一种Ⅰ型副流感病毒、Ⅲ型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法与流程

一种i型副流感病毒、iii型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种i型副流感病毒、iii型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法。


背景技术：

2.who数据显示，呼吸道感染是全球第四大致死原因，是中国5岁以下儿童的第三大死因。流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和人冠状病毒是引起成人急性呼吸道感染的主要病原体。2021年3月1日，国家卫健委医管局印发《2021年国家医疗质量安全改进目标》，针对当前医疗质量安全领域突出或者共同存在的薄弱环节和关键领域，提出了33项改进目标。其中第六项指出，呼吸道感染病原谱复杂，部分可引起流行，应提高呼吸道病原体核酸检测率。其中流感病毒和呼吸道合胞病毒是婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者重症下呼吸道感染及其死亡的首要致病原。
3.人副流感病毒(human parainfluenza virus，hpiv)为无节段单负链rna病毒，全长约15 000个核苷酸，属副黏病毒科，hpivs分为hpiv1-4四个血清型，其中hpiv-4又分为hpiv-4a和hpiv-4b两种亚型，hpiv-1和hpiv-3为呼吸道病毒属(respirovims)，hpiv-2和hpiv-4为腮腺炎病毒(mbulavirus)。hpivs是继呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)后引起儿童急性呼吸道感染的又一常见病毒，有研究显示，人副流感病毒引起的急性呼吸道疾病在儿童呼吸道患者中可高达40％，会引起哮喘，毛细支气管炎，肺炎等较严重的临床症状。此外，人副流感病毒在老年人和免疫功能不全人群中也会引起严重的下呼吸道疾病。
4.腺病毒属于双链dna病毒，可长期存在于人群中，造成急性发热性呼吸道感染的大规模流行。目前已发现的腺病毒包括7个亚群(a-g)，67个型别，其中对人类具有致病性的有55个血清型，可感染呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱、眼和肝脏等，并引起广泛的临床症状，但呼吸道腺病毒更为常见，其中可导致呼吸道感染的腺病毒包括腺病毒3型、7型、11型、14型、21型、55型等，3型、7型、55型在我国较为常见。腺病毒感染临床症状主要为发热、咽部充血、咽痛、咳嗽、身体酸痛乏力较多，少数患者可有腹泻、腹痛等胃肠道症状。
5.目前临床检验中应用的针对副流感和腺病毒病毒的方法主要是多种病毒核酸联合检测方法，大多包含是6种及以上病毒检测，如呼吸道病毒核酸六重联检试剂盒(pcr荧光探针法)等，项目的收费比较高。但目前所应用的荧光pcr检测方法，作为一种酶促反应，仍然存在样本处理繁琐、对核酸纯度要求高、pcr检测时间偏长、自动化成本偏高等缺点，另外在血筛等临床检验中现有的检测方法也无法满足其灵敏度的要求；以上的不足导致目前针对副流感和腺病毒的荧光pcr检测方法在临床检验中的应用受到了限制，尤其无法满足门诊和急诊的需求。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种i型副流感病毒、iii型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法，以解决现有检测技术中存在的样本处理繁琐、对核酸纯度要求高、pcr检测时间偏长、自动化成本偏高等缺点。
7.基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.一种用于i型副流感病毒、iii型副流感病毒和腺病毒的多重荧光pcr检测的引物探针组合物，该组合物包括如seq id no.1至seq id no.13所示的核苷酸序列，具体是(表1)：
9.表1
[0010][0011][0012]
一种用于i型副流感病毒、iii型副流感病毒和腺病毒的多重荧光pcr检测的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物探针组合物。
[0013]
一种i型副流感病毒、iii型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法，该方法用于非疾病诊断目的，该方法包括如下步骤：
[0014]
s1、免疫磁珠的制备：将i型副流感病毒、iii型副流感病毒和腺病毒三种抗体分别偶联至羧基修饰的超顺纳米磁珠上，得到三种偶联病毒抗体的免疫磁珠；
[0015]
s2、病毒的富集：将i型副流感病毒阳性或iii型副流感病毒阳性或呼腺病毒阳性的样本保存液，与三种偶联病毒抗体的免疫磁珠混合孵育，得到免疫磁珠-病毒复合物；
