用于鉴定白色茶薪菇品种ZJCXG001的EST-SSR分子标记及其应用的制作方法

用于鉴定白色茶薪菇品种zjcxg001的est-ssr分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于食用菌分子生物学技术领域，具体涉及一种用于鉴定白色茶薪菇品种zjcxg001的est-ssr分子标记及其应用。


背景技术：

2.茶薪菇cyclocybe chaxingu隶属于担子菌门，蘑菇目，假脐菇科，环伞属cyclocybe。别名油茶菇、茶菇，商业名统称茶树菇。茶薪菇盖肥柄脆，油茶香气浓郁，味道鲜美，其不仅营养丰富，蛋白质含量高，含有 8 种人体必需氨基酸；还具有清热、平肝、利尿和健脾等功效。在民间，有人用来治疗胃寒、腰痛、肾虚尿频、水肿等疾病，素有“中华神菇”之美誉。据统计，2020年我国茶薪菇年产量约92.23万吨，居主要食用菌品种第8位，是我国主栽食用菌之一，具有重要的经济价值。目前，我国茶薪菇干品主要产区为福建和江西；浙江、湖北、云南、北京等省市是鲜品重要产区。栽培品种以黑茶3号、黑茶5号、古田2号为主，多为黄褐色至黑褐色。随着茶薪菇产业的不断发展，以及消费者对品种的需求增加，茶薪菇白色品种越来越受消费者的欢迎，其已经在江西广昌等地区有少量栽培。
3.目前，我国茶薪菇白色品种以白茶6号为主，由于其生产周期长，茬数多，产量较低，至今尚未实现工厂化栽培，严重阻碍了其产业的发展；另一方面，传统的栽培方式和菌株老化退化现象对茶薪菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、精准的菌株鉴定技术，以保证每批次使用的都是优质、准确的菌种。为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。本研究单位前期做了很多工作，以白茶6号为亲本，通过单孢杂交选育出一株适合工厂化栽培的白色茶薪菇菌株“中菌白茶1号”（zjcxg001）。
4.近年快速增长的表达序列标签（est，expressed sequence tags）数据已成为简单重复序列（ssr，simple sequence repeats）引物设计的重要来源，由此而生的est-ssr分子标记是基于表达序列标签开发微卫星的一种新型分子标记。与基因组ssr相比，est-ssr这种新型分子标记，凭借依赖于est-ssr侧翼序列的保守性和ssr进化的稳定性，从而保证了est-ssr引物在不同物种间的高通用性，est-ssr具有在物种之间转移性较高的优点，不同物种间est-ssr引物的通用性就可显著提高该标记的利用价值及增加现有标记数目，而传统基因组来源的ssr在物种之间的通用性很差。
5.现有关茶薪菇菌种研究的报道都是涉及菌株遗传多样性、菌种扩繁方法等，而基于茶薪菇的est-ssr分子标记开发的研究，尚未见报道。因此，针对上述茶薪菇产业发展现状，利用现代分子生物学技术开发精准有效的茶薪菇菌株鉴定体系是一项极为重要的工作。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的在于提供一种用于鉴定白色茶薪菇品种zjcxg001的est-ssr分
子标记组合物，本发明的第二目的在于提供所述est-ssr分子标记组合物在鉴定白色茶薪菇品种zjcxg001中的应用。
7.本发明的第一目的是这样实现的，用于鉴定白色茶薪菇品种zjcxg001的est-ssr分子标记由以下2对est-ssr分子标记组合组成：aba001和aba079；所述est-ssr分子标记的引物序列分别为：aba001-f：accaacgacagacaacacca；aba001-r：cgaaccagtcgtaccctcat；aba079-f：ctggtactgcgcagcaaata；aba079-r：tcgttggtggatcttcttcc。
