14～图16是表示草莓栽培试验的结果的图。图15中，为了在视觉上显示果实和花的附着方式等生长状态的差异，记载了实施例6和比较例10中栽培的植株的苗定植后110天后的照片。
[0337]
如图14所示，实施例6中栽培的植株与比较例10中栽培的植株相比，果实的收获时期提前。此外，实施例6中收获的果实数与比较例10中收获的果实数相比，增加了约47％。
[0338]
另外，如图15所示，在实施例6中栽培的植株与比较例10中栽培的植株相比，叶繁茂，花、花苞及果实的数量也多，生长良好。
[0339]
另外，如图16所示，关于实施例6和比较例10中收获的每1个果实的平均重量，没有统计学上显著的变化。
[0340]
(7-5)莴苣水培栽培试验
[0341]
水培用的培养液使用了含有氮总量为6％、水溶性磷酸为10％、水溶性钾为5％、水溶性氧化镁为0.05％、水溶性锰为0.001％和水溶性硼为0. 005％的市售的培养液原液的500倍稀释液。光条件在白色光源的光量子通量密度为200μmol/m2/s、亮条件为16小时和暗条件为8小时的条件下在室温(22℃)下栽培35天。
[0342]
(实施例7)
[0343]
在上述栽培期间中，将修饰蓝细菌的分泌物按照每1株达到5ml的分量、1周1次地添加到水培用的培养液中。收获后，测定植株重量，求出平均值和标准偏差(sd)。其中，修饰蓝细菌为实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688抑制株。
[0344]
(比较例11)
[0345]
除了使用水代替修饰蓝细菌的分泌物以外，与实施例7同样地进行。
[0346]
(结果)
[0347]
将实施例7及比较例11的结果示于图17及图18。图17及图18是表示莴苣水培栽培试验的结果的图。在图17中，为了在视觉上显示叶的附着方式等生长状态的差异，记载了实施例7和比较例11中栽培的植株栽培3 4天后的照片。
[0348]
如图17所示，实施例7中栽培的植株与比较例11中栽培的植株相比，叶数多、生长良好。
[0349]
另外，如图18所示，实施例7中收获的植株的平均重量与比较例11 中收获的株相比，增加了约21％。
[0350]
(总结)
[0351]
从菠菜栽培试验和矮牵牛花栽培试验的结果确认了，本实施方式的植物生长促进剂与以往的植物生长促进剂(例如化肥、有机肥料及亲本蓝细菌的热水提取物等)相比，具有更高的植物生长促进效果。
[0352]
另外，从番茄栽培试验和草莓栽培试验的结果确认了，对于结果的植物，除了以往的植物生长促进剂(例如化肥)以外，通过添加本实施方式的植物生长促进剂，能够得到更高的植物生长促进效果。
[0353]
另外，从莴苣水培栽培试验的结果确认了，本实施方式的植物生长促进剂不仅对土壤栽培的植物，而且对水培栽培的植物也具有高的植物生长促进效果。
[0354]
产业上的可利用性
[0355]
根据本公开，能够提供植物生长促进物质的分泌生产率提高了的修饰蓝细菌。另外，当培养本公开的修饰蓝细菌时，能够高效地制造上述物质，例如通过将该物质添加到土中，能够促进植物的生长，能够期待作物的收获量增加。
[0356]
符号说明
[0357]1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
内膜
[0358]2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
肽聚糖
[0359]3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
糖链
[0360]4ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
细胞壁
[0361]5ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
外膜
[0362]6ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
slh结构域保持型外膜蛋白
[0363]7ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
slh结构域
[0364]8ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
有机物通道蛋白
[0365]9ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
细胞壁-丙酮酸修饰酶。