[0016]
s3、用磁性工具分离免疫磁珠-病毒复合物，将免疫磁珠-病毒复合物重悬于te缓冲液中加热裂解；
[0017]
s4、用磁性工具分离磁珠，得到富集浓缩的病毒，用多重荧光pcr试剂对裂解产物中的液体直接进行检测；该多重荧光pcr试剂包含本发明所述的引物探针组合物。
[0018]
本发明检测方法主要过程是：将呼吸道样本与分别偶联有i型副流感病毒抗体、iii型副流感病毒抗体、腺病毒抗体的免疫磁珠混合，一定温度下混合孵育，使用磁性工具分离免疫磁珠-病毒复合物，将复合物重悬于盐离子缓冲液中，将重悬的免疫磁珠-病毒复合物进行加热裂解，使用磁性工具分离磁珠，对裂解产物(液体部分)使用荧光pcr检测试剂直接进行检测。使用多重荧光pcr技术，在同一检测孔中加入10个引物探针，包含3个荧光通道，可检测i型副流感病毒、iii型副流感病毒、腺病毒3型、腺病毒7型和腺病毒55型。在检测的同时可区分i型副流感病毒、iii型副流感病毒和腺病毒病毒，有利于精准判断病情，辅助疾病早期的诊断和治疗。
[0019]
作为优选，步骤s4所述荧光pcr试剂(20μl)包含以下组分：如seq id no：1至seq id no：2所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.2μm；如seq id no：3至seq id no：5所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.3μm；如seq id no：6所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.13μm；如seq id no：7至seq id no：9所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.3μm；如seq id no：10所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.2μm；如seq id no：11至seq id no：13所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.1μm。
[0020]
作为优选，步骤s4所述荧光pcr试剂(20μl)包含以下组分：dna聚合酶及逆转录酶混合液2μl/份，5
×
reaction buffer(含镁离子及dntp)6μl/份，即终浓度1
×
。
[0021]
本发明所述的荧光pcr检测试剂中含有耐抑制抗干扰的pcr反应缓冲液和快速扩增的dna聚合酶，能对含有各种干扰物质的样本进行有效扩增和荧光检测。
[0022]
作为优选，步骤s1所述i型副流感、iii型副流感和腺病毒三种抗体均为单克隆病毒表面抗体。
[0023]
作为优选，步骤s2所述病毒的富集具体方法为：取样本保存液200μl与三种偶联病毒抗体的免疫磁珠各5μl混合，室温下(25-37℃)混匀6-15分钟。
[0024]
作为优选，步骤s3所述的加热裂解是：在85-95℃加热5-15分钟裂解病毒释放核酸。
[0025]
作为优选，pcr扩增反应条件：52℃持续15min；95℃持续1min；(95℃持续5s；58℃持续30s并采集荧光)45个循环。
[0026]
作为优选，所述超顺纳米磁珠直径为200nm-350nm，表面带有羧基(-cooh)基团。
[0027]
作为优选，所述免疫磁珠制备具体为：利用edc活化法将单克隆表面抗体连接到表面带羧基(-cooh)的超顺纳米磁珠表面，并用bsa对偶联了抗体后的磁珠进行封闭。
[0028]
作为优选，所述免疫磁珠的风干保存方法为：将免疫磁珠置于烘箱中，将温度调至30℃-37℃，开启通风，静置10小时以上后取出，于2-8℃密封保存。
[0029]
作为优选，所述免疫磁珠所偶联的病毒抗体为指i型副流感病毒hn抗体、iii型副流感病毒hn抗体、腺病毒hexon蛋白抗体，是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0030]
相对于现有的i型/iii型副流感病毒和腺病毒核酸联合荧光pcr检测技术，本发明的有益效果在于：样本处理简单，因进行了富集浓缩而大幅提高检测灵敏度，通过免疫识别和基因识别两道把关而特异性强，使用快速pcr试剂而荧光pcr检测时间短等。
附图说明
[0031]
图1为本发明i型/iii型流感病毒和腺病毒核酸联合荧光pcr检测流程示意图；
[0032]
图2为本发明i型副流感病毒、iii型副流感病毒或腺病毒阳性样本在富集后免核酸纯化荧光pcr检测的扩增曲线图，其中a、i型副流感毒阳性样本，b、iii型副流感病毒阳性样本，c、呼吸道腺病毒阳性样本；
[0033]
图3为i型副流感病毒、iii型副流感病毒或呼吸道腺病毒阳性样本进行核酸提取后荧光pcr检测的扩增曲线图，其中a、i型副流感毒阳性样本，b、iii型副流感病毒阳性样本，c、呼吸道腺病毒阳性样本；
[0034]