8.本发明的第二目的是这样实现的，所述est-ssr分子标记在鉴定白色茶薪菇品种zjcxg001中的应用具体按以下步骤实现：s1、菌丝培养：将待检测茶薪菇菌株转接到pda固体培养基上，23-25℃培养7-9d后收集菌丝；s2、基因组总dna的提取：提取所述菌丝的基因组dna，紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和质量；s3、est-ssr分子标记扩增：采用所述est-ssr分子标记组合物对步骤2提取的dna进行est-ssr标记的pcr扩增；s4、比对分析：将s3得到的扩增产物进行毛细管电泳检测，分析est-ssr引物扩增出的等位片段的数量及分子量大小编号，毛细管电泳中通过分子量内标gs-500liz可确定各est-ssr引物扩增的等位位点的相对分子量，获得不同est-ssr等位片段的编号组合，符合est-ssr等位片段编号组合的菌种即为白色茶薪菇zjcxg001菌株。
9.本发明的有益效果是：1、本发明首次基于茶薪菇转录组测序数据，提供的白色茶薪菇zjcxg001菌株的两对est-ssr分子标记在供试的10个茶薪菇菌株（包括bc6h、gc2h、hc3h、hc5h、lqm-ncys、lqm23-smys、lqm25-smys、lqm7、lqm9、zjcxg001）中具有白色茶薪菇zjcxg001菌株的专一性。用本发明提供的引物组合，可方便快速地将白色茶薪菇zjcxg001菌株和亲本白茶6号（bc6h）及其它8个黑褐色品种区分开，具有节约成本、提高效率、操作方便、结果准确的优势，可用于白色茶薪菇zjcxg001菌株的快速鉴定，具有良好的应用前景。
10.2、本发明提供的白色茶薪菇zjcxg001菌株的精准鉴定方法，可以避免己选育出的白色茶薪菇优良菌种在生产经营和市场流通过程中与其它同品种混杂，从而有效保护其知识产权，对茶薪菇生产过程中品种的真实性鉴定有着重要意义。
附图说明
11.图1为引物aba001分别在所选白色茶薪菇zjcxg001菌株和9种茶薪菇菌种bc6h、gc2h、hc3h、hc5h、lqm-ncys、lqm23-smys、lqm25-smys、lqm7、lqm9中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图2为引物aba079分别在所选白色茶薪菇zjcxg001菌株和9种茶薪菇菌种bc6h、gc2h、hc3h、hc5h、lqm-ncys、lqm23-smys、lqm25-smys、lqm7、lqm9中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图3为基于est-ssr分子标记构建的10株茶薪菇菌种遗传距离upgma聚类树。
具体实施方式
12.下面结合附图与实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
13.本发明提供了一种用于鉴定茶薪菇品种的est-ssr分子标记，由aba001和aba0792对est-ssr分子标记组合组成；所述est-ssr分子标记的引物序列信息如表1所示。
14.表1 2对est-ssr标记引物信息用于鉴定茶薪菇品种的est-ssr分子标记组合物，由以下2对est-ssr分子标记组合组成：aba001和aba079；所述est-ssr分子标记的引物序列分别为：aba001-f：accaacgacagacaacacca；aba001-r：cgaaccagtcgtaccctcat；aba079-f：ctggtactgcgcagcaaata；aba079-r：tcgttggtggatcttcttcc。
15.2对 ssr引物的等位片段数量及分子量大小信息如下：表2 est-ssr标记引物扩增的等位片段信息本发明还提供了所述金耳est-ssr分子标记在鉴定茶薪菇品种中的应用，具体茶薪菇品种的鉴定方法按以下步骤实现：s1、菌丝培养：将待检测茶薪菇菌株转接到pda固体培养基上，23-25℃培养7-9d后收集菌丝；s2、基因组总dna的提取：提取所述菌丝的基因组dna，紫外分光光度法检测总基因
组dna浓度和质量；s3、est-ssr分子标记扩增：采用所述est-ssr分子标记组合物对步骤2提取的dna进行est-ssr标记的pcr扩增；s4、比对分析：将s3得到的扩增产物进行毛细管电泳检测，分析est-ssr引物扩增出的等位片段的数量及分子量大小编号，毛细管电泳中通过分子量内标gs-500liz可确定各est-ssr引物扩增的等位位点的相对分子量，获得不同est-ssr等位片段的编号组合，符合est-ssr等位片段编号组合的菌种即为白色茶薪菇zjcxg001菌株。
16.本发明还提供了一种用于鉴别白色茶薪菇品种zjcxg001的试剂盒，该试剂盒仅含有所述est-ssr分子标记组合的特异性引物组合。
