苯并双噻二唑衍生物、包含其的超亮近红外IIb区聚集诱导发光探针及其生物成像应用的制作方法

苯并双噻二唑衍生物、包含其的超亮近红外iib区聚集诱导发光探针及其生物成像应用
技术领域
1.本发明涉及有机荧光材料的设计领域，具体地，涉及用于荧光成像、尤其是体内生物成像的荧光探针的设计。更具体地，本发明一种苯并双噻二唑衍生物、包括所述衍生物的组合物、包括所述衍生物或所述组合物的荧光探针、以及使用其进行体内生物成像的方法。


背景技术：

2.有机荧光材料的光致发光(photoluminescence,pl)是一种基本的光物理过程，荧光分子吸收光子被激发到较高的电子态，然后在衰减到较低电子态的同时发射光子。由于有机荧光材料的高量子产率、易加工性和显著的光稳定性，其已经在各种领域得到应用，例如有机发光场效应晶体管(oledss)、有机发光二极管(oled)、有机半导体激光器、荧光传感器等。无论在何种应用中，荧光分子的亮度是其最基本的特征之一，因为高亮度可以提高荧光分子在荧光显示和检测中的分辨率和灵敏度，并降低激发功率。因此，许多研究都集中在提高荧光分子的亮度上。然而，有效增强荧光分子的亮度的策略仍然很少。
3.在现有技术中，最可靠的方法之一是提高光致发光量子产率(φ
pl
)。根据等式(1)，φ
pl
可以通过减小无辐射速率常数(k
nr
)来增强。为了抑制k
nr
，设计并合成了具有广泛刚性π共轭体系的离散分子，其显示出优异的荧光效率。然而，当这些分子分散在水等生命介质中时，会出现聚集，进而引起荧光猝灭(aggregation-caused quenching,acq)，这是由于受激分子的π-π共面堆积产生了占主导地位的非辐射弛豫途径(图1，左侧)，这极大地阻碍了它们在聚集态或固态中的应用。
[0004][0005][0006]ipl
＝φ
pl
i0(1-10-a
)
ꢀꢀꢀꢀ
(3)
[0007]ipl
∝a∝
ε
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(4)
[0008]
其中φ
pl
＝光致发光量子产率，kr＝辐射速率常数，k
nr
＝非辐射速率常数，n
em
＝发射光子数，n
ab
＝吸收光子数，i
pl
＝光致发光强度，i0＝入射光强度，a＝吸光度，ε＝摩尔消光系数。
[0009]
此外，aie近期成为构建高发光聚集/固态材料的有效方法。聚集诱导发光分子(aiegen)通常拥有充满多个分子转子的扭曲主链，这些扭曲主链可以限制聚集体中的强烈分子间相互作用，从而给出高φ
pl
(图1，中间)。
[0010]
然而，高φ
pl
有时并不能保证高亮度，因为φ
pl
被定义为发射光子数(n
em
)与吸收光子数(n
ab
)的比率(等式2)。而亮度由荧光分子在给定激发强度下发射的荧光量(即光致发光强度(i
pl
))给出。从等式(3)和(4)可知，光致发光强度(i
pl
)是φ
pl
和摩尔消光系数(ε)的乘积，这表明在给定的φ
pl
下，吸收的光子越多，发射器越亮。但聚集诱导发光分子的扭曲主链
会因共轭断裂而影响分子对光子的吸收。
[0011]
为了提高ε，许多研究都集中在扩展π共轭体系上。然而，荧光分子会由于共面π-π相互作用而聚集，进而遭受因聚集引起的荧光猝灭(acq)问题，使得荧光分子在总体上给出了极低的φ
pl
。尽管聚集诱导发光分子总体上可以显著提高φ
pl
，但是固有的扭曲结构破坏了共轭，导致较低的吸收强度。acq和aie这两个矛盾的个体，在增亮方面各有利弊。因此，本领域面临的挑战是如何同时将高吸收强度和高荧光效率结合到一种荧光分子中，以获得高亮度的聚集体/固态荧光材料。
[0012]
另一方面，近红外-iib(nir-iib，1500nm至1700nm)区域中的荧光成像由于极弱的自发荧光和低得多的光散射而特别适合哺乳动物的深层组织成像，但是在现有技术中缺乏在该区域中具有高亮度的荧光分子。因此，迫切需要一种能够在nir-iib区域具有高亮度的聚集体/固态荧光材料。


技术实现要素：

[0013]
如上所述，本领域亟需一种能够在nir-iib区域具有高亮度的聚集体/固态荧光材料。对此，本发明的发明人提出了一种提高荧光分子亮度的设计策略：将合适的π共轭平面合并到聚集诱导发光分子具有多个分子转子的扭曲主链中。如图1(右)所示，这种分子一方面继承了聚集诱导发光分子的扭曲结构，保证了聚集体的高φ
pl
；另一方面，通过增强π共轭平面单元来增强摩尔消光系数ε，增强了光致发光强度(i
pl
)，并且避免了因π共轭体系扩展引起的荧光猝灭。在此基础上，本发明的发明人利用该分子设计策略解决了荧光分子在近红外-iib区域中的亮度较低的问题，进而实现了对哺乳动物的深层组织成像。
[0014]
因此，在本发明的第一方面，提供了由下式表示的苯并双噻二唑衍生物：
[0015][0016]
其中，n 1为噻吩单元的数量，并且n是1-10的整数；
[0017]
r1和r
’1是相同或不同的空间位阻基团，各自独立地选自c
6-c
20
链烷基；
[0018]
r2和r
’2是相同或不同的分子转子，各自独立地选自是相同或不同的分子转子，各自独立地选自
[0019]
在本发明的第二方面，提供了一种组合物，其包括本发明第一方面的苯并双噻二唑衍生物以及用于包封所述苯并双噻二唑衍生物的基质。
[0020]
在本发明的第三方面，提供了一种荧光探针，其用于荧光成像，包括：本发明第一
方面的苯并双噻二唑衍生物、或者本发明第二方面的组合物。
[0021]
