一种小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法

1.本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法。


背景技术：

2.毛囊的真皮成分由毛乳头(dermal papilla，dp)和真皮鞘组成。dp是位于hf(hair follicle，毛囊)底部的一种特殊的间充质细胞群，具有诱导毛囊形态发生和周期循环再生的能力。因此，dp细胞是毛囊组织工程领域的一种关键种子细胞。
3.既往研究通常采用小鼠触须毛囊内dp细胞作为毛囊再生中dp的细胞来源。然而，一只成年小鼠仅含15-20个触须毛囊，所提供的dp细胞数量有限，且dp细胞在体外培养扩增过程中会快速丢失其诱导毛囊再生的特性，而毛囊再生研究又需要大量的dp细胞。因此，如何获取足够多的dp细胞是毛囊组织工程领域的一个难点。
4.小鼠背部皮肤含有大量的被毛毛囊，这些可能是未来获取毛囊dp细胞的优良供区。而用来获取小鼠触须毛囊内dp细胞的显微解剖法和酶解法并不适合于获取体积微小和数量庞大的被毛毛囊内的dp细胞。迄今为止，尚未见到关于获取小鼠被毛毛囊内dp细胞的提取方案。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于建立一种新型基于重力密度梯度沉降(fdgs)技术的提取小鼠被毛毛囊内毛乳头细胞的方法，其仅利用离心力和优化的密度梯度分层，即可高效的获得大量小鼠被毛毛乳头细胞。
6.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
7.提供一种小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法，包括以下步骤：
8.s10、收集新生小鼠被毛毛囊真皮并经后处理，重悬沉淀后离心处理，获得含真皮细胞的沉淀物；
9.s20、第一次fdgs处理：将真皮细胞重悬后的混悬液与等量的10％ficoll(聚蔗糖)充分混合，形成细胞-ficoll混悬液；取新的试管，再加入10％ficoll，然后将细胞-ficoll混悬液轻轻加入，形成上下层分界清晰密度梯度混悬液，离心处理，获得富含小鼠被毛毛囊的沉淀物；
10.s30、幼稚毛囊培养：收集离心后的沉淀物(毛囊)并接种于培养瓶中用完全培养基培养；培养置镜下观察幼稚毛囊结构贴壁丧失原有的三维结构，而毛乳头球仍保持界限分明的球形结构后，加入1％中性蛋白酶/胰蛋白酶进行消化处理，终止消化后收集细胞；
11.s40、第二次fdgs处理：将步骤s30中收集的细胞重悬沉淀后，与等量的10％ficoll充分混合；取新的试管，再加入10％ficoll后，将细胞-ficoll混悬液轻轻加入，形成上下层分界清晰的密度梯度混悬液，离心处理，收集的沉淀即为dp球。
12.s50、dp球培养：收集沉淀的细胞并接种于培养瓶中，用完全培养基培养，待dp球中
细胞完全迁出后即可进行消化传代。
13.作为小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法的一种优选方案，所述完全培养基为含20％fbs、1％三抗(青霉素-链霉素-两性霉素b)的dmem溶液。
14.作为小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法的一种优选方案，步骤s20中，两次加入的10％ficoll的体积相等。
15.作为小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法的一种优选方案，步骤s40中，两次加入的10％ficoll的体积相等。
16.作为小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法的一种优选方案，步骤s10中的离心处理是指50g离心3min。
17.作为小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法的一种优选方案，步骤s20中的离心处理是指50g离心3min。
18.作为小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法的一种优选方案，步骤s30中的消化处理是指37℃消化15min。
