一种区分革兰阴性杆菌中碳青霉烯酶的检测试剂与方法与流程

1.本发明属于碳青霉烯酶酶型的检测技术领域，具体涉及一种区分革兰阴性杆菌中碳青霉烯酶的检测试剂与方法。


背景技术：

2.抗菌药物的不合理使用及滥用，导致细菌对其的耐药率快速上升。自2005年开始，临床分离的革兰阴性杆菌对重要抗菌药物尤其是碳青霉烯类药物的耐药率快速上升。国内30所医院临床分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率平均值为15％，部分医院可高达50％。研究表明，细菌对碳青霉烯类药物的最主要耐药机制是产碳青霉烯酶，目前我国主要流行的产酶类型是kpc型和ndm型碳青霉烯酶。对于碳青酶烯类耐药菌株，临床上可选择的抗菌药物非常有限，且不同产酶类型的菌株对有限的抗菌药物的敏感性亦不同，因此产酶菌株的快速和准确筛选对临床的抗感染治疗选择药物具有重要的参考价值。在美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute，clsi)推荐用于肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌中kpc型和ndm型碳青霉烯酶检测的实验室方法是改良碳青霉烯酶灭活试验(mcim)和添加edta的碳青霉烯酶灭活试验(ecim)，但在临床应用中发现，这两种方法对于同时产kpc型和ndm型碳青霉烯酶的菌株检测效果不好，存在漏检现象。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明提供了一种区分革兰阴性杆菌中碳青霉烯酶的检测试剂与方法，针对革兰阴性杆菌中的碳青霉烯酶的检测进行研究，开发了可用于碳青霉烯酶的r1溶液和r2溶液，其与与亚胺培南纸片配套使用于药敏试验中，能准确检测出单产a类kpc型碳青霉烯酶和单产b类ndm型金属酶，以及同时产a类和b类碳青霉烯酶的菌株，为临床合理选择碳青酶烯类耐药菌株的抗菌药物提供强有力的依据。
4.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
5.一种区分革兰阴性杆菌中碳青霉烯酶的检测试剂，包括a类碳青霉烯酶抑制剂r1溶液以及b类金属酶抑制剂r2溶液，所述a类碳青霉烯酶抑制剂r1溶液的浓度为30-80mg/ml，所述b类金属酶抑制剂r2溶液的浓度为0.15-0.25mol/l。
6.作为本发明的一种优选方案，a类碳青霉烯酶抑制剂r1溶液为3-氨基苯硼酸溶液，b类金属酶抑制剂r2溶液为edta溶液。
7.本发明还提供了一种检测区分革兰阴性杆菌中碳青霉烯酶的方法，包括以下步骤：
8.1)配置a类碳青霉烯酶抑制剂r1溶液以及b类金属酶抑制剂r2溶液；
9.2)于血琼脂平板上划线纯分受试细菌，孵育18-24h；
10.3)挑取新鲜菌落，制备菌悬液，涂布于mha琼脂表面，干燥后，用亚胺培南纸片贴于涂布菌液的mha琼脂表面，记为a，b，c，d；
11.4)在步骤3)的纸片b上加入步骤1)得到的r1溶液，纸片c上加入步骤1)得到的r2溶
液，纸片d上同时加入步骤1)得到的r1溶液与r2溶液；
12.5)孵育18-24h后阅读亚胺培南的抑菌圈直径，观察并比较a、b、c、d四张亚胺培南纸片的抑菌圈直径的大小，得到结果。
13.作为本发明的一种优选方案，步骤1)中，所述的r1溶液的配置方法为：在水中加入3
’‑
氨基苯硼酸，加入二甲基亚砜助溶，在磁力搅拌器上搅拌，完全溶解后定容至1000ml，高压灭菌，分装。
14.作为本发明的一种优选方案，步骤1)中，所述的r2溶液的配置方法为：在水中加入二水乙二胺四乙酸，在磁力搅拌器上搅拌，完全溶解后测定ph值，调节溶液ph值至7.35
±
0.1后，定容至1000ml，高压灭菌，分装。
15.作为本发明的一种优选方案，步骤5)中，纸片b的抑菌圈直径-纸片a的抑菌圈直径≥5mm，表明产a类碳青霉烯酶。
16.作为本发明的一种优选方案，步骤5)中，纸片c的抑菌圈直径-纸片a的抑菌圈直径≥5mm，表明产b类金属酶。
17.作为本发明的一种优选方案，步骤5)中，纸片d的抑菌圈直径-纸片a的抑菌圈直径≥5mm，且纸片b的抑菌圈直径-纸片a的抑菌圈直径＜5mm，纸片c的抑菌圈直径-纸片a的抑菌圈直径＜5mm，表明同时产a类碳青霉烯酶和b类金属酶。
18.作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，所述的菌悬液为以生理盐水制备的0.5麦氏浊度菌悬液。