在本发明的第四方面，提供了一种进行体内生物成像的方法，所述方法包括：将本发明第一方面的苯并双噻二唑衍生物、本发明第二方面的组合物、或者本发明第三方面的荧光探针施用于有此需要的受试者。
[0022]
在本发明的第五方面，提供了一种用于荧光成像的试剂盒，所述试剂盒包括：本发明第一方面的苯并双噻二唑衍生物、本发明第二方面的组合物、或者本发明第三方面的荧光探针，以及用于指导荧光成像的使用说明书。
[0023]
本发明的有益之处在于：本发明提供了一种能够在近红外-ii(1000nm至1700nm)区域、尤其是近红外-iib(1500nm至1700nm)区域中发出高亮度的荧光分子，其相比现有技术的荧光分子具有更高的光致发光强度，包括该荧光分子的纳米颗粒形式的荧光探针实现了哺乳动物如人的深部组织成像，为血管如全身血管、股血管、脑血管等和内脏器官膀胱的生物成像提供了强大的平台，并且为设计激发高亮度的荧光分子提供了新的灵感。
附图说明
[0024]
本发明附图与本发明的实施例一起提供了对本发明的进一步解释，并且构成说明书的一部分。显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施方案，而并不构成对本发明的限制。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
[0025]
图1示出了本发明荧光分子设计的演变示意图。
[0026]
图2示出了荧光分子tt1-ocb、tt2-ocb、和tt3-ocb的化学结构和理论计算结果，其中图a示出化学结构，图b示出优化的气相基态结构，图c示出最低空轨道(lumo)的电子分布，图d示出最高占据轨道(homo)的电子分布。
[0027]
图3示出了荧光分子tt1-ocb、tt2-ocb、和tt3-ocb的光物理性质，其中：图a示出在四氢呋喃(thf)溶液中的摩尔消光系数，图b-图d分别示出荧光分子tt1-ocb、tt2-ocb、和tt3-ocb在溶液(thf)中和为纳米颗粒形式(水)的吸收强度变化，图e示出总摩尔消光系数(fw＝90体积％)，图f示出荧光光谱总量(fw＝90体积％)，图g示出荧光分子tt3-ocb的荧光强度在不同的fw下随波长的变化，图h示出荧光分子tt3-ocb的aie曲线，其中，fw表示介质中水的体积占比，tict表示分子内扭曲电荷转移。
[0028]
图4示出了荧光分子tt1-ocb、tt2-ocb、和tt3-ocb的纳米颗粒形式的相关信息，其中：图a示出制备tt3-ocb纳米颗粒的示意图，图b示出tt1-ocb、tt2-ocb、tt3-ocb以及吲哚菁绿(icg)纳米颗粒的光稳定性，图c示出tt1-ocb、tt2-ocb、和tt3-ocb纳米颗粒的光致发光的荧光光谱，插图为1500nm至1550nm区域放大的荧光光谱，图d示出不同浓度的tt1-ocb、tt2-ocb、tt3-ocb纳米颗粒在1500nm-1550nm区域的荧光光谱的积分强度，图e示出tt1-ocb、tt2-ocb、tt3-ocb纳米颗粒在nir-iib区域的荧光光谱的平均强度比较(0.2mg/ml，793nm激发，1500nm长波通，17mw/cm2，100ms)，其中的插图为nir-iib区域的荧光图像。
[0029]
图5示出了不同浓度的tt3-ocb纳米颗粒(0、2、5、10、25、50μg/ml)与l-02细胞一起孵育24小时后对l-02细胞的细胞活力的影响。
[0030]
图6示出了经tt3-ocb纳米颗粒处理和不经tt3-ocb纳米颗粒处理(对照)的活体小鼠的血液常规指标，包括白细胞计数(wbc，图a)、红细胞计数(rbc，图b)、平均红细胞体积
(mcv，图c)、血小板(plt，图d)、红细胞分布宽度可变系数(rdw-cv，图e)和平均血小板体积(mpv，图f)。
[0031]
图7示出了经tt3-ocb纳米颗粒处理和不经tt3-ocb纳米颗粒处理(对照)的活体小鼠的肝功能指标和肾功能指标，其中，肝功能指标包括碱性磷酸酶(alp，图a)、丙氨酸转氨酶(alt，图b)、天冬氨酸转氨酶(ast，图c)和γ-谷氨酰转移酶(ggt，图d)，肾功能指标包括尿素氮(urea，图e)和肌酐(crea，图f)。
[0032]
图8使用不同的长波通(long pass,lp)滤光片对经tt3-ocb纳米颗粒(200μl,0.8mg/ml)处理的活体小鼠全身血管的nir-ii荧光成像，其中图a为1000nm lp、42mw/cm2、3ms，图b为1200nm lp、42mw/cm2、15ms，图c为1500nm lp、102mw/cm2、150ms，图d-图f为横截面荧光强度分布沿红色虚线用高斯函数拟合的结果。
[0033]
图9示出了使用不同的长波通(lp)滤光片对经tt3-ocb纳米颗粒(200μl,0.8mg/ml)处理的活体小鼠的股骨血管的nir-ii荧光成像，其中图a从左到右分别为900nm lp、10mw/cm2、15ms，1200nm lp、40mw/cm2、39ms，1500nm lp、98mw/cm2、250ms，图b为横截面荧光强度分布沿红色虚线用高斯函数拟合的结果，图c为横截面荧光强度分布沿白色虚线用高斯函数拟合的结果。
[0034]
图10示出了活体小鼠经由完整颅骨(100μl,2.5mg/ml)的大脑血管系统的nir-iib荧光成像，其中图a为脑血管显微成像示意图，图b为使用物镜(lsm03，thorlabs)的nir-iib荧光图像(1500nm lp,236mw/cm2,400ms)，图c为横截面荧光强度分布沿红色虚线用高斯函数拟合的结果，图d为横截面荧光强度分布沿绿色虚线用高斯函数拟合的结果。
