一种靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂及其制备方法和应用与流程

一种靶向真菌
β-碳酸酐酶的抑制剂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.真菌感染是热区环境及夏季作业的常见病因之一。浅部真菌病在执行特殊任务(船舶、雨林、海岛、抗洪抢险)的作业人员中发病率居高不下，易在作业人员中传染是皮肤真菌病的一大特点，尤其是疲劳、机体抵抗力降低，使皮肤真菌病的患病率急剧上升。因此，真菌性皮肤病不仅影响患者身体健康，而且严重降低湿热环境劳动人员的作业能力。近年来的抗真菌药物研究取得了较大进展，但其毒副作用和耐药菌株产生，为临床抗真菌的治疗提出挑战。再加上广谱抗感染药物滥用，抗肿瘤药物和免疫抑制剂的高剂量使用，使真菌病的发病率日趋增高，因此，筛选出能够针对真菌全新靶点的抑制化合物对于皮肤真菌病的防治具有重要意义。二氧化碳(co2)不仅细胞呼吸代谢的终产物，也是一种重要的信号分子，参与多种生物过程的调节。比如，co2是吸血性雌蚊寻找合适目标的主要信号分子，高浓度二氧化碳能促进动物生殖细胞的成熟和游动，甚至影响小型动物(如线虫)的寿命。许多真菌(如白色念珠菌)既是人体重要的病原真菌，也是健康人群体内常见的共生菌。co2作为微生物生命活动的重要信号分子，正常空气中 co2的含量约为0.03％，动物体内等约为4.5％～30％，参与多种生物过程的调节。人体内co2浓度远远高于空气中co2浓度，研究表明，co2在病原真菌白色念珠菌形态转换和感染宿主过程中起重要的调控作用。高浓度co2促进菌丝生长和灰菌(opaque)形成，从而促进白色念珠菌在体内定植。这种应答作用是该菌与宿主相互作用及其长期适应性进化的结果。因此，co2在生物进化和细胞生命活动中起非常重要的作用。碳酸酐酶(carbonic anhydrase,ca)是一种含zn
2
金属酶，能有效地催化 co2和hco
3-的可逆水合反应。根据其遗传学差异，cas分为五个家族α,β,γ,δ,ε。其中α-ca研究最为深入，包括16个亚型，存在于哺乳动物(人和鼠)、植物、原核生物及真菌中，在呼吸、光合作用、co2传输、酸碱平衡的维持、离子输送等生物过程中发挥着重要的作用。近年来开始有报道从植物、原核生物及真菌中鉴定出β-ca的存在，不存在于哺乳动物，且β-ca的活性中心不同于人源α-ca，是理想的抗真菌药物靶标。目前研究发现，β-ca不仅在致病真菌的co2传感系统中发挥重要作用，而且参与真菌有性繁殖和致病机制，其主要作用camp信号通路，激活pka，而发挥感染、毒力转移和繁殖的作用，这一途径目前得到证实。因此，β-ca是理想的抗真菌药物靶标。另外有报道发现，针对白色念珠菌和新隐球菌等深部真菌感染致病菌的β-ca(can和nce)，合成筛选了系列磺胺类先导化合物，并对其作用机制进行了初步探索，该类化合物主要是在目前现有磺胺类药物结构的改构，其在药物结构创新有待进一步提升。我国科研人员首次发现flo8对于co2诱导的菌丝生长和灰菌形成都是必需的，flo8含有一个真核生物中保守的lish结构域，不仅调节co2诱导的白色念珠菌“酵母-菌丝形态”转换，也控制了“白菌-灰菌”之间的转换，过表达flo8基因则增强了白色念珠菌细胞感应co2的敏
感性，在此过程中β-ca发挥重要的作用。因此，不论是作用于β-ca现有药物衍生化合物的研究，还是和β-ca相关通路的重要基因和蛋白的研究，均说明β-ca在真菌的生命系统的特异性和重要性，是作为理想药物靶标的基础，值得进一步深入的研究。因此，开展靶向β-ca的抑制剂筛选研究对于新一代防治真菌病新型药物的研究具有重要的意义。


技术实现要素：

针对现有技术中的上述问题，本发明提出了一种靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法。第一方面，本发明提出了一种靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，包括如下步骤：s101：将待筛选抗真菌化合物及对照药物分别用dmso溶解后配置成浓度为6mg/ml～7mg/ml的母液，在-85℃～-75℃温度下保存；s102：将所述对照药物配置成母液，在-85℃～-75℃温度下保存；s103：分别取上述母液，将每一种母液分别加入rpmi 1640培养液，充分振荡混匀，稀释为640μg/ml中间浓度；s104：将50μl待筛选抗真菌化合物和浓度为6.4mg/ml阳性药母液加入到含450μlrpmi 1640培养液的1ml深孔板中混匀；氟康唑母液取160μl，加入含340μl rpmi 1640培养液的1ml深孔板中混匀，各药物得浓度为640μg/ml 测试液；10级倍比稀释，得到640～1.25μg/ml 10个浓度的测试液；s105：取上述各测试液640～1.25μg/ml 10个浓度的测试液各20μl，分别分装于96孔板各排2～11号孔内制成药敏板；s106：将受试菌株分别制备成浓度介于1
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103～5
