治疗性抗体和它们的用途的制作方法

治疗性抗体和它们的用途
发明领域
1.本发明涉及抗体，例如全长抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合bcma(b-细胞成熟抗原)和/或cd3(分化簇3)。本发明还涉及包含bcma抗体的抗体缀合物(例如抗原-药物-缀合物)，包含bcma抗体的组合物，以及利用bcma抗体和它们的缀合物治疗与表达bcma的细胞相关的疾病状况(例如癌症或自身免疫性疾病)的方法。本发明进一步涉及特异性地结合cd3和肿瘤细胞抗原的异源多聚体抗体(例如特异性地结合cd3和bcma的双特异性抗体)。还提供包含这类异源多聚体抗体的组合物，制备和纯化这类异源二聚体抗体的方法，以及它们在诊断和治疗中的用途。
2.发明背景
3.b-细胞成熟抗原(bcma、cd269或tnfrsf17)是肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族的成员。bcma是在恶性人t细胞淋巴瘤中鉴定的，包含t(4；16)易位。该基因在b-细胞谱系中选择性地表达，在抗体分泌细胞浆母细胞和浆细胞中具有最高表达。bcma结合2个配体，b-细胞激活因子(baff)(也称作b-淋巴细胞刺激物(blys)和apol-相关的白细胞表达配体(tall-1))和增殖诱导配体(april)，分别具有1μm和16nm的亲和力。april或baff结合bcma促进包括nf-κb、elk-1、c-jun n-端激酶和p38促分裂原活化蛋白激酶的信号级联放大，其产生细胞存活和增殖的信号。
4.bcma还在恶性b细胞和涉及b淋巴细胞的几种癌症上表达，包括多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。在涉及浆母细胞的自身免疫性疾病如系统性红斑性狼疮(sle)和类风湿性关节炎中，bcma表达抗体生成细胞分泌自我攻击的自身抗体。
5.在多发性骨髓瘤的情况下，在美国每年新诊断约24,000例新病例，并且这个数字相当于美国新诊断的血液癌症的约15％。每年多发性骨髓瘤导致平均11,000人死亡，并且平均5-年存活率为约44％，中位生存期50-55个月。目前多发性骨髓瘤的治疗集中在浆细胞凋亡和/或减少破骨细胞活性(例如化疗、沙利度胺、来那度胺、双膦酸盐和/或蛋白酶体抑制剂如硼替佐米或卡非佐米)。但是，多发性骨髓瘤仍是不治之症，并且几乎所有患者对这些药剂产生耐药性并最终复发。因此，多发性骨髓瘤的替代治疗，如利用抗bcma拮抗剂，包括抗体和其他免疫治疗剂(例如双特异性抗体或抗体-药物缀合物)，会成为更好的治疗剂。
6.发明概述
7.本文公开的发明涉及结合bcma和/或cd3的治疗性抗体。还提供包含bcma的抗体缀合物(例如抗体-药物缀合物)。此外，还提供特异性地结合cd3和肿瘤细胞抗原的异源多聚体抗体(例如双特异性抗体)(例如特异性地结合cd3和bcma的双特异性抗体)。
8.在一方面，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合b-细胞成熟抗原(bcma)，其中所述抗体包含(a)重链可变(vh)区，包含(i)vh互补决定区1(cdr1)，包含序列syx1mx2，其中x1为a或p；并且x2为t、n或s(seq id no:301)，gftfx1sy，其中x1为g或s(seq id no:302)，或者gftfx1syx2mx3，其中x1为g或s，x2为a或p；并且x3为t、n或s
(seq id no:303)；(ii)vh cdr2，包含序列ax1x2x3x4gx5x6x7x8yadx9x
10
kg，其中x1为i、v、t、h、l、a或c；x2为s、d、g、t、i、l、f、m或v；x3为g、y、l、h、d、a、s或m；x4为s、q、t、a、f或w；x5为g或t；x6为n、s、p、y、w或f；x7为s、t、i、l、t、a、r、v、k、g或c；x8为f、y、p、w、h或g；x9为v、r或l；并且x
10
为g或t(seqid no:305)，或者x1x2x3x4x5x6，其中x1为s、v、i、d、g、t、l、f或m；x2为g、y、l、h、d、a、s或m；x3为s、g、f或w；x4为g或s；x5为g或t；并且x6为n、s、p、y或w(seq id no:306)；以及iii)vh cdr3，包含序列vspix1x2x3x4，其中x1为a或y；x2为a或s；并且x3为g、q、l、p或e(seq id no:307)，或者ywpmx1x2，其中x1为d、s、t或a；并且x2为i、s、l、p或d(seq id no:308)；和/或(b)轻链可变(vl)区，包含(i)vl cdr1，包含序列x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
，其中x1为r、g、w、a或c；x2为a、p、g、l、c或s；x3为s、g或r；x4为q、c、e、v或i；x5为s、p、g、a、r或d；x6为v、g、i或l；x7为s、e、d、p或g；x8为s、p、f、a、m、e、v、n、d或y；x9为i、t、v、e、s、a、m、q、y、h、r或f；x
10
为y或f；x
11
为l、w或p；并且x
12
为a、s或g(seq id no:309)；(ii)vl cdr2，包含序列x1asx2rax3，其中x1为g或d；x2为s或i；并且x3为t或p(seq id no:310)；以及(iii)vl cdr3，包含序列qqyx1x2x3px4t，其中x1为g、q、e、l、f、a、s、m、k、r或y；x2为s、r、t、g、v、f、y、d、a、h、v、e、k或c；x3为w、f或s；并且x4为l或i(seq id no:311)，或者qqyx1x2x3px4，其中x1为g、q、e、l、f、a、s、m、r、k或y；x2为s、r、t、g、r、v、d、a、h、e、k、c、f或y；x3为w、s或f；并且x4为l或i(seq id no:312)。
9.在另一方面，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合bcma，其中所述抗体包含：vh区，包含seq id no:2、3、7、8、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、37、39、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、83、87、92、95、97、99、101、104、106、110、112、114、118、120、122、125、127、313、314、363或365中示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；和/或vl区，包含seq id no:1、4、5、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、34、36、38、40、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、317、81、82、84、85、86、88、89、90、91、93、94、96、98、100、102、103、105、107、108、109、111、113、115、116、117、119、121、123、124、126、128、315、316或364中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。在一些实施方案中，vh区包含(i)vh cdr1，包含seq id no:150、151、152、156或157；(ii)vh cdr2，包含seq id no:169、154、194、159、195、196、162、158、198、177、178、199、200、201、202、203、204、206、207、208、172、203或204；以及(iii)vh cdr3，包含seq id no:155、161、197、205或164；和/或其中vl区包含(i)vl cdr1，包含seq id no:209、271、273、275、251、277、260、279、245、283、285、287、290、292、235、297或299；(ii)vl cdr2，包含seq id no:221；以及(iii)vl cdr3，包含seq id no:225、272、274、276、278、280、281、282、284、286、288、289、291、293、294、229、296、298或300。在一些实施方案中，vh区包含seq id no:112中示出的序列或者在不在cdr内的残基中具有一个或几个保守氨基酸取代的变体和/或vl区包含seq id no:38中示出的氨基酸序列或者其在不在cdr内的氨基酸中具有一个或几个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，所述轻链包含seq id no:357中示出的序列，所述重链包含seq id no:358中示出的序列。在一些实施方案中，所述抗体包含通过具有atcc登录号pta-122094的表达载体产生的vh区。在一些实施方案中，所述抗体包含通过具有atcc登录号pta-122093的表达载体产生的vl区。
10.在另一方面，本发明提供一种分离的抗体，其包含在本发明的bcma抗体的特异性
位点工程化的含有酰基供体谷氨酰胺的标签。在一些实施方案中，所述标签包含选自q、lqg、llqgg(seq id no:318)、llqg(seq id no:454)、lslsqg(seq id no:455)、gggllqgg(seq id no:456)、gllqg(seq id no:457)、llq、gsplaqshgg(seq id no:458)、gllqggg(seq id no:459)、gllqgg(seq id no:460)、gllq(seq id no:461)、llqllqga(seq id no:462)、llqga(seq id no:463)、llqyqga(seq id no:464)、llqgsg(seq id no:465)、llqyqg(seq id no:466)、llqllqg(seq id no:467)、sllqg(seq id no:468)、llqlq(seq id no:469)、llqllq(seq id no:470)、llqgr(seq id no:471)、llqgpp(seq id no:472)、llqgpa(seq id no:473)、ggllqgpp(seq id no:474)、ggllqga(seq id no:475)、llqgpgk(seq id no:476)、llqgpg(seq id no:477)、llqgp(seq id no:478)、llqp(seq id no:479)、llqpgk(seq id no:480)、llqapgk(seq id no:481)、llqgapg(seq id no:482)、llqgap(seq id no:483)和llqlqg(seq id no:484)的氨基酸序列。
11.在一变化中，本发明提供一种分离的抗体，其包含在本发明的bcma抗体的位置222、340或370处的含有酰基供体谷氨酰胺的标签和氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是从赖氨酸至精氨酸的取代。
12.在一些实施方案中，本发明的bcma抗体进一步包含接头。在一些实施方案中，所述接头选自ac-lys-gly(乙酰基-赖氨酸-甘氨酸)、氨基己酸、ac-lys-β-ala(乙酰基-赖氨酸-β-丙氨酸)、氨基-peg2(聚乙二醇)-c2、氨基-peg3-c2、氨基-peg6-c2、ac-lys-val-cit-pabc(乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基)、氨基-peg6-c2-val-cit-pabc、氨基己酰基-val-cit-pabc、[(3r,5r)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-val-cit-pabc、[(3s,5s)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-val-cit-pabc、腐胺和ac-lys-腐胺。
[0013]
在另一方面，本发明提供如本文所述的bcma抗体或抗原结合片段的缀合物，其中将所述抗体或抗原结合片段缀合至药剂，其中所述药剂选自细胞毒剂、免疫调节剂、显像剂、治疗性蛋白、生物聚合物和寡核苷酸。在一些实施方案中，所述药剂是细胞毒剂，包括但不限于蒽环类、阿里他汀(auristatin)、喜树碱、考布他汀、多拉司他汀、多卡米星(duocarmycin)、烯二炔、格尔德霉素、吲哚啉-苯二氮二聚体、美登素、嘌呤霉素、吡咯苯并二氮杂卓二聚体、紫杉烷、长春花生物碱、tubulysin、哈米特林(hemiasterlin)、spliceostatin、普拉二烯内酯(pladienolide)以及它们的立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。例如所述细胞毒剂是mmad(单甲基阿里他汀d)、0101(2-甲基丙氨酰-n-[(3r,4s,5s)-3-甲氧基-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1s)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)、3377(n,2-二甲基丙氨酰-n-{(1s,2r)-4-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-n-甲基-l-缬氨酰胺)、0131(2-甲基-l-脯氨酰-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)或0121(2-甲基-l-脯氨酰-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(2s)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)。
[0014]
在一些实施方案中，本发明提供一种缀合物，其包含式：抗体-(含有酰基供体谷氨酰胺的标签)-(接头)-(细胞毒剂)。在一些实施方案中，含有酰基供体谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列llqg(seq id no:319)和/或ggllqgpp(seq id no:339)，并且其中接头包含乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基或氨基-peg6-c2。在一些实施方案中，所述缀合物选自1)抗体-ggllqgpp(seq id no:339)-(乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基(aclys-vc-pabc))-0101；2)抗体-llqg(seq id no:319)-氨基-peg6-c2-0131；以及3)抗体-llqg(seq id no:319)-氨基-peg6-c2-3377。在一些实施方案中，所述缀合物在抗体位置222处进一步包含从赖氨酸至精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述缀合物在抗体位置n297q或n297a处进一步包含氨基酸取代。
[0015]
在另一方面，提供一种制备如本文所述的bcma抗体的方法，所述方法包括在导致产生bcma抗体的条件下培养宿主细胞，以及从宿主细胞或培养物分离bcma抗体。
[0016]
在另一方面，本发明提供如本文所述的bcma抗体或bcma抗体缀合物在制造用于治疗与bcma表达相关的疾病状况(例如癌症或自身免疫性病症)的药物中的用途。在一些实施方案中，提供如本文所述的bcma抗体或bcma抗体缀合物在制造用于抑制肿瘤生长或发展的药物中的用途。在一些实施方案中，提供如本文所述的bcma抗体或bcma抗体缀合物在制造用于抑制表达bcma的恶性细胞转移的药物中的用途。在一些实施方案中，提供如本文所述的bcma抗体或bcma抗体缀合物在制造用于诱导肿瘤消退的药物中的用途。
[0017]
在另一方面，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合cd3，其中所述抗体包含seq id no:320、322、324、326、328、330、345、347、349、351、444、354、356、378、442、380、382、384 386、388、390、392、394、396、398或400中示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；和/或包含seq id no:319、321、323、325、327、329、344、346、348、350、352、355、377、443、445、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397或399中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的轻链可变(vl)区。在一些实施方案中，所述抗体包含seq id no:324或388中示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；和/或包含seq id no:323或387中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的轻链可变(vl)区。在一些实施方案中，vh区包含：(i)vh互补决定区1(cdr1)，包含seq id no:331、332、333、401、402、403、407、408、415、416、418、419、420、424、425、426、446、447或448中示出的序列；(ii)vh cdr2，包含seq id no:334、336、337、338、339、404、405、409、410、411、412、413、414、417、418、421、422、427、428、449或450中示出的序列；以及iii)vh cdr3，包含seq id no:335、406、423、429或451中示出的序列；和/或轻链可变(vl)区，包含(i)vl cdr1，包含seq id no:340、343、430、431、435或440、441中示出的序列；(ii)vl cdr2，包含seq id no:341、433、452或436中示出的序列；以及(iii)vl cdr3，包含seq id no:342、432、434、437、438、439、446或453中示出的序列。在一些实施方案中，vh区包含(i)vh互补决定区1(cdr1)，包含seq id no:331、332、333、401、407或408中示出的序列；(ii)vh cdr2，包含seq id no:336、404、405或417中示出的序列；以及iii)vh cdr3，包含seq id no:335或406中示出的序列；和/或轻链可变(vl)区，包含(i)vl cdr1，包含seq id no:343或441中示出的序列；(ii)vl cdr2，包含seq id no:341或436中示出的序列；以及(iii)vl cdr3，包含seq id no:342或439中示出的序列。在一些实施方案中，所述抗体包含通过具有atcc登录号pta-122513的表达载体产生的vh区。在一些实施方案中，所述抗体包含通过具有atcc登录号pta-122512的
表达载体产生的vl区。
[0018]
在另一方面，提供一种分离的抗体，其特异性地结合cd3并与如本文所述的本发明的抗cd3抗体竞争。
[0019]
在另一方面，本发明提供一种双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是全长人抗体，包含能够通过特异性地结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原来募集人免疫效应细胞活性的双特异性抗体的第一抗体可变结构域，并且包含能够特异性地结合靶抗原的双特异性抗体的第二抗体可变结构域，其中第一抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，包含seq id no:320、322、324、326、328、330、345、347、349、351、444、354、356、378、442、380、382、384 386、388、390、392、394、396、398或400中示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；和/或轻链可变(vl)区，包含seq id no:319、321、323、325、327、329、344、346、348、350、352、355、377、443、445、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397或399中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。在一些实施方案中，第一抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，包含seq id no:seq id no:331、332、333、401、402、403、407、408、415、416、418、419、420、424、425、426、446、447或448中示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；(ii)vh cdr2，包含seq id no:334、336、337、338、339、404、405、409、410、411、412、413、414、417、418、421、422、427、428、449或450中示出的序列；以及iii)vh cdr3，包含seq id no:335、406、423、429或451中示出的序列；和/或轻链可变(vl)区，包含(i)vl cdr1，包含seq id no:340、343、430、431、435或440、441中示出的序列；(ii)vl cdr2，包含seq id no:341、433、452或436中示出的序列；以及(iii)vl cdr3，包含seq id no:342、432、434、437、438、439、446或453中示出的序列。在一些实施方案中，第一抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，包含seq id no:324或388中示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；和/或轻链可变(vl)区，包含seq id no:323或387中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；并且第二抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，包含seq id no:112示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；和/或轻链可变(vl)区，包含seq id no:38中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。
[0020]
在一些实施方案中，第二抗体可变结构域包含(a)重链可变(vh)区，包含(i)vh互补决定区1(cdr1)，包含序列syx1mx2，其中x1为a或p；并且x2为t、n或s(seq id no:301)，gftfx1sy，其中x1为g或s(seq id no:302)，或者gftfx1syx2mx3，其中x1为g或s，x2为a或p；并且x3为t、n或s(seq id no:303)；(ii)vh cdr2，包含序列ax1x2x3x4gx5x6x7x8yadx9x
10
kg，其中x1为i、v、t、h、l、a或c；x2为s、d、g、t、i、l、f、m或v；x3为g、y、l、h、d、a、s或m；x4为s、q、t、a、f或w；x5为g或t；x6为n、s、p、y、w或f；x7为s、t、i、l、t、a、r、v、k、g或c；x8为f、y、p、w、h或g；x9为v、r或l；并且x
10
为g或t(seq id no:305)，或者x1x2x3x4x5x6，其中x1为s、v、i、d、g、t、l、f或m；x2为g、y、l、h、d、a、s或m；x3为s、g、f或w；x4为g或s；x5为g或t；并且x6为n、s、p、y或w(seq id no:306)；以及iii)vh cdr3，包含序列vspix1x2x3x4，其中x1为a或y；x2为a或s；并且x3为g、q、l、p或e(seq id no:307)，或者ywpmx1x2，其中x1为d、s、t或a；并且x2为i、s、l、p或d(seq id no:308)；和/或(b)轻链可变(vl)区，包含(i)vl cdr1，包含序列x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
，其中x1为r、g、w、a或c；x2为a、p、g、l、c或s；x3为s、g或r；x4为q、c、e、v或i；x5为s、l、p、g、a、r或d；x6为v、g或i；x7为s、e、d或p；x8为s、p、f、a、m、e、v、n、d或y；x9为i、t、v、e、s、a、m、q、y、h或r；x
10
为y或f；x
11
为l、w或p；并且x
12
为a、s或g(seq id no:309)；(ii)vl cdr2，包含序列
x1asx2rax3，其中x1为g或d；x2为s或i；并且x3为t或p(seq id no:310)；以及(iii)vl cdr3，包含序列qqyx1x2x3px4t，其中x1为g、q、e、l、f、a、s、m、k、r或y；x2为s、r、t、g、v、f、y、d、a、h、v、e、k或c；x3为w、f或s；并且x4为l或i(seq id no:311)，或者qqyx1x2x3px4，其中x1为g、q、e、l、f、a、s、m、r、k或y；x2为s、r、t、g、r、v、d、a、h、e、k、c、f或y；x3为w、s或f；并且x4为l或i(seq id no:312)。在一些实施方案中，第二抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，包含(i)vh cdr1，包含seq id no:150、151、152、156、157、348、349、353、354或355中示出的序列；(ii)vh cdr2，包含seq id no:169、154、194、159、195、196、162、158、198、177、178、199、200、201、202、203、204、206、207、208、172、203、204、350、351、356或357中示出的序列；以及(iii)vh cdr3，包含seq id no:155、161、197、205、164或352或358中示出的序列；和/或其中轻链可变(vl)区包含(i)vl cdr1，包含seq id no:209、271、273、275、251、277、260、279、245、283、285、287、290、292、235、297、299或361中示出的序列；(ii)vl cdr2，包含seq id no:221、359或362中示出的序列；以及(iii)vl cdr3，包含seq id no:211、225、272、274、276、278、280、281、282、284、286、288、289、291、293、294、229、296、298、300或360中示出的序列。
