一种树脂以PEG为间隔基共价结合氨基酸的方法与流程

一种树脂以peg为间隔基共价结合氨基酸的方法
技术领域
1.本发明属于树脂吸附材料领域，具体涉及一种树脂以peg为间隔基共价结合氨基酸的方法。


背景技术：

2.血液灌流法是指血液借助体外循环通过具有固定特异性配体的吸附剂装置，清除血液中的内源性或外源性致病物质达到血液净化的目的，相较于涂层、包埋等，吸附剂上共价结合的特异性配体更稳定，不易脱落。
3.聚苯乙烯树脂因其化学性质稳定，价格低廉，易加工成型，年产量高得以广泛应用，是目前血液灌流中主要吸附材料。为了共价结合特异性配体，目前一般将聚苯乙烯树脂氯甲基化引入氯甲基活性官能团，或者采用市售的氯甲基化聚苯乙烯树脂为原料，再直接与氨基酸、蛋白、酶等进行共价结合。该方法氨基酸等的负载量较低，限制了其部分应用。
4.目前peg-树脂，多以市场上售卖的氯甲基化聚苯乙烯树脂为原料，在氢化钠或萘钠作用下与peg相连，但其反应条件苛刻后改用氢氧化钠水溶液作为碱液，然而采用碱液的反应时间过长。


