以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用与流程

以
β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基
β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用。


背景技术：

2.5-羟基β-吲哚基丙氨酸广泛存在于豆科植物的种子中，其中非洲植物加纳的种子中含量最高。从加纳籽中提取和精制5-羟基β-吲哚基丙氨酸的基本工艺路线为：加纳籽粉碎—萃取—过滤离心—物理脱色—真空浓缩—结晶、重结晶—真空干燥。但随着非洲加纳树数量不断减少，传统提取法获得5-羟基β-吲哚基丙氨酸变得越来越困难，作为人体神经代谢途径中抵抗抑郁、缓解情感性精神障碍的天然药物，近年来5-羟基β-吲哚基丙氨酸的市场需求越来越大，依靠天然产物提取己难以满足市场需求，越来越多的企业开始从化学合成与生物发酵等方面研究5-羟基β-吲哚基丙氨酸的生产。
3.目前所报道的生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的合成方法，大部分是先合成β-吲哚基丙氨酸后再羟化其生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。β-吲哚基丙氨酸的生物合成方法目前已比较成熟。但是β-吲哚基丙氨酸羟化生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸需要有bh4为辅因子参与才能进行，而bh4难以储存且价格昂贵，这使得通过额外添加bh4以工业化生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸成为不可能。
4.而微生物中又没有bh4的合成路径，要想在微生物中合成则必须通过外源基因的加入。本发明通过对工程菌的bh4合成和再生能力的加强，并通过双bh4再生系统的应用，提高了5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题为提供5-羟基β-吲哚基丙氨酸高产菌株、构建以及以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
7.提供一种以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法，包括以下步骤：
8.1)利用所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因或能够表达合成β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌，以β-吲哚基丙氨酸为底物，生物发酵合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸，所述的能够表达合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因包括β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因tph2；bh4合成基因fole、ptps、spr；bh4再生酶基因包括pcd基因、qbh2产bh4再生酶基因qdpr和bh2产bh4再生酶基因dhfr；
9.2)从1)的体系中分离得到5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
10.按上述方案，pcd基因的核苷酸序列如seq id no:5所示，qbh2产bh4再生酶基因qdpr的核苷酸序列如seq id no:6-10中任一序列所示；bh2产bh4再生酶基因dhfr的核苷酸
序列如seq id no:11-15中任一序列所示。
11.优选地，所述bh2产bh4再生酶基因qdpr的核苷酸序列如seq id no:6，和seq id no:8中任一序列所示；bh2产bh4再生酶基因dhfr的核苷酸序列如seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14中任一序列所示。
12.更优选地，所述bh2产bh4再生酶基因qdpr的核苷酸序列如seq id no:8所示；bh2产bh4再生酶基因dhfr的核苷酸序列如seq id no:14所示。
13.按上述方案，β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因tph2的核苷酸序列如seq id no:1所示；
14.bh4合成途径关键酶基因fole、ptps、spr的核苷酸序列如seq id no:2-4所示。
15.按上述方案，所述的步骤1)为将所构建的重组菌经过活化培养后，转接至发酵培养基诱导表达后，以β-吲哚基丙氨酸为底物转化生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
16.具体的，上述方法为：将所构建的重组基因工程菌分别经过lb培养基活化培养后，得到种子液，将种子液转接至发酵培养基，发酵后加入iptg诱导，并加入β-吲哚基丙氨酸，发酵转化生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
17.进一步地，所述种子液od600＝5；
18.所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物；
19.所述种子液的培养条件为28-40℃，160-230rpm，优选为37℃，225rpm；
20.所述种子液接入发酵培养基的比例为1％-10％，优选比例为2％；
21.所述发酵培养基的组成(质量百分比)为：1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％kh2po4和1.64％k2hpo4·
3h2o；
22.所述进行诱导前的发酵时间为1-5h，优选为2h；
23.所述iptg的终浓度为0.1-10mm，优选为1mm；
24.所述诱导表达的条件为16-37℃，优选为30℃；
25.所述反应体系β-吲哚基丙氨酸浓度为1-50g/l，优选10g/l；
26.所述发酵时间为18-72h，优选为24-66h，更优选为36-48h。
27.本发明还提供bh4再生酶基因，所述的bh4再生酶基因包括bh2产bh4再生酶基因dhfr，核苷酸序列如seq id no:11-15中任一序列所示。
28.按上述方案，所述的bh4再生酶基因还进一步包括pcd基因、qbh2产bh4再生酶基因qdpr，pcd基因的核苷酸序列如seq id no:5所示，qbh2产bh4再生酶基qdpr的核苷酸序列如seq id no:6-10中任一序列所示。
29.本发明还提供一种以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的工程菌，包含合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因，所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因包括β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因tph2；bh4合成基因fole、ptps、spr；上述bh4再生酶基因。
30.本发明同时提供一种上述基因工程菌的构建方法：β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因tph2，bh4合成基因fole、ptps、spr放入同一质粒串连表达；bh4再生酶基因pcd、qdpr、dhfr放入同一质粒串连表达；将上述质粒共同转化至宿主细胞中，得到重组基因工程菌。
31.进一步地，所述的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，优选为bl21(de3)。
32.本发明的有益效果：
33.本发明通过构建双bh4再生系统工程菌，提供的5-羟基β-吲哚基丙氨酸高产菌株，用于以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸，5-羟基β-吲哚基丙氨酸的合成产量高。