[0021]
在一些实施方案中，(a)第一抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，包含(i)vh互补决定区1(cdr1)，包含seq id no:331、332、333、401、407或408中示出的序列；(ii)vh cdr2，包含seq id no:336、417、404或405中示出的序列；以及iii)vh cdr3，包含seq id no:335或406中示出的序列；和/或轻链可变(vl)区，包含(i)vl cdr1，包含seq id no:343或441中示出的序列；(ii)vl cdr2，包含seq id no:341或436中示出的序列；以及(iii)vl cdr3，包含seq id no:342或439中示出的序列；并且(b)第二抗体可变结构域包含重链vh区，包含重链可变(vh)区，包含(i)vh cdr1，包含seq id no:151、156或157中示出的序列；(ii)vh cdr2，包含seq id no:158或159中示出的序列；以及(iii)vh cdr3，包含seq id no:155中示出的序列；和/或其中轻链可变(vl)区包含(i)vl cdr1，包含seq id no:209中示出的序列；(ii)vl cdr2，包含seq id no:221中示出的序列；以及(iii)vl cdr3，包含seq id no:225中示出的序列。
[0022]
在一些实施方案中，双特异性抗体的第一和第二抗体可变结构域在铰链区的位置223、225和228以及人igg2(seq id no:493)的ch3区的位置409或368(eu编号方案)处包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，如本文所述的双特异性抗体在人igg2的位置265处进一步包含氨基酸修饰。
[0023]
在另一方面，本发明提供包含本文描述的任何抗体(例如bcma、cd3或双特异性)或其缀合物(例如bcma抗体-药物缀合物)的药物组合物。
[0024]
在另一方面，本发明还提供重组产生本文描述的任何抗体(例如bcma、cd3或双特异性)或其缀合物(例如bcma抗体-药物缀合物)的细胞系。
[0025]
在另一方面，本发明还提供编码本文描述的任何抗体(例如bcma、cd3或双特异性)或其缀合物(例如bcma抗体-药物缀合物)的核酸。本发明还提供编码本文描述的任何这些抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸。
[0026]
本发明还提供包含有效量的本文描述的任何抗体(例如bcma、cd3或双特异性)或其缀合物(例如bcma抗体-药物缀合物)的试剂盒。
[0027]
本发明还提供治疗有此需要的个体中的疾病状况(例如肿瘤生长/发展抑制；表达bcma的恶性细胞的转移抑制；具有表达bcma的恶性细胞的个体中的肿瘤消退)的方法，所述
no:454。
[0033]
图4还示出mm1s原位多发性骨髓瘤模型中抗bcmaadc的体内效力，包括与1)h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-3377，2)n297q/k222r-aclys-val-cit-pabc-aur0101，3)lcq05/k222r-aclys-val-cit-pabc-aur0101，4)h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-0131和5)n297q/k222r/lcq05-aclys-val-cit-pabc-aur0101缀合的l3.py/p6e01抗体。nnc是对照非bcma抗体(抗体-n297q/k222r-aclys-vc-pabc-0101)。“lcq05”和h7c分别对应于包含谷氨酰胺的转谷氨酰胺酶标签seq id no:474和seq id no:454。
[0034]
图5还示出mm1s原位多发性骨髓瘤模型中抗bcmaadc的体内效力。将抗bcma抗体combo_rd4_0.6nm-c29(“comboc29di)缀合至h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-131，剂量范围为0.1mg/kg、0.38mg/kg、0.75mg/kg、1.5mg/kg，相比之下对照非bcma抗体nnc(抗体-n297q/k222r-aclys-vc-pabc-0101)为3mg/kg。h7c对应于包含谷氨酰胺的转谷氨酰胺酶标签seq id no:454。
[0035]
图6a-图6f示出食蟹猴中抗cd3/抗cd20双特异性抗体的体内效力。单一剂量的双特异性抗体之后的b细胞消耗显示为研究前计数的百分比。
[0036]
图7a-图7f示出食蟹猴中抗cd3/抗cd20双特异性抗体的体内效力。在单一剂量的双特异性抗体之后追踪cd8 t细胞动力学。
[0037]
图8a和图8b示出食蟹猴中抗cd3/抗cd20双特异性抗体的体内效力。分析了单价cd3抗体对t细胞动力学和增殖的影响。
[0038]
图9a-图9d示出食蟹猴中抗cd3/抗cd20双特异性抗体的体内效力。分析了抗cd3臂亲和力对b细胞消耗的影响。
[0039]
图10a和10b示出所选抗cd3抗体在人和食蟹猴pbmc上具有胸苷掺入读数。
[0040]
图11a-图11d显示所有人抗epcam_h2b4双特异性抗体在体外环境中具有细胞杀死活性。
[0041]
图12显示单一剂量的人抗bcma/cd3双特异性抗体在原位mm1.s骨髓瘤模型中以剂量依赖性方式导致肿瘤消退。
[0042]
图13显示两个剂量的人抗bcma/cd3双特异性抗体在原位molp8骨髓瘤模型中导致增加的肿瘤消退。
[0043]
图14显示在原位molp8肿瘤模型中，抗bcma/cd3双特异性抗体单独或与多发性骨髓瘤的护理标准(来那度胺或硼替佐米)组合比组合的来那度胺和硼替佐米更有效。
[0044]
图15a-图15c分别显示与单独抗bcma/cd3双特异性抗体相比，卡非佐米(carfilzomib)、来那度胺和多柔比星对抗bcma/cd3双特异性抗体对opm2细胞的功能没有负面影响。
[0045]
图16显示与单独每种分子相比，当与卡非佐米和来那度胺组合时对抗bcma/cd3双特异性抗体功能的协同效应。
[0046]
发明详述
[0047]
本文公开的发明提供特异性地结合bcma(例如人bcma)的抗体和抗体缀合物(例如抗体-药物缀合物)。本发明还提供编码这些抗体和缀合物的多核苷酸，包含这些抗体和缀合物的组合物以及制备这些抗体和缀合物的方法。此外，本文公开的发明提供特异性地结合cd3(例如人cd3)的抗体以及特异性地结合cd3和肿瘤抗原(例如bcma)的异源二聚体抗体
(例如双特异性抗体)。本发明还提供编码这些抗体的多核苷酸，包含这些抗体的组合物以及制备和使用这些抗体的方法。本发明进一步提供治疗个体中与恶性bcma表达相关的疾病状况的方法，如癌症或自身免疫性疾病，利用如本文所述的抗体(例如bcma、cd3或双特异性抗体)或其缀合物(bcma抗体-药物缀合物)。
[0048]
一般技术
[0049]
除非另有说明，本发明的实施会采用本领域技术内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这类技术在文献中充分说明，例如molecular cloning:a laboratory manual，second edition(sambrook et al.，1989)cold spring harbor press；oligonucleotide synthesis(m.j.gait，ed.，1984)；methods in molecular biology，hμmana press；cell biology:a laboratory notebook(j.e.cellis，ed.，1998)academic press；animal cell culture(r.i.freshney，ed.，1987)；introduction to cell and tissue culture(j.p.mather and p.e.roberts，1998)plenμm press；cell and tissue culture:laboratory procedures(a.doyle，j.b.griffiths，and d.g.newell，eds.，1993-1998)j.wiley and sons；methods in enzymology(academic press，inc.)；handbook of experimental immunology(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.m.miller and m.p.calos，eds.，1987)；current protocols in molecular biology(f.m.ausubel et al.，eds.，1987)；pcr:the polymerase chain reaction,(mullis et al.，eds.，1994)；current protocols in immunology(j.e.coligan et al.，eds.，1991)；short protocols in molecular biology(wiley and sons，1999)；immunobiology(c.a.janeway and p.travers，1997)；antibodies(p.finch，1997)；antibodies:a practical approach(d.catty.，ed.，irl press，1988-1989)；monoclonal antibodies:a practical approach(p.shepherd and c.dean，eds.，oxford university press，2000)；using antibodies:a laboratory manual(e.harlow and d.lane(cold spring harbor laboratory press，1999)；the antibodies(m.zanetti and j.d.capra，eds.，harwood academic publishers，1995)。
[0050]
定义
[0051]“抗体”是免疫球蛋白分子，其能够通过位于所述免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标，例如糖类、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所用，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖它们的片段(例如fab、fab’、f(ab’)2、fv)、单链(scfv)和结构域抗体(包括，例如鲨鱼和骆驼抗体)、及包含抗体的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。抗体包括任何类别的抗体，例如igg、iga或igm(或它们的亚类)，并且所述抗体不必是任何特殊类别。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。有五种主要类别的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些中的几种可以进一步分为若干亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
[0052]
如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指保留特异性地结合给定抗原(例如bcma或cd3)的能力的完整抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能
可以由完整抗体的片段进行。术语抗体的“抗原结合片段”内涵盖的结合片段的实例包括fab；fab’；f(ab’)2；由vh和ch1结构域组成的fd片段；由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；单结构域抗体(dab)片段(ward et al.，nature 341:544-546，1989)，以及分离的互补决定区(cdr)。
[0053]“优先结合”或“特异性地结合”(在本文中可交换使用)至靶标(例如bcma蛋白或cd3蛋白)的抗体、抗体缀合物或多肽是本领域中很好理解的术语，并且确定这样的特异性或优先结合的方法也是本领域公知的。如果和分子与可选细胞或物质相比，其更频繁、更快速地以更大的持续时间和/或以更大的亲和力与特定分子或物质反应或相关，则说分子表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果与抗体结合其他物质相比，其以更大的亲和力、亲和性，更快速地和/或以更大的持续时间结合，则抗体“特异性地结合”或“优先结合”至靶标。例如特异性或优先结合bcma表位或cd3表位的抗体是与其结合其他bcma表位、非bcma表位、cd3表位或非cd3表位相比，以更大的亲和力、亲和性，更快速地和/或以更大的持续时间结合这个表位的抗体。通过阅读这个定义，还应当理解，例如特异性或优先结合第一靶标的抗体(或者部分或表位)可以或不可以特异性或优先结合第二靶标。因此，“特异性结合”或“优先结合”不必要求(虽然其可以包括)专一结合。一般来说，但不是必需的，提到结合表示优先结合。
[0054]
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独或组合。如本领域已知的，重链和轻链的可变区各自由通过也称作高变区的3个互补决定区(cdr)连接的4个框架区(fr)组成。每条链中的cdr通过fr紧紧保持在一起，以及与来自其他链的保持在一起，有助于形成抗体的抗原结合位点。有至少两种技术用于确定cdr：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，kabat et al.sequences of proteins of immunological interest,(5th ed.，1991，national institutes of health，bethesda md))；以及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(al-lazikani et al.，1997，j.molec.biol.273:927-948)。如本文所用，cdr可以指通过任一种方法或通过两种方法的组合定义的cdr。
[0055]
可变结构域的“cdr”是按照kabat、chothia的定义，kabat和chothia的积累，abm，接触和/或构象定义或者本领域公知的cdr确定的任何方法鉴定的可变区内的氨基酸残基。抗体cdr可以鉴定为kabat等人最初定义的高变区。参见例如kabat et al.，1992，sequences of proteins of immunological interest，5th ed.，public health service，nih，washington d.c。cdr的位置还可以鉴定为chothia和其他人最初描述的结构环结构。参见例如chothia et al.，nature 342:877-883，1989。cdr鉴定的其他方法包括“abm定义”，其是kabat和chothia之间的折衷并利用牛津分子abm抗体建模软件(现在)衍生，或者基于观察到的抗原接触的cdr的“接触定义”，在maccallμm et al.，j.mol.biol.，262:732-745，1996中示出。在另一方法中，在本文中称作cdr的“构象定义”，cdr的位置可以鉴定为对抗原结合作出焓贡献的残基。参见例如makabe et al.，journal of biological chemistry，283:1156-1166，2008。还有其他cdr边界定义可能不严格遵循上述方法之一，但是与至少一部分的kabat cdr重叠，虽然按照特定残基或残基的组或甚至整个cdr不显著影响抗原结合的预测或实验发现它们可以缩短或延长。如本文所用，cdr可以指通过本领域已知的任何方法定义的cdr，包括方法的组合。本文使用的方法可以利用根据任何这些方法定义的cdr。对于包含一个以上cdr的任何给定实施方案，cdr可以按照
kabat、chothia、延伸的、abm、接触和/或构象定义中的任一种定义。
[0056]
如本文所用，“单克隆抗体”是指获得自基本上同质的抗体群体的抗体，即包含该群体的各抗体是相同的，除了可能少量存在的可能自然发生的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每个单克隆抗体只针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体，并且不应当理解为要求通过任何特定方法制备抗体。例如根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由kohler and milstein，nature 256:495，1975首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过如u.s.pat.no.4,816,567中描述的重组dna方法制备。单克隆抗体还可以分离自利用例如mccafferty et al.，nature 348:552-554，1990中描述的技术产生的噬菌体文库。
[0057]
如本文所用，“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体的形式，其是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如fv、fab、fab’、f(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(cdr)的残基被来自具有期望的特异性、亲和性和能力(capacity)的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的cdr的残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的fv构架区(fr)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含这样的残基，在受体抗体或者引入的cdr或框架序列中均未发现，但是包括所述残基以进一步精制和优化抗体性能。一般来说，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有cdr区对应于非人免疫球蛋白的那些区域，并且所有或基本上所有fr区是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体最优选还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或结构域(fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。优选具有如wo 99/58572所述修饰的fc区的抗体。其他形式的人源化抗体具有对原抗体改变的一个或多个cdr(cdr l1、cdr l2、cdr l3、cdr h1、cdr h2或cdr h3)，其也称作“源自”来自原抗体的一个或多个cdr的一个或多个cdr。
[0058]
如本文所用，“人抗体”表示具有对应于人产生的抗体的氨基酸序列的抗体和/或利用本领域技术人员已知或本文公开的制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这个定义包括这样的抗体，其包含至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽。一个这样的实例是包含小鼠轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可以利用本领域已知的各种技术制备。在一实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达人抗体(vaughan et al.，nature biotechnology，14:309-314，1996；sheets et al.，proc.natl.acad.sci.(usa)95:6157-6162，1998；hoogenboom and winter，j.mol.biol.，227:381，1991；marks et al.，j.mol.biol.，222:581，1991)。人抗体还可以通过免疫其中已转基因引入人免疫球蛋白基因座代替内源基因座的动物来制备，例如其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全灭活的小鼠。这种方法在u.s.pat.no.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016中描述。或者，人抗体可以通过永生化产生针对靶抗原的抗体的人b淋巴细胞来制备(这类b淋巴细胞可以回收自个体或cdna的单细胞克隆，或者可以体外免疫)。参见例如cole et al.monoclonal antibodies and cancer therapy，alan r.liss，p.77，1985；boerner et al.，j.immunol.，147(1):86-95，1991；和u.s.pat.no.5,750,373。
[0059]
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，而恒定区序列
源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人抗体的抗体。
[0060]
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可交换使用，指任何长度的氨基酸链，优选地，相对短的(例如10-100个氨基酸)。所述链可以是线性或支化的，其可以包含修饰的氨基酸，和/或可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖天然或通过干预修饰的氨基酸链；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或者任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。该定义还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解多肽可以作为单链或相关链存在。
[0061]“单价抗体”每分子包含一个抗原结合位点(例如igg或fab)。在某些情况下，单价抗体可以具有一个以上抗原结合位点，但是所述结合位点来自不同抗原。
[0062]“单特异性抗体”每分子包含两个相同的抗原结合位点(例如igg)，从而两个结合位点结合抗原上的相同表位。因此，它们互相竞争结合一个抗原分子。自然界中发现的大多数抗体是单特异性的。在某些情况下，单特异性抗体也可以是单价抗体(例如fab)。
[0063]“二价抗体”每分子包含两个抗原结合位点(例如igg)。在某些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。但是，二价抗体可以是双特异性的。
[0064]“双特异性”或“双重特异性”是具有两个不同抗原结合位点的杂交抗体。双特异性抗体的两个抗原结合位点结合两个不同表位，其可以位于相同或不同蛋白靶标上。
[0065]“双功能”抗体是这样的抗体，其两臂中具有相同的抗原结合位点(即，相同的氨基酸序列)，但是每个结合位点可以识别两个不同抗原。
[0066]“异源多聚体”、“异源多聚体复合物”或“异源多聚体多肽”是至少包含第一多肽和第二多肽分子，其中第二多肽的氨基酸序列与第一多肽的不同之处在于至少一个氨基酸残基。异源多聚体可以包含由第一和第二多肽形成的“异源二聚体”，或者可以形成更高级的三级结构，其中存在除第一和第二多肽以外的多肽。
[0067]“异源二聚体”、“异源二聚体蛋白”、“异源二聚体复合物”或“异源二聚体多肽”是包含第一多肽和第二多肽分子，其中第二多肽的氨基酸序列与第一多肽的不同之处在于至少一个氨基酸残基。
[0068]
如本文所用，“铰链区”、“铰链序列”及其变化包括本领域已知的含义，其在例如janeway et al.，immunobiology:the immune system in health and disease,(elsevier science ltd.，ny)(4th ed.，1999)；bloom et al.，protein science(1997)，6:407-415；hμmphreys et al.，j.immunol.methods(1997)，209:193-202中说明。
[0069]
如本文所用，“免疫球蛋白样铰链区”、“免疫球蛋白样铰链序列”及其变化是指免疫球蛋白样或抗体样分子(例如免疫粘附素)的铰链区和铰链序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白样铰链区可以来自或衍生自任何igg1、igg2、igg3或igg4亚型，或者来自iga、ige、igd或igm，包括其嵌合形式，例如嵌合igg1/2铰链区。
[0070]
如本文所用的术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”是指人免疫系统中的天然细胞库内的细胞，可以将其激活以影响靶细胞的生存力。靶细胞的生存力可以包括细胞存活、增殖和/或与其他细胞相互作用的能力。
[0071]
可以利用本领域公知的技术制备本发明的抗体，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或这类技术的组合或者本领域中容易知道的其他技术(参见例如jayasena，s.d.，clin.chem.，45:1628-50，1999and fellouse，f.a.，et al，j.moi.biol.，373(4):924-40，
health，bethesda，md.，1991。免疫球蛋白的fc区一般包含两个恒定区ch2和ch3。
[0077]
如本领域所用，“fc受体”和“fcr”描述结合抗体fc区的受体。优选的fcr是天然序列人fcr。此外，优选的fcr是结合igg抗体的fcr(γ受体)，并且包括fcγri、fcγrii和fcγriii亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可选剪接形式。fcγrii受体包括fcγriia(“激活受体”)和fcγriib(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要不同之处在于其细胞质结构域。fcr在ravetch and kinet，ann.rev.immunol.，9:457-92，1991；capel et al.，immunomethods，4:25-34，1994；和de haas et al.，j.lab.clin.med.，126:330-41，1995中综述。“fcr”还包括新生儿受体fcrn，其负责将母体igg转移至胎儿(guyer et al.，j.immunol.，117:587，1976；和kim et al.，j.immunol.，24:249，1994)。
