检测血浆中tRF型胃癌分子标记物以及在制备胃癌辅助诊断试剂盒的应用

3'；r3：5'-ggtacctcctctcttctctact-3'；
10.trf-33-p4r8yp9lon4vdp的核苷酸序列如seq id no.4所示，gcaugggugguucagugguagaauucucgccug；
11.所述trf-33-p4r8yp9lon4vdp在胃早癌患者血浆中显著下调；f4：5'-gcatgggtggttcagtggtaga-3'；r4：5'-ggtacctcctctcttctctact-3'。
12.进一步地，所述试剂盒还包括有trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b以及trf-33-p4r8yp9lon4vdp的逆转录引物序列，其中，
13.trf-18-79mp9p04的逆转录序列如seq id no.5所示：5'-gcagacgagggtacctcctctcttctctactcgtgtcctaccctcgtctgcccacta-3'；
14.trf-30-87r8wp9n1ewj的逆转录序列如seq id no.6所示：5'-gcagacgagggtacctcctctcttctctactcgtgtcctaccctcgtctgcgccgaa-3'；
15.trf-21-v2989uv3b的逆转录序列如seq id no.7所示：5'-gcagacgagggtacctcctctcttctctactcgtgtcctaccctcgtctgctaccta-3'；
16.trf-33-p4r8yp9lon4vdp的逆转录序列如seq id no.8所示：5'-acagacgagggtacctcctctcttctctactcgtgtcctaccctcgtctgtcaggcg-3'。
17.进一步地，所述试剂盒还包括有trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b以及trf-33-p4r8yp9lon4vdp的探针引物序列，其中，
18.trf-18-79mp9p04的探针引物序列如seq id no.9所示：5'-fam-tgtcctaccctcgtctgcccacta-tamra-3'；
19.trf-30-87r8wp9n1ewj的探针引物序列如seq id no.10所示：5'-fam-ggattcggcgcagacgagggtagga-tamra-3'；
20.trf-21-v2989uv3b的探针引物序列如seq id no.11所示：5'-fam-aggtagcagacgagggtaggacac-tamra-3'；
21.trf-33-p4r8yp9lon4vdp的探针引物序列如seq id no.12所示：5'-fam-ttctcgcctgacagacgagggtagga-tamra-3'。
22.本发明还提供一种检测血浆中trf分子标记物的方法，其特征在于，所述trf分子标记物为权利要求1中所述的trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b以及trf-33-p4r8yp9lon4vdp，所述的方法包括如下步骤：
23.(1)采集血液，提取血浆中的总rna；
24.(2)将总rna逆转录成cdna；
25.(3)利用trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b以及trf-33-p4r8yp9lon4vdp的特异性扩增引物对步骤(2)的cdna溶液进行荧光定量pcr检测，反应结束后检测荧光信号值并设定y值；
26.(4)获得每个样品的cq值，也就是y值，并按所检测trf对应的标准曲线计算出相应的拷贝数x后，将按照400
×
10
x
/3计算每个样品对应1ml血浆时的拷贝数，并进行早期胃癌患者1ml血浆内trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b、trf-33-p4r8yp9lon4vdp拷贝数的统计学分析。
27.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的试剂盒将trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b以及trf-33-p4r8yp9lon4vdp单独或联合使用以作为
p4r8yp9lon4vdp分别在胃癌组织和正常组织中差异达5.12、8.73和173.11倍，如图1自上而下第二个箭头和表1所示，as-tdr-008225在mintbase数据库中命名为trf-30-87r8wp9n1ewj，而如图1自上而下第三个箭头和表1所示，as-tdr-009407在mintbase数据库中命名为trf-21-v2989uv3b，而如图1自上而下第一个箭头和表1所示，as-tdr-001290在mintbase数据库中命名为trf-33-p4r8yp9lon4vdp，提示trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b和trf-33-p4r8yp9lon4vdp在胃癌中可能作为一个重要基因发挥作用。