[0035]
图11示出了使用不同的长波通(lp)滤光片对经tt3-ocb纳米颗粒(1mg/ml,30μl)处理的活体小鼠的膀胱nir-ii荧光成像，其中图a为900nm lp、21mw/cm2、1ms，图b为1300nm lp、43mw/cm2、10ms，图c为1500nm lp、106mw/cm2、199ms，图d-图f为横截面荧光强度分布沿红色虚线用高斯函数拟合的结果。
具体实施方式
[0036]
下面将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0037]
在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
[0038]
如本文所使用的，术语“λex”是指激发波长。
[0039]
如本文所使用的，短语“聚集引起猝灭”或“acq”是指π-共轭荧光分子的聚集显著降低荧光分子的荧光强度的现象。聚集体形成会导致荧光分子的光发射“猝灭”。
[0040]
如本文所使用的，短语“聚集诱导发光”或“aie”是指化合物以无定形或结晶(固体)状态聚集时表现出显著增强的光发射而在稀溶液中表现出弱发射或几乎无发射的现象。
[0041]
如本文所使用的，术语“发光强度”是指通常由荧光光谱仪或荧光显微镜测量获得的荧光/磷光的大小；本文所使用的术语“荧光分子”是指表现出荧光的分子；本文所使用的
术语“发光分子”是指表现出发光的分子；本文所使用的术语“aiegen”或者“聚集诱导发光分子”是指表现出聚集诱导发光(aie)特征的分子。
[0042]
如本文所使用的，“给体”材料是指具有空穴作为主要电流或电荷载流子的有机材料，例如有机纳米颗粒材料。
[0043]
如本文所使用的，“受体”材料是指具有电子作为主要电流或电荷载流子的有机材料，例如有机纳米颗粒材料。
[0044]
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0045]
在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
[0046]
在整个申请中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由
……
组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由
……
组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由
……
组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由
……
组成”。
[0047]
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
[0048]
如上所述，本领域亟需一种能够用于在900nm-1700nm的近红外ii区域、尤其是在1500nm-1700nm的近红外iib区域成像的荧光探针，使得能够对所述哺乳动物的血管如全身血管、股骨血管、脑血管、以及内脏器官如膀胱进行生物成像。
[0049]
因此，在本发明的第一方面，提供了由下式表示的苯并双噻二唑衍生物：
[0050][0051]
其中，n 1为噻吩单元的数量，并且n是1-10的整数；
[0052]
r1和r
’1是相同或不同的空间位阻基团，各自独立地选自c
6-c
20
链烷基；
[0053]
r2和r
’2是相同或不同的分子转子，各自独立地选自地选自
[0054]
根据发明人的设计策略，在聚集诱导发光分子的扭曲骨架中，苯并双噻二唑(benzo[1,2-c:4,5-c
′
]bis([1,2,5]thiadiazole)，作为分子激发过程的电子受体，其相对于分子中其他单元的强的吸电子能力有利于长波长的吸收及发射。引入的平面状的噻吩单元是分子激发过程的电子给体，同时也起着电子受体和分子转子之间的共轭桥的作用。并且，噻吩单元上的空间位阻基团r1和r
’1连接在噻吩单元邻近苯并双噻二唑的位置上，使得所述衍生物中苯并双噻二唑单元所在平面与噻吩单元所在平面之间具有30
°
至70
°
，优选为40
°
至50
°
的扭曲角，但同时还能够保留aie的发光性质。分子转子r2同样与噻吩单元呈扭曲状态，一方面作为电子给体，一方面起着抑制分子间相互作用的作用。
[0055]
在一个优选的实施方案中，n为1-5。
[0056]
在一个更优选的实施方案中，n为2。
[0057]
在一个更优选的实施方案中，r1和r
’1为十一烷基或二十烷基。
[0058]
在又一个优选的实施方案中，r2和r
’2为
[0059]
在一个具体的实施方案中，所述衍生物的苯并双噻二唑单元所在平面与噻吩单元所在平面之间的扭曲角为30
°
至70
°
。在一个优选的实施方案中，所述衍生物的苯并双噻二唑单元所在平面与噻吩单元所在平面之间的扭曲角为40
°
至50
°
。在这样的扭曲角下，可以避免分子之间的π-π堆积，从而避免聚集引起的荧光淬灭。
[0060]
在又一个具体的实施方案中，所述苯并双噻二唑衍生物选自下式表示的结构式：
[0061]
[0062]
在一个优选的实施方案中，所述苯并双噻二唑衍生物为：
[0063][0064]
在本发明的第二方面，提供了一种组合物，所述组合物包含本发明第一方面的苯并双噻二唑衍生物以及用于包封所述苯并双噻二唑衍生物的基质。
[0065]