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103cfu/ml的酵母菌菌悬液和浓度介于2
×
103～1
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104cfu/ml丝状真菌菌悬液；s107：取药敏板中依次加入上述于每排1号孔加rpmi 1640培养液200μl，作空白对照；12号孔加待测菌株200μl，作阴性对照；药敏板每排2～11号孔分别加菌液180μl，充分混匀，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、 2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，各孔中dmso含量均低于1％；12号孔不含药物，作阴性对照；药敏板h排为氟康唑和质控菌株近平滑念珠菌atcc22019；s108：针对所述待筛选抗真菌化合物的适宜温度范围对所述待筛选抗真菌化合物进行培养；s109：通过培养结果确定最低抑菌浓度，选择得到靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂。本发明的靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，可以有效筛选出具有较强抑制真菌活性的药物，对于新一代防治真菌病新型药物的研究具有重要的意义。作为本发明的具体实施方式，在所述步骤s106中，所述受试菌株选自白假丝酵母菌y0109、白假丝酵母菌sc5314、近平滑假丝酵母菌atcc 22019、光滑假丝酵母菌537、新生隐球菌32609、石膏状小孢子菌cmccfmza、红色毛癣菌 cmccftla和烟曲霉菌07544中的至少一种。作为本发明的具体实施方式，在所述步骤s101中，所述真菌培养基至少选自rpmi 1640培养液、yepd培养液、沙堡葡萄糖琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基中的一种。
作为本发明的具体实施方式，在所述步骤s108中，白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌或近平滑假丝酵母菌在35℃静置培养24h；和/或，新隐球菌35℃静置培养72h；和/或，红色毛癣菌30℃静置培养4-7天；和/或，石膏状小孢子菌30℃静置培养4-7天；和/或，烟曲霉菌35℃静置培养24h。作为本发明的具体实施方式，所述抗真菌化合物为甲基-5-({5-硝基-1,3-噻唑
ꢀ‑
2-基}磺酰基)-1,3,4-噻二唑-2-基氨基甲酸叔丁酯，所述对照药物至少选自氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑和特比萘芬中的一种。作为本发明的具体实施方式，在所述步骤s 102中，配置浓度为2mg/ml 的氟康唑注射液，浓度为6.4mg/ml伊曲康唑、6.4mg/ml伏立康唑、6.4mg/ml 酮康唑、6.4mg/ml特比萘芬、1280μg/ml氟康唑母液。作为本发明的具体实施方式，在所述步骤s 102中，所述酵母菌悬液的制备方法包括如下步骤：将所述受试菌株于sda平皿上活化2次后将活化菌株划线接种于sda平皿，35℃培养24h，挑取直径大于1mm的菌落5个，将其溶解于灭菌三蒸水中，于振荡器上震荡15sec制备成菌悬液，再用血细胞计数板将菌悬液浓度用rpmi 1640培养液调整至1
×
106～5
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106cfu/ml，再将上述已经配置好的菌悬液用rpmi 1640培养液稀释1000倍，使其浓度介于1
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103～5
×
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3 cfu/ml之间。作为本发明的具体实施方式，在所述步骤s 102中，所述丝状真菌悬液的制备方法包括如下步骤：将所述受试菌株于pda平皿上活化7d，以诱导分生孢子以及孢囊孢子的形成；在孵育7d的菌落上加入含有0.01ml吐温20的0.85％盐水1ml，制备菌悬液；菌悬液静置3～5min后，取上层均质液体；用血细胞计数板将菌悬液浓度用rpmi 1640培养液调整至2
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106～1
×
107cfu/ml；将上述已经配置好的菌悬液用rpmi 1640培养液稀释1000倍，使其浓度介于 2
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103～1