51.表1.胃癌血浆中筛选差异表达的trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b和trf-33-p4r8yp9lon4vdp
[0052][0053]
而trf-18-79mp9p04是结合trf和tirna数据库mintbase(https://cm.jefferson.edu/mintbase/)挑选出来。
[0054]
实施例2
[0055]
本用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒，包括用于检测血浆样本中trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b以及trf-33-p4r8yp9lon4vdp的试剂，其中：
[0056]
trf-18-79mp9p04的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述trf-18-79mp9p04在胃早癌患者血浆中显著下调；所述引物为：f1：5'-gtccctgttgtgtttccgtag 3'；r1：5'-ggtacctcctctcttctctact-3'；
[0057]
trf-18-79mp9p04的逆转录序列如seq id no.5所示：5'-gcagacgagggtacctcctctcttctctactcgtgtcctaccctcgtctgcccacta-3'；
[0058]
trf-18-79mp9p04的探针引物序列如seq id no.9所示：5'-fam-tgtcctaccctcgtctgcccacta-tamra-3'；
[0059]
trf-30-87r8wp9n1ewj的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述trf-30-87r8wp9n1ewj在胃早癌患者血浆中显著上调；f2：5'-gtgtccctggtggtctagtggtt-3'；r2：5'-ggtacctcctctcttctctact-3'；
[0060]
trf-30-87r8wp9n1ewj的逆转录序列如seq id no.6所示：5'-gcagacgagggtacctcctctcttctctactcgtgtcctaccctcgtctgcgccgaa-3'；
[0061]
trf-30-87r8wp9n1ewj的探针引物序列如seq id no.10所示：5'-fam-ggattcggcgcagacgagggtagga-tamra-3'；
[0062]
trf-21-v2989uv3b的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述trf-21-v2989uv3b在胃早癌患者血浆中显著上调；f3：5'-cgttggtaggatggggtgtga-3'；r3：5'-ggtacctcctctcttctctact-3'；
[0063]
trf-21-v2989uv3b的逆转录序列如seq id no.7所示：5'-gcagacgagggtacctcctctcttctctactcgtgtcctaccctcgtctgctaccta-3'；
[0064]
trf-21-v2989uv3b的探针引物序列如seq id no.11所示：5'-fam-aggtagcagacgagggtaggacac-tamra-3'；
[0065]
trf-33-p4r8yp9lon4vdp的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述trf-33-p4r8yp9lon4vdp在胃早癌患者血浆中显著下调；f4：5'-gcatgggtggttcagtggtaga-3'；r4：5'-ggtacctcctctcttctctact-3'。
[0066]
trf-33-p4r8yp9lon4vdp的逆转录序列如seq id no.8所示：5'-acagacgagggtacctcctctcttctctactcgtgtcctaccctcgtctgtcaggcg-3'。
[0067]
trf-33-p4r8yp9lon4vdp的探针引物序列如seq id no.12所示：5'-fam-ttctcgcctgacagacgagggtagga-tamra-3'。
[0068]
具体可以参考如下表1中trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b以及trf-33-p4r8yp9lon4vdp设计的引物序列；