在本文中，术语“基质”是指具有两亲性(amphipathy)的聚合物。所谓“两亲性”是指分子同时具有亲水性和亲油性，其中亲水性和亲油性是特定基团的性质。而两亲性聚合物是指在同一分子链中含有亲水链段和亲油链段的大分子化合物，由于它可以降低水的表面张力，也可称为高分子表面活性剂。亲水链段和亲油链段的不相容性会导致微相分离发生，使得两亲性聚合物在选择性溶剂、本体及表、界面结构中表现出自组装特性。
[0066]
因此，在一个实施方案中，所述基质为两亲性聚合物。作为示例，所述两亲性聚合物可以包括pluronic f127和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](dspe-peg2000)，但不限于此。任何其他可用于本发明的两亲性聚合物也本发明的范围内。
[0067]
在一个优选的实施方案中，本发明的苯并双噻二唑衍生物被封装于所述基质内。通过将本发明化合物封装于基质内，可以更好地利用本发明化合物的苯并双噻二唑衍生物的聚集诱导发光属性进行荧光成像。
[0068]
在一个具体的实施方案中，所述组合物为纳米颗粒形式。
[0069]
在一个优选的实施方案中，所述组合物是尺寸为20纳米至200纳米的纳米颗粒。
[0070]
在一个进一步优选的实施方案中，所述组合物是尺寸为50纳米至140纳米的纳米颗粒。
[0071]
在本发明的第三方面，提供了一种荧光探针，其用于荧光成像，包括：第一方面的苯并双噻二唑衍生物、或者第二方面的组合物。
[0072]
在一个具体的实施方案中，所述荧光探针能够在900nm至1700nm的近红外ii区域发出荧光。
[0073]
在又一个具体的实施方案中，所述荧光探针能够在1500nm至1700nm的近红外iib区域发出荧光。
[0074]
如前所述，光致发光强度(i
pl
)与荧光量子效率(φ
pl
)和摩尔消光系数(ε)的乘积
成正比。一方面，苯并双噻二唑衍生物特别是纳米颗粒形式的苯并双噻二唑衍生物的摩尔消光系数ε会随着噻吩单元的数目增加而增加，但另一方面，苯并双噻二唑衍生物特别是纳米颗粒形式的苯并双噻二唑衍生物在整个nir-ii区域的总φ
pl
也会因共轭的延长而降低。但是，不希望被理论束缚，本发明的发明人发现，本发明的苯并双噻二唑衍生物特别是纳米颗粒形式的苯并双噻二唑衍生物在波长为1500nm至1700nm的nir-iib区域并没有表现出因共轭的延长而φ
pl
降低的现象，尤其是当噻吩单元的数目从2增至3时，显示出相似的φ
pl
。这使得本发明增加共轭的苯并双噻二唑衍生物因优化的ε和φ
pl
而在nir-iib区域具有极好的光致发光强度(i
pl
)。
[0075]
如本文所用的，荧光探针能够在波长为1500nm至1700nm的nir-iib区域具有高亮度是指具有能够用于需要进行生物成像的受试者、进而得到可以通过肉眼或仪器读取而清晰可识别的体内生物成像的亮度。
[0076]
在又一个具体的实施方案中，所述荧光探针为纳米颗粒的形式。
[0077]
在一个优选的实施方案中，所述荧光探针为尺寸为20纳米至200纳米的纳米颗粒。
[0078]
在进一步优选的实施方案中，所述荧光探针为尺寸为50纳米至140纳米的纳米颗粒。
[0079]
在又一个具体的实施方案中，所述荧光探针可以是胃饲制剂、口服或静脉注射制剂，但不限于此。
[0080]
在本发明的第四方面，提供了一种进行体内生物成像的方法，所述方法包括：将本发明第一方面的苯并双噻二唑衍生物、本发明第二方面的组合物、或者本发明第三方面的荧光探针施用于有此需要的受试者。
[0081]
在一个具体的实施方案中，所述生物成像是近红外荧光成像。
[0082]
在更具体的实施方案中，所述生物成像是在900nm至1700nm的近红外ii区域的成像。
[0083]
在进一步具体的实施方案中，所述生物成像是在1500nm至1700nm的近红外iib区域的成像。
[0084]
如本文所用的，“有此需要的受试者”是指需要进行体内生物成像的对象。在一个具体的实施方案中，所述受试者为哺乳动物如人类和非人类例如小鼠、大鼠，但不限于此。
[0085]
在又一个具体的实施方案中，所述方法对所述哺乳动物的血管或内脏器官进行生物成像。
[0086]
在进一步具体的实施方案中，所述哺乳动物的血管包括全身血管、股骨血管、脑血管等，但不限于此。
[0087]
需要指出的是，术语“内脏器官”特别包括那些不能通过常规成像方法进行成像的内脏器官，或者能够通过常规成像方法进行成像但分辨率不高的内脏器官。本文所使用的“内脏器官”可以为深度大于1mm、大于5mm、大于10mm、大于25mm、或甚至50mm的内脏器官。
[0088]
在进一步具体的实施方案中，所述内脏器官是膀胱，但不限于此。
[0089]
在又一个具体的实施方案中，所述苯并双噻二唑衍生物、所述组合物或所述荧光探针通过静脉内注射、口服或胃饲方式施用于所述有此需要的受试者，但不限于此。
[0090]
在本发明的第五方面，提供了一种用于荧光成像的试剂盒，所述试剂盒包括：本发明第一方面的苯并双噻二唑衍生物、本发明第二方面的组合物、或本发明第三方面的荧光
探针，以及用于指导荧光成像的使用说明书。
[0091]
本发明的有益之处在于：本发明提供了一种能够在波长为1500nm至1700nm的nir-iib区域中发出高亮度的荧光分子苯并双噻二唑衍生物，其在该nir-iib区域具有优化的荧光量子效率φ
pl