[0078]
如本文关于抗体所用，术语“竞争”表示第一抗体或其抗原结合片段(或部分)以与第二抗体或其抗原结合部分的结合非常相似的方式结合表位，从而与第一抗体在第二抗体不存在下的结合相比，第一抗体与其同源表位结合的结果在第二抗体的存在下可检测地减少。其中第二抗体与其表位的结合在第一抗体的存在下也可检测地减少的另一选择是可以的，但不必如此。即，第一抗体可以抑制第二抗体结合其表位而第二抗体不抑制第一抗体结合其相应的表位。但是，当每个抗体可检测地抑制另一抗体与其同源表位或配体结合时，无论相同、更大或更小程度，认为抗体互相“交叉竞争”结合它们各自的表位。本发明涵盖竞争和交叉竞争抗体。无论这样的竞争或交叉竞争发生的机制(例如位阻、构象改变或者结合共同表位或其部分)，基于本文提供的教导，技术人员会理解涵盖这类竞争和/或交叉竞争抗体，并且可以用于本文公开的方法。
[0079]“功能性fc区”具有天然序列fc区的至少一个效应子功能。示例性“效应子功能”包括c1q结合；补体依赖性细胞毒性；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；吞噬作用；细胞表面受体(例如b细胞受体)的下调等。这类效应子功能一般需要fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以利用本领域已知用于评价这类抗体效应子功能的各种测定进行评价。
[0080]“天然序列fc区”包含与自然界中发现的fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体fc区”包含与天然序列fc区的不同之处在于至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，但是仍保留天然序列fc区的至少一个效应子功能。在一些实施方案中，变体fc区与天然序列fc区或母体多肽的fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如天然序列fc区或母体多肽的fc区中约1-约10个氨基酸取代，并且优选地，约1-约5个氨基酸取代。本文中的变体fc区优选与天然序列fc区和/或与母体多肽的fc区具有至少约80％序列相同性，并且最优选地，与其至少约90％序列相同性，更优选地，与其至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列相同性。
[0081]
术语“效应子功能”是指可归因于抗体fc区的生物活性。抗体效应子功能的实例包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、fc受体结合、补体依赖性细胞毒性(cdc)、吞噬作用、c1q结合以及细胞表面受体(例如b细胞受体；bcr)的下调。参见例如u.s.pat no.6,737,056。这类效应子功能一般需要fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以利用本领域已知用于评价这类抗体效应子功能的各种测定进行评价。效应子功能的示例性测量是通过fcγ3和/或c1q结合。
[0082]
如本文所用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指细胞介导的反应，
其中表达fc受体(fcr)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞的裂解。所关注的分子的adcc活性可以利用体外adcc测定进行评价，如美国专利号5,500,362或5,821,337所述。可用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和nk细胞。可选地或额外地，所关注的分子的adcc活性可以体内评价，例如在如clynes et al.，1998，pnas(usa)，95:652-656中公开的动物模型中。
[0083]“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指在补体存在下的靶标裂解。补体激活途径通过补体系统的第一组分(c1q)结合与同源抗原络合的分子(例如抗体)起始。为了评价补体激活，可以进行cdc测定，例如gazzano-santoro et al.，j.immunol.methods，202:163(1996)所述。
[0084]
如本文所用，“治疗”是获得有益的或期望的临床结果的方法。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下情况中的一种或多种：减少肿瘤或癌细胞的增殖(或者破坏肿瘤或癌细胞)，抑制肿瘤细胞的转移，bcma相关疾病(例如癌症或自身免疫性疾病)的缓解，减少bcma相关疾病(例如癌症或自身免疫性疾病)所致的症状，增加患有bcma相关疾病(例如癌症或自身免疫性疾病)的患者的生活质量，减少治疗bcma相关疾病(例如癌症或自身免疫性疾病)所需要的其他药物的剂量，延缓bcma相关疾病(例如癌症或自身免疫性疾病)的发展，治愈bcma相关疾病(例如癌症或自身免疫性疾病)，和/或延长患有bcma相关疾病(例如癌症或自身免疫性疾病)的患者的生存期。
[0085]“改善”表示与未给予bcma抗体或bcma抗体缀合物相比，一种或多种症状的减轻或改善。“改善”还包括缩短或减少症状的持续时间。
[0086]
如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现任何一种或多种有益的或期望的结果的量。对于预防性用途，有益的或期望的结果包括消除或降低疾病的风险，减轻疾病的严重程度，或者延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症以及疾病发展中存在的中间病理学表型。为了治疗性用途，有益的或期望的结果包括临床结果，例如减少各种bcma相关疾病或疾病状况(如多发性骨髓瘤)的一种或多种症状的发生或改善，减少治疗该疾病所需要的其他药物的剂量，增强另一药物的效果，和/或延缓患者的bcma相关疾病的发展。有效剂量可以通过一次或多次施用来给予。为了本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。如临床的上下文中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以与或不与另一药物、化合物或药物组合物联用而实现。因此，可以根据给予一种或多种治疗剂来考虑“有效剂量”，并且如果与一种或多种其他药物联用，可以考虑以有效量给予单一药物是否可以实现期望的结果。
[0087]“个体”或“对象”是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠物、灵长类、马、犬、猫、小鼠和大鼠。
[0088]
如本文所用，“载体(vector)”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的dna或rna表达载体、包囊化于脂质体中的dna或rna表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。
[0089]
如本文所用，“表达控制序列”表示指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以
是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或者增强子。表达控制序列可操纵地连接至待转录的核酸序列。
[0090]
如本文所用，“药学可接受的载体”或“药学可接受的赋形剂"包括任何这样的材料，当与活性成分组合时，其允许所述成分保持生物活性，并且不与对象的免疫系统反应。实例包括但不限于任何标准药学载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)以及各种类型的湿润剂。用于气溶胶或肠胃外施用的优选稀释剂为磷酸缓冲盐水(pbs)或生理盐水(0.9％)。通过公知的常规方法配制包含这类载体的组合物(参见例如remington's pharmaceutical sciences，18th edition，a.gennaro，ed.，mack publishing co.，easton，pa，1990；和remington，the science and practice of pharmacy 21st ed.mack publishing，2005)。
[0091]
如本文所用的术语“含有酰基供体谷氨酰胺的标签”或“谷氨酰胺标签”是指包含充当转谷氨酰胺酶胺受体的一个或多个gln残基的多肽或蛋白。参见例如wo2012059882和wo2015015448。
[0092]
如本文所用，术语“k
on”或“k
a”是指抗体结合抗原的速率常数。具体地，利用完整抗体(即二价)和单体bcma蛋白测量速率常数(k
on
/ka和k
off
/kd)和平衡解离常数。
[0093]
如本文所用，术语“k
off”或“k
d”是指抗体抗体从抗体/抗原复合物解离的速率常数。
[0094]
如本文所用，术语“k
d”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
[0095]
在本文中提到“大约”值或参数包括(并且描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如提到“约x”的描述包括“x”的描述。数字范围包括定义范围的数字。
[0096]
应当理解在本文中无论哪里用语言“包含”描述实施方案，还提供按照“由
…
组成”和/或“基本上由
…
组成”描述的其他类似实施方案。
[0097]
当在markush组或替代的其他分组方面描述本发明的方面或实施方案时，本发明不仅涵盖作为整体列出的整个组，而且单独组的每个成员和主组的所有可能的亚组，而且还涵盖不存在一个或多个组成员的主组。本发明还设想明确排除要求保护的发明中的任何组成员的一个或多个。
[0098]
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，本说明书，包括定义会控制。在整个说明书和权利要求中，词语“包含(comprise)”或变异如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”理解为表示包括所述整数或整数的组但不排除任何其他整数或整数的组。除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。
[0099]
本文描述了示例性方法和材料，虽然与本文所述那些相似或相等的方法和材料也可以用于本发明的实施或测试。材料、方法和实例仅是说明性的且不意图是限制性的。
[0100]
bcma抗体及其制备方法
[0101]
本发明提供一种抗体，其结合bcma(例如人bcma(例如seq id no:353或登录号：q02223-2)，并且特征在于以下特征的任何一种或多种：(a)治疗、预防、改善个体中与表达bcma的恶性细胞相关的疾病状况(例如b-细胞相关癌症如多发性骨髓瘤)的一种或多种症状；(b)抑制个体(其具有表达bcma的恶性肿瘤)中的肿瘤生长或发展；(c)抑制个体(其具有表达bcma的一种或多种恶性细胞)中表达bcma的癌症(恶性)细胞的转移；(f)诱导表达bcma
的肿瘤的消退(例如长期消退)；(d)在表达bcma的恶性细胞中发挥细胞毒性活性；以及(e)阻断bcma与其他尚待鉴定的因素的相互作用。
[0102]
在一方面，提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合b-细胞成熟抗原(bcma)，其中所述抗体包含(a)重链可变(vh)区，包含(i)vh互补决定区1(cdr1)，包含序列syx1mx2，其中x1为a或p；并且x2为t、n或s(seq id no:301)，gftfx1sy，其中x1为g或s(seq id no:302)，或者gftfx1syx2mx3，其中x1为g或s，x2为a或p；并且x3为t、n或s(seq id no:303)；(ii)vh cdr2，包含序列ax1x2x3x4gx5x6x7x8yadx9x
10
kg，其中x1为i、v、t、h、l、a或c；x2为s、d、g、t、i、l、f、m或v；x3为g、y、l、h、d、a、s或m；x4为s、q、t、a、f或w；x5为g或t；x6为n、s、p、y、w或f；x7为s、t、i、l、t、a、r、v、k、g或c；x8为f、y、p、w、h或g；x9为v、r或l；并且x
10
为g或t(seq id no:305)，或者x1x2x3x4x5x6，其中x1为s、v、i、d、g、t、l、f或m；x2为g、y、l、h、d、a、s或m；x3为s、g、f或w；x4为g或s；x5为g或t；并且x6为n、s、p、y或w(seq id no:306)；以及iii)vh cdr3，包含序列vspix1x2x3x4，其中x1为a或y；x2为a或s；并且x3为g、q、l、p或e(seq id no:307)，或者ywpmx1x2，其中x1为d、s、t或a；并且x2为i、s、l、p或d(seq id no:308)；和/或轻链可变(vl)区，包含(i)vl cdr1，包含序列x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
，其中x1为r、g、w、a或c；x2为a、p、g、l、c或s；x3为s、g或r；x4为q、c、e、v或i；x5为s、p、g、a、r或d；x6为v、g、i或l；x7为s、e、d、p或g；x8为s、p、f、a、m、e、v、n、d或y；x9为i、t、v、e、s、a、m、q、y、h、r或f；x
10
为y或f；x
11
为l、w或p；并且x
12
为a、s或g(seq id no:309)；(ii)vl cdr2，包含序列x1asx2rax3，其中x1为g或d；x2为s或i；并且x3为t或p(seq id no:310)；以及(iii)vl cdr3，包含序列qqyx1x2x3px4t，其中x1为g、q、e、l、f、a、s、m、k、r或y；x2为s、r、t、g、v、f、y、d、a、h、v、e、k或c；x3为w、f或s；并且x4为l或i(seq id no:311)，或者qqyx1x2x3px4，其中x1为g、q、e、l、f、a、s、m、r、k或y；x2为s、r、t、g、r、v、d、a、h、e、k、c、f或y；x3为w、s或f；并且x4为l或i(seq id no:312)。
[0103]
在另一方面，提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合bcma，其中所述抗体包含：vh区，包含seq id no:2、3、7、8、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、37、39、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、83、87、92、95、97、99、101、104、106、110、112、114、118、120、122、112、125、127、313、314、363或365中示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；和/或vl区，包含seq id no:1、4、5、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、34、36、38、40、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、317、80、81、82、84、85、86、88、89、90、91、93、94、96、98、100、102、103、105、107、108、109、111、113、115、116、117、119、121、123、124、126、128、315、316或364中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。
[0104]
在一些实施方案中，提供一种抗体，其具有如表1中列出的任一部分轻链序列和/或如表1中列出的任一部分重链序列。
[0105]
表1
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
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[0123]
[0124]
[0125]
[0126]
[0127][0128]
在表1中，下划线的序列是根据kabat的cdr序列，而黑体根据chothia，除了如下的重链cdr2序列，其中chothia cdr序列是下划线的，而kabat cdr序列是黑体的：p5a2_vhvl、a02_rd4_0.6nm_c06、a02_rd4_0.6nm_c09、a02_rd4_6nm_c16、a02_rd4_6nm_c03、a02_rd4_6nm_c01、a02_rd4_6nm_c26、a02_rd4_6nm_c25、a02_rd4_6nm_c22、a02_rd4_6nm_c19、a02_rd4_0.6nm_c03、a02_rd4_6nm_c07、a02_rd4_6nm_c23、a02_rd4_0.6nm_c18、a02_rd4_6nm_c10、a02_rd4_6nm_c05、a02_rd4_0.6nm_c10、a02_rd4_6nm_c04、a02_rd4_0.6nm_c26、a02_rd4_0.6nm_c13、a02_rd4_0.6nm_c01、a02_rd4_6nm_c08、p5c1_vhvl、c01_rd4_6nm_c24、c01_rd4_6nm_c26、c01_rd4_6nm_c10、c01_rd4_0.6nm_c27、c01_rd4_6nm_c20、c01_rd4_6nm_c12、c01_rd4_0.6nm_c16、c01_rd4_0.6nm_c09、c01_rd4_6nm_c09、c01_rd4_0.6nm_c03、c01_rd4_0.6nm_c06、c01_rd4_6nm_c04、combo_rd4_0.6nm_c22、combo_rd4_6nm_c21、combo_rd4_6nm_c10、combo_rd4_0.6nm_c04、combo_rd4_6nm_c25、combo_rd4_0.6nm_c21、combo_rd4_6nm_c11、combo_rd4_0.6nm_c20、combo_rd4_6nm_c09、combo_rd4_6nm_c08、combo_rd4_0.6nm_c19、combo_rd4_0.6nm_c02、combo_rd4_0.6nm_c23、combo_rd4_0.6nm_c29、combo_rd4_0.6nm_c09、combo_rd4_6nm_c12、combo_rd4_0.6nm_c30、combo_rd4_0.6nm_c14、combo_rd4_6nm_c07、combo_rd4_6nm_c02、combo_rd4_0.6nm_c05、combo_rd4_0.6nm_c17、combo_rd4_6nm_c22、和combo_rd4_0.6nm_c11。
[0129]
本发明还提供bcma抗体的cdr部分(包括chothia、kabat cdr和cdr接触区)。cdr区的确定在本领域技术之内。应当理解在一些实施方案中，cdr可以是kabat和chothia cdr的组合(也称作“组合的cr”或“延长的cdr”)。在一些实施方案中，cdr是kabat cdr。在其他实施方案中，cdr是chothia cdr。换句话说，在具有一个以上cdr的实施方案中，cdr可以是任何kabat、chothia、组合cdr或它们的组合。表2提供本文提供的cdr序列的实例。
[0130]
表2
[0131]
[0132]
[0133]
[0134]
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146][0147]
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体，其结合bcma并与如本文所述的抗体竞争，包括p6e01/p6e01、p6e01/h3.aq、l1.lgf/l3.kw/p6e01；l1.lgf/l3.ny/p6e01、l1.gdf/l3.ny/p6e01、l1.lgf/l3.kw/h3.al、l1.lgf/l3.kw/h3.ap、l1.lgf/l3.kw/h3.aq、l1.lgf/l3.py/h3.ap、l1.lgf/l3.py/h3.aq、l1.lgf/l3.ny/h3.al、l1.lgf/l3.ny/h3.ap、l1.lgf/l3.ny/h3.aq、l1.gdf/l3.kw/h3.al、l1.gdf/l3.kw/h3.ap、l1.gdf/l3.kw/h3.aq、l1.gdf/l3.py/h3.aq、l1.gdf/l3.ny/h3.al、l1.gdf/l3.ny/h3.ap、l1.gdf/l3.ny/h3.aq、l3.kw/p6e01、l3.py/p6e01、l3.ny/p6e01、l3.py/l1.ps/p6e01、l3.py/l1.ah/p6e01、l3.py/l1.ff/p6e01、l3.py/l1.ph/p6e01、l3.py/l3.ky/p6e01、l3.py/l3.kf/p6e01、l3.py/h2.qr、l3.py/h2.dy、l3.py/h2.yq、l3.py/h2.lt、l3.py/h2.ha、l3.py/h2.ql、l3.py/h3.ya、l3.py/h3.ae、l3.py/h3.aq、l3.py/h3.taq、l3.py/p6e01、l3.py/l1.ps/h2.qr、l3.py/l1.ps/h2.dy、l3.py/l1.ps/h2.yq、l3.py/l1.ps/h2.lt、l3.py/l1.ps/h2.ha、l3.py/l1.ps/h2.ql、l3.py/l1.ps/h3.ya、l3.py/l1.ps/h3.ae、l3.py/l1.ps/h3.aq、l3.py/l1.ps/h3.taq、l3.py/l1.ah/h2.qr、l3.py/l1.ah/h2.dy、l3.py/l1.ah/h2.yq、l3.py/l1.ah/h2.lt、l3.py/l1.ah/h2.ha、l3.py/l1.ah/h2.ql、l3.py/l1.ah/h3.ya、l3.py/l1.ah/h3.ae、l3.py/l1.ah/h3.aq、l3.py/l1.ah/h3.taq、l3.py/l1.ff/h2.qr、l3.py/l1.ff/h2.dy、l3.py/l1.ff/h2.yq、l3.py/l1.ff/h2.lt、l3.py/l1.ff/h2.ha、l3.py/l1.ff/h2.ql、l3.py/l1.ff/h3.ya、l3.py/l1.ff/h3.ae、l3.py/l1.ff/h3.aq、l3.py/l1.ff/h3.taq、l3.py/l1.ph/h2.qr、l3.py/l1.ph/h2.ha、l3.py/l1.ph/h3.ae、l3.py/l1.ph/h3.aq、l3.py/l1.ph/h3.taq、l3.py/l3.ky/h2.qr、l3.py/l3.ky/h2.dy、l3.py/l3.ky/h2.yq、l3.py/l3.ky/h2.lt、l3.py/l3.ky/h2.ha、l3.py/l3.ky/h2.ql、l3.py/l3.ky/h3.ya、l3.py/l3.ky/h3.taq、l3.py/l3.kf/h2.dy、l3.py/l3.kf/h2.yq、l3.py/l3.kf/h2.lt、l3.py/l3.kf/h2.ql、l3.py/l3.kf/h3.ya、l3.py/l3.kf/h3.ae、l3.py/l3.kf/h3.aq、l3.py/l3.kf/h3.taq、p5a2_vhvl、a02_rd4_0.6nm_c06、a02_rd4_0.6nm_c09、a02_rd4_6nm_c16、a02_rd4_6nm_c03、a02_rd4_6nm_c01、a02_rd4_6nm_c26、a02_rd4_6nm_c25、a02_rd4_6nm_c22、a02_rd4_6nm_c19、a02_rd4_0.6nm_c03、a02_rd4_6nm_c07、a02_rd4_6nm_c23、a02_rd4_0.6nm_c18、a02_rd4_6nm_c10、a02_rd4_6nm_c05、a02_rd4_0.6nm_c10、a02_rd4_6nm_c04、a02_rd4_0.6nm_c26、a02_rd4_0.6nm_c13、a02_
rd4_0.6nm_c01、a02_rd4_6nm_c08、p5c1_vhvl、c01_rd4_6nm_c24、c01_rd4_6nm_c26、c01_rd4_6nm_c10、c01_rd4_0.6nm_c27、c01_rd4_6nm_c20、c01_rd4_6nm_c12、c01_rd4_0.6nm_c16、c01_rd4_0.6nm_c09、c01_rd4_6nm_c09、c01_rd4_0.6nm_c03、c01_rd4_0.6nm_c06、c01_rd4_6nm_c04、combo_rd4_0.6nm_c22、combo_rd4_6nm_c21、combo_rd4_6nm_c10、combo_rd4_0.6nm_c04、combo_rd4_6nm_c25、combo_rd4_0.6nm_c21、combo_rd4_6nm_c11、combo_rd4_0.6nm_c20、combo_rd4_6nm_c09、combo_rd4_6nm_c08、combo_rd4_0.6nm_c19、combo_rd4_0.6nm_c02、combo_rd4_0.6nm_c23、combo_rd4_0.6nm_c29、combo_rd4_0.6nm_c09、combo_rd4_6nm_c12、combo_rd4_0.6nm_c30、combo_rd4_0.6nm_c14、combo_rd4_6nm_c07、combo_rd4_6nm_c02、combo_rd4_0.6nm_c05、combo_rd4_0.6nm_c17、combo_rd4_6nm_c22、combo_rd4_0.6nm_c11、combo_rd4_0.6nm_c29、p4g4或p1a11。
[0148]
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段，其特异性地结合bcma，其中所述抗体包含vh区，包含seq id no:112中示出的序列；和/或vl区，包含seq id no:38中示出的序列。在一些实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，所述轻链包含序列eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprllmydasiratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqyqswpltfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:357)，所述重链包含序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssypmswvrqapgkglewvsaiggsggslpyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarywpmdiwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:358)。
[0149]