19.作为小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法的一种优选方案，步骤s40中的离心处理是指100g离心3min。
20.本发明的有益效果：本发明创新性地提供了一种基于重力密度梯度沉降(fdgs)技术提取小鼠被被毛毛囊dp细胞的方法。无需通过复杂的显微操作、转基因或荧光标记染色技术，仅基于单个成纤维细胞和幼稚毛囊结构之间的差异(如细胞数量、密度和重量)，可以使用不同的离心力和密度梯度离心法分离，最终获得大量小鼠被毛dp细胞。本发明填补了国内外小鼠被毛毛囊分离方法的空缺。
附图说明
21.图1为第一次fdgs分离前后镜下图；
22.图2为第二次fdgs分离前后镜下图；
23.图3为提取的鼠被毛dp球新鲜分离，原代培养第5天，传代后的细胞状态；
24.图4为培养3代后dp和成纤维细胞增殖率的定量分析图。
具体实施方式
25.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。实施例中所使用的耗材、设备等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的材料。
26.提取的全过程均严格要求无菌，所用的器械均需高温高压，配置试剂均需高温高压或通过0.22um过滤器。
27.本实施例中的小鼠被毛毛囊毛乳头细胞提取方法的具体步骤如下：
28.1.液体配置：
29.(1)冷洗涤液：pbs磷酸缓冲盐溶液加入1％三抗(青霉素-链霉素-两性霉素b)，于4℃预冷；
30.(2)完全培养基：含20％fbs、1％三抗(青霉素-链霉素-两性霉素b)的dmem溶液。
31.2.动物准备：
32.(1)出生1-2天的乳鼠，co2气体处死后，浸泡2次酒精消毒，并通过冷洗涤液漂洗干
净。
33.(3)取消毒好的乳鼠，使用无菌眼科剪刀剪去四肢及尾巴。用眼科镊固定乳鼠躯干并用手术刀沿背部中线，自头部到尾部做一个切口，而不穿透下面的筋膜。随后分离皮肤及乳鼠躯干，将分离后的皮肤置于冷洗涤液中浸泡。
34.(4)将漂洗干净的皮肤置于0.1％的中性蛋白酶中，酶液充分没过皮肤，4℃消化过夜。取出皮肤，使用眼科镊轻柔撕去表皮，收集分离干净的真皮。
35.(5)将收集的真皮用眼科剪刀剪至匀浆状，加入0.2％胶原蛋白酶，37℃消化1h后终止消化。消化后的真皮组织，过70um细胞滤网去除大块未消化的真皮组织，收集滤液，离心后弃上清，收集沉淀，重悬沉淀后50g，3min，去除上清液中大部分单个成纤维细胞，收集富含幼稚毛囊结构的沉淀物。
36.3.fdgs处理：
37.(1)第一次fdgs处理，真皮混悬液后，与等量的10％ficoll充分混合。取新的试管，加入10％ficoll后，将细胞-ficoll混悬液轻轻加入，形成上下层分界清晰密度梯度混悬液，50g离心3min。
38.(2)幼稚毛囊培养：收集沉淀的细胞并接种于培养瓶中，用完全培养基培养。培养置镜下观察幼稚毛囊结构贴壁丧失原有的三维结构，而毛乳头球仍保持界限分明的球形结构后，加入1％中性蛋白酶/胰蛋白酶，37℃消化15min，终止消化后收集细胞。
39.(3)第二次fdgs处理，重悬沉淀后，与等量的10％ficoll充分混合。取新的试管，加入10％ficoll后，将细胞-ficoll混悬液轻轻加入，形成上下层分界清晰密度梯度混悬液，100g离心3min，收集的沉淀即为dp球。
40.(4)dp球培养：收集沉淀的细胞并接种于培养瓶中，用完全培养基培养，待dp球中细胞完全迁出后即可进行消化传代。
41.图1为第一次fdgs分离前后镜下图，可见经过第一次fdgs处理，能显著的去除真皮内成纤维单细胞而保留完整幼稚毛囊结构。
42.图2为第二次fdgs分离前后镜下图，可见经过第二次fdgs处理，能显著的毛囊内非dp单细胞而保留完整的dp球。
43.图3为提取的鼠被毛dp球新鲜分离、原代培养第5天、传代后的细胞状态，表明经过fdgs处理后，dp细胞仍保持良好的贴壁及增殖状态。
44.图4同样证实了上述观点，与成纤维细胞对比，dp细胞表现出符合其特性的稳定增值曲线。
45.以上实施例仅用来说明本发明的详细方法，本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明白，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。