34.进一步通过qbh2产bh4再生酶基因qdpr(二氢喋呤还原酶)的筛选和bh2产bh4再生酶基因dhfr(二氢叶酸还原酶)不同物种来源的同功酶组合筛选，可进一步显著提升了生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量。
附图说明
35.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
36.图1：pet28a-h2fps质粒图谱
37.图2：pacycduet-pq质粒图谱
38.图3：pacycduet-pqf质粒图谱
39.图4：双bh4再生系统以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸路线示意图；
具体实施方式
40.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
41.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
42.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
43.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
44.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
45.大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。下述以大肠杆菌出发，通过改造大肠杆菌以实现发酵法高效大规模工业化生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
pq4、pacycduet-pq5。(如图2)
58.表1引物序列1
[0059][0060][0061]
单bh4再生酶产5-羟基β-吲哚基丙氨酸菌株的构建和筛选
[0062]
将质粒pet28a-h2fps分别与pacycduet-pq1、pacycduet-pq2、pacycduet-pq3、pacycduet-pq4、pacycduet-pq5电转化入大肠杆菌bl21(de3)感受态中，得到工程菌kc011、kc012、kc013、kc014、kc015。将工程菌kc011、kc012、kc013、kc014、kc015分别在含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素抗生素的种子培养基中培养10h，得到种子液，所述种子液的od
600
＝5，所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物，所述种子液的培养条件为37℃，225rpm；将2％的上述种子液接种到含有1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％kh2po4和1.64％k2hpo4·
3h2o的发酵培养基(质量百分比)中进行发酵培养；发酵培养2h后，加入终浓度1mm iptg进行诱导表达，诱导表达的温度为30℃，加入终浓度为10g/l的β-吲哚基丙氨酸。发酵转化，利用高效液相色谱检测5-羟
基β-吲哚基丙氨酸的产量。
[0063]
结果如表所示，其中：工程菌kc011、kc013产5-羟基β-吲哚基丙氨酸的初始速度高于其他菌株，并且工程菌kc013持续产5-羟基β-吲哚基丙氨酸优于kc011，表明：编号q3的qdpr再生bh4能力最好。
[0064]
表2：不同qdpr菌株产量比较
[0065][0066]
实施例2双bh4再生系统工程菌的构建和筛选
[0067]
进一步将上述bh4再生关键基因qdpr和dhfr组合，形成双bh4再生系统，评价筛选这些不同基因组合的工程菌合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的效果。具体以seq id no：5所示的pcd基因和seq id no：8所示的qdpr基因为例构建双bh4再生系统。
[0068]
基于双bh4再生系统，以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸路线如图4所示。
[0069]
双bh4再生系统关键基因pcd、qdpr和不同dhfr的串连表达：
[0070]
选择不同来源的dhfr基因经过密码子优化人工合成得到f1-f5(序列依次如seq id no:11-15所示)，将f1-f5基因插入到pacycduet质粒的ncoi和aflⅱ位点之间，获得pacycduet-f1、pacycduet-f2、pacycduet-f3、pacycduet-f4、pacycduet-f5、质粒。
[0071]
以pacycduet-p-f、pacycduet-pq3-r为引物，pacycduet-pq3质粒为模板克隆获得含pcd和q3基因的pacycduet质粒载体；以f1-f、f1-r，f2-f、f2-r，f3-f、f3-r，f4-f、f4-r，f5-f、f5-r，为引物，分别以质粒pacycduet-f1、pacycduet-f2、pacycduet-f3、pacycduet-f4、pacycduet-f5为模板克隆获得f1-f5基因片段。
[0072]
将f1-f5基因片段与含pcd和q3基因的pacycduet质粒载体通过无缝克隆试剂盒连接在一起，形成质粒pacycduet-pq3f1、pacycduet-pq3f2、pacycduet-pq3f3、pacycduet-pq3f4、pacycduet-pq3f5。(如图3)表3引物序列2
[0073][0074]
双bh4再生酶产5-羟基β-吲哚基丙氨酸菌株的构建和筛选
[0075]
将质粒pet28a-h2fps分别与pacycduet-pq3f1、pacycduet-pq3f2、pacycduet-pq3f3、pacycduet-pq3f4、pacycduet-pq3f5电转化入大肠杆菌bl21(de3)感受态中，得到工程菌kc021、kc022、kc023、kc024、kc025。将工程菌kc021、kc022、kc023、kc024、kc025分别在含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素抗生素的种子培养基中培养10h，得到种子液，所述
种子液的od
600
＝5，所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物，所述种子液的培养条件为37℃，225rpm；将2％的上述种子液接种到含有1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％kh2po4和1.64％k2hpo4·
3h2o的发酵培养基(质量百分比)中进行发酵培养；发酵培养2h后，加入终浓度1mm iptg进行诱导表达，诱导表达的温度为30℃，加入终浓度为10g/l的β-吲哚基丙氨酸。发酵转化，利用高效液相色谱检测5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量。
[0076]
结果如表所示，其中：工程菌kc021、kc022、kc023、kc024产5-羟基β-吲哚基丙氨酸的初始速度高于其他菌株，而工程菌kc023、kc024持续产5-羟基β-吲哚基丙氨酸优于kc021、kc022，且确定编号f4的dhfr与q3组合再生bh4能力最好，可以保证产物持续高效生产。
[0077]
表4：不同dhfr菌株产量比较
[0078][0079]
本发明通过对β-吲哚基丙氨酸羟化基因tph2；bh4合成基因fole、ptps、spr；bh4再生基因pcd、qdpr、dhfr的配合、构建获得了以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的工程菌，用于以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
[0080]
进一步的通过bh4再生途径关键酶基因qdpr的筛选和新的bh4再生途径关键酶基因dhfr的组合筛选，构建的双bh4再生系统显著提升了生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量。为高效大规模工业化生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸提供了条件。