[0069]
表1 设计的trf引物序列
[0070][0071][0072]
本实施例选取了宁波大学医学院附属医院的胃癌及健康人血浆样本40例，均从本人或家属获得知情同意，相关病人信息完整并按规定建立临床资料数据库。
[0073]
(1)所有血液样本均严格按照标本采集规范进行采集。抽取10ml外周血于普通edta抗凝的采血管中，立即置于4℃冰箱，静置30min，4℃条件下500g离心20min，以去除血浆中残留的血细胞成分，吸取上层血浆，转移至一个新的离心管中，4℃条件下1500g离心20min，以彻底去除血浆中残存的细胞碎片等物质，将所得血浆分装，于-80℃冰箱冻存；
[0074]
(2)血浆总rna提取：采用美国invitrogen公司的trizol ls试剂，吸取250μl血浆样本至一新的无核酸酶的1.5ml离心管，加入750μl的trizol ls试剂，扣紧离心管管盖后，旋涡震荡10s，4℃冰箱放置5min；加入200μl三氯甲烷，扣紧离心管管盖后，手摇震荡6次，4℃冰箱放置5min，4℃12000rpm离心15min，使管内液体分为清晰的3层；准备一新的无核酸酶的1.5ml离心管，加入500μl异丙醇，将离心后的标本拿出，小心吸取上层透明液体500μl至另一离心管中，扣紧离心管管盖后，旋涡震荡5s，4℃冰箱放置15min，于4℃12000rpm离心10min，小心吸弃上清液；在离心管中加入1ml预冷后的75％乙醇，扣紧离心管管盖后，上下颠倒离心管以洗涤沉淀；4℃12000rpm离心5min后，吸弃上清液，并将离心管再至离心机，4℃12000rpm离心3min并吸弃上清；干燥3min，加8μl无酶水，扣紧离心管管盖后，旋涡震荡数秒，4℃3000rpm离心30s；吸取1μl rna溶液，使用美国热电-赛默飞公司nanodrop one超微量紫外分光光度计检测样品的总rna浓度和纯度，确保获得的rna溶液a
260
/a
280
数值在1.8-2.1之间，取6μl总rna进行逆转录。
[0075]
(3)cdna的合成：按照北京宝盈同汇生物技术有限公司生产的polestar1st cdnasynthesis kit(gdna removal)的说明书进行操作，按以下组分配制反逆转录反应液：
[0076]
①
逆转录反应体系(20μl)：
[0077][0078]
②
cdna合成反应程序为：37℃30min，85℃5min以失活mlv。获得的cdna可于-20℃冻存，或是直接进行荧光定量pcr。
[0079]
③
质粒标准品的制作：
[0080]
trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b、trf-33-p4r8yp9lon4vdpcdna扩增产物的重组质粒trf-18-79mp9p04puc57、trf-30-87r8wp9n1ewj puc57、trf-21-v2989uv3b puc57、trf-33-p4r8yp9lon4vdp puc57各2.4μg，由通用生物(安徽)股份有限公司制备。
[0081]
④
以紫外分光光度计测量重组质粒：
[0082]
trf-18-79mp9p04puc57、trf-30-87r8wp9n1ewj puc57、trf-21-v2989uv3bpuc57、trf-33-p4r8yp9lon4vdp puc57的od260、od280及od260/od280值，并重复3次，确定每个质粒dna的浓度和纯度。
[0083]
按拷贝数＝质粒浓度
×
6.02
×
10
23
/(660
×
质粒总长度)，获得质粒的拷贝数，并稀释至1
×
106拷贝/μl，
–
20℃保存备用。以1
×
106拷贝/μl作为质粒原液，进行10-1
×
质粒原液样本，10-2
×
质粒原液样本，10-3
×
质粒原液样本，10-4
×
质粒原液样本和10-5
×
质粒原液样本梯度稀释的荧光定量pcr检测。
[0084]
将已定值的重组质粒稀释至1
×
105拷贝/μl，再10倍系列稀释，获得1
×
101拷贝/μ
l、1
×
102拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl和1
×
105拷贝/μl稀释液为后续扩增模板。
[0085]
⑤
荧光定量pcr：每个cdna样品设置3个重复，加样至96孔板的pcr反应板中，按照两步法进行扩增。同时进行阴性对照样本(以等体积的ddh2o代替质粒或cdna)和梯度稀释的重组质粒标准品的荧光定量pcr扩增。反应程序为95℃预变性30sec；95℃变性10sec，60℃延伸/退火20sec，共40个循环。通过实时定量pcr扩增，荧光定量pcr测定系统根据荧光值的变化规律自动生成重组质粒：
[0086]