图4为i型副流感病毒、iii型副流感病毒或呼吸道腺病毒阳性样本原液直接荧光pcr检测扩增曲线图，其中a、i型副流感毒阳性样本，b、iii型副流感病毒阳性样本，c、呼吸道腺病毒阳性样本；
[0035]
图5为i型副流感病毒、iii型副流感病毒或呼吸道腺病毒阳性样本经过病毒免疫富集的样本上清液加热裂解后荧光pcr检测扩增曲线图，其中a、i型副流感毒阳性样本，b、iii型副流感病毒阳性样本，c、呼吸道腺病毒阳性样本；
[0036]
图6为i型副流感病毒培养物、iii型副流感病毒培养物或呼吸道腺病毒阳性质粒检测限样本经过病毒免疫富集的样本上清液加热裂解后荧光pcr检测扩增曲线图，其中a、i型副流培养物阳性检测限样本，b、iii型副流培养物阳性检测限样本，c、腺病毒3型质粒检测限样本，d、腺病毒7型质粒检测限样本，e、腺病毒55型质粒检测限样本。
[0037]
图7为健康人咽拭子样本，a、内标-cy5通道检测结果，b、腺病毒-fam通道检测结果，c、piv3-rox通道检测结果，d、piv1-vic通道检测结果。
具体实施方式
[0038]
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0039]
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0040]
下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得到。
[0041]
实施例1 i型副流感病毒、iii型副流感病毒和呼吸道腺病毒的富集
[0042]
一种i型副流感病毒、iii型副流感病毒和呼吸道腺病毒的多重富集检测方法，流程图见图1，具体过程是：
[0043]
1、配制i型副流感病毒/iii型副流感病毒和呼吸道腺病毒核酸联合检测试剂(免提取荧光pcr法)。
[0044]
(1)配制pcr反应液
[0045]
[0046][0047]
(2)分装pcr反应液
[0048]
将pcr反应液，按照20μl/反应，分装至pcr管中。
[0049]
(3)免疫磁珠的制备：将i型副流感病毒、iii型副流感病毒和呼吸道腺病毒三种抗体分别偶联至羧基修饰的超顺纳米磁珠上，得到三种偶联病毒抗体的免疫磁珠。所述超顺纳米磁珠直径为200nm-350nm。
[0050]
利用edc活化法将单克隆表面抗体连接到表面带羧基(-cooh)的超顺纳米磁珠表面，并用bsa对偶联了抗体后的磁珠进行封闭。
[0051]
所述免疫磁珠的风干保存方法为：将免疫磁珠置于烘箱中，将温度调至30℃-37℃，开启通风，静置10小时以上后取出，于2-8℃密封保存。
[0052]
2、样本处理
[0053]
取3份临床呼吸道样本(样板1为i型副流感病毒阳性，样本2为iii型副流感病毒阳性，样本3位呼吸道腺病毒阳性)，每个样本均平行进行如下三组处理；
[0054]
(1)处理组-免疫富集组
[0055]
将偶联有i型副流感病毒、iii型副流感病毒、呼吸道腺病毒抗体的免疫磁珠各5μl添加至离心管中，再加入200μl样本，使其与免疫磁珠混合，使用移液器轻缓吹吸5-6次；
[0056]
室温孵育10分钟；
[0057]
使用磁力架进行磁分离，弃上清，在剩余磁珠中加入25μl te；
[0058]
90℃加热5分钟。使用磁力架进行磁分离；
[0059]
取上清10μl加入到pcr管中，准备上机检测；
[0060]
(2)对照组1-提取检测组
[0061]
取200μl样本，加入到核酸提取试剂中，进行核酸提取，将提取好的核酸10μl加到pcr管中，准备上机检测；
[0062]
(3)对照组2-原液检测组
[0063]
样本混匀后，直接取样本10μl进行加到pcr管中，准备上机检测；
[0064]
(4)对照组3-上清检测组
[0065]
将(1)免疫富集组磁分离后的上清作为样本，90℃加热5分钟后取上清10μl加入到pcr管中，准备上机检测。
[0066]
3、上机检测
[0067]
将完成加样的pcr管放入荧光pcr仪中，进行荧光pcr扩增，检测程序：52℃持续15min；95℃持续1min；(95℃持续5s；58℃持续30s并采集荧光)45个循环。
[0068]
结果及分析
[0069]
设备检测程序运行完成后，观察扩增曲线图，读取ct值；
[0070]
本发明i型副流感病毒、iii型副流感病毒、呼吸道腺病毒阳性样本在富集后免核酸纯化荧光pcr检测的扩增曲线见图2，对照组1(未富集)、对照组2、对照组3的扩增曲线分别见图3，图4和图5。
[0071]
各处理组检测结果(荧光曲线ct值)如表5所示。
[0072][0073][0074]
说明：fam：腺病毒；vic：i型副流感病；rox：iii型副流感病毒
[0075]
根据图2，图3，图4和图5，以及表5可以看出，免疫富集处理后进行检测(本发明)，与常规提取后检测对照组的检测效率(ct值小者效率更高)检测效率更高，与直接扩增对比也有显著优势；而与上清液检测结果的比较说明本发明的免疫富集具有较好的病毒捕获能力。
[0076]
实施例2 i型副流感病毒、iii型副流感病毒和呼吸道腺病毒检测试剂
[0077]
一、引物探针的设计