技术实现要素：

5.为提高树脂上共价结合氨基酸的负载量，本发明提供一种树脂以peg为间隔基共价结合氨基酸的方法。
6.本发明实现上述目的所采用的技术方案如下：
7.一种树脂以peg为间隔基共价结合氨基酸的方法，包括以下步骤：
8.(1)提供peg-树脂；
9.(2)用对羟基苯甲醛在peg-树脂上固定醛基，得到cho-ph-peg-树脂；
10.(3)将cho-ph-peg-树脂的醛基还原，得到ch2oh-ph-peg-树脂；
11.(4)ch2oh-ph-peg-树脂和氨基被保护的氨基酸在4-二甲氨基吡啶和二异丙基碳二亚胺的作用下反应，得到共价结合氨基酸的树脂。
12.优选地，peg-树脂采用以下方法获得：氯甲基化聚苯乙烯树脂与聚乙二醇在碱的作用下反应，得到所述peg-树脂，所述反应采用微波辐射加热，温度为160～180℃，时间为10～20min，重复加热1～2次。
13.优选地，所述聚乙二醇的数均分子量为200～600。
14.优选地，所述碱的用量为氯甲基化聚苯乙烯树脂的20～40wt％。
15.在peg-树脂的制备过程中，聚乙二醇即起到接枝反应物的作用，又起到反应溶剂的作用，优选地，聚乙二醇的用量为氯甲基化聚苯乙烯树脂质量的5～20倍。
16.优选地，所述碱为氢氧化钠。
17.步骤(2)中，用对羟基苯甲醛在peg-树脂上固定醛基的步骤包括：
18.peg-树脂和对羟基苯甲醛在三苯基膦、n,n-二异丙基乙胺(dipea)、偶氮二羧酸二
异丙酯(diad)的作用下反应，得到cho-ph-peg-树脂。
19.上述反应中，三苯基膦起活化剂的作用，n,n-二异丙基乙胺起缩合剂的作用，偶氮二羧酸二异丙酯起催化剂的作用。
20.优选地，所述对羟基苯甲醛与peg-树脂的质量比为0.5～0.7:1。
21.优选地，所述三苯基膦、n,n-二异丙基乙胺、偶氮二羧酸二异丙酯和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:1:1:1。更优选地，所述反应在室温下进行，时间20h以上。
22.步骤(2)还包括：cho-ph-peg-树脂与醋酸酐在吡啶催化下反应，以封闭cho-ph-peg-树脂上未反应的残余羟基。
23.优选地，所述吡啶、醋酸酐和peg-树脂的质量比为0.9～1.1:0.9～1.1:1。更优选地，所述反应时间为10～20min。
24.优选地，步骤(3)中，用硼氢化钠还原cho-ph-peg-树脂。
25.优选地，先将cho-ph-peg-树脂加入溶剂中，再加入过量的硼氢化钠进行还原反应。
26.更优选地，所述溶剂为体积比为1:3～4的甲醇和四氢呋喃，反应时间10h以上。
27.优选地，步骤(4)中，所述4-二甲氨基吡啶、二异丙基碳二亚胺和ch2oh-ph-peg-树脂的质量比为0.05～0.15:0.3～0.5:1。更优选地，所述反应在室温下进行，时间10h以上。
28.在上述反应中，4-二甲氨基吡啶起催化剂的作用，二异丙基碳二亚胺起缩合剂的作用。
29.优选地，步骤(4)中，氨基被保护的氨基酸的用量相对ch2oh-ph-peg-树脂保持过量。
30.优选地，所述氨基被保护的氨基酸为fmoc-l-苯丙氨酸。
31.优选地，fmoc-l-氨基酸的负载量在0.14mmol/g以上，更优选地为0.14～1.15mmol/g。
32.一种用于吸附净化内毒素的树脂，其化学结构式为：
[0033]33.表示树脂基体，n＝4～14。
附图说明
[0034]
图1为peg-树脂共价结合氨基酸的流程示意图。
具体实施方式
[0035]
以下结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
[0036]
氯甲基化聚苯乙烯树脂、peg-树脂可自制或采用市售产品。
[0037]
fmoc表示9-芴甲氧羰基
[0038]
peg表示聚乙二醇
[0039]
ph表示苯环
[0040]
实施例1
[0041]
一：氯甲基化聚苯乙烯树脂
[0042]
①
制备1,4-二氯甲氧基丁烷(dcmb)：取30ml 1,4-丁二醇和75ml甲醛加入到250ml的四口烧瓶中，15℃冰浴，边搅动边滴加pcl3。3h后移至分液漏斗，将上层用无水硫酸钠干燥，通过减压蒸馏即获得高纯度dcmb。
[0043]
②
将聚苯乙烯大孔吸附树脂分别在乙醇、40％氢氧化钠碱液中浸泡4h，去除杂质，清洗干净备用。
[0044]
③
在装有搅拌器和回流冷凝装置的四口烧瓶中，放入5g树脂，加入30ml ch2cl2作为溶剂，加入1.5ml 0.013mm sncl4作为催化剂，13ml bcmb，室温(25℃)下搅拌24h。
[0045]
④
反应结束后，分别用1mol/l盐酸和乙醇洗涤二次，最后用1,4-二氧六环、蒸馏水依次冲洗至无氯(用0.1mol/l硝酸银溶液检测)，即得到氯甲基化聚苯乙烯树脂。
[0046]
二：微波辅助法制备peg-树脂
[0047]
①
取10g氯甲基化聚苯乙烯树脂和3g固体氢氧化钠，放于过量的120ml纯peg200中。
[0048]
②
按照功率600w、温度170℃、时间15min，进行第一次微波辐射。
[0049]
③
第一次微波辐射结束后，冷却至室温，重复一次微波照射，冷却后抽滤。
[0050]
④
用去离子水，2mol/l盐酸，甲醇依次冲洗，循环洗涤4-5次。
[0051]
⑤
烘干后得peg-树脂。重复实验三次，结果见表1。