和摩尔消光系数ε，使得相比现有技术的荧光分子在nir-iib区域具有更高的光致发光强度。包括该荧光分子在内的纳米颗粒形式的组合物或荧光探针实现了对哺乳动物如人的内脏器官进行生物成像，突破了高分辨率光学成像深度“软极限”(～1mm)，能够实现对血管如全身血管、股血管、脑血管、和/或深度大于1mm、大于5mm、大于10mm、大于25mm、或甚至50mm的内脏器官如膀胱的生物成像。例如，使用本发明苯并双噻二唑衍生物进行的全身血管造影术呈现出0.29毫米的表观血管宽度。对于表观宽度仅为0.04毫米的股骨血管，本发明的生物成像方法获得的图像分辨率得到提高。另外，大脑血管系统的高倍透颅显微nir-iib成像给出约3.3微米的表观宽度。因此，本发明为生物成像提供了强大的平台。此外，本发明也为设计高亮度的荧光分子提供了新的灵感和思路。
[0092]
实施例
[0093]
下述实施例将以苯并双噻二唑衍生物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb为实验对象，验证根据本发明设计的荧光材料在nir-iib区域的高亮度以及其生物成像效果。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
[0094]
应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
[0095]
材料
[0096]
所有的化学药品和试剂都是可商购的。用于化学反应的溶剂在使用前都经过蒸馏。例如，苯并双噻二唑购自derthon optoelectronic materials science technology co.ltd.pluronic f-127购自sigma-aldrich。
[0097]
测量
[0098]
紫外-可见-近红外吸收光谱：使用perkinelmer lambda 365分光光度计测量。
[0099]
核磁共振(nmr)光谱：使用unity-400核磁共振谱仪，在室温、以cdcl3为溶剂、以四甲基硅烷(tms)为参照，记录1h和
13
c谱。
[0100]
质谱(ms)：使用gct premier cab048质谱仪在maldi-tof模式下测量。
[0101]
光致发光(pl)光谱：使用horiba fluorolog-3荧光分光光度计测量。
[0102]
动态光散射(dls)：使用购自美国布鲁克汉文仪器公司的90 粒度分析仪测量。
[0103]
透射电子显微镜(tem)图像：使用jem-2010f透射电子显微镜在200千伏的加速电压下获得。
[0104]
实施例1：化合物tt1-ocb的合成
[0105][0106]
在n2气氛下，将有机锡1(0.7g,1mmol)、二溴-bbt(87mg,0.25mmol)、pd2(dba)3(22mg,0.025mmol)、p(o-tol)3(66mg,0.21mmol)和20ml甲苯加入100ml预干燥的双颈烧瓶中。混合物回流24小时。冷却至室温后，通过旋转蒸发除去溶剂。粗产物通过硅胶柱纯化，获得目标分子(产率，54％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)＝7.59-7.57(2h,d,j＝8hz),7.38(2h,s),7.32-7.28(8h,m),7.17-7.15(8h,m),7.12-7.07(8h,m),2.60(4h,t,j＝8hz),1.64(4h,m),1.23-1.10(36h,m),0.87(6h,t,j＝8hz).13c nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)＝152.60,146.96,146.82,146.26,145.03,128.71,127.55,126.13,124.16,124.02,122.75,122.57,115.45,31.29,29.88,29.71,29.04,29.00,28.97,28.88,28.83,28.73,22.07,13.51.c
74h80
n6s4的ms:m/z:其计算值为1080.5327,实验值为1080.5367。
[0107]
实施例2：化合物tt2-ocb的合成
[0108][0109]
在n2气氛下，将有机锡2(0.83g,1mmol)、二溴-bbt(87mg,0.25mmol)、pd2(dba)3(22mg,0.025mmol)、p(o-tol)3(66mg,0.21mmol),和20ml甲苯加入到100ml预干燥的双颈烧瓶中。混合物回流24小时。冷却至室温后，通过旋转蒸发除去溶剂。粗产物通过硅胶柱纯化，获得目标分子(产率，56％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)＝7.58-7.56(4h,d,j＝8hz),7.49(2h,s),7.33-7.29(8h,m),7.18-7.06(16h,m),2.74(4h,t,j＝8hz),1.80(4h,m),1.20-1.10(32h,m),0.87(6h,t,j＝8hz).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)＝152.75,147.15,146.74,146.21,141.05,138.89,136.03,129.23,128.75,127.86,126.09,124.07,122.82,115.90,113.93,31.27,29.40,28.98,28.94,28.87,28.83,28.69,28.60,27.63,22.05,
13.49.c
76h76