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104cfu/ml之间。第二方面，本发明提出了所述的方法制备得到的靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂。第三方面，本发明提出了所述的方法在筛选抑制剂中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例的一种β-ca晶体结构；图2为图1的β-ca晶体结构的微观结构。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不构成对本发明的任何限制。实验材料和方法一、实验材料1、受试菌株试验用菌株如表1所示。表1、抗真菌活性体外筛选用受试菌株菌种名称species菌株编号
白假丝酵母菌candida albicansy0109白假丝酵母菌candida albicanssc5314近平滑假丝酵母菌candida parapsilosisatcc 22019光滑假丝酵母菌candida glabrata537新生隐球菌cryptococcus neoformans32609石膏状小孢子菌microsporum gypseumcmccfmza红色毛癣菌trichophyton rubrumcmccftla烟曲霉菌aspergillus fumigatus075442、真菌培养基(1)rpmi 1640培养液：rpmi1640(gibco brl，invitrogen)10g，nahco
3 2.0g，吗啉基丙磺酸(morpholinepropanesulfonic acid,mops,sigma) 34.5g(0.165m)，加三蒸水900ml溶解，1m naoh调ph至7.0 (25℃)，定容至1000ml，过滤除菌，4℃保存。(2)yepd培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水 900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。(3)沙堡葡萄糖琼脂培养基(sabouraud dextrose agar，sda)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整ph至7.0，定容至1000ml，115℃，高压灭菌，4℃保存。(4)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda培养基)：去皮马铃薯200g，葡萄糖 20g，琼脂20g。加三蒸水900ml溶解，定容至1000ml，高压灭菌， 4℃保存。3、抗真菌化合物及对照药物(1)t21化合物名称与分子式甲基-5-({5-硝基-1,3-噻唑-2-基}磺酰基)-1,3,4-噻二唑-2-基氨基甲酸叔丁酯(2)碳酸酐酶抑制剂-醋氮酰胺(aaz)
(5)将上述已经配置好的菌悬液用rpmi 1640培养液稀释1000倍，使其浓度介于1
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103～5
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103cfu/ml之间。丝状真菌菌悬液制备(1)将受试菌株于pda平皿上活化7d，以诱导分生孢子以及孢囊孢子的形成；(2)在孵育7d的菌落上加入含有0.01ml吐温20(1滴)的0.85％盐水1ml，制备菌悬液；(3)菌悬液静置3～5min后，大颗粒沉于底部，取上层均质液体(含孢囊孢子或分生孢子以及菌丝片段)；(4)用血细胞计数板将菌悬液浓度用rpmi 1640培养液调整至 2
×
106～1
×
107cfu/ml；计算公式：菌液浓度＝5个中方格内孢子数
×5×
104(5)将上述已经配置好的菌悬液用rpmi 1640培养液稀释1000倍，使其浓度介于2
×
103～1
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104cfu/ml之间。5、接种(1)取药敏板，于每排1号孔加rpmi 1640培养液200μl，作空白对照； 12号孔加待测菌液200μl，作阴性对照；药敏板每排2～11号孔分别加菌液180μl，充分混匀，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、 8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，各孔中dmso含量均低于1％； 12号孔不含药物，作阴性对照；(2)药敏板h排为氟康唑和质控菌株近平滑念珠菌atcc22019。6、培养(1)白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌35℃静置培养 24小时后观察结果。(2)新隐球菌35℃静置培养72小时后观察结果。(3)红色毛癣菌30℃静置培养4-7天后观察结果。(4)石膏状小孢子菌30℃静置培养4-7天后观察结果。(5)烟曲霉菌35℃静置培养24小时后观察结果。7、结果判读(1)吸光度测定判断法酶标仪检测96孔板吸光度值，与阴性对照孔相比，吸光度值下降80％为药物的最低抑菌浓度(mic)。(2)肉眼结果判定读取mic值时，应当在阅读镜的辅助之下，将每个受试孔中真菌的生长情况与生长对照孔相比较，进行评分，4分示：生长无抑制；3分示：生长轻微减少或相当于生长对照的75％；2分示：生长明显减少或相当于生长对照的50％；1分示：轻微生长或相当于生长对照的25％；0分示：肉眼观察澄清或未见生长。酵母菌待筛选化合物mic值判定为相当于生长对照有50％或更多的生长减少时的最低药物浓度(读数为2)。氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑和特比萘芬mic值判定为相当于生长对照有