17.实施例1 鉴定白色茶薪菇zjcxg001菌株一、试验方法1、dna提取将10个供试茶薪菇菌株（bc6h、gc2h、hc3h、hc5h、lqm-ncys、lqm23-smys、lqm25-smys、lqm7、lqm9、zjcxg001）转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃培养7-9d后收集菌丝，采用磁珠法植物基因组dna提取试剂盒配套自动化工作站对茶薪菇样本进行基因组dna提取。
18.2、pcr扩增采用2对est-ssr分子标记对提取的dna进行est-ssr标记的pcr扩增；pcr扩增体系为：总体积10ul，包括：2
×
taq pcr master mix5ul，10umol/l ssr标记正向引物和反向引物各0.5ul，模板dna 1ul，ddh2o 3ul。
19.pcr反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30s，62-52℃梯度退火30s，72℃延伸30 s，运行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，25个循环，72℃ 延伸30 s；72℃延伸20 min。为保证鉴定的准确性，进行三次重复实验。
20.3、将扩增产物进行毛细管电泳检测：1）将hi-di formamide缓存液与genescan 500liz size standard内标试剂按13：1混合，配成mix；2）用384孔反应板分装mix，每个孔中加入9ul mix；3）对应着在384孔板中加入1ul样品模板，离心到4000 rpm即停；4）用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20℃；5）冷却后拿出，4000 rpm离心，解冻、混匀；6）使用3730测序仪进行毛线管电泳，加样量为2ul样品和6ul溴酚蓝，电压为300v，时间12分钟。
21.二、结果分析：1、毛细管电泳的荧光检测峰值图对比分析将其他9个茶薪菇菌种的电泳检测峰值图与白色茶薪菇zjcxg001菌株的电泳检测峰值图进行对比（图1-2），白色茶薪菇zjcxg001菌株与其他9个菌种的每个荧光标记出现的峰均不重叠，清晰可辨。图1为引物aba001扩增的结果，zjcxg001和9种茶薪菇菌种bc6h、gc2h、hc3h、hc5h、lqm-ncys、lqm23-smys、lqm25-smys、lqm7、lqm9对应的片段大小依次为157、（157，161）、153、153、（157，161）、153、155、153、157、153；图2为引物aba079扩增的结
果，白色茶薪菇zjcxg001菌株和9种茶薪菇菌种bc6h、gc2h、hc3h、hc5h、lqm-ncys、lqm23-smys、lqm25-smys、lqm7、lqm9对应的片段大小依次为225、228、216、216、228、222、222、222、228、216；图1和图2的结果说明本发明提供的2对est-ssr分子标记引物能够精准地将白色茶薪菇zjcxg001菌种与和亲本白茶6号（bc6h）及其它8个黑褐色品种区分开。
22.2、2对ssr引物扩增出的条带组合分析将2对est-ssr引物在10个供试茶薪菇菌种中扩增出的等位片段根据分子量大小进行编码，并进行编号组合。bc6h、gc2h、hc3h、hc5h、lqm-ncys、lqm23-smys、lqm25-smys、lqm7、lqm9对应的编号组合为（3 4）/4、1/1、1/1、（3 4）/4、1/2、2/2、1/2、3/4、1/1。而符合编号组合3/3的菌株即为白色茶薪菇zjcxg001菌株。
23.3、聚类分析基于2对est-ssr扩增出的多态性片段对10个茶薪菇菌种菌种进行遗传多样性分析，基于nei的遗传距离，构建了10个茶薪菇菌种的upgma聚类树（图3）。从图3可知，本发明提供的2对引物将白色茶薪菇zjcxg001与其它9个供试茶薪菇菌种区分在不同的聚类枝上，且白色茶薪菇zjcxg001菌种为单独的一枝，完全和亲本白茶6号（bc6h）及其它8个黑褐色品种区分开。
24.由此可见，本发明提供的茶薪菇est-ssr引物组合可以应用于白色茶薪菇zjcxg001菌株的鉴定。