n6s6的ms:m/z：其计算值为1264.4456,实验值为1264.4442。
[0110]
实施例3：化合物tt3-ocb的合成
[0111][0112]
在n2气氛下，将有机锡3(0.88g,1mmol)、二溴-bbt(87mg,0.25mmol)、pd2(dba)3(22mg,0.025mmol)、p(o-tol)3(66mg,0.21mmol),和20ml甲苯加入到100ml预干燥的双颈烧瓶中。混合物回流24小时。冷却至室温后，通过旋转蒸发除去溶剂。粗产物通过硅胶柱纯化，获得目标分子(产率，56％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)＝7.51-7.49(4h,d,j＝8hz),7.42(2h,s),7.33-7.29(6h,m),7.16-7.04(16h,m),6.96(2h,s),2.74(4h,t,j＝8hz),1.78(4h,m),1.380-1.27(32h,m),0.89(6h,t,j＝8hz).13c nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)＝152.72,147.15,146.71,145.54,141.91,141.81,137.15,132.34,129.06,128.76,127.62,125.89,124.31,124.08,122.82,122.71,121.74,115.78,114.85,31.28,29.31,28.99,28.91,28.83,28.71,28.58,27.74,22.07,13.52.c
80h76
n6s8的ms:m/z：其计算值为1376.3897,实验值为1377.3777。
[0113]
实施例4：苯并双噻二唑衍生物分子结构的理论计算
[0114]
苯并双噻二唑衍生物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb的优化的气相基态结构、homo和lumo的电子分布均通过密度泛函理论(dft)计算得出，计算结果示于图2中。具体使用了gaussian 09软件包，采用b3lyp泛函结合6g(d)基组进行。
[0115]
由图2可知，在化合物tt1-ocb的优化分子结构中，苯并双噻二唑单元所在平面与噻吩单元所在平面之间的扭曲角分别为50.0
°
和50.1
°
，homo轨道与lumo轨道之间的能级差为1.47ev。
[0116]
在化合物tt2-ocb的优化分子结构中，苯并双噻二唑单元所在平面与噻吩单元所在平面之间的扭曲角分别为49.8
°
和51.8
°
，homo轨道与lumo轨道之间的能级差为1.42ev，略低于化合物tt1-ocb的能级差，这会使得化合物tt2-ocb的荧光光谱相对于tt1-ocb发生红移。
[0117]
在化合物tt3-ocb的优化分子结构中，苯并双噻二唑单元所在平面与噻吩单元所在平面之间的扭曲角分别为49.6
°
和49.6
°
，homo轨道与lumo轨道之间的能级差为1.35ev，略低于化合物tt1-ocb和化合物tt2-ocb的能级差，这会使得化合物tt3-ocb的荧光光谱相对于tt2-ocb和tt1-ocb发生红移。
[0118]
实施例5：聚集诱导发光分子纳米颗粒的制备
[0119]
将1mg上述制备的化合物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb、两亲性聚合物pluronic f127(2mg)和thf(1ml)的混合物进行超声处理(输出功率12w，xl2000，米索尼公司，纽约州)
以获得澄清的溶液。将混合物快速注入9ml水中，在水中剧烈超声2分钟。接着，将混合物在通风橱中搅拌12小时以除去thf。然后，得到的包含聚集诱导发光分子的组合物悬浮液在3000g下进行30分钟的超滤(分子量截止值为100kda)，得到纳米颗粒形式的组合物(于水中)。tt3-ocb纳米颗粒的制备示意图如图4a所示。
[0120]
实施例6：吸收光谱与摩尔消光系数的测定
[0121]
化合物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb在thf中和以纳米颗粒形式存在的吸收光谱和摩尔消光系数均采用perkinelmer lambda 365分光光度计测量得到。结果列于图3a-3e中。
[0122]
具体地，图3a给出了化合物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb在thf中的摩尔消光系数。其中，结果显示，随着π共轭单元尺寸的增加，tt3-ocb在thf中的摩尔消光系数与化合物tt1-ocb和tt2-ocb相比明显增大。并且化合物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb在793nm处的ε依次增加，分别为0.87
×
104m-1
cm-1
、1.26
×
104m-1
cm-1
和1.58
×
104m-1
cm-1
，表明共轭增强对吸收的积极影响。
[0123]
图3e给出了以纳米颗粒形式存在的化合物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb的摩尔消光系数总量，其中水的占比(fw)为90体积％。其结果显示，随着π共轭单元尺寸的增加，以纳米颗粒形式存在的tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb在793nm处的ε也依次增加，分别为1.13