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段，其特异性地结合bcma，其中所述抗体包含vh区，包含seq id no:2、32、42或78中示出的序列；和/或vl区，包含seq id no:6、16、43或85中示出的序列。
[0150]
在一些实施方案中，本发明还提供基于cdr接触区的bcma抗体的抗体cdr部分。cdr接触区是灌输抗体对抗原特异性的抗体区域。一般来说，cdr接触区包括cdr和vernier区中的残基位置，其受到约束以保持适当的环结构用于抗体结合特异性抗原。参见例如makabe et al.，j.biol.chem.，283:1156-1166，2007。cdr接触区的确定在本领域技术之内。
[0151]
如本文所述的bcma抗体对bcma(如人bcma(例如(seq id no:353)的结合亲和力(kd)可以为约0.002nm-约6500nm。在一些实施方案中，结合亲和力大约为任何6500nm、6000nm、5986nm、5567nm、5500nm、4500nm、4000nm、3500nm、3000nm、2500nm、2134nm、2000nm、1500nm、1000nm、750nm、500nm、400nm、300nm、250nm、200nm、193nm、100nm、90nm、50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、19nm、18nm、17nm、16nm、15nm、10nm、8nm、7.5nm、7nm、6.5nm、6nm、5.5nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.3nm、0.1nm、0.01nm或0.002nm。在一些实施方案中，结合亲和力少于大约任何6500nm、6000nm、5500nm、5000nm、4000nm、3000nm、2000nm、1000nm、900nm、800nm、250nm、200nm、100nm、50nm、30nm、20nm、10nm、7.5nm、7nm、6.5nm、6nm、5nm、4.5nm、4nm、3.5nm、3nm、2.5nm、2nm、1.5nm、1nm或0.5nm。
[0152]
在一些实施方案中，本发明涵盖组合物，包括药物组合物，其包含本文描述或通过所述方法制备的抗体并具有本文描述的特征。如本文所用，组合物包含一种或多种结合bcma的抗体，和/或一种或多种包含编码一种或多种这些抗体的序列的多核苷酸。这些组合物可以进一步包含合适的赋形剂，如药学可接受的赋形剂，包括缓冲剂，其是本领域公知的。
[0153]
本发明还提供制备任何这些抗体的方法。本发明的抗体可以通过本领域已知的方法制备。多肽可以通过抗体的蛋白水解或其他降解、通过如上文描述的重组方法(即，单一或融合多肽)或者通过化学合成制备。抗体的多肽，特别是长达约50个氨基酸的较短多肽，通过化学合成方便地制备。化学合成的方法是本领域已知的，并且是可商购的。例如抗体可以通过采用固相方法的自动化多肽合成仪制备。还参见，u.s.pat.no.5,807,715；4,816,567；和6,331,415。
[0154]
本发明还涵盖包含来自本发明的抗体的一个或多个片段或区域的融合蛋白。在一实施方案中，提供一种融合多肽，其包含seq id no:1、4、5、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、34、36、38、40、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、317、81、82、84、85、86、88、89、90、91、93、94、96、98、100、102、103、105、107、108、109、111、113、115、116、117、119、121、123、124、126、128、80、315、36或364中示出的可变轻链区的至少10个连续氨基酸，和/或seq id no:2、3、7、8、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、37、39、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、83、87、92、95、97、99、101、104、106、110、112、114、118、120、122、112、125、127、313、314、363或365中示出的可变重链区的至少10个氨基酸。在其他实施方案中，提供一种融合多肽，其包含可变轻链区的至少约10、至少约15、至少约20、至少约25或至少约30个连续氨基酸和/或可变重链区的至少约10、至少约15、至少约20、至少约25或至少约30个连续氨基酸。在另一实施方案中，所述融合多肽包含轻链可变区和/或重链可变区，如选自以下seq id no的任何序列对所示：1和2、1和3、4和2、5和2、6和2、4和7、4和8、4和3、9和8、9和3、10和7、10和8、10和3、11和7、11和8、11和3、12和3、13和7、13和8、14和3、15和2、16和2、17和2、18和2、19和2、20和2、21和2、22和2、23和2、16和24、16和25、16和26、16和27、16和28、16和29、16和30、16和31、16和3、16和32、16和2、18和24、18和25、18和26、18和27、18和28、18和29、18和30、18和31、18和3、18和32、19和24、19和25、19和26、19和27、19和28、19和29、19和30、19和31、19和3、19和32、20和24、20和25、20和26、20和27、20和28、20和29、20和30、20和31、20和3、20和32、21和24、21和28、21和31、21和3、21和32、22和24、22和25、22和26、22和27、22和28、22和29、22和30、22和32、23和25、23和26、23和27、23和29、23和30、23和31、23和3、23和32、34和33、36和35、38和37、40和39、41和33、43和42、45和44、47和46、49和48、51和50、53和52、55和54、57和56、59和58、61和60、63和62、65和64、67和66、69和68、71和70、73和72、75和74、77和76、79和78、317和78、79和78、81和78、82和78、84和83、85和78、86和78、88和87、89和78、90和78、91和78、93和92、94和78、96和95、98和97、38和78、102和101、103和78、105和104、107和106、108和78、109和78、111和110、38和112、113和112、115和114、116和76、117和112、119和118、121和120、123和122、124和112、126和125、128和127、80和363或者364和365。在另一实施方案中，所述融合多肽包含一个或多个cdr。在其他实施方案中，所述融合多肽包含cdr h3(vh cdr3)和/或cdr l3(vl cdr3)。为了本发明的目的，融合蛋白包含一个或多个抗体以
及在天然分子中未连接的另一氨基酸序列，例如异源序列或来自另一区域的同源序列。示例性异源序列包括但不限于“标签”如flag标签或6his标签。标签是本领域公知的。
[0155]
本发明还提供编码本发明的抗体的分离的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。
[0156]
在一实施方案中，多核苷酸包含编码以下抗体的重链和/或轻链可变区的序列：p6e01/p6e01、p6e01/h3.aq、l1.lgf/l3.kw/p6e01；l1.lgf/l3.ny/p6e01、l1.gdf/l3.ny/p6e01、l1.lgf/l3.kw/h3.al、l1.lgf/l3.kw/h3.ap、l1.lgf/l3.kw/h3.aq、l1.lgf/l3.py/h3.ap、l1.lgf/l3.py/h3.aq、l1.lgf/l3.ny/h3.al、l1.lgf/l3.ny/h3.ap、l1.lgf/l3.ny/h3.aq、l1.gdf/l3.kw/h3.al、l1.gdf/l3.kw/h3.ap、l1.gdf/l3.kw/h3.aq、l1.gdf/l3.py/h3.aq、l1.gdf/l3.ny/h3.al、l1.gdf/l3.ny/h3.ap、l1.gdf/l3.ny/h3.aq、l3.kw/p6e01、l3.py/p6e01、l3.ny/p6e01、l3.py/l1.ps/p6e01、l3.py/l1.ah/p6e01、l3.py/l1.ff/p6e01、l3.py/l1.ph/p6e01、l3.py/l3.ky/p6e01、l3.py/l3.kf/p6e01、l3.py/h2.qr、l3.py/h2.dy、l3.py/h2.yq、l3.py/h2.lt、l3.py/h2.ha、l3.py/h2.ql、l3.py/h3.ya、l3.py/h3.ae、l3.py/h3.aq、l3.py/h3.taq、l3.py/p6e01、l3.py/l1.ps/h2.qr、l3.py/l1.ps/h2.dy、l3.py/l1.ps/h2.yq、l3.py/l1.ps/h2.lt、l3.py/l1.ps/h2.ha、l3.py/l1.ps/h2.ql、l3.py/l1.ps/h3.ya、l3.py/l1.ps/h3.ae、l3.py/l1.ps/h3.aq、l3.py/l1.ps/h3.taq、l3.py/l1.ah/h2.qr、l3.py/l1.ah/h2.dy、l3.py/l1.ah/h2.yq、l3.py/l1.ah/h2.lt、l3.py/l1.ah/h2.ha、l3.py/l1.ah/h2.ql、l3.py/l1.ah/h3.ya、l3.py/l1.ah/h3.ae、l3.py/l1.ah/h3.aq、l3.py/l1.ah/h3.taq、l3.py/l1.ff/h2.qr、l3.py/l1.ff/h2.dy、l3.py/l1.ff/h2.yq、l3.py/l1.ff/h2.lt、l3.py/l1.ff/h2.ha、l3.py/l1.ff/h2.ql、l3.py/l1.ff/h3.ya、l3.py/l1.ff/h3.ae、l3.py/l1.ff/h3.aq、l3.py/l1.ff/h3.taq、l3.py/l1.ph/h2.qr、l3.py/l1.ph/h2.ha、l3.py/l1.ph/h3.ae、l3.py/l1.ph/h3.aq、l3.py/l1.ph/h3.taq、l3.py/l3.ky/h2.qr、l3.py/l3.ky/h2.dy、l3.py/l3.ky/h2.yq、l3.py/l3.ky/h2.lt、l3.py/l3.ky/h2.ha、l3.py/l3.ky/h2.ql、l3.py/l3.ky/h3.ya、l3.py/l3.ky/h3.taq、l3.py/l3.kf/h2.dy、l3.py/l3.kf/h2.yq、l3.py/l3.kf/h2.lt、l3.py/l3.kf/h2.ql、l3.py/l3.kf/h3.ya、l3.py/l3.kf/h3.ae、l3.py/l3.kf/h3.aq、l3.py/l3.kf/h3.taq、p5a2_vhvl、a02_rd4_0.6nm_c06、a02_rd4_0.6nm_c09、a02_rd4_6nm_c16、a02_rd4_6nm_c03、a02_rd4_6nm_c01、a02_rd4_6nm_c26、a02_rd4_6nm_c25、a02_rd4_6nm_c22、a02_rd4_6nm_c19、a02_rd4_0.6nm_c03、a02_rd4_6nm_c07、a02_rd4_6nm_c23、a02_rd4_0.6nm_c18、a02_rd4_6nm_c10、a02_rd4_6nm_c05、a02_rd4_0.6nm_c10、a02_rd4_6nm_c04、a02_rd4_0.6nm_c26、a02_rd4_0.6nm_c13、a02_rd4_0.6nm_c01、a02_rd4_6nm_c08、p5c1_vhvl、c01_rd4_6nm_c24、c01_rd4_6nm_c26、c01_rd4_6nm_c10、c01_rd4_0.6nm_c27、c01_rd4_6nm_c20、c01_rd4_6nm_c12、c01_rd4_0.6nm_c16、c01_rd4_0.6nm_c09、c01_rd4_6nm_c09、c01_rd4_0.6nm_c03、c01_rd4_0.6nm_c06、c01_rd4_6nm_c04、combo_rd4_0.6nm_c22、combo_rd4_6nm_c21、combo_rd4_6nm_c10、combo_rd4_0.6nm_c04、combo_rd4_6nm_c25、combo_rd4_0.6nm_c21、combo_rd4_6nm_c11、combo_rd4_0.6nm_c20、combo_rd4_6nm_c09、combo_rd4_6nm_c08、combo_rd4_0.6nm_c19、combo_rd4_0.6nm_c02、combo_rd4_0.6nm_c23、combo_rd4_0.6nm_c29、combo_rd4_0.6nm_c09、combo_rd4_6nm_c12、combo_rd4_0.6nm_c30、combo_rd4_0.6nm_c14、combo_rd4_6nm_c07、combo_rd4_
6nm_c02、combo_rd4_0.6nm_c05、combo_rd4_0.6nm_c17、combo_rd4_6nm_c22、combo_rd4_0.6nm_c11、combo_rd4_0.6nm_c29、p4g4或p1a11。可以将编码所关注的抗体的序列维持在宿主细胞中的载体中，然后可以扩增并冷冻宿主细胞用于未来使用。本文进一步描述了载体(包括表达载体)和宿主细胞。
[0157]
本发明还涵盖本发明的抗体的scfv。通过利用短连接肽连接轻链和/或重链可变区制备单链可变区片段(bird et al.，science 242:423-426，1988)。连接肽的实例是(ggggs)3(seq id no:498)，其桥接一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间约3.5nm。已设计并使用其他序列的接头(bird et al.，1988，上文)。接头应当是短的柔性多肽，并且优选包含少于约20个氨基酸残基。转过来可以修饰接头用于额外的功能，如药物的连接或连接至固体支持物。可以重组或合成产生单链变体。对于scfv的合成产生，可以使用自动化合成仪。对于scfv的重组产生，可以将包含编码scfv的多核苷酸的合适的质粒引入合适的宿主细胞，真核生物，如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或者原核生物，如大肠杆菌(e.coli)。可以通过常规操作如多核苷酸的连接制备编码所关注的scfv的多核苷酸。可以利用本领域已知的标准蛋白纯化技术分离所得的scfv。
[0158]
还涵盖其他形式的单链抗体，如双抗体或微抗体。双抗体是二价的双特异性抗体，其中重链可变(vh)和轻链可变(vl)结构域在单一多肽链上表达，但是利用很短的接头而不允许相同链上的两个结构域之间配对，从而强迫结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如holliger，p.，et al.，proc.natl.acad sci.usa90:6444-6448，1993；poljak，r.j.，et al.，structure 2:1121-1123，1994)。微抗体包括融合至免疫球蛋白分子的铰链区和ch3结构域的天然抗体的vl和vh结构域。参见例如us5,837,821。
[0159]
在另一方面，本发明提供包含本发明的任何多核苷酸的组合物(例如药物组合物)。在一些实施方案中，所述组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码本文所述任何抗体的多核苷酸。在其他实施方案中，所述组合物包含以下seq id no:486和seq id no:485中示出的多核苷酸中的任一种或两种：
[0160]
combo_rd4_0.6nm_c29重链可变区
[0161]
gaagtccaactcctcgaatccggtggcggccttgtccagcctggaggttccttgcgcctgtcatgtgccgccagcggattcaccttctcgtcctacccgatgtcgtgggtccgccaggctccgggaaagggcctggaatgggtgtcagccatcggaggatcggggggctccctgccctacgccgatatcgtgaagggaaggttcaccattagccgggacaactccaagaacactctgtacctccaaatgaacagcctgagagcggaggacaccgcagtgtactattgcgcccggtactggccaatggacatctggggccaggggactctggtcaccgtctcctca(seq id no:486)
[0162]
combo_rd4_0.6nm_c29轻链可变区
[0163]
gagatcgtgctgactcagtcccctggaaccctgtccctgtcacctggcgaaagagctaccttgtcctgtcgcgcatcacaatccgtgtcgtcgagctatctcgcgtggtaccagcagaagcccggacaggccccaaggctgcttatgtacgacgcctccatccgggccactggtatccccgaccgcttctcgggctccggaagcggcaccgacttcaccctgactatttcccggctcgaaccggaggatttcgccgtgtactactgccaacagtaccagagctggccgctgacgtttgggcaggggaccaaggtcgaaatcaaa
[0164]
(seq id no:485)
[0165]
在其他实施方案中，所述组合物包含以下seq id no:488和seq id no:487中示出的多核苷酸中的任一种或两种：
[0166]
l3.py/h3taq重链可变区
[0167]
gaagtgcagctgctggaatctggcggaggactggtgcagcctggcggctctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttcggcagctacgctatgacctgggtgcgccaggcccctggcaaaggactggaatgggtgtccgccatctctggcagcggcggcaataccttctacgccgagagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactattgtacacgggtgtcccctatcgccgcgcagatggattattggggccagggcactctggtcaccgtctcctca
[0168]
(seq id no:488)
[0169]
l3.py/h3taq重链可变区
[0170]
gagatcgtgctgacacagagccctggcaccctgagcctgtctccaggcgaaagagccaccctgtcctgcagagccagccagagcgtgtccagcagctacctggcctggtatcagcagaagcccggccaggctccccggctgctgatctatggcgcctcttctagagccaccggcatccccgatagattcagcggctctggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagactggaacccgaggacttcgccgtgtactactgccagcactacccttatccccccagcttcacatttggccagggcaccaaggtggagatcaaa
[0171]
(seq id no:487)
[0172]
在其他实施方案中，所述组合物包含以下seq id no:490和seq id no:489中示出的多核苷酸中的任一种或两种：
[0173]
a02_rd4_0.6nm_c01重链可变区
[0174]
gaagttcaattattggaatctggtggaggactggtgcagcctggcggctctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgaactgggtgcgccaggcccctggtaaaggtttggaatgggtttctgctattactgcgtctggtggttctacttactatgccgatgtggttaagggtagattcaccatttctagagacaactctaagaacaccttgtacttgcaaatgaactccttgagagctgaagatactgctgtttattactgtgctagatactggccaatgtcgttgtggggtcaaggtactctggtcaccgtctcctca
[0175]
(seq id no:490)
[0176]
a02_rd4_0.6nm_c01轻链可变区
[0177]
gagatcgtgctgacacagagccctggcaccctgagcctgtctcctggtgaaagagctactttgtcttgtagagcttctcaatccgtttccgcgtattatttggcttggtatcaacaaaaaccaggtcaagctccaagattattgatgtacgatgcttctattagagccaccggtattccagatagattttctggttctggttccggtactgatttcactttgactatctctagattggaaccagaagatttcgctgtttactactgtcaacaatatgagcgttggccattgacttttggtcaaggtacaaaggttgaaatcaaacgtgag
[0178]
(seq id no:489)
[0179]
在其他实施方案中，所述组合物包含以下seq id no:492和seq id no:491中示出的多核苷酸中的任一种或两种：
[0180]
a02_rd4_0.6nm_c16重链可变区
[0181]
gaagttcaattattggaatctggtggaggactggtgcagcctggcggctctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgaactgggtgcgccaggcccctggtaaaggtttggaatgggtttctgctatttctgattttggtggttctacttactatgccgatatcgttaagggtagattcaccatttctagagacaactctaagaacaccttgtacttgcaaatgaactccttgagagctgaagatactgctgtttattactgtgctagatactggccaatggatatttggggtcaaggtactctggtcaccgtctcctca
[0182]
(seq id no:492)
[0183]
a02_rd4_0.6nm_c16轻链可变区
[0184]
gagatcgtgctgacacagagccctggcaccctgagcctgtctcctggtgaaagagctactttgtcttgtagagcttctcaatccgtttccgatctgtatttggcttggtatcaacaaaaaccaggtcaagctccaagattattgatgtacgatgcttctattagagccaccggtattccagatagattttctggttctggttccggtactgatttcactttgactatctctagattggaaccagaagatttcgctgtttactactgtcaacaatatcagacttggccattgacttttggtcaaggtacaaaggttgaaatcaaacgtgag
[0185]
(seq id no:491).
[0186]
表达载体以及多核苷酸组合物的施用在本文中进一步描述。
[0187]
在另一方面，本发明提供制备本文所述任何多核苷酸的方法。
[0188]
本发明还涵盖与任何这样的序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链，并且可以是dna(基因组、cdna或合成)或rna分子。rna分子包括hnrna分子，其含有内含子并且以一对一的方式与dna分子对应；以及mrna分子，其不含内含子。额外的编码或非编码序列可以但不必存在于本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接至其他分子和/或支持物质。
[0189]
多核苷酸可以包含天然序列(即，编码抗体或其部分的内源序列)或者可以包含这样的序列的变体。多核苷酸变体含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，从而相对于天然免疫反应分子，所编码的多肽的免疫反应性未减少。对所编码的多肽的免疫反应性的影响一般可以如本文所述进行评价。变体优选表现出与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列的至少约70％相同性，更优选地，至少约80％相同性，更优选地，至少约90％相同性，并且最优选地，至少约95％相同性。
[0190]
如果在如下文所述比对最大对应时两个序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则说两个多核苷酸或多肽序列“相同”。两个序列之间的比较通常通过在比较窗口上比较所述序列以鉴定和比较序列局部区域相似性来进行。如本文所用，“比较窗口”是指至少约20个连续位置的片段，通常30至约75个，或者40至约50个，其中在两个序列最佳对齐之后可以将序列与相同数目连续位置的参考序列比较。
[0191]
用于比较的序列的最佳对齐可以使用生物信息学软件lasergene套件中的megalign程序(dnastar，inc.，madison，wi)利用缺省参数进行。这个程序包括以下参考文献中描述的几个比对方案：dayhoff，m.o.，1978，a model of evolutionary change in proteins-matrices for detecting distant relationships.in dayhoff，m.o.(ed.)atlas of protein sequence and structure，national biomedical research foundation，washington dc vol.5，suppl.3，pp.345-358；hein j.，1990，unified approach to alignment and phylogenes pp.626-645methods in enzymology vol.183，academic press，inc.，san diego，ca；higgins，d.g.and sharp，p.m.，1989，cabios 5:151-153；myers，e.w.and muller w.，1988，cabios 4:11-17；robinson，e.d.，1971，comb.theor.11:105；santou，n.，nes，m.，1987，mol.biol.evol.4:406-425；sneath，p.h.a.and sokal，r.r.，1973，nμmerical taxonomy the principles and practice of nμmerical taxonomy，freeman press，san francisco，ca；wilbur，w.j.and lipman，d.j.，1983，proc.natl.acad.sci.usa 80:726-730.