[0052]
现有naoh法：
[0053]
①
取10g氯甲基化聚苯乙烯树脂和3g固体氢氧化钠，放入过量的60ml纯peg200中，加入60ml二氧六环使其充分溶胀。
[0054]
②
充分溶胀后，加热，于80℃，反应10h。
[0055]
③
捞出树脂用去离子水，2mol/l盐酸，甲醇依次冲洗，循环洗涤4-5次。
[0056]
④
烘干后得peg-树脂。重复实验三次，结果见表1。
[0057]
表1不同方法peg的接枝量对比
[0058][0059]
peg的枝接量以每克树脂增加的质量计算，相较于现有naoh法，微波辅助法的反应时间可由10h缩短至0.5h，且每克树脂增加量从0.150g/g提高到0.185g/g。
[0060]
三：负载fmoc-氨基酸，流程如图1所示，具体操作过程如下：
[0061]
1)用对羟基苯甲醛在peg-树脂上固定醛基
[0062]
具体的反应如下：
[0063][0064]
①
称取4g peg-树脂、20mmol对羟基苯甲醛和20mmol三苯基膦于40ml四氢呋喃(thf)中。
[0065]
②
注入20mmol n,n-二异丙基乙胺(dipea)，冰浴20min。
[0066]
③
用10ml thf溶解20mmol偶氮二羧酸二异丙酯(diad)，缓慢注入上述混合体系中。
[0067]
④
注入完毕后，冰浴0.5h后，室温搅拌反应24h。然后用乙醇，thf，去离子水循环冲洗树脂4遍，烘干。
[0068]
⑤
将上述树脂加入4ml吡啶，4ml醋酸酐，12ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，10min后用乙醇，thf，去离子水循环冲洗4遍，烘干，得cho-ph-peg-树脂。红外光谱显示，改性后的树脂在1690cm-1
处增加个吸收峰，此处是醛基吸收峰，表明改性成功。
[0069]
2)醛基还原
[0070]
①
将4g cho-ph-peg-树脂，放入8ml甲醇与30ml thf中。
[0071]
②
冰浴5min后，加入0.5g nabh4，搅拌，4h后室温反应12h。
[0072]
③
倒出树脂，放入2mmol/l盐酸中，淬灭反应。
[0073]
④
捞出树脂，用甲醇，dmf循环清洗4遍，真空抽干，得到ch2oh-ph-peg-树脂。
[0074]
3)负载各种氨基酸，以负载fmoc-l-苯丙氨酸为例
[0075]
①
取0.5g上述ch2oh-ph-peg-树脂，1.5mmol fmoc-l-苯丙氨酸溶于5ml ch2cl2中。
[0076]
②
加入50mg 4-二甲氨基吡啶(cas:1122-58-3)，0.5ml dmf，冰浴10min。
[0077]
③
加入200mg二异丙基碳二亚胺(dic)，搅拌30min后，室温放置10h。
[0078]
④
反应完毕后，用dmf，去离子水冲洗4遍，真空干燥，得到共价结合苯丙氨酸的树脂。重复实验三次，结果见表2。红外光谱显示，改性后的树脂在1600cm-1
处有明显吸收峰，此处是氨基酸coo-吸收峰，表明改性成功。
[0079]
与直接共价结合氨基酸相比，以peg为间隔基共价结合氨基酸，其负载量大大提高。如fmoc-l-苯丙氨酸从0.082mmol/g提高到0.144mmol/g如下：
[0080]
表2本发明方法和现有方法氨基酸负载量的对比
[0081][0082]
其中，对比1的制备过程如下：
[0083]
①
取0.5g上述氯甲基化聚苯乙烯树脂于5.5ml dmf中，加入1.5mmol fmoc-l-苯丙
氨酸，混合摇匀。
[0084]
②
加入92mg k2co3和2mg ki，70℃恒温空气浴反应24h。
[0085]
③
依次用dmf、无水乙醇，无水乙醚冲洗两次，真空干燥至恒重。重复实验三次，结果见表2。
[0086]
氨基酸的负载量按1000*
△
m/(m-x)/0.5计算，
△
m为树脂负载氨基酸前后的质量差值，m为所用保护氨基酸的相对分子质量，x由化学反应式决定(氯甲基化聚苯乙烯树脂为hcl取36.5，实施例1为h2o取18)
[0087]
内毒素净化能力测试
[0088]
将0.5g实施例1所制备的共价结合苯丙氨酸的树脂放入到5ml 10eu/ml的内毒素生理盐水中，37℃摇2h，测试对内毒素的吸附量(eu/g树脂)，以氯甲基化聚苯乙烯树脂和peg-树脂直接负载苯丙氨酸作为对照样，结果见表3。
[0089]
相比于对照(peg-树脂直接负载苯丙氨酸)其吸附量从27.7eu/g提高到53.1eu/g如下。
[0090]
表3不同树脂对内毒素的吸附量
[0091][0092]
对比1：即用氯甲基化聚苯乙烯树脂直接负载苯丙氨酸，具体负载过程见上文。
[0093]
对比2：即用peg-树脂直接负载苯丙氨酸，具体负载过程与实施例1的步骤3)相同，区别在于用实施例1步骤1)中的peg-树脂直接替代步骤3)中的ch2oh-ph-peg-树脂。
[0094]
从表3的结果可以看出，在peg和苯丙氨酸之间引入苯环后，可显著提高树脂对内毒素的净化能力。
[0095]
实施例2
[0096]
以氯甲基化聚苯乙烯树脂为基体共价结合苯丙氨酸，制备过程同实施例1的步骤二至三，区别在于用peg600替代peg200。
[0097]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。