×
104m-1
cm-1
、1.62
×
104m-1
cm-1
和2.02
×
104m-1
cm-1
，表明共轭增强对吸收的积极影响。另一方面，与thf中的化合物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb相比，以纳米颗粒形式存在的tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb在793nm处的ε也显著增大，这表明本发明化合物存在明显的聚集诱导发光(aie)效应。
[0124]
图3b-3d分别给出了化合物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb在thf中和以纳米颗粒形式存在时的吸收光谱。从图中可以看出，以纳米颗粒形式存在的各化合物的吸收光谱相比其在thf中的吸收光谱均发生了红移，并且以纳米颗粒形式存在的化合物tt3-ocb的吸收光谱的红移最显著(δλ为62nm)。
[0125]
实施例7：荧光光谱的测定
[0126]
化合物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb在thf中和作为纳米颗粒形式存在的荧光光谱均采用horiba fluorolog-3荧光分光光度计测量得到。对于光稳定性研究，将tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb的纳米颗粒和icg在808nm激光下照射(0.8w/cm2)，然后在不同的时间点测量pl光谱。结果列于图3f-3h和图4b-4c中。
[0127]
图3f示出了以纳米颗粒形式存在的化合物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb的荧光光谱总量(fw＝90体积％)，由该图可见，这些化合物的荧光光谱随着分子中噻吩单元从1个增至3个(共轭增大)而发生红移。
[0128]
图3g示出了以纳米颗粒形式存在的化合物tt3-ocb的荧光光谱强度在不同fw下随波长的变化。由该图可见，化合物tt3-ocb的荧光光谱强度在fw＝90体积％的情况下最强，并随着fw减小而逐渐变弱，直到fw＝30体积％，随着fw从30体积％继续减小，荧光光谱强度再次开始增强。
[0129]
图3h示出了以纳米颗粒形式存在的化合物tt3-ocb的aie曲线。可以看出，与图3g的结论类似，当fw＝30体积％时，tt3-ocb荧光强度最弱，fw减小，tt3-ocb会发生分子内扭曲电荷转移，使得α
aie
增大(α
aie
是fw＝90体积％时的荧光强度与fw＝0体积％时的荧光强度的比值)，而fw增大，溶液极性逐渐增强，tt3-ocb开始聚集，则会产生聚集诱导发光，进而使得
α
aie
增大。以纳米颗粒形式存在的化合物tt1-ocb和tt2-ocb也具有类似的aie曲线，两者分别从fw＝30体积％和fw＝40体积％开始具有升高的α
aie
(未图示)。
[0130]
图4b示出了以纳米颗粒形式存在的化合物tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb的光稳定性。可以看出，与传统的染料吲哚菁绿(icg)相比，本发明的苯并双噻二唑衍生物的荧光强度并不会随时间的推移而发生荧光强度的衰减；相反，本发明的苯并双噻二唑衍生物保持稳定，具有光稳定性。
[0131]
图4c示出了以纳米颗粒形式存在的化合物tt1-ocb、tt2-ocb、tt3-ocb在nri-ii区域(约950nm至1150nm区域)的光致发光的荧光光谱，其中的插图为1500nm至1550nm区域放大的荧光光谱。从该图中可见，相对于tt1-ocb和tt2-ocb，tt3-ocb发生了明显的红移，并且在1500nm至1550nm区域的荧光强度显著高于tt1-ocb和tt2-ocb(见插图)。
[0132]
实施例8：荧光量子产率(φ
pl
)的测定
[0133]
以nir
‑ⅱ
型荧光ir-26染料作为参考(qy＝0.5％)，以类似于现有技术的方式测量染料的φ
pl
。为了进行参考校准，用溶解于1,2-二氯乙烷(dce)中的ir-26进一步用dce稀释，以制备在808nm处的吸光度值分别为～0.1、～0.08、～0.06、～0.04和～0.02的五个样品，因为这些高度稀释的样品可以最小化二次光学过程(例如，再吸收和再发射)效应。然后，将这五种浓度线性间隔的溶于dce的ir-26溶液一次性转移到10mm路径的荧光试管中。激发源是一个808nm的二极管激光器。发射光用900nm长波通滤光片以排除其他光干扰，并获取900nm至1600nm范围的发射光谱。
[0134]
对本发明实施例中制备的三种聚集诱导发光分子(分别在dce和h2o中以溶液或纳米颗粒形式)实施以上相同的步骤。然后将参考样品和本发明的聚集诱导发光分子样品的全部发射光谱在900-1600nm nir
‑ⅱ
区内积分。将该nir
‑ⅱ
区域的荧光积分强度对在808nm激发波长下的吸光度作图，并将其拟合成线性关系。在计算样品的量子产率时，采用了两个斜率，一个是从参照样品(dce中的ir-26)获得的，另一个是从聚集诱导发光分子获得的，基于如下等式(5)：
[0135][0136]
其中，φ
pl,sample
和φ
pl,ref
分别为样品和参照样品的量子产率，s
sample
和s
ref
分别为样品和参照样品的斜率，n
sample
和n
ref