trf-18-79mp9p04puc57、trf-30-87r8wp9n1ewj puc57、trf-21-v2989uv3bpuc57、trf-33-p4r8yp9lon4vdp puc57的标准曲线。
[0087]
重组质粒trf-18-79mp9p04puc57曲线的相关系数r2＝0.9993，trf-30-87r8wp9n1ewj puc57曲线的相关系数r2＝0.9994；
[0088]
trf-21-v2989uv3b puc57曲线的相关系数r2＝0.9998；
[0089]
trf-33-p4r8yp9lon4vdp puc57曲线的相关系数r2＝0.9896；
[0090]
说明在线性质粒稀释质量浓度范围的内具有良好的线性关系：
[0091]
trf-18-79mp9p04 puc57回归方程为y＝-3.590x 43.91；
[0092]
trf-30-87r8wp9n1ewj puc57回归方程为y＝-3.297x 42.04；
[0093]
trf-21-v2989uv3b puc57回归方程为y＝-3.054x 39.83；
[0094]
trf-33-p4r8yp9lon4vdp puc57回归方程为y＝-3.578x 44.07；
[0095]
中y为实时定量pcr检测获得的cq值，10
x
为检测样本内对应的拷贝数。各曲线的扩增效率为100％，显示各重组质粒建立的标准曲线能准确地反映目的产物的扩增情况。
[0096]
获得每个样品的cq值，也就是y值，并按所检测trf对应的标准曲线计算出相应的拷贝数x后，将按照400
×
10
x
/3计算每个样品对应1ml血浆时的拷贝数，并进行早期胃癌患者1ml血浆内trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b、trf-33-p4r8yp9lon4vdp拷贝数的统计学分析。
[0097]
⑥
结果显示：
[0098]
trf-18-79mp9p04、trf-30-87r8wp9n1ewj、trf-21-v2989uv3b、trf-33-p4r8yp9lon4vdp
[0099]
在胃早癌血浆中联合诊断价值为：其roc曲线下面积为0.985，灵敏度为0.925，特异度为0.975，(如图2所示)能有效地可用于胃早癌的筛查和诊断。
[0100]
实施例3
[0101]
单独使用trf-18-79mp9p04作为分子标记物用于胃早癌的筛查和诊断的结果为：
[0102]
胃早癌患者每毫升血浆中trf-18-79mp9p04的拷贝数极显著低于健康人群(p《0.001)，具体结果参考图3，截断值为8711997；其在早癌血浆中联合诊断价值为：其roc曲线下面积为0.851，灵敏度为0.675，特异度为1.000，具体参考图3-1；而图4为本发明实施例3中胃癌组织trf-18-79mp9p04的扩增曲线图，图5为本发明实施例3中胃癌组织trf-18-79mp9p04质粒标准品的荧光定量标准曲线图。
[0103]
实施例4
[0104]
单独使用trf-30-87r8wp9n1ewj作为分子标记物用于胃早癌的筛查和诊断的结果为：胃早癌患者每毫升血浆中的拷贝数极显著高于健康人群(p《0.05)，具体结果参考图6，
截断值为840884；其在早癌血浆中联合诊断价值为：其roc曲线下面积为0.716，灵敏度为0.550，特异度为0.950，具体参考图6-1；而图7为本发明实施例4中胃癌组织trf-30-87r8wp9n1ewj的扩增曲线图，图8为本发明实施例4中胃癌组织trf-30-87r8wp9n1ewj质粒标准品的荧光定量标准曲线图。
[0105]
实施例5
[0106]
单独使用trf-33-p4r8yp9lon4vdp作为分子标记物用于胃早癌的筛查和诊断的结果为：胃早癌患者每毫升血浆中trf-33-p4r8yp9lon4vdp的拷贝数高于健康人群(p《0.05)，具体结果参考图9，截断值为1113632；其在早癌血浆中联合诊断价值为：其roc曲线下面积为0.740，灵敏度为0.875，特异度为0.500，具体参考图9-1；而图10为本发明实施例5中胃癌组织trf-33-p4r8yp9lon4vdp的扩增曲线图，图11为本发明实施例5中胃癌组织trf-33-p4r8yp9lon4vdp质粒标准品的荧光定量标准曲线图。
[0107]
实施例6
[0108]
单独使用trf-21-v2989uv3b作为分子标记物用于胃早癌的筛查和诊断的结果为：胃早癌患者每毫升血浆中trf-21-v2989uv3b的拷贝数极显著低于健康人群(p《0.001)，具体结果参考图12，截断值为40823；其在早癌血浆中联合诊断价值为：其roc曲线下面积为0.631，灵敏度为0.775，特异度为0.475，具体参考图12-1；而图13为本发明实施例6中胃癌组织trf-21-v2989uv3b的扩增曲线图，图14为本发明实施例6中胃癌组织trf-21-v2989uv3b质粒标准品的荧光定量标准曲线图。