[0192]
优选地，通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对的序列来测定“序
列相同性百分比”，其中当为了两个序列的最佳比对与参考序列(其不含添加或缺失)比较时，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含20％或更少的添加或缺失(即，缺口)，通常5-15％，或者10-12％。百分比这样计算，确定在两个序列中均存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，匹配位置的数目除以参考序列中位置的总数目并将结果乘以100以产生序列相同性的百分比。
[0193]
变体还可以或者可选地基本上与天然基因或者其部分或互补物同源。这类多核苷酸变体能够在中等严格条件下与编码天然抗体的天然存在的dna序列(或互补序列)杂交。
[0194]
合适的“中等严格条件”包括在5x ssc、0.5％sds、1.0mm edta(ph 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃、5x ssc下杂交过夜；然后在65℃下洗涤2次20分钟，每次用含有0.1％sds的2x、0.5x和0.2x ssc。
[0195]
如本文所用，“高度严格条件”或“高严格性条件”是：(1)采用低离子强度和高温洗涤，例如在50℃下0.015m氯化钠/0.0015m柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)杂交期间采用变性剂，如甲酰胺，例如在42℃下具有750mm氯化钠、75mm柠檬酸钠的具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲可/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/在ph 6.5的50mm磷酸钠缓冲液的50％(v/v)甲酰胺；或者(3)采用42℃下的50％甲酰胺、5x ssc(0.75m nacl、0.075m柠檬酸钠)、50mm磷酸钠(ph 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x denhardt’s溶液、超声处理的鲑鱼精dna(50μg/ml)、0.1％sds和10％硫酸葡聚糖，在42℃下于0.2x ssc(氯化钠/柠檬酸钠)中以及在55℃下的50％甲酰胺中洗涤，然后在55℃下由含有edta的0.1x ssc组成的高严格性洗涤。技术人员会认识到怎样调整温度、离子强度等，必要时调整诸如探针长度等的因素。
[0196]
本领域技术人员会理解，作为遗传密码简并性的结果，有许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。但是，本发明特别考虑由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸。而且，包含本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围之内。等位基因是作为一个或多个突变的结果而改变的内源基因，例如核苷酸的缺失、添加和/或取代。所得的mrna和蛋白可以但不必具有改变的结构或功能。等位基因可以利用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定。
[0197]
本发明的多核苷酸可以利用化学合成、重组方法或pcr获得。化学多核苷酸合成的方法是本领域公知的，并且不必在本文中详述。本领域技术人员可以使用本文所提供的序列和商业dna合成仪制备期望的dna序列。
[0198]
为了利用重组方法制备多核苷酸，如本文进一步讨论的，可以将包含期望序列的多核苷酸插入合适的载体，然后将所述载体引入合适的宿主细胞用于复制和扩增。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入宿主细胞。通过直接吸收、胞吞、转染、f-接合或电穿孔引入外源多核苷酸来转化细胞。一旦引入，所述外源多核苷酸可以作为非整合载体(例如质粒)维持在细胞内或者整合入宿主细胞基因组。这样扩增的多核苷酸可以通过本领域公知的方法从宿主细胞分离。参见例如sambrook et al.，1989。
[0199]
或者，pcr允许复制dna序列。pcr技术是本领域公知的，并且如美国专利号4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202以及pcr:the polymerase chain reaction，mullis et al.eds.，birkauswer press，boston(1994)所述。
[0200]
rna可以通过使用适当载体中的分离的dna并将其插入合适的宿主细胞来获得。当
细胞复制物和dna转录为rna时，然后可以利用本领域技术人员公知的方法分离所述rna，例如上文sambrook et al.，1989所示。
[0201]
合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或者可以选自本领域可用的大量克隆载体。虽然所选的克隆载体可以根据预期使用的宿主细胞变化，但是有用的克隆载体一般具有自我复制的能力，可以具有特定限制性内切核酸酶的单一靶标，和/或可以携带可以用于选择含有所述载体的克隆的标记的基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如puc18、puc19、bluescript(例如pbs sk )及其衍生物、mp18、mp19、pbr322、pmb9、cole1、pcr1、rp4、噬菌体dna以及穿梭载体，如psa3和pat28。这些和许多其他克隆载体可从商业供应商获得，例如biorad、strategene和invitrogen。
[0202]
表达载体一般是含有本发明的多核苷酸的可复制的多核苷酸构建体。据暗示表达载体必须作为附加体或者作为染色体dna的整合部分在宿主细胞中可复制。合适的表达载体包括但不限于质粒，病毒载体，包括腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒，粘粒，以及pct公开第wo 87/04462号中公开的表达载体。载体组件一般可以包括但不限于一种或多种以下组件：信号序列；复制起点；一个或多个标记基因；合适的转录控制元件(例如启动子、增强子和终止子)。为了表达(即，翻译)，通常还需要一种或多种翻译控制元件，例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
[0203]
可以通过许多适当方法中的任一种将含有所关注的多核苷酸的载体引入宿主细胞，包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其他物质转染；微粒轰击；脂转染；以及感染(例如当所述载体是感染物质时，如痘苗病毒)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特征。
[0204]
本发明还提供包含本文所述任何多核苷酸的宿主细胞。能够过量表达异源dna的任何宿主细胞可以用于分离编码所关注的抗体、多肽或蛋白的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于cos、hela和cho细胞。还参见pct公开第wo 87/04462号。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(例如大肠杆菌(e.coli)或枯草杆菌(b.subtillis))和酵母(例如酿酒酵母(s.cerevisae)、裂殖酵母(s.pombe)；或者乳酸克鲁维酵母(k.lactis))。优选地，宿主细胞以比宿主细胞中相应的内源性所关注的抗体或蛋白(如果存在)高约5倍，更优选地，高10倍，甚至更优选地，高20倍的水平表达cdna。筛选特异性结合bcma或bcma结构域(例如结构域1-4)的宿主细胞通过免疫测定或facs进行。可以鉴定过量表达所关注的抗体或蛋白的细胞。
[0205]
本发明的代表性材料于2015年4月15日储存在美国典型培养物保藏中心(atcc)。具有atcc登录号pta-122094的载体是编码人源化bcma抗体重链可变区的多核苷酸，而具有atcc登录号pta-122093的载体是编码人源化bcma抗体轻链可变区的多核苷酸。根据国际承认用于专利程序和条例的微生物保存的布达佩斯条约(布达佩斯条约)的规定进行保存。这确保从保存日期维持储存物的活培养物30年。atcc会在布达佩斯条约的条款下使储存物可用，并且在pfizer，inc.和atcc之间达成协议，其确保在颁发有关美国专利或者向任何美国或外国专利申请公开时储存物的培养物的子代对公众的永久和非限制性可用性，以先到者为准，并且确保子代对美国专利和商标专员根据35u.s.c.122节及其依据的专员规则(包括37c.f.r.1.14节，特别参考886og 638)确定授权的人的可用性。
[0206]
本技术的受让人已同意如果储存的材料的培养物在合适的条件下培养时应当死
亡或丢失或破坏，会在通知时用另一相同材料迅速代替所述材料。储存材料的可用性不应当理解为违反任何政府按照其专利法授权下授予的权利实施本发明的许可。
[0207]
bcma抗体缀合物
[0208]
本发明还提供如本文所述的bcma抗体或其抗原结合片段的缀合物(或免疫缀合物)，其中将所述抗体或抗原结合片段直接或通过接头间接缀合至药剂(例如细胞毒剂)用于靶向免疫疗法(例如抗体-药物缀合物)。例如可以将细胞毒剂连接或缀合至如本文所述的bcma抗体或其抗原结合片段用于将细胞毒剂部分靶向局部递送至肿瘤(例如bcma表达肿瘤)。
[0209]
将细胞毒剂或其他治疗剂缀合至抗体的方法已在各种出版物中描述。例如可以在抗体中通过赖氨酸侧链胺或通过还原链间二硫键激活的半胱氨酸巯基进行化学修饰用于缀合反应发生。参见例如tanaka et al.，febs letters 579:2092-2096，2005，和gentle et al.，bioconjugate chem.15:658-663，2004。还已描述在抗体的特定位点工程化用于特定药物缀合的具有定义的化学计量的反应性半胱氨酸残基。参见例如junutula et al.，nature biotechnology，26:925-932，2008。在国际申请wo2012/059882和wo2015015448中还描述了在转谷氨酰胺酶和胺(例如包含或连接至反应性胺的细胞毒剂)的存在下利用含有酰基供体谷氨酰胺的标签或通过多肽工程化使其具有反应性(即，作为酰基供体形成共价键的能力)的内源谷氨酰胺缀合。
[0210]
在一些实施方案中，如本文所述的bcma抗体或缀合物包含在抗体的特定位点(例如羧基末端，氨基末端，或在bcma抗体中的另一位点)工程化的含有酰基供体谷氨酰胺的标签。在一些实施方案中，所述标签包含氨基酸谷氨酰胺(q)或氨基酸序列lqg、llqgg(seq id no:318)、llqg(seq id no:454)、lslsqg(seq id no:455)、gggllqgg(seq id no:456)、gllqg(seq id no:457)、llq、gsplaqshgg(seq id no:458)、gllqggg(seq id no:459)、gllqgg(seq id no:460)、gllq(seq id no:461)、llqllqga(seq id no:462)、llqga(seq id no:463)、llqyqga(seq id no:464)、llqgsg(seq id no:465)、llqyqg(seq id no:466)、llqllqg(seq id no:467)、sllqg(seq id no:468)、llqlq(seq id no:469)、llqllq(seq id no:470)、llqgr(seq id no:471)、llqgpp(seq id no:472)、llqgpa(seq id no:473)、ggllqgpp(seq id no:474)、ggllqga(seq id no:475)、llqgpgk(seq id no:476)、llqgpg(seq id no:477)、llqgp(seq id no:478)、llqp(seq id no:479)、llqpgk(seq id no:480)、llqapgk(seq id no:481)、llqgapg(seq id no:482)、llqgap(seq id no:483)和llqlqg(seq id no:484)。
[0211]
在一些实施方案中，如本文所述的bcma抗体或缀合物包含在抗体的特定位点工程化的含有酰基供体谷氨酰胺的标签，其中所述标签包含在bcma抗体的轻链羧基末端工程化的氨基酸序列ggllqgpp(seq id no:474)或ggllqga(seq id no:475)。
[0212]
在一些实施方案中，如本文所述的bcma抗体或缀合物包含在抗体的特定位点工程化的含有酰基供体谷氨酰胺的标签，其中所述标签包含在bcma抗体重链中的残基t135之后工程化的氨基酸序列llqg(seq id no:454)。在其他实施方案中，如本文所述的bcma抗体或缀合物包含在抗体的特定位点工程化的含有酰基供体谷氨酰胺的标签，其中所述标签包含在bcma抗体的重链羧基末端工程化的氨基酸序列llqga(seq id no:463)或llqgpp(seq id no:472)，并且其中将重链羧基末端处的赖氨酸残基缺失。在一些实施方案中，如本文所述
的bcma抗体或缀合物在bcma抗体的位置297(eu编号方案)处包含氨基酸取代。例如在bcma抗体的位置297处可以用谷氨酰胺(q)或丙氨酸(a)取代氨基酸天冬酰胺(n)。
[0213]
还提供一种分离的抗体，其包含含有酰基供体谷氨酰胺的标签以及在抗体的位置222、340或370(eu编号方案)处的氨基酸修饰，其中所述修饰是氨基酸缺失、插入、取代、突变或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，提供如本文所述的bcma抗体或缀合物，其包含在bcma抗体的特定位点(例如在重链或轻链的羧基末端，抗体重链中的残基t135，或者另一位点)缀合的含有酰基供体谷氨酰胺的标签(例如q、lqg、llqgg(seq id no:318)、llqg(seq id no:454)、lslsqg(seq id no:455)、gggllqgg(seq id no:456)、gllqg(seq id no:457)、llq、gsplaqshgg(seq id no:458)、gllqggg(seq id no:459)、gllqgg(seq id no:460)、gllq(seq id no:461)、llqllqga(seq id no:462)、llqga(seq id no:463)、llqyqga(seq id no:464)、llqgsg(seq id no:465)、llqyqg(seq id no:466)、llqllqg(seq id no:467)、sllqg(seq id no:468)、llqlq(seq id no:469)、llqllq(seq id no:470)、llqgr(seq id no:471)、llqgpp(seq id no:472)、llqgpa(seq id no:473)、ggllqgpp(seq id no:474)、ggllqga(seq id no:475)、llqgpgk(seq id no:476)、llqgpg(seq id no:477)、llqgp(seq id no:478)、llqp(seq id no:479)、llqpgk(seq id no:480)、llqapgk(seq id no:481)、llqgapg(seq id no:482)、llqgap(seq id no:483)和llqlqg(seq id no:484))以及在抗体的位置222、340或370(eu编号方案)处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是从赖氨酸至精氨酸的取代(例如k222r、k340r或k370r)。
[0214]
在一些实施方案中，如本文所述的bcma抗体或缀合物包含含有酰基供体谷氨酰胺的标签(包含在bcma抗体轻链的c-末端工程化的序列ggllqgpp(seq id no:474))以及在抗体的位置222(eu编号方案)处从赖氨酸至精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，如本文所述的bcma抗体或缀合物包含含有酰基供体谷氨酰胺的标签(包含在bcma抗体轻链的c-末端工程化的序列ggllqga(seq id no:475))以及在抗体的位置222(eu编号方案)处从赖氨酸至精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，如本文所述的bcma抗体或缀合物包含含有酰基供体谷氨酰胺的标签(包含在bcma抗体重链的c-末端工程化的序列llqga(seq id no:463))以及在抗体的位置222(eu编号方案)处从赖氨酸至精氨酸的氨基酸取代，其中将重链羧基末端的赖氨酸残基缺失。在一些实施方案中，如本文所述的bcma抗体或缀合物包含含有酰基供体谷氨酰胺的标签(包含在bcma抗体重链中的残基t135之后工程化的序列llqg(seq id no:454))以及在抗体的位置222(eu编号方案)处从赖氨酸至精氨酸的氨基酸取代。
[0215]
在一些实施方案中，如本文所述的bcma抗体或缀合物包含含有酰基供体谷氨酰胺的标签(在bcma抗体中包含在位置297处工程化的谷氨酰胺或在位置297处从天冬酰胺(n)至另一氨基酸的氨基酸取代)以及在抗体的位置222(eu编号方案)处从赖氨酸至精氨酸的氨基酸取代。例如在一些实施方案中，如本文所述的bcma抗体或缀合物包含含有酰基供体谷氨酰胺的标签(包含在bcma抗体轻链的c-末端工程化的序列ggllqgpp(seq id no:474))、在bcma抗体的位置297处从天冬酰胺(n)至谷氨酰胺(q)的氨基酸取代以及在抗体的位置222(eu编号方案)处从赖氨酸至精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，如本文所述的bcma抗体或缀合物包含含有酰基供体谷氨酰胺的标签(包含在bcma抗体重链中的残基
t135之后工程化的序列llqg(seq id no:454))、在bcma抗体的位置297处从天冬酰胺(n)至丙氨酸(a)的氨基酸取代以及在抗体的位置222(eu编号方案)处从赖氨酸至精氨酸的氨基酸取代。
[0216]
可以缀合至本发明的bcma抗体或抗原结合片段的药剂包括但不限于细胞毒剂、免疫调节剂、显像剂、治疗性蛋白、生物聚合物或寡核苷酸。
[0217]
细胞毒剂的实例包括但不限于蒽环类、阿里他汀、多拉司他汀、考布他汀、多卡米星、吡咯苯并二氮杂卓二聚体、吲哚啉-苯二氮二聚体、烯二炔、格尔德霉素、美登素、嘌呤霉素、紫杉烷、长春花生物碱、喜树碱、tubulysin、哈米特林、spliceostatin、普拉二烯内酯以及它们的立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。
[0218]
蒽环类源自细菌链霉菌(strepomyces)，并且已用来治疗广泛的癌症，如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌。示例性蒽环类包括但不限于柔红霉素、多柔比星(即，阿霉素)、表柔比星、伊达比星、戊柔比星和米托蒽醌。
[0219]
多拉司他汀以及它们的肽类似物和衍生物阿里他汀是高度有效的抗有丝分裂剂，已显示具有抗癌和抗真菌活性。参见例如u.s.pat.no.5,663,149和pettit et al.，antimicrob.agents chemother.42:2961-2965，1998。示例性多拉司他汀和阿里他汀包括但不限于多拉司他汀10、阿里他汀e、阿里他汀eb(aeb)、阿里他汀efp(aefp)、mmad(单甲基阿里他汀d或单甲基多拉司他汀10)、mmaf(单甲基阿里他汀f或n-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸(dolaisoleuine)-海兔脑氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸)、mmae(单甲基阿里他汀e或n-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸-海兔脑氨酸-去甲麻黄碱)、5-苯甲酰戊酸-ae酯(aevb)和其他新阿里他汀(如美国公开第2013/0129753中公开的阿里他汀)。在一些实施方案中，阿里他汀是具有以下结构的0101(2-甲基丙氨酰-n-[(3r,4s,5s)-3-甲氧基-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1s)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)：
[0220][0221]
在一些实施方案中，阿里他汀是具有以下结构的3377(n,2-二甲基丙氨酰-n-{(1s,2r)-4-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-n-甲基-l-缬氨酰胺)：
[0222]
[0223]
在一些实施方案中，阿里他汀是具有以下结构的0131-ome(n,2-二甲基丙氨酰-n-[(3r,4s,5s)-3-甲氧基-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-1-甲氧基-3-{[(2s)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-n-甲基l-缬氨酰胺)：
[0224][0225]
在其他实施方案中，阿里他汀是具有以下结构的0131(2-甲基-l-脯氨酰-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)：
[0226][0227]
在其他实施方案中，阿里他汀是具有以下结构的0121(2-甲基-l-脯氨酰-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(2s)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)：
[0228][0229]
喜树碱是抑制酶拓扑异构酶i的细胞毒性喹啉生物碱。喜树碱及其衍生物的实例包括但不限于托泊替康和伊立替康，以及它们的代谢物如sn-38。
[0230]
考布他汀是在肿瘤中具有血管破坏特性的天然酚。示例性考布他汀和它们的衍生物包括但不限于考布他汀a-4(ca-4)和奥拉布林(ombrabulin)。
[0231]
多卡米星和cc-1065是具有细胞毒性效力的dna烷化剂。参见boger and johnson，pnas 92:3642-3649(1995)。示例性多卡米星和cc-1065包括但不限于( )-多卡米星a和( )-多卡米星sa，( )-cc-1065，以及如国际申请pct/ib2015/050280中公开的化合物，包括但不限于具有以下结构的n～2～-乙酰基-l-赖氨酰-l-缬氨酰-n～5～-氨甲酰-n-[4-({[(2-{[({(1s)-1-(氯甲基)-3-[(5-{[(1s)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1,2-二氢-3h-苯并[e]吲哚-3-基]羰基}噻吩-2-基)羰基]-2,3-二氢-1h-苯并[e]吲哚-5-基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)氨甲酰]氧基}甲基)苯基]-l-ornithinamide：
[0232][0233]
具有以下结构的n～2～-乙酰基-l-赖氨酰-l-缬氨酰-n～5～-氨甲酰-n-[4-({[(2-{[({(8s)-8-(氯甲基)-6-[(3-{[(1s)-1-(氯甲基)-8-甲基-5-(膦酰基氧基)-1,6-二氢吡咯并[3,2-e]吲哚-3(2h)-基]羰基}二环[1.1.1]戊-1-基)羰基]-1-甲基-3,6,7,8-四氢吡咯并[3,2-e]吲哚-4-基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)氨甲酰]氧基}甲基)苯基]-l-ornithinamide：
[0234][0235]
具有以下结构的n～2～-乙酰基-l-赖氨酰-l-缬氨酰-n～5～-氨甲酰-n-[4-({[(2-{[({(8s)-8-(氯甲基)-6-[(4-{[(1s)-1-(氯甲基)-8-甲基-5-(膦酰基氧基)-1,6-二氢吡咯并[3,2-e]吲哚-3(2h)-基]羰基}五环[4.2.0.0～2,5～.0～3,8～.0～4,7～]辛-1-基)羰基]-1-甲基-3,6,7,8-四氢吡咯并[3,2-e]吲哚-4-基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)氨甲酰]氧基}甲基)苯基]-l-ornithinamide：
[0236][0237]
烯二炔是一类抗肿瘤细菌产品，其特征在于九元环和十元环或者缀合的三-双-三键的环系统的存在。示例性烯二炔包括但不限于卡奇霉素、埃斯波霉素(esperamicin)、uncialamicin、dynemicin和它们的衍生物。
[0238]
格尔德霉素是结合hsp90(热休克蛋白90)并已用作抗肿瘤药物的苯醌安莎类抗生素。示例性格尔德霉素包括但不限于17-aag(17-n-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)和17-dmag(17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)。
[0239]
哈米特林及其类似物(例如hti-286)结合微管蛋白，扰乱正常微管动力学，并且在化学计量量解聚微管。
[0240]
美登素或它们的衍生物美登醇(maytansinoid)通过抑制微管蛋白的聚合在有丝分裂期间抑制微管形成来抑制细胞增殖。参见remillard et al.，science 189:1002-1005，1975。示例性美登素和美登醇包括但不限于mertansine(dm1)及其衍生物以及安丝菌素。
[0241]
吡咯苯并二氮杂卓二聚体(pbd)和吲哚啉-苯二氮二聚体(ign)是包含一个或多个immine官能团或者它们的等同物的抗肿瘤剂，其结合双链dna。pbd和ign分子是基于天然产物athramycin，并且以序列选择性方式与dna相互作用，偏好嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列。示例性pbd和它们的类似物包括但不限于sjg-136。