50％或更多的生长减少时的最低药物浓度(读数为2)。丝状真菌待筛选化合物mic值判定为相当于生长对照有50％或更多的生长减少时的最低药物浓度(读数为2)。伏立康唑mic值判定为没有可见生长(读数为0)的最低药物浓度。氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、特比萘芬mic值判定为相当于生长对照有50％或更多的生长减少时的最低药物浓度(读数为2)。(3)本实验进行结果判定时，首先进行吸光度测定判断mic，并采用肉眼结果判定确认结果的可靠性。8、质量控制每块药敏板第h行为质控菌株和质控化合物，其目的在于监测药敏试验的准确度、精密度、所用试剂、测试条件以及仪器的情况，保证试验者的操作以及结果的准确客观。质控化合物采用氟康唑，质控菌株采用近平滑念珠菌atcc22019。近平滑念珠菌atcc22019 mic参考值如下表所示，只有当其mic值界于上述范围时，方认为试验操作准确可靠。同时，试验菌株生长良好，则可认为试验成功，结果可接受。9.t21与β-ca作用位点的预测选择蛋白质数据库(universal protein)中β-ca晶体结构作为对接模型，采用计算机辅助药物设计方法帮助进行药物筛选，即在进行生物活性筛选之前，利用计算机上的分子对接软件模拟目标靶点与化合物之间的相互作用，计算两者之间的亲和力大小，以降低实际筛选化合物数目，同时提高先导化合物发现效率。运用计算机辅助药物设计软件进行蛋白质结构转换和构象调整，进行分子力学优化，并由软件自动产生结合位点化合物的结构由软件产生，并进行3d结构优化。利用软件筛选和物化性质排除等方法，对接结果按能量由低到高排序，寻找可能与β-ca结合的小分子化合物，从而得到活性较高的化合物。三、结果1.t21体外抗真菌活性根据质量控制，本研究中每块药敏板均设有质控菌株及质控化合物，实验过程中质控化合物氟康唑mic波动范围不超过1个药物梯度浓度，均在clsi-m27a3和clsi-m38a2公布的质控菌株mic标准范围内，表明本研究中实验结果数据可靠。本研究采用clsi推荐的微量液基稀释法检测t21化合物对 8株常见致病真菌的最低抑菌浓度(mic)值，实验数据见表2。t21对y0109、 sc53148、新隐32609、光滑537和红毛cmccftla具有较强的抑制活性，其活性甚至优于常见的抗真菌药物(fcz)，对近平22019、烟曲07544和石小cmccfmz 真菌体外表
现一定的抑制活性。上述结果表明，t21具有很好的抑制真菌活性。表2系列化合物对常见致病真菌体外活性(mic,μg/ml)注：氟康唑(fcz)、伊曲康唑(icz)、伏立康唑(vcz)、酮康唑(kcz)、特比萘芬 (tbf)2.t21与β-ca相互作用β-ca晶体结构来自2w3n.pdb (https://pdbj.org/emnavi/quick.php？id＝pdb-2w3n)，β-ca晶体结构(如图1和图 2所示)分析发现，药物作用靶位腔穴很小、很浅，可能主要靠zn
2
的螯合作用，化合物上含有酸基团或含孤电子对的中性基团，利于与zn
2
作用。t21与β-ca 相互作用分析发现，其与β-ca的相互作用总能量达-27.94kcal/mol，相互作用亲和力高；而aaz与β-ca的相互作用总能量达-25.38kcal/mol，t21亲和活性好于阳性对照药物aaz(表3)。以上结果表明，t21可以与β-ca特异性结合，具有靶向β-ca抗真菌药物的作用。ca抗真菌药物的作用。表3 t21和醋氮酰胺(aaz)与β-ca相互作用比较在本发明中的提到的任何数值，如果在任何最低值和任何最高值之间只是有两个单位的间隔，则包括从最低值到最高值的每次增加一个单位的所有值。例如，如果声明一种组分的量，或诸如温度、压力、时间等工艺变量的值为50-90，在本说明书中它的意思是具体列举了51-89、52-88
……
以及69-71以及70-71等数值。对于非整数的值，可以适当考虑以0.1、0.01、0.001或0.0001为一单位。这仅是一些特殊指明的例子。在本技术中，以相似方式，所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合都被认为已经公开。应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉
及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。