[0078]
根据文献报道，选用i型副流感病毒、iii型副流感病毒及呼吸道腺病毒相对应的
保守区作为本发明试剂盒的目标基因，针对每种病毒分别设计了3对引物及相对应的探针。并根据实验结果，综合考虑检出率、扩增线型、扩增效率等方面，每个病毒选取一个引物组合。最终选择的各病毒的引物对及探针序列见表2。
[0079]
表2
[0080][0081]
本发明内标引物探针的设计：
[0082]
本发明引入人基因作为内标，综合考虑内标基因对靶基因检测造成的抑制和内标基因扩增信号的强度，经过不同对内标引物探针的对比筛选，最终选择的内标的引物、探针序列见表3。
[0083]
表3内标的引物、探针序列
[0084]
引物序列(5
’‑3’
)序列号ic fcatcgctggtaacaccaccseq id no：11ic ragtccctatgacagagagagaagseq id no：12ic ptcactgggcagcagcatgtggcaccseq id no：13
[0085]
二、反应体系的建立和优化
[0086]
为了能最大限度提高了实验的可靠性和精密性，得到阳性符合率高的实验结果，本发明对基因扩增系统特别是酶混合液和pcr反应缓冲液的主要成分进行了优化，具体是：
[0087]
酶混合液的组成为：
[0088][0089]
扩增反应液1的组成为：
[0090][0091]
扩增反应液2中引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，对引物浓度进行梯度测试，对探针浓度进行梯度测试，经过多次对比试验，最终确定的引物浓度和探针浓度见表4。
[0092]
表4扩增反应液2组成
[0093][0094][0095]
本发明对扩增反应条件优化后，确定为：
[0096]
52℃持续15min；95℃持续1min；(95℃持续5s；58℃持续30s并采集荧光)45个循环。
[0097]
本发明的结果判读如表5所示：
[0098]
表5
[0099][0100][0101]
三、试剂盒检测限确定
[0102]
1.阳性样本的制备：
[0103]
i型副流感病毒、iii型副流感病毒阳性样本为外购广州邦德盛生物科技有限公司的人副流感1型病毒核糖核酸(piv 1 rna)液体室内质控品、人副流感3型病毒核糖核酸(piv3 rna)液体室内质控品。
[0104]
在ncbi数据库中，搜索腺病毒3型、7型、55型基因序列，选取hexon蛋白编码区序列，提交质粒合成公司(上海百力格生物技术有限公司)插入至puc57质粒载体中进行质粒合成。
[0105]
2.样本浓度确定：
[0106]
采用新羿制造科技(北京)有限公司的数字pcr仪(a300/drop mark m1/chip reader r1)进行浓度标定。
[0107]
3.检测限确定
[0108]
将i型副流感病毒阳性样本稀释至500copies/ml、iii型副流感病毒阳性样本稀释至500copies/ml、腺病毒3型、7型、55型阳性样本稀释至500copies/ml，重复20次检测，检测结果ct值如表6所示，扩增曲线见图6。
[0109]
表6
[0110][0111][0112]
由表6和图6可见，20例i型副流感病毒500copies/ml的阳性样本检测结果均为阳性，20例iii型副流感病毒500copies/ml的阳性样本检测结果均为阳性，腺病毒3型、7型、55型各20例500copies/ml的阳性样本检测结果均为阳性，可知该试剂盒的检测限在500copies/ml或以下，远高于同类试剂盒检测灵敏度。
[0113]
四、试剂盒特异性验证
[0114]
对多例健康人咽拭子样本进行检测，检测结果如表7，扩增曲线见图7。
[0115]
表7
[0116][0117][0118]
由表7和图7可见，16例健康人咽拭子的检测结果均为阴性，表明试剂盒无非特异情况存在。
[0119]
实施例3
[0120]
一种检测i型副流感病毒、iii型副流感病毒、呼吸道腺病毒的引物探针组合，该组合是由表2所示的引物探针，以及表3所示的内标引物探针组成。该组合用于对i型副流感病毒、iii型副流感病毒或呼吸道腺病毒阳性样本的检测。
[0121]
实施例4
[0122]
一种i型副流感病毒、iii型副流感病毒和呼吸道腺病毒的检测试剂盒，该检测试剂盒中包括用于多重荧光pcr检测的荧光pcr试剂，所述荧光pcr试剂含有实施例3所述的引物探针组合，且含有dna聚合酶及逆转录酶、镁离子、dntp及表面活性剂等。
[0123]
pcr试剂组成为(20μl)：
[0124][0125]
其中，扩增反应液2的组成见表4。
[0126]
该试剂盒使用时，加入10μl样本，反应体系为30μl。
[0127]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
[0128]
以上对本发明所提供的i型副流感病毒、iii型副流感病毒和呼吸道腺病毒的多重富集检测方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。