[0242]
spliceostatin和普拉二烯内酯是抑制剪接并与剪接体sf3b相互作用的抗肿瘤化合物。spliceostatin的实例包括但不限于spliceostatin a、fr901464和具有
[0243][0244]
结构的(2s,3z)-5-{[(2r,3r,5s,6s)-6-{(2e,4e)-5-[(3r,4r,5r,7s)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2h-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯。普拉二烯内酯的实例包括但不限于普拉二烯内酯b、普拉二烯内酯d或e7107。
[0245]
紫杉烷是充当抗微管蛋白剂或有丝分裂抑制剂的二萜。示例性紫杉烷包括但不限
pabc-0101；2)抗体-aclys-vc-pabc-0101且包含n297q；3)抗体-ggllqgpp(seq id no:474)-aclys-vc-pabc-0101且包含n297q；4)抗体-llqg
(
seq id no:454)-氨基-peg6-c2-0131且包含n297a；5)抗体
–
llqg
(
seq id no:454)-氨基-peg6-c2-3377且包含n297a；6)抗体-ggllqga(seq id no:475)-aclys-vc-pabc-0101。在一些实施方案中，在抗体轻链的c-末端工程化包含例如ggllqgpp(seq id no:474)或ggllqga(seq id no:475)的含有酰基供体谷氨酰胺的标签。在其他实施方案中，在抗体重链的c-末端工程化含有酰基供体谷氨酰胺的标签(例如llqga(seq id no:463)或llqgpp(seq id no:472))，其中将c-末端的赖氨酸残基缺失。在一些实施方案中，在抗体重链中的残基t135之后工程化包含例如llqg(seq id no:454)的含有酰基供体谷氨酰胺的标签或者代替抗体重链中的氨基酸残基e294-n297。抗体的实例包括但不限于p6e01/p6e01、p6e01/h3.aq、l1.lgf/l3.kw/p6e01；l1.lgf/l3.ny/p6e01、l1.gdf/l3.ny/p6e01、l1.lgf/l3.kw/h3.al、l1.lgf/l3.kw/h3.ap、l1.lgf/l3.kw/h3.aq、l1.lgf/l3.py/h3.ap、l1.lgf/l3.py/h3.aq、l1.lgf/l3.ny/h3.al、l1.lgf/l3.ny/h3.ap、l1.lgf/l3.ny/h3.aq、l1.gdf/l3.kw/h3.al、l1.gdf/l3.kw/h3.ap、l1.gdf/l3.kw/h3.aq、l1.gdf/l3.py/h3.aq、l1.gdf/l3.ny/h3.al、l1.gdf/l3.ny/h3.ap、l1.gdf/l3.ny/h3.aq、l3.kw/p6e01、l3.py/p6e01、l3.ny/p6e01、l3.py/l1.ps/p6e01、l3.py/l1.ah/p6e01、l3.py/l1.ff/p6e01、l3.py/l1.ph/p6e01、l3.py/l3.ky/p6e01、l3.py/l3.kf/p6e01、l3.py/h2.qr、l3.py/h2.dy、l3.py/h2.yq、l3.py/h2.lt、l3.py/h2.ha、l3.py/h2.ql、l3.py/h3.ya、l3.py/h3.ae、l3.py/h3.aq、l3.py/h3.taq、l3.py/p6e01、l3.py/l1.ps/h2.qr、l3.py/l1.ps/h2.dy、l3.py/l1.ps/h2.yq、l3.py/l1.ps/h2.lt、l3.py/l1.ps/h2.ha、l3.py/l1.ps/h2.ql、l3.py/l1.ps/h3.ya、l3.py/l1.ps/h3.ae、l3.py/l1.ps/h3.aq、l3.py/l1.ps/h3.taq、l3.py/l1.ah/h2.qr、l3.py/l1.ah/h2.dy、l3.py/l1.ah/h2.yq、l3.py/l1.ah/h2.lt、l3.py/l1.ah/h2.ha、l3.py/l1.ah/h2.ql、l3.py/l1.ah/h3.ya、l3.py/l1.ah/h3.ae、l3.py/l1.ah/h3.aq、l3.py/l1.ah/h3.taq、l3.py/l1.ff/h2.qr、l3.py/l1.ff/h2.dy、l3.py/l1.ff/h2.yq、l3.py/l1.ff/h2.lt、l3.py/l1.ff/h2.ha、l3.py/l1.ff/h2.ql、l3.py/l1.ff/h3.ya、l3.py/l1.ff/h3.ae、l3.py/l1.ff/h3.aq、l3.py/l1.ff/h3.taq、l3.py/l1.ph/h2.qr、l3.py/l1.ph/h2.ha、l3.py/l1.ph/h3.ae、l3.py/l1.ph/h3.aq、l3.py/l1.ph/h3.taq、l3.py/l3.ky/h2.qr、l3.py/l3.ky/h2.dy、l3.py/l3.ky/h2.yq、l3.py/l3.ky/h2.lt、l3.py/l3.ky/h2.ha、l3.py/l3.ky/h2.ql、l3.py/l3.ky/h3.ya、l3.py/l3.ky/h3.taq、l3.py/l3.kf/h2.dy、l3.py/l3.kf/h2.yq、l3.py/l3.kf/h2.lt、l3.py/l3.kf/h2.ql、l3.py/l3.kf/h3.ya、l3.py/l3.kf/h3.ae、l3.py/l3.kf/h3.aq、l3.py/l3.kf/h3.taq、p5a2_vhvl、a02_rd4_0.6nm_c06、a02_rd4_0.6nm_c09、a02_rd4_6nm_c16、a02_rd4_6nm_c03、a02_rd4_6nm_c01、a02_rd4_6nm_c26、a02_rd4_6nm_c25、a02_rd4_6nm_c22、a02_rd4_6nm_c19、a02_rd4_0.6nm_c03、a02_rd4_6nm_c07、a02_rd4_6nm_c23、a02_rd4_0.6nm_c18、a02_rd4_6nm_c10、a02_rd4_6nm_c05、a02_rd4_0.6nm_c10、a02_rd4_6nm_c04、a02_rd4_0.6nm_c26、a02_rd4_0.6nm_c13、a02_rd4_0.6nm_c01、a02_rd4_6nm_c08、p5c1_vhvl、c01_rd4_6nm_c24、c01_rd4_6nm_c26、c01_rd4_6nm_c10、c01_rd4_0.6nm_c27、c01_rd4_6nm_c20、c01_rd4_6nm_c12、c01_rd4_0.6nm_c16、c01_rd4_0.6nm_c09、c01_rd4_6nm_c09、c01_rd4_0.6nm_c03、c01_rd4_0.6nm_c06、c01_rd4_6nm_c04、combo_rd4_0.6nm_c22、combo_rd4_6nm_c21、
combo_rd4_6nm_c10、combo_rd4_0.6nm_c04、combo_rd4_6nm_c25、combo_rd4_0.6nm_c21、combo_rd4_6nm_c11、combo_rd4_0.6nm_c20、combo_rd4_6nm_c09、combo_rd4_6nm_c08、combo_rd4_0.6nm_c19、combo_rd4_0.6nm_c02、combo_rd4_0.6nm_c23、combo_rd4_0.6nm_c29、combo_rd4_0.6nm_c09、combo_rd4_6nm_c12、combo_rd4_0.6nm_c30、combo_rd4_0.6nm_c14、combo_rd4_6nm_c07、combo_rd4_6nm_c02、combo_rd4_0.6nm_c05、combo_rd4_0.6nm_c17、combo_rd4_6nm_c22、combo_rd4_0.6nm_c11、combo_rd4_0.6nm_c29、p4g4或p1a11。
[0260]
在一变化中，所述缀合物在位置222处进一步包含从赖氨酸至精氨酸的氨基酸取代。因此，例如所述缀合物是1)抗体-ggllqgpp(seq id no:474)-aclys-vc-pabc-0101且包含k222r；2)抗体-aclys-vc-pabc-0101其包含n297q和k222r；3)抗体-ggllqgpp(seq id no:474)-aclys-vc-pabc-0101且包含n297q和k222r；4)抗体-llqg
(
seq id no:454)-氨基-peg6-c2-0131且包含n297a和k222r；5)抗体
–
llqg
(
seq id no:454)-氨基-peg6-c2-3377且包含n297a和k222r；以及6)抗体-ggllqga(seq id no:475)-aclys-vc-pabc-0101且包含k222r。在一些实施方案中，在抗体轻链的c-末端工程化包含例如ggllqgpp(seq id no:474)或ggllqga(seq id no:475)的含有酰基供体谷氨酰胺的标签。在其他实施方案中，在抗体重链的c-末端工程化含有酰基供体谷氨酰胺的标签(例如llqga(seq id no:473)或llqgpp(seq id no:472))，其中将c-末端的赖氨酸残基缺失。在一些实施方案中，在抗体重链中的残基t135之后工程化包含例如llqg(seq id no:454)的含有酰基供体谷氨酰胺的标签或者代替抗体重链中的氨基酸残基e294-n297。抗体的实例包括但不限于p6e01/p6e01、p6e01/h3.aq、l1.lgf/l3.kw/p6e01；l1.lgf/l3.ny/p6e01、l1.gdf/l3.ny/p6e01、l1.lgf/l3.kw/h3.al、l1.lgf/l3.kw/h3.ap、l1.lgf/l3.kw/h3.aq、l1.lgf/l3.py/h3.ap、l1.lgf/l3.py/h3.aq、l1.lgf/l3.ny/h3.al、l1.lgf/l3.ny/h3.ap、l1.lgf/l3.ny/h3.aq、l1.gdf/l3.kw/h3.al、l1.gdf/l3.kw/h3.ap、l1.gdf/l3.kw/h3.aq、l1.gdf/l3.py/h3.aq、l1.gdf/l3.ny/h3.al、l1.gdf/l3.ny/h3.ap、l1.gdf/l3.ny/h3.aq、l3.kw/p6e01、l3.py/p6e01、l3.ny/p6e01、l3.py/l1.ps/p6e01、l3.py/l1.ah/p6e01、l3.py/l1.ff/p6e01、l3.py/l1.ph/p6e01、l3.py/l3.ky/p6e01、l3.py/l3.kf/p6e01、l3.py/h2.qr、l3.py/h2.dy、l3.py/h2.yq、l3.py/h2.lt、l3.py/h2.ha、l3.py/h2.ql、l3.py/h3.ya、l3.py/h3.ae、l3.py/h3.aq、l3.py/h3.taq、l3.py/p6e01、l3.py/l1.ps/h2.qr、l3.py/l1.ps/h2.dy、l3.py/l1.ps/h2.yq、l3.py/l1.ps/h2.lt、l3.py/l1.ps/h2.ha、l3.py/l1.ps/h2.ql、l3.py/l1.ps/h3.ya、l3.py/l1.ps/h3.ae、l3.py/l1.ps/h3.aq、l3.py/l1.ps/h3.taq、l3.py/l1.ah/h2.qr、l3.py/l1.ah/h2.dy、l3.py/l1.ah/h2.yq、l3.py/l1.ah/h2.lt、l3.py/l1.ah/h2.ha、l3.py/l1.ah/h2.ql、l3.py/l1.ah/h3.ya、l3.py/l1.ah/h3.ae、l3.py/l1.ah/h3.aq、l3.py/l1.ah/h3.taq、l3.py/l1.ff/h2.qr、l3.py/l1.ff/h2.dy、l3.py/l1.ff/h2.yq、l3.py/l1.ff/h2.lt、l3.py/l1.ff/h2.ha、l3.py/l1.ff/h2.ql、l3.py/l1.ff/h3.ya、l3.py/l1.ff/h3.ae、l3.py/l1.ff/h3.aq、l3.py/l1.ff/h3.taq、l3.py/l1.ph/h2.qr、l3.py/l1.ph/h2.ha、l3.py/l1.ph/h3.ae、l3.py/l1.ph/h3.aq、l3.py/l1.ph/h3.taq、l3.py/l3.ky/h2.qr、l3.py/l3.ky/h2.dy、l3.py/l3.ky/h2.yq、l3.py/l3.ky/h2.lt、l3.py/l3.ky/h2.ha、l3.py/l3.ky/h2.ql、l3.py/l3.ky/h3.ya、l3.py/l3.ky/h3.taq、l3.py/l3.kf/h2.dy、l3.py/l3.kf/h2.yq、l3.py/l3.kf/h2.lt、
l3.py/l3.kf/h2.ql、l3.py/l3.kf/h3.ya、l3.py/l3.kf/h3.ae、l3.py/l3.kf/h3.aq、l3.py/l3.kf/h3.taq、p5a2_vhvl、a02_rd4_0.6nm_c06、a02_rd4_0.6nm_c09、a02_rd4_6nm_c16、a02_rd4_6nm_c03、a02_rd4_6nm_c01、a02_rd4_6nm_c26、a02_rd4_6nm_c25、a02_rd4_6nm_c22、a02_rd4_6nm_c19、a02_rd4_0.6nm_c03、a02_rd4_6nm_c07、a02_rd4_6nm_c23、a02_rd4_0.6nm_c18、a02_rd4_6nm_c10、a02_rd4_6nm_c05、a02_rd4_0.6nm_c10、a02_rd4_6nm_c04、a02_rd4_0.6nm_c26、a02_rd4_0.6nm_c13、a02_rd4_0.6nm_c01、a02_rd4_6nm_c08、p5c1_vhvl、c01_rd4_6nm_c24、c01_rd4_6nm_c26、c01_rd4_6nm_c10、c01_rd4_0.6nm_c27、c01_rd4_6nm_c20、c01_rd4_6nm_c12、c01_rd4_0.6nm_c16、c01_rd4_0.6nm_c09、c01_rd4_6nm_c09、c01_rd4_0.6nm_c03、c01_rd4_0.6nm_c06、c01_rd4_6nm_c04、combo_rd4_0.6nm_c22、combo_rd4_6nm_c21、combo_rd4_6nm_c10、combo_rd4_0.6nm_c04、combo_rd4_6nm_c25、combo_rd4_0.6nm_c21、combo_rd4_6nm_c11、combo_rd4_0.6nm_c20、combo_rd4_6nm_c09、combo_rd4_6nm_c08、combo_rd4_0.6nm_c19、combo_rd4_0.6nm_c02、combo_rd4_0.6nm_c23、combo_rd4_0.6nm_c29、combo_rd4_0.6nm_c09、combo_rd4_6nm_c12、combo_rd4_0.6nm_c30、combo_rd4_0.6nm_c14、combo_rd4_6nm_c07、combo_rd4_6nm_c02、combo_rd4_0.6nm_c05、combo_rd4_0.6nm_c17、combo_rd4_6nm_c22、combo_rd4_0.6nm_c11、combo_rd4_0.6nm_c29、或p4g4、或p1a11。
[0261]
cd3抗体及其制备方法
[0262]
本发明进一步提供结合cd3(例如人cd3(seq id no:502；或登录号：nm_000733.3)的抗体。
[0263]
在一方面，提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合cd3，其中所述抗体包含seq id no:320、322、324、326、328、330、345、347、349、351、444、354、356、378、442、380、382、384 386、388、390、392、394、396、398或400中示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；和/或包含seq id no:319、321、323、325、327、329、344、346、348、350、352、355、377、443、445、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397或399中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的轻链可变(vl)区。
[0264]
在另一方面，提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合cd3，其中vh区包含：(i)vh互补决定区1(cdr1)，包含seq id no:331、332、333、401、402、403、407、408、415、416、418、419、420、424、425、426、446、447或448中示出的序列；(ii)vh cdr2，包含seq id no:334、336、337、338、339、404、405、409、410、411、412、413、414、417、418、421、422、427、428、449或450中示出的序列；以及iii)vh cdr3，包含seq id no:335、406、423、429或451中示出的序列；和/或轻链可变(vl)区，包含(i)vl cdr1，包含seq id no:340、343、430、431、435或440、441中示出的序列；(ii)vl cdr2，包含seq id no:341、433、452或436中示出的序列；以及(iii)vl cdr3，包含seq id no:342、432、434、437、438、439、446或453中示出的序列。
[0265]
在一些实施方案中，提供一种抗体，其具有如表3中列出的任一部分轻链序列和/或如表3中列出的任一部分重链序列。
[0266]
表3
[0267]
[0268]
[0269]
[0270][0271]
[0272]
在表3中，下划线序列是根据kabat的cdr序列，而黑体是根据chothia。
[0273]
本发明还提供cd3抗体的cdr部分(包括chothia、kabat cdr和cdr接触区)。cdr区的确定在本领域技术之内。应当理解在一些实施方案中，cdr可以是kabat和chothia cdr的组合(也称作“组合的cr”或“延长的cdr”)。在一些实施方案中，cdr是kabat cdr。在其他实施方案中，cdr是chothia cdr。换句话说，在具有一个以上cdr的实施方案中，cdr可以是任何kabat、chothia、组合cdr或它们的组合。表4提供本文提供的cdr序列的实例。
[0274]
表4
[0275]
[0276]
[0277]
[0278]
[0279]
[0280][0281]
本发明还提供编码本发明的抗体的分离的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。
[0282]
在一实施方案中，多核苷酸包含编码抗体h2b4、h2b4-vh-wt vl_tk、h2b4-vh-hnps vl_tk、h2b4-vh-yaes vl_tk、h2b4-vh-yads vl_tk、h2b4-vh-yaps vl_tk、h2b4-vh-hnps vl_tk-s55y、h2b4-vh-hnps vl_tk-s105q、h2b4—vh-hnps vl_tk-s55y/s105q、2b4、h2b4-11、1c10、1a4、7a3、25a8、16g7、h25a8-b5、h25a8-b8、h25a8-b12、h25a8-b13、h25a8-c5、h25a8-c8、h25a8-d13、h25a8-e13、h25a8-f13或h25a8-g13的重链和/或轻链可变区的序列。可以将编码所关注的抗体的序列维持在宿主细胞中的载体中，然后可以扩增并冷冻宿主细胞用于未来使用。本文进一步描述了载体(包括表达载体)和宿主细胞。
[0283]
本发明还涵盖包含来自本发明的抗体的一个或多个片段或区域的融合蛋白。在一实施方案中，提供一种融合多肽，其包含seq id no:319、321、323、325、327、329、344、346、348、350、445、352、355、443、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397或399中示出的可变轻链区的至少10个连续氨基酸，和/或seq id no:320、322、324、326、328、330、345、347、349、351、354、356、444、442、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398或400中示出的可变重链区的至少10个氨基酸。在其他实施方案中，提供一种融合多肽，其包含可变轻链区的至少约10、至少约15、至少约20、至少约25或至少约30个连续氨基酸和/或可变重链区的至少约10、至少约15、至少约20、至少约25或至少约30个连续氨基酸。在另一实施方案中，所述融合多肽包含轻链可变区和/或重链可变区，如选自seq id no:319和320、321和322、323和324、325和326、327和328、329和330、344和345、346和347、348和349、350和351、445和444、352和354、355和356、443和442、377和378、379和380、381和382、383和384、385和386、387和388、389和390、391和392、393和394、395和396、397和398或者399和400的任何序列对所示。在另一实施方案中，所述融合多肽包含一个或多个cdr。在其他实施方案中，所述融合多肽包含cdr h3(vh cdr3)和/或cdr l3(vl cdr3)。为了本发明的目的，融合蛋白包含一个或多个抗体以及在天然分子中未连接的另一氨基酸序列，例如异源序列或来自另一区域的同源序列。示例性异源序列包括但不限于“标签”如flag标签或6his标签。标签是本领域公知的。
[0284]
融合多肽可以通过本领域已知的方法产生，例如合成或重组。通常，通过利用本文描述的重组方法制备编码它们的表达多核苷酸来制备本发明的融合蛋白，虽然还可以通过本领域已知的其他方式制备它们，包括例如化学合成。
[0285]
本发明中的cd3抗体的代表性材料于2015年9月11日储存在美国典型培养物保藏中心(atcc)。具有atcc登录号pta-122513的载体是编码人源化cd3抗体重链可变区的多核苷酸，而具有atcc登录号pta-122512的载体是编码人源化cd3抗体轻链可变区的多核苷酸。根据国际承认用于专利程序和条例的微生物保存的布达佩斯条约(布达佩斯条约)的规定进行保存。这确保从保存日期维持储存物的活培养物30年。atcc会在布达佩斯条约的条款下使储存物可用，并且在pfizer，inc.和atcc之间达成协议，其确保在颁发有关美国专利或者向任何美国或外国专利申请公开时储存物的培养物的子代对公众的永久和非限制性可用性，以先到者为准，并且确保子代对美国专利和商标专员根据35u.s.c.122节及其依据的专员规则(包括37c.f.r.1.14节，特别参考886og638)确定授权的人的可用性。
[0286]
本技术的受让人已同意如果储存的材料的培养物在合适的条件下培养时应当死亡或丢失或破坏，会在通知时用另一相同材料迅速代替所述材料。储存材料的可用性不应当理解为违反任何政府按照其专利法授权下授予的权利实施本发明的许可。
[0287]
双特异性抗体和制备方法
[0288]
可以利用本文公开的抗体制备双特异性抗体，对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的(参见例如suresh et al.，methods in enzymology 121:210，1986)。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，两条重链具有不同特异性(millstein and cuello，nature305，537-539，1983)。
[0289]
根据制备双特异性抗体的一种方法，将具有期望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)融合至免疫球蛋白恒定区序列。融合物优选具有免疫球蛋白重链恒定区，包含至少部分的铰链、ch2和ch3区。优选具有第一重链恒定区(ch1)，包含轻链结合所必需的位点，存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和免疫球蛋白轻链(如果期望)的dna插入不同表达载体，并且共转染入合适的宿主生物体。当构建中使用的不等比例的3条多肽链提供最佳收率时，这在调整实施方案中的3个多肽片段的相互比例中提供极大的灵活性。但是，当表达等比例的至少两条多肽链导致高收率时或者当比例没有特别意义时，可以将两条或全部三条多肽链的编码序列插入一个表达载体。
[0290]
在一种方法中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和另一个臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。仅在一半双特异性分子中具有免疫球蛋白轻链的这种不对称结构促进分离期望的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合。pct公开第wo 94/04690号中描述了这种方法。
[0291]
在另一种方法中，双特异性抗体由一个臂中的第一铰链区中的氨基酸修饰组成，并且第一铰链区中的取代/置换的氨基酸具有与另一个臂中的第二铰链区中的相应氨基酸相反的电荷。国际专利申请号pct/us2011/036419(wo2011/143545)中描述了这种方法。
[0292]
在另一种方法中，通过改变或工程化第一和第二免疫球蛋白样fc区(例如铰链区和/或ch3区)之间的界面增强期望的异源多聚体或异源二聚体蛋白(例如双特异性抗体)的形成。在这种方法中，双特异性抗体可以由ch3区组成，其中所述ch3区包含第一ch3多肽和第二ch3多肽，其一起相互作用形成ch3界面，其中ch3界面内的一个或多个氨基酸使同源二聚体形成不稳定并且静电不利于同源二聚体形成。国际专利申请号pct/us2011/036419(wo2011/143545)中描述了这种方法。
[0293]