19.作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，纸片b上加入的r1溶液的体积为5μl，纸片c上加入的r2溶液的体积为5μl，纸片d上同时加入体积为5μl的r1溶液与5μl的r2溶液。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.1)本发明针对同时产生a类和b类碳青霉烯酶的菌株，提供了一种可简单检测区分革兰阴性杆菌中碳青霉烯酶的方法；
22.2)本发明的方法结果易读，操作简单，成本低。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
24.图1是产kpc型碳青霉烯酶菌株结果图。
25.图2是产ndm型碳青霉烯酶菌株的结果图。
26.图3是同时产kpc和ndm型碳青霉烯酶菌株的结果图。
27.图4是不产碳青霉烯酶菌株的结果图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都
属于本发明保护的范围。
29.实施例1
30.本实施例提供了一种区分革兰阴性杆菌中碳青霉烯酶的检测试剂，包括a类碳青霉烯酶抑制剂r1溶液以及b类金属酶抑制剂r2溶液，所述a类碳青霉烯酶抑制剂r1溶液的浓度为30-80mg/ml，所述b类金属酶抑制剂r2溶液的浓度为0.15-0.25mol/l。
31.r1溶液的配置方法为：在800ml水中加入61.22g 3
’‑
氨基苯硼酸(h2nc6h4b(oh)2·
h2o；98％)，加入二甲基亚砜(dmso)助溶，在磁力搅拌器上搅拌，完全溶解后定容至1000ml，高压灭菌，分装，r2溶液的浓度为60mg/ml；
32.r2溶液的配置方法为：在800ml水中加入74.44g二水乙二胺四乙酸(edta-na.2h2o)，在磁力搅拌器上搅拌，完全溶解后测定ph值，用naoh溶液调节溶液ph值至7.35
±
0.1后，定容至1000ml，高压灭菌，分装，r1溶液的浓度为0.2mol/l。
33.实施例2
34.本实施例提供了一种检测区分革兰阴性杆菌中碳青霉烯酶的方法，包括以下步骤：
35.1)第一天：划线纯分受试细菌于血琼脂平板上，35℃
±
2℃大气环境孵育18-24h；
36.2)第二天：挑取过夜培养的新鲜纯菌落，以2ml生理盐水制备0.5麦氏浊度菌悬液，15分钟内涂布于mha琼脂表面。干燥15分钟后，用无菌镊子取出亚胺培南纸片4张，贴于已涂布菌液的琼脂表面(a、b、c、d)；
37.3)在纸片b上滴加5μl的r1溶液，在纸片c上滴加5μl的r2溶液，在纸片d上滴加5μl的r1溶液和5μl的r2溶液；
38.4)35℃
±
2℃大气环境孵育18-24h后阅读亚胺培南的抑菌圈直径，观察并比较a、b、c、d四张亚胺培南纸片的抑菌圈直径的大小；
39.结果：纸片b的抑菌圈直径-纸片a的抑菌圈直径≥5mm，表明产a类碳青霉烯酶；
40.纸片c的抑菌圈直径-纸片a的抑菌圈直径≥5mm，表明产b类金属酶；
41.纸片d的抑菌圈直径-纸片a的抑菌圈直径≥5mm，且纸片b的抑菌圈直径-纸片a的抑菌圈直径＜5mm，纸片c的抑菌圈直径-纸片a的抑菌圈直径＜5mm，表明同时产a类碳青霉烯酶和b类金属酶。
42.按美国临床和实验室标准化协会要求进行标准的纸片扩散法药敏试验，将3株经pcr扩增和测序验证过的分别产kpc型、产ndm型及同时产kpc和ndm型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌各取0.5麦氏浊度菌悬液均匀涂布于3块mueller-hinton琼脂平板上，干燥15分钟后分别贴上四张亚胺培南纸片(a、b、c、d),并在纸片b上滴加5μl的r1溶液，在纸片c上滴加5μl的r2溶液，在纸片d上滴加5μl的r1溶液和5μl的r2溶液，经过夜孵育后分别量取抑菌圈直径。结果如下：
43.1.亚胺培南对产kpc型酶的肺炎克雷伯菌的常规抑菌圈为18mm(纸片a)，添加r1溶液后抑菌圈扩大为26mm(纸片b)，添加r2溶液后抑菌圈为18mm(纸片c)，同时添加r1和r2溶液后抑菌圈扩大为26mm(纸片d)(见图1)。
44.2.亚胺培南对产ndm型酶的肺炎克雷伯菌的常规抑菌圈。为9mm(纸片a)，添加r1溶液后抑菌圈为9mm(纸片b)，添加r2溶液后抑菌圈扩大为17mm(纸片c)，同时添加r1和r2溶液后抑菌圈扩大为17mm(纸片d)(见图2)
45.3.亚胺培南对产同时产kpc型和ndm型酶的肺炎克雷伯菌的常规抑菌圈为6mm(纸片a)，添加r1溶液后抑菌圈不变(纸片b)，添加r2溶液后抑菌圈直径为9mm(纸片c)，同时添加r1和r2溶液后抑菌圈扩大为19mm(纸片d)(见图3)。
46.4.对于不产碳青霉烯酶菌株，无论是加r1或r2或同时滴加r1和r2，其与单药的抑菌圈直径相差均＜5mm(图4)。
47.以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。