分别是h2o和dce的折射率。
[0137]
结果如图4d所示，以纳米颗粒形式存在的tt1-ocb、tt2-ocb、tt3-ocb在不同浓度下，在1500nm至1550nm区域的荧光光谱的积分强度与在808nm激发波长的吸光度成线性关系，该线性的斜率即为tt1-ocb、tt2-ocb、tt3-ocb在1500nm至1550nm区域的荧光量子产率。尽管在整个nir-iib区域，以纳米颗粒形式存在的tt1-ocb、tt2-ocb和tt3-ocb的荧光量子产率φ
pl
分别为8.6％、7.8％和4.6％，但在1500nm至1550nm区域的nir-iib区域，它们显示出相似的φ
pl
，均约为0.03％。
[0138]
图4e示出了以纳米颗粒形式存在的化合物tt1-ocb、tt2-ocb、tt3-ocb在nir-iib区域的荧光光谱的平均强度比较(0.2mg/ml，793nm激发，1500nm长波通，17mw/cm2，100ms)；其中的插图为这三种纳米颗粒在nir-iib区域的荧光图像。可以看出，tt3-ocb的亮度明显高于tt1-ocb和tt2-ocb的亮度。
[0139]
实施例9：纳米颗粒形式的tt3-ocb的体外毒性测试
[0140]
使用cck-8活力测定法在l-02细胞上检测tt3-ocb纳米颗粒的细胞毒性。具体地，将l-02细胞以5
×
103个细胞/孔的密度(100μl悬浮液)接种到96孔板中，并孵育24小时，使其生长至～80％融合。然后，将培养基替换为100μl的含有不同浓度(0、2、5、10、25、50μg/ml)的tt3-ocb纳米颗粒的新鲜培养基，并将细胞再孵育24小时。随后，除去培养基，用pbs洗涤细胞3次，然后每孔加入含有cck-8(10％)的新鲜培养基。然后，将细胞再次孵育2小时。最后通过使用酶标仪(thermo，u.s.)测量培养基在450nm处的吸光度，以评估细胞活力。
[0141]
结果如图5所示。从该图中可知，不同浓度的纳米颗粒形式的tt3-ocb对l-02细胞活力并无显著差异，这表明tt3-ocb对于细胞是安全无毒的。
[0142]
实施例10：纳米颗粒形式的tt3-ocb的体内毒性测试
[0143]
在本实施例中测试了纳米颗粒形式的tt3-ocb在健康的icr小鼠中的体内细胞毒性，具体步骤如下：
[0144]
健康的icr小鼠被随机分配到两组(每组n＝9)。在第0天，一组静脉注射tt3-ocb纳米颗粒(200μl，1mg/ml)，另一组注射pbs(200μl，1
×
)作为对照。在第21天，处死小鼠，从眼动脉收集它们的血液。血液样品分别用于血常规检查和肝功能分析。
[0145]
结果如图6和图7所示。图6示出了经tt3-ocb纳米颗粒处理和不经tt3-ocb纳米颗粒处理(对照)的小鼠的血常规指标，包括白细胞计数(wbc)、红细胞计数(rbc)、平均红细胞体积(mcv)、血小板(plt)、红细胞分布宽度可变系数(rdw-cv)和平均血小板体积(mpv)。图7示出了经tt3-ocb纳米颗粒处理和不经tt3-ocb纳米颗粒处理(对照)的小鼠的肝功能指标和肾功能指标，其中，肝功能指标包括碱性磷酸酶(alp)、丙氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)和γ-谷氨酰转移酶(ggt)，肾功能指标包括尿素氮(urea)和肌酐(crea)。由图6和图7可知，使用tt3-ocb纳米颗粒的小鼠的血常规指标和肝、肾功能指标与不使用tt3-ocb纳米颗粒相比，并无显著差异，尽管处理组的白细胞计数相比于对照有所下降。
[0146]
实施例11：小鼠的体内nir-ii荧光成像
[0147]
使用纳米颗粒形式的tt3-ocb，分别对活体小鼠血管和胃肠道(内脏)进行nir-iib区域的荧光成像。对于小鼠的血管成像，将200μl的tt3-ocb纳米颗粒经静脉注射到裸鼠的血管中。成像前用戊巴比妥麻醉小鼠。对于小鼠的内脏成像，向裸鼠的胃中灌注300μl的tt3-ocb纳米颗粒(1.0mg/ml)。为了更好地进行处理，在灌注后的不同时间用戊巴比妥麻醉小鼠。
[0148]
血管成像和内脏成像是用装有793nm激光器的自制nir-iib荧光成像装置进行的。光束耦合到准直器，并通过透镜扩展，在成像平面上提供均匀的照射。用一个35mm的定焦镜头采集信号，用一台ingaas相机(tekwin system，中国，900～1700nm灵敏)检测荧光信号。900nm和1100nm长波通滤光片被放置在照相机和成像透镜之间，以获得波长为1100nm以上的成像。采用同样的方法，用900nm和1200nm长波通滤光片获得波长为1200nm以上的成像。用1500nm长波通滤光片获得波长为1500nm以上的成像。所有这些长波通滤光片都来自索尔实验室(thorlabs)。
[0149]
图8-图11分别示出了使用tt3-ocb纳米颗粒对活体小鼠的全身血管(图8)、股骨血管(图9)、大脑血管系统(图10)和膀胱(图11)的荧光成像。
[0150]
本发明的发明人发现，使用tt3-ocb纳米颗粒的小鼠全身血管成像，呈现出0.29毫米的表观血管宽度(图8)。而对于表观宽度仅为0.04毫米的股骨血管，使用tt3-ocb纳米颗
粒的nir-iib区域的成像也能够得到提高的分辨率(图9)。同样使用tt3-ocb纳米颗粒，结合高倍透颅显微nir-iib成像，可以得到约3.3μm的表观宽度的大脑血管系统的成像(图10)。此外，利用本发明的tt3-ocb纳米颗粒，还可以高度清晰地识别位于深处的内脏器官，例如膀胱(图11)。