在另一种方法中，可以在转谷氨酰胺酶的存在下利用一个臂中工程化至针对表位(例如bcma)的抗体的含有谷氨酰胺的肽标签以及另一个臂中工程化至针对第二表位的第二抗体的另一肽标签(例如含有lys的肽标签或反应性内源lys)产生双特异性抗体。国际专利申请号pct/ib2011/054899(wo2012/059882)中描述了这种方法。
[0294]
在本发明的另一方面，如本文所述的异源二聚体蛋白(例如双特异性抗体)包含全长人抗体，其中异源二聚体蛋白的第一抗体可变结构域能够通过特异性地结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原来募集人免疫效应细胞活性，并且其中异源二聚体蛋白的第二抗体可变结构域能够特异性地结合靶抗原。在一些实施方案中，人抗体具有igg1、igg2、igg3或igg4同种型。在一些实施方案中，异源二聚体蛋白包含免疫惰性fc区。
[0295]
人免疫效应细胞可以是本领域已知的各种免疫效应细胞的任一种。例如免疫效应细胞可以是人淋巴样细胞谱系的成员，包括但不限于t细胞(例如细胞毒性t细胞)、b细胞和自然杀伤(nk)细胞。免疫效应细胞还可以是例如但不限于人髓系的成员，包括但不限于单核细胞、中性粒细胞和树突细胞。这类免疫效应细胞可以通过效应抗原的结合在激活时对靶细胞具有细胞毒性或凋亡作用或者其他期望的作用。
[0296]
效应抗原是在人免疫效应细胞上表达的抗原(例如蛋白或多肽)。异源二聚体蛋白(例如异源二聚体抗体或双特异性抗体)可以结合的效应抗原的实例包括但不限于人cd3(或cd3(分化簇)复合物)、cd16、nkg2d、nkp46、cd2、cd28、cd25、cd64和cd89。
[0297]
靶细胞可以是人天然或外源的细胞。在天然靶细胞中，细胞可能已转化为恶性细胞或病理修饰的(例如感染病毒、疟原虫或细菌的天然靶细胞)。在外源靶细胞中，细胞是入侵的病原体，如细菌、疟原虫或病毒。
[0298]
靶抗原在疾病条件(例如炎性疾病、增殖性疾病(例如癌症)、免疫病症、神经系统疾病、神经变性疾病、自身免疫性疾病、传染病(例如病毒感染或寄生虫感染)、过敏反应、移植物对宿主疾病或宿主对移植物疾病)下在靶细胞上表达。靶抗原不是效应抗原。靶抗原的实例包括但不限于bcma、epcam(上皮细胞粘附分子)、ccr5(趋化因子受体5型)、cd19、her(人表皮生长因子受体)-2/neu、her-3、her-4、egfr(表皮生长因子受体)、psma、cea、muc-1(粘蛋白)、muc2、muc3、muc4、muc5ac、muc5b、muc7、cihcg、lewis-y、cd20、cd33、cd30、神经节苷脂gd3、9-o-乙酰基-gd3、gm2、globo h、岩藻糖基gm1、poly sa、gd2、carboanhydrase ix(mn/ca ix)、cd44v6、shh(sonic hedgehog)、wue-1、浆细胞抗原、(膜结合的)ige/mcsp(黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖)、ccr8、tnf-α前体、steap、间皮素、a33抗原、psca(前列腺干细胞抗原)、ly-6；桥粒芯蛋白4、e-钙粘着蛋白新表位(neoepitope)、胚胎乙酰胆碱受体、cd25、ca19-9标记、ca-125标记和mis(muellerian抑制物质)受体ii型、stn(唾液酸化的tn抗原；tag-72)、fap(成纤维细胞激活抗原)、内皮唾液酸蛋白、egfrviii、lg、sas和cd63。
[0299]
在一些实施方案中，如本文所述的异源二聚体蛋白(例如双特异性抗体)包含全长人抗体，其中异源二聚体蛋白的第一抗体可变结构域能够通过特异性地结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原(例如cd3抗原)来募集人免疫效应细胞活性，其中异源二聚体蛋白的第二抗体可变结构域能够特异性地结合靶抗原(例如cd20抗原或epcam)，其中异源二聚体蛋白的第一和第二抗体可变结构域在铰链区中的位置223、225和228(例如(c223e或c223r)、(e225r)和(p228e或p228r))以及人igg2(seq id no:493)的ch3区中的位置409或368(例如k409r或l368e(eu编号方案))处包含氨基酸修饰。
[0300]
在一些实施方案中，异源二聚体蛋白的第一和第二抗体可变结构域在铰链区中的位置221和228(例如(d221r或d221e)和(p228r或p228e))以及人igg1(seq id no:494)的ch3区中的位置409或368(例如k409r或l368e(eu编号方案))处包含氨基酸修饰。
[0301]
在一些实施方案中，异源二聚体蛋白的第一和第二抗体可变结构域在铰链区中的位置228(例如(p228e或p228r))以及人igg4(seq id no:495)的ch3区中的位置409或368(例如r409或l368e(eu编号方案))处包含氨基酸修饰。
[0302]
在另一实施方案中，异源二聚体蛋白的第一抗体可变结构域包含vh区，包含seq id no:320、322、324、326、328、330、345、347、349、351、444、354、356、378、442、380、382、384 386、388、390、392、394、396、398或400中示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；和/或轻链可变(vl)区，包含seq id no:319、321、323、325、327、329、344、346、348、350、352、355、377、443、445、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397或399中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，并且异源二聚体蛋白的第二抗体可变结构域包含vh区，包含seq id no:2、3、7、8、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、37、39、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、83、87、92、95、97、99、101、104、106、110、112、114、118、120、122、125、127、313、314、363或365中示出的vh序列；和/或vl区，包含seq id no:1、4、5、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、34、36、38、40、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、317、81、82、84、85、86、88、89、90、91、93、94、96、98、100、102、103、105、107、108、109、111、113、115、116、117、119、121、123、124、126、128、315或364中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。
[0303]
在另一实施方案中，第一抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，包含seq id no:324或388中示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；和/或轻链可变(vl)区，包含seq id no:323或387中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；并且第二抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，包含seq id no:112示出的vh序列的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3；和/或轻链可变(vl)区，包含seq id no:38中示出的vl序列的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。
[0304]
可用于本发明的抗体可以涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv、fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异源缀合抗体、单链(scfv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白(例如结构域抗体)、人源化抗体以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体可以是小鼠、大鼠、人或任何其他来源的(包括嵌合或人源化抗体)。
[0305]
在一些实施方案中，如本文所述的bcma或cd3抗体是单克隆抗体。例如bcma或cd3抗体是人源化单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。
[0306]
在一些实施方案中，抗体包含修饰的恒定区，例如但不限于具有增加的激发免疫应答潜力的恒定区。例如可以修饰恒定区已具有增加的对fcγ受体如fcγri、fcγriia或fcγiii的亲和力。
[0307]
在一些实施方案中，抗体包含修饰的恒定区，如免疫惰性的恒定区，即，具有减少的激发免疫应答潜力。在一些实施方案中，如eur.j.immunol.，29:2613-2624，1999；pct公开第pct/gb99/01441号；和/或uk专利申请第98099518号所述修饰恒定区。fc可以是人igg1、人igg2、人igg3或人igg4。fc可以是包含突变a330p331至s330s331的人igg2(igg2δ
a)，其中氨基酸残基参考野生型igg2序列编号。eur.j.immunol.，29:2613-2624，1999。在一些实施方案中，抗体包含igg4的恒定区，其包含以下突变(armour et al.，molecular immunology 40 585-593，2003)：e233f234l235至p233v234a235(igg4δc)，其中编号参考野生型igg4。在另一实施方案中，fc是人igg4e233f234l235至p233v234a235，具有缺失g236(igg4δb)。在另一实施方案中，fc是包含铰链稳定突变s228至p228的任何人igg4 fc(igg4、igg4δb或igg4δc)(aalberse et al.，immunology 105，9-19，2002)。在另一实施方案中，fc可以是非糖基化的fc。
[0308]
在一些实施方案中，通过突变寡糖连接残基(如asn297)和/或是恒定区中糖基化识别序列部分的侧翼残基来将恒定区非糖基化。在一些实施方案中，将恒定区对n-联糖基化酶促非糖基化。可以酶促或通过在糖基化缺陷宿主细胞中表达使恒定区对n-联糖基化是非糖基化的。
[0309]
在一些实施方案中，恒定区具有去除或减少fcγ受体结合的修饰的恒定区。例如fc可以是包含突变d265的人igg2，其中氨基酸残基参考野生型igg2序列(seq id no:493)编号。因此，在一些实施方案中，恒定区具有修饰的恒定区，其具有seq id no:496中示出的序列：astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkcrvrcprcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpssiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflysrltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。
[0310]
在一些实施方案中，恒定区具有修饰的恒定区，其具有seq id no:497中示出的序列：
[0311]
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkcevecpecpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpssiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltcevkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。
[0312]
确定抗体对bcma或cd3的结合亲和力的一种方法是通过测量抗体的单功能fab片段的结合亲和力。为了获得单功能fab片段，可以将抗体(例如igg)用木瓜蛋白酶切割或重组表达。抗体的bcma fab片段的亲和力可以通过装有预固定的链霉抗生物素蛋白传感器芯片(sa)的表面等离子共振(biacore
tm
3000
tm
表面等离子共振(spr)系统，biacore
tm
，inc，piscataway nj)或者利用hbs-ep运行缓冲液(0.01m hepes，ph 7.4，0.15nacl，3mm edta，0.005％v/v表面活性剂p20)的抗小鼠fc或抗人fc确定。可以将生物素化或fc融合人bcma在hbs-ep缓冲液中稀释至少于0.5μg/ml的浓度，并且利用可变接触时间注射通过单独的芯片通道，以便获得两个范围的抗原密度，50-200反应单位(ru)用于详细的动力学研究或800-1,000ru用于筛选测定。再生研究显示25％v/v乙醇中的25mm naoh有效去除结合的fab，同时保持芯片上bcma的活性长达200次注射。通常，将纯化的fab样品的系列稀释液(跨越0.1-10x估计的kd的浓度)以100μl/分钟注射1min，并且允许长达2小时的解离时间。通过elisa和/或sds-page电泳利用已知浓度的fab(如通过氨基酸分析确定的)作为标准品确定fab蛋白的浓度。通过利用bia评价程序将数据全面拟合至1:1langmuir结合模型(karlsson，
r.roos，h.fagerstam，l.petersson，b.(1994).methods enzymology 6.99-110)来同时获得动力学结合速率(k
on
)和解离速率(k
off
)。平衡解离常数(kd)值计算为k
off
/k
on
。这个方案适合用于确定抗体对任何bcma的结合亲和力，包括人bcma、另一哺乳动物的bcma(如小鼠bcma、大鼠bcma或灵长类bcma)以及不同形式的bcma(例如糖基化bcma)。抗体的结合亲和力一般在25℃下测量，但是也可以在37℃下测量。
[0313]
如本文所述的抗体可以通过本领域已知的任何方法制备。如本文进一步描述的，对于杂交瘤细胞系的制备，宿主动物免疫的途径和时间表一般按照抗体刺激和产生的既定和常规技术。制备人和小鼠抗体的一般技术是本领域已知的和/或在本文中描述。
[0314]
考虑可以操作包括人在内的任何哺乳动物个体或其抗体生成细胞以用作哺乳动物制备的基础，包括人和杂交瘤细胞系。通常，用一定量的免疫原腹腔内、肌肉内、口服、皮下、足底注射和/或皮内接种宿主动物，包括如本文所述。
[0315]
杂交瘤可以利用kohler，b.and milstein，c.，nature 256:495-497，1975或如buck，d.w.，et al.，in vitro，18:377-381，1982修改的一般体细胞杂交技术制备自淋巴细胞和永生化的骨髓瘤细胞。在杂交中可以使用可用的骨髓瘤系，包括但不限于x63-ag8.653和来自salk institute，cell distribution center，san diego，calif.，usa的那些。通常，该技术包括利用融合剂如聚乙二醇或通过本领域技术人员公知的电学方法融合骨髓瘤细胞和淋巴样细胞。融合之后，从融合培养基分离细胞并使其在选择性生长培养基如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(hat)上生长，以便消除未杂交的亲代细胞。补充或未补充血清的本文描述的任何培养基可以用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一选择，ebv永生化的b细胞可以用来产生本发明的单克隆抗体。将杂交瘤扩增并亚克隆，如果期望，并且通过常规免疫测定过程(例如放射免疫测定、酶免疫测定或荧光免疫测定)测定上清液的抗免疫原活性。
[0316]
可以用作抗体来源的杂交瘤涵盖产生bcma、cd3或其部分特异性的单克隆抗体的亲代杂交瘤的所有衍生物、子代细胞。
[0317]
可以利用已知方法使产生这类抗体的杂交瘤体外或体内生长。如果期望，可以通过常规免疫球蛋白纯化方法如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色谱和超滤从培养基或体液分离单克隆抗体。可以例如通过在由连接至固相的免疫原制成的吸附剂上运行制品并从免疫原洗脱或释放期望的抗体来去除不期望的活性(如果存在)。利用双功能或衍生试剂如马来酰亚胺基苯甲酸硫代琥珀酰亚胺(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide)酯(通过半胱氨酸残基缀合)、n-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、socl2或r1n＝c＝nr(其中r和r1是不同的烷基)，用人bcma或cd3或者包含缀合至在待免疫的物种中是免疫原性的蛋白(例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或胰蛋白酶抑制物)的靶氨基酸序列的片段免疫，可以产生一群抗体(例如单克隆抗体)。
[0318]
如果期望，可以将所关注的抗体(单克隆或多克隆)测序，然后可以将多核苷酸序列克隆至载体中用于表达或增殖。可以将编码所关注的抗体的序列维持在宿主细胞中的载体中，然后可以扩增并冷冻宿主细胞用于未来使用。在细胞培养中产生重组单克隆抗体可以通过本领域已知的方式从b细胞克隆抗体基因进行。参见例如tiller et al.，j.immunol.methods 329，112，2008；u.s.pat.no.7,314,622。
[0319]
在一选择中，多核苷酸序列可以用于遗传操作以“人源化”抗体或提高亲和力，或
s.and chiswell，david j.，current opinion in structural biology 3:564-571，1993。v-基因片段的几个来源可以用于噬菌体展示。clackson et al.，nature 352:624-628，1991从源自免疫小鼠脾的v基因的小随机组合文库分离了多样化的抗噁唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的v基因库，并且可以基本上按照mark et al.，j.mol.biol.222:581-597，1991或griffith et al.，embo j.12:725-734，1993描述的技术分离多样化抗原(包括自体抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因高速积累突变(体细胞超突变)。引入的一些变化会赋予高亲和力，并且表现出高亲和力表面免疫球蛋白的b细胞在随后的抗原攻击期间优先复制和分化。这个天然过程可以通过采用已知为“链改组”的技术模仿。(marks et al.，bio/technol.10:779-783，1992).在这种方法中，可以通过用获得自未免疫的供体的v结构域的天然存在的变体(库)的库顺序代替重链和轻链v区来提高通过噬菌体展示获得的“初级”人抗体的亲和力。这种技术允许产生具有pm-nm范围中的亲和力的抗体和抗体片段。waterhouse et al.，nucl.acids res.21:2265-2266，1993已描述了制备非常大的噬菌体抗体库(也称作“根源文库”)的策略。基因改组也可以用来从啮齿动物抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始啮齿动物抗体相似的亲和力和特异性。根据这种方法，其也称作“表位印迹”，用人v结构域基因的库代替通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链v结构域基因，产生啮齿动物-人嵌合体。对抗原选择导致分离能够恢复功能性抗原结合位点的人可变区，即表位支配(印迹)配对物的选择。当重复该过程以代替剩余的啮齿动物v结构域时，获得人抗体(参见pct公开第wo 93/06213号)。不像通过cdr移植的啮齿动物抗体的传统人源化，这种技术提供完全人抗体，其没有啮齿动物来源的框架或cdr残基。
[0325]
可以通过首先从宿主动物分离抗体或抗体生成细胞，获得基因序列，并且利用基因序列在宿主细胞(例如cho细胞)中重组表达抗体来重组制备抗体。可以采用的另一方法是在植物(例如烟草)或转基因牛奶中表达抗体序列。已公开了在植物或牛奶中重组表达抗体的方法。参见例如peeters，et al.vaccine 19:2756，2001；lonberg，n.and d.huszar int.rev.immunol 13:65，1995；和pollock，et al.，j immunol methods 231:147，1999。制备抗体衍生物如人源化、单链等的方法是本领域已知的。
[0326]
免疫测定和流式细胞仪分选技术如荧光激活细胞分选术(facs)也可以用来分离bcma、cd3或所关注的肿瘤抗原特异性的抗体。
[0327]
如本文所述的抗体可以结合许多不同载体。载体可以是活性和/或惰性的。公知的载体的实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。为了本发明的目的，载体的性质可以是可溶性或不溶性的。本领域技术人员会知道用于结合抗体的其他合适的载体，或者能够利用常规实验确定这类载体。在一些实施方案中，载体包含靶向心肌的部分。
[0328]
利用常规方法容易地分离和测序编码单克隆抗体的dna(例如通过利用能够特异性地结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞用作这类dna的优选来源。一旦分离，可以将dna置于表达载体中(如pct公开第wo 87/04462号中公开的表达载体)，然后将其转染至不产生免疫球蛋白的宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。参见例如pct公开第wo 87/04462号。还可以将dna修饰，例如通过取代人重链和轻链恒
定区的编码序列代替同源小鼠序列，morrison et al.，proc.nat.acad.sci.81:6851，1984，或者通过共价连接至免疫球蛋白编码序列，全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列。以这种方式，制备“嵌合”或“杂交”抗体，其具有本文的单克隆抗体的结合特异性。
[0329]
可以利用本领域已知的方法鉴定或表征如本文所述的bcma或所灌注的肿瘤抗原抗体，从而检测和/或测量bcma或其他肿瘤抗原表达水平的降低。在一些实施方案中，通过温育候选物质与bcma并监测结合和/或伴随的bcma表达水平降低来鉴定bcma抗体。可以用纯化的bcma多肽，或者用天然表达或转染表达bcma多肽的细胞进行结合测定。在一实施方案中，结合测定是竞争结合测定，其中评价候选抗体与已知的bcma抗体竞争bcma结合的能力。该测定可以以各种形式进行，包括elisa形式。
[0330]
初始鉴定之后，候选bcma、cd3或其他肿瘤抗原抗体的活性可以通过已知检测靶生物活性的生物测定进一步证实和完善。或者，生物测定可以用来直接筛选候选物。鉴定和表征抗体的一些方法在实施例中详细描述。
[0331]
可以利用本领域公知的方法表征bcma、cd3或其他肿瘤抗原抗体。例如一种方法是鉴定其结合的表位，或“表位作图”。有许多本领域已知的用于作图和表征蛋白上表位位置的方法，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，例如chapter 11 of harlow and lane，using antibodies，a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，new york，1999中所述。在额外的实例中，表位作图可以用来确定抗体结合的序列。表位作图可商购自各种来源，例如pepscan systems(edelhertweg 15，8219 ph lelystad，the netherlands)。表位可以是线性表位，即，包含在单个氨基酸段中，或者是可以不必包含在单段中的氨基酸的三维相互作用形成的构象表位。可以分离或合成(例如重组)不同长度(例如至少4-6个氨基酸长)的肽，并且用于与bcma、cd3或其他肿瘤抗原抗体的结合测定。在另一实例中，可以通过利用源自bcma、cd3或其他肿瘤抗原序列的重叠肽并通过bcma、cd3或其他肿瘤抗原抗体确定结合在系统筛选中确定bcma、cd3或其他肿瘤抗原抗体结合的表位。根据基因片段表达测定，将编码bcma、cd3或其他肿瘤抗原的开放阅读框随机或通过特定遗传构建片段化，并且确定表达的bcma、cd3或其他肿瘤抗原片段与待测试的抗体的反应性。基因片段可以例如通过pcr产生，然后在放射性氨基酸的存在下体外转录和翻译为蛋白。然后通过免疫沉淀或凝胶电泳确定抗体与放射性标记的bcma、cd3或其他肿瘤抗原片段的结合。还可以通过利用噬菌体颗粒表面上展示的随机肽序列的大文库(噬菌体文库)鉴定某些表位。或者，可以在简单的结合测定中测试重叠肽片段的定义文库结合受试抗体。在额外的实例中，可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴定表位结合需要、足够和/或必需的残基。例如可以利用突变的bcma、cd3或其他肿瘤抗原进行结构域交换实验，其中已用来自另一物种(例如小鼠)的bcma或密切相关但抗原性不同的蛋白(例如trop-1)的序列代替(交换)bcma、cd3或其他肿瘤抗原蛋白的各种片段。通过评价抗体结合突变的bcma、cd3或其他肿瘤抗原，可以评价特定bcma、cd3或其他肿瘤抗原片段对抗体结合的重要性。
[0332]
可以用来表征bcma、cd3或其他肿瘤抗原抗体的另一方法是使用与已知结合相同抗原(即，bcma、cd3或其他肿瘤抗原上的各种片段)的其他抗体的竞争测定，以便确定bcma，cd3或其他肿瘤抗原抗体是否结合与其他抗体相同的表位。竞争测定是本领域技术人员公知的。
[0333]
表达载体可以用来直接表达bcma、cd3或其他肿瘤抗原抗体。本领域技术人员熟悉施用表达载体以体内获得外源蛋白的表达。参见例如u.s.pat.no.6,436,908；6,413,942；和6,376,471。表达载体的施用包括局部或全身施用，包括注射、口服施用、粒子枪或插管施用和体表施用。在另一实施方案中，表达载体直接施用至交感神经干或节，或者至冠状动脉、心房、心室或心包中。
[0334]
还可以使用包含表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。例如findeis et al.，trends biotechnol.，1993，11:202；chiou et al.，gene therapeutics:methods and applications of direct gene transfer，j.a.wolff，ed.，1994；wu et al.，j.biol.chem.，263:621，1988；wu et al.，j.biol.chem.，269:542，1994；zenke et al.，proc.natl.acad.sci.usa，87:3655，1990；和wu et al.，j.biol.chem.，266:338，1991中描述了受体介导的dna递送技术。对于基因治疗方案中的局部施用，包含多核苷酸的治疗组合物在约100ng-约200mg的dna的范围中施用。在基因治疗方案中还可以使用约500ng-约50mg、约1μg-约2mg、约5μg-约500μg和约20μg-约100μg的dna的浓度范围。可以利用基因递送媒介物递送治疗多核苷酸和多肽。基因递送媒介物可以是病毒或非病毒来源的(一般参见，jolly，cancer gene therapy,1:51，1994；kimura，hμman gene therapy，5:845，1994；connelly，hμman gene therapy，1995，1:185；和kaplitt，nature genetics，6:148，1994)。可以利用内源哺乳动物或异源启动子诱导这类编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成型或调节的。
[0335]
在期望的细胞中递送期望的多核苷酸和表达的基于病毒的载体是本领域公知的。示例性基于病毒的媒介物包括但不限于重组反转录病毒(参见例如pct公开号wo 90/07936；wo 94/03622；wo 93/25698；wo 93/25234；wo 93/11230；wo 93/10218；wo 91/02805；u.s.pat.no.5，219,740和4,777,127；gb pat.no.2,200,651；以及ep pat.no.0 345 242)、基于甲病毒的载体(例如辛德比斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(atcc vr-67；atcc vr-1247)、罗斯河病毒(atcc vr-373；atcc vr-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(atcc vr-923；atcc vr-1250；atcc vr 1249；atcc vr-532))和腺伴随病毒(aav)载体(参见例如pct公开号wo 94/12649、wo 93/03769；wo 93/19191；wo 94/28938；wo 95/11984和wo 95/00655)。还可以采用如curiel，hμm.gene ther.，1992，3:147所述的连接至杀死的腺病毒的dna的施用。
[0336]
还可以采用非病毒递送媒介物和方法，包括但不限于连接或单独未连接至杀死的腺病毒的聚氧离子缩合的dna(参见例如curiel，hμm.gene ther.，3:147，1992)；配体连接的dna(参见例如wu，j.biol.chem.，264:16985，1989)；真核细胞递送媒介物细胞(参见例如u.s.pat.no.5,814,482；pct公开号wo 95/07994；wo 96/17072；wo 95/30763；和wo 97/42338)以及核电荷中和或与细胞膜融合。还可以采用裸dna。pct公开第wo 90/11092号和u.s.pat.no.5,580,859中描述了示例性裸dna引入方法。u.s.pat.no.5,422,120；pct公开号wo 95/13796；wo 94/23697；wo 91/14445；和ep 0524968描述了可以充当基因递送媒介物的脂质体。philip，mol.cell biol.，14:2411，1994和woffendin，proc.natl.acad.sci.，91:1581，1994中描述了额外的方法。
[0337]
在一些实施方案中，本发明涵盖组合物，包括药物组合物，其包含本文描述或通过所述方法制备的抗体并具有本文描述的特征。如本文所用，组合物包含一种或多种结合cd3
或肿瘤抗原(例如bcma)的抗体，和/或一种或多种包含编码一种或多种这些抗体的序列的多核苷酸。这些组合物可以进一步包含合适的赋形剂，如药学可接受的赋形剂，包括缓冲剂，其是本领域公知的。
[0338]
本发明还提供制备任何这些抗体的方法。本发明的抗体可以通过本领域已知的方法制备。多肽可以通过抗体的蛋白水解或其他降解、通过如上文描述的重组方法(即，单一或融合多肽)或者通过化学合成制备。抗体的多肽，特别是长达约50个氨基酸的较短多肽，通过化学合成方便地制备。化学合成的方法是本领域已知的，并且是可商购的。例如抗体可以通过采用固相方法的自动化多肽合成仪制备。还参见，u.s.pat.no.5,807,715；4,816,567；和6,331,415。
[0339]
包含两个共价连接的抗体的异源缀合抗体也在本发明的范围内。这类抗体已用来将免疫系统细胞靶向至不需要的细胞(u.s.pat.no.4,676,980)，以及用于hiv感染的治疗(pct公开号wo 91/00360和wo 92/200373；ep 03089)。可以利用任何方便的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交联剂和技术是本领域公知的，并且在u.s.pat.no.4,676,980中描述。
[0340]
还可以利用合成蛋白化学的已知方法体外制备嵌合或杂交抗体，包括涉及交联剂的那些方法。例如可以利用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于这个目的的合适试剂的实例包括亚胺硫醇(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚胺(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
[0341]
在重组人源化抗体中，可以修饰fcγ部分以避免与fcγ受体以及补体和免疫系统相互作用。wo 99/58572中描述了制备这类抗体的技术。例如可以将恒定区工程化为更像人恒定区，以便如果抗体用于临床试验和人中的治疗，避免免疫应答。参见例如u.s.pat.no.5,997,867和5,866,692。
[0342]
本发明涵盖对如本文所述的本发明的抗体和多肽的修饰，包括不显著影响它们特性的功能等同抗体以及具有增强或减少的活性和/或亲和力的变体。例如可以将氨基酸序列突变以获得具有期望的对bcma和/或cd3的结合亲和力的抗体。多肽的修饰是本领域中的常规实践，并且不必在本文中详细描述。修饰的多肽的实例包括具有氨基酸残基的保守取代、氨基酸的一个或多个缺失或添加的多肽，其不显著有害改变功能活性，或者其成熟(增强)多肽对其配体的亲和力，或者使用化学类似物。
[0343]
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基至包含一百或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有n-末端甲硫氨酰残基的抗体或融合至表位标签的抗体。抗体分子的其他插入变体包括增加抗体在血液循环中的半衰期的酶或多肽融合至抗体的n-或c-末端。
[0344]
取代变体在抗体分子中具有至少一个去除的氨基酸残基以及插入其位置的不同残基。取代诱变最关注的位点包括高变区，但是也考虑fr改变。保守取代在表5中以“保守取代”的标题示出。如果这类取代导致生物活性的改变，则可以引入更实质的变化，在表5中命名为“示例性取代”，或者如下文参考氨基酸类别进一步描述的，并且筛选产物。
[0345]
表5：氨基酸取代
[0346][0347][0348]
抗体生物特性的本质改变可以通过选择在它们的效应上显著不同的取代来完成，所述效应维持(a)所述取代的区域中多肽骨架的结构，例如折叠或螺旋构象，(b)在靶位点的分子的电荷或疏水性，或者(c)大部分侧链。基于共同的侧链特性将天然存在的氨基酸残基分组：
[0349]
(1)非极性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
[0350]
(2)极性没有电荷：cys、ser、thr、asn、gln；
[0351]
(3)酸性(带负电荷)：asp、glu；
[0352]
(4)碱性(带正电荷)：lys、arg；
[0353]
(5)影响链方向的残基：gly、pro；以及
[0354]
(6)芳香族：trp、tyr、phe、his。
[0355]
用另一类别交换这些类别之一的成员产生非保守取代。
[0356]
不参与维持抗体正确构象的任何半胱氨酸残基一般还可以用丝氨酸取代以提高分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反地，可以将半胱氨酸键添加至抗体以提高其稳定
性，特别是当抗体是抗体片段如fv片段时。
[0357]
氨基酸修饰的范围可以从改变或修饰一个或多个氨基酸至完全重新设计区域，例如可变区。可变区中的变化可以改变结合亲和力和/或特异性。在一些实施方案中，在cdr结构域内产生不超过1-5个保守氨基酸取代。在其他实施方案中，在cdr结构域内产生不超过1-3个保守氨基酸取代。在其他实施方案中，所述cdr结构域是cdr h3和/或cdr l3。
[0358]
修饰还包括糖基化或非糖基化多肽，以及具有其他翻译后修饰的多肽，例如用不同的糖糖基化、乙酰化和磷酸化。将抗体在它们恒定区中的保守位置糖基化(jefferis and lund，chem.immunol.65:111-128，1997；wright and morrison，tibtech 15:26-32，1997)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白的功能(boyd et al.，mol.immunol.32:1311-1318，1996；wittwe and howard，biochem.29:4175-4180，1990)，并且糖蛋白部分之间的分子内相互作用可以影响构象并呈现糖蛋白的三维表面(jefferis and lund，supra；wyss and wagner，current opin.biotech.7:409-416，1996)。基于特定识别结构，寡糖还可以用来靶向给定糖蛋白至某些分子。还已报道抗体的糖基化影响抗体依赖性细胞毒性(adcc)。特别地，据报道具有四环素调节的β(1,4)-n-乙酰葡糖胺转移酶iii(gntiii)(催化平分glcnac形成的糖基转移酶)表达的cho细胞具有提高的adcc活性(μmana et al.，mature biotech.17:176-180，1999)。
[0359]
抗体的糖基化通常是n-联或o-联。n-联是指糖部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸、天冬酰胺-x-苏氨酸和天冬酰胺-x-半胱氨酸(其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是糖部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一种的存在产生潜在的糖基化位点。o-联糖基化是指糖n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接至基氨基酸，最常见丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
[0360]
将糖基化位点添加至抗体通过改变氨基酸序列方便地完成，从而其包含一个或多个上述三肽序列(对于n-联糖基化位点)。还可以通过向原始抗体的序列添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基产生改变(对于o-联糖基化位点)。
[0361]
还可以改变抗体的糖基化模式而不改变根本的核苷酸序列。糖基化主要取决于用来表达抗体的宿主细胞。因为用于表达重组糖蛋白如抗体作为潜在治疗剂的细胞类型很少是天然细胞，可以预期抗体糖基化模式的变化(参见例如hse et al.，j.biol.chem.272:9062-9070，1997)。
[0362]
除了宿主细胞的选择，在抗体的重组产生期间影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧化、ph、纯化方案等。已提出各种方法改变特定宿主生物体中实现的糖基化模式，包括引入或过量表达参与寡糖产生的某些酶(u.s.pat.no.5,047,335；5,510,261和5,278,299)。糖基化或某些类型的糖基化可以从糖蛋白酶促去除，例如利用内切糖苷酶h(endo h)、n-糖苷酶f、内切糖苷酶f1、内切糖苷酶f2、内切糖苷酶f3。此外，可以将重组宿主细胞遗传工程化以成为加工某些类型的多糖缺陷的。这些和相似技术是本领域公知的。
[0363]
修饰的其他方法包括使用本领域已知的偶联技术，包括但不限于酶促方法、氧化取代和螯合。例如修饰可以用于连接免疫测定的标记。利用本领域建立的方法制备修饰的多肽，并且可以利用本领域已知的标准测定筛选，下文和实施例中描述了其中一些。
[0364]
在本发明的一些实施方案中，所述抗体包含修饰的恒定区，如具有增加的对人fcγ受体的亲和力的恒定区，是免疫惰性或部分惰性的，例如不触发补体介导的裂解，不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，或者不激活巨噬细胞；或者在以下任何一种或多种中具有减少的活性(与未修饰的抗体相比)：触发补体介导的裂解，刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，或者激活小胶质细胞。恒定区的不同修饰可以用来获得最佳水平和/或效应子功能的组合。参见例如morgan et al.，immunology 86:319-324，1995；lund et al.，j.immunology 157:4963-9 157:4963-4969，1996；idusogie et al.，j.immunology 164:4178-4184，2000；tao et al.，j.immunology 143:2595-2601，1989；和jefferis et al.，immunological reviews 163:59-76，1998。在一些实施方案中，如eur.j.immunol.，1999，29:2613-2624；pct公开第pct/gb99/01441号；和/或uk专利申请第9809951.8号所述修饰恒定区。在其他实施方案中，所述抗体包含人重链igg2恒定区，其包含以下突变：a330p331至s330s331(参考野生型igg2序列的氨基酸编号)。eur.j.immunol.，1999，29:2613-2624。在其他实施方案中，将恒定区对n-联糖基化非糖基化。在一些实施方案中，通过突变恒定区中的糖基化氨基酸残基或是n-糖基化识别序列部分的侧翼残基来将恒定区对n-联糖基化非糖基化。例如可以将n-糖基化位点n297突变为a、q、k或h。参见，tao et al.，j.immunology 143:2595-2601，1989；和jefferis et al.，immunological reviews 163:59-76，1998。在一些实施方案中，将恒定区对n-联糖基化非糖基化。可以酶促(如通过酶pngase去除糖)或通过在糖基化缺陷宿主细胞中表达将恒定区对n-联糖基化非糖基化。
[0365]
其他抗体修饰包括已如pct公开第wo 99/58572号所述修饰的抗体。除了针对靶分子的结合结构域，这些抗体包含效应结构域，其具有与人免疫球蛋白重链恒定区的全部或部分基本上同源的氨基酸序列。这些抗体能够结合靶分子而不触发显著的补体依赖性裂解或细胞介导的靶标破坏。在一些实施方案中，效应结构域能够特异性地结合fcrn和/或fcγriib。这些通常是基于源自两个或更多个人免疫球蛋白重链ch2结构域的嵌合结构域。以这种方式修饰的抗体特别适合用于慢性抗体疗法，以便避免常规抗体疗法的炎症和其他不良反应。
[0366]
本发明包括亲和力成熟的实施方案。例如亲和力成熟的抗体可以通过本领域已知的方法制备(marks et al.，bio/technology，10:779-783，1992；barbas et al.，proc nat.acad.sci，usa 91:3809-3813，1994；schier et al.，gene，169:147-155，1995；yelton et al.，j.immunol.，155:1994-2004，1995；jackson et al.，j.immunol.，154(7):3310-9，1995，hawkins et al.，j.mol.biol.，226:889-896，1992；和pct公开第wo2004/058184号)。
[0367]
以下方法可以用于调整抗体的亲和力和表征cdr。表征抗体的cdr和/或改变(如提高)多肽如抗体的结合亲和力的一种方法称作“文库扫描诱变”。通常，文库扫描诱变工作如下。利用本领域公知的方法用两个或更多个(如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸置换cdr中的一个或多个氨基酸位置。这产生克隆的小文库(在一些实施方案中，分析的每个氨基酸位置一个)，每个具有两个或更多个成员的复杂性(如果在每个位置取代两个或更多个氨基酸)。通常，文库还包括含有天然(未取代的)氨基酸的克隆。筛选来自每个文库的少量克隆如约20-80个克隆(取决于文库的复杂性)对靶多肽(或其他结合靶标)的结合亲和力，并且鉴定具有增加、相同、减少或没有结合的候选物。确定结合
亲和力的方法是本领域公知的。可以利用biacore
tm
表面等离子共振分析确定结合亲和力，其检测约2倍或更大的结合亲和力差异。当起始抗体已以相对高的亲和力，例如约10nm或更低的kd结合时，biacore
tm
特别有用。本文在实施例中描述了利用biacore
tm
表面等离子共振的筛选。
[0368]
可以利用kinexa biocensor、闪烁接近测定、elisa、origen免疫测定(igen)、荧光猝灭、荧光转移和/或酵母展示确立结合亲和力。还可以利用合适的生物测定筛选结合亲和力。
[0369]
在一些实施方案中，利用本领域公知的诱变方法(本文描述了其中一些)用全部20种天然氨基酸置换cdr中的每个氨基酸位置(在一些实施方案中，一次一个)。这产生克隆的小文库(在一些实施方案中，分析的每个氨基酸位置一个)，每个具有20个成员的复杂性(如果在每个位置取代全部20种氨基酸)。
[0370]
在一些实施方案中，待筛选的文库在两个或更多个位置包含取代，所述位置可以在相同cdr中或者在两个或更多个cdr中。因此，文库可以在一个cdr中的两个或更多个位置中包含取代。文库可以在两个或更多个cdr中的两个或更多个位置中包含取代。文库可以在3、4、5或更多个位置中包含取代，所述位置位于2、3、4、5或6个cdr中。可以利用低冗余密码子制备取代。参见例如balint et al.，gene 137(1):109-18，1993的表2。
[0371]
cdr可以是cdrh3和/或cdrl3。cdr可以是cdrl1、cdrl2、cdrl3、cdrh1、cdrh2和/或cdrh3中的一个或多个。cdr可以是kabat cdr、chothia cdr或延长的cdr。
[0372]
可以将具有提高的结合的候选物测序，从而鉴定导致提高的亲和力的cdr取代突变去(也称作“提高的”取代)。还可以将结合的候选物测序，从而鉴定保持结合的cdr取代。
[0373]
可以进行多轮筛选。例如具有提高的结合的候选物(每个在一个或多个cdr的一个或多个位置包含氨基酸取代)还可用于在每个提高的cdr位置(即，取代突变体表现出提高的结合的cdr中的氨基酸位置)至少包含原始和取代的氨基酸的第二文库的设计。这种文库的制备以及筛选或选择在下文中进一步讨论。
[0374]
文库筛选诱变还提供表征cdr的方法，因为具有提高的结合、相同的结合、减少的结合或没有结合的克隆的频率还提供关于每个氨基酸对抗体-抗原复合物稳定性的重要性的信息。例如如果cdr的位置在改变为全部20种氨基酸时保持结合，则该位置鉴定为抗原结合不太可能需要的位置。相反地，如果cdr的位置仅在一小部分取代中保持结合，则该位置鉴定为对cdr功能重要的位置。因此，文库筛选诱变方法产生关于可以改变为许多不同氨基酸(包括全部20种氨基酸)的cdr中的位置以及不可以改变或仅可以改变为几种氨基酸的cdr中的位置的信息。
[0375]
具有提高的亲和力的候选物可以在第二文库中合并，其包括提高的氨基酸、在该位置的原始氨基酸，并且可以在该位置进一步包括额外的取代，取决于期望或者利用期望的筛选或选择方法允许的文库复杂性。此外，如果期望，可以将相邻的氨基酸位置随机化为至少两种或更多种氨基酸。相邻氨基酸的随机化可以允许突变cdr中额外的构象柔性，反过来其可以允许或促进引入大量的提高突变。文库还可以在第一轮筛选中未表现出提高的亲和力的位置包含取代。
[0376]
利用本领域已知的任何方法筛选或选择第二文库的具有提高和/或改变的结合亲和力的文库成员，包括利用biacore
tm
表面等离子共振分析筛选，以及利用本领域已知用于
选择的任何方法选择，包括噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示。
[0377]
本发明还提供组合物，其包含缀合至促进偶联至固体支持物(如生物素或抗生物素蛋白)的药剂的抗体。为了简单，一般会参考抗体，理解这些方法应用于本文描述的任何bcma抗体实施方案。缀合一般是指如本文所述连接这些组分。连接(其一般以直接关联的方式固定这些组分至少用于施用)可以以任何方式实行。例如当各自具有能够互相反应的取代基时，药剂和抗体之间的直接反应是可能的。例如一个上的亲核基团如氨基或巯基可能能够与含有羰基的基团如酐或酸性卤化物反应，或者与另一个上的含有良好离去基团(例如卤化物)的烷基反应。
[0378]
在另一方面，本发明提供一种制备本文所述任何多核苷酸的方法。
[0379]
本发明还涵盖任何这类序列的多核苷酸互补性。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链，并且可以是dna(基因组、cdna或合成)或rna分子。rna分子包括hnrna分子，其含有内含子并且以一对一的方式与dna分子对应；以及mrna分子，其不含内含子。额外的编码或非编码序列可以但不必存在于本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接至其他分子和/或支持物质。
[0380]
多核苷酸可以包含天然序列(即，编码抗体或其部分的内源序列)或者可以包含这样的序列的变体。多核苷酸变体含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，从而相对于天然免疫反应分子，所编码的多肽的免疫反应性未减少。对所编码的多肽的免疫反应性的影响一般可以如本文所述进行评价。变体优选表现出与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列的至少约70％相同性，更优选地，至少约80％相同性，更优选地，至少约90％相同性，并且最优选地，至少约95％相同性。
[0381]
如果在如下文所述比对最大对应时两个序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则说两个多核苷酸或多肽序列“相同”。两个序列之间的比较通常通过在比较窗口上比较所述序列以鉴定和比较序列局部区域相似性来进行。如本文所用，“比较窗口”是指至少约20个连续位置的片段，通常30至约75个，或者40至约50个，其中在两个序列最佳对齐之后可以将序列与相同数目连续位置的参考序列比较。
[0382]
用于比较的序列的最佳对齐可以使用生物信息学软件lasergene套件中的megalign程序(dnastar，inc.，madison，wi)利用缺省参数进行。这个程序包括以下参考文献中描述的几个比对方案：dayhoff，m.o.，1978，a model of evolutionary change in proteins-matrices for detecting distant relationships.in dayhoff，m.o.(ed.)atlas of protein sequence and structure，national biomedical research foundation，washington dc vol.5，suppl.3，pp.345-358；hein j.，1990，unified approach to alignment and phylogenes pp.626-645methods in enzymology vol.183，academic press，inc.，san diego，ca；higgins，d.g.and sharp，p.m.，1989，cabios 5:151-153；myers，e.w.and muller w.，1988，cabios 4:11-17；robinson，e.d.，1971，comb.theor.11:105；santou，n.，nes，m.，1987，mol.biol.evol.4:406-425；sneath，p.h.a.and sokal，r.r.，1973，nμmerical taxonomy the principles and practice of nμmerical taxonomy，freeman press，san francisco，ca；wilbur，w.j.and lipman，d.j.，1983，proc.natl.acad.sci.usa 80:726-730.
[0383]
优选地，通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对的序列来测定“序
列相同性百分比”，其中当为了两个序列的最佳比对与参考序列(其不含添加或缺失)比较时，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含20％或更少的添加或缺失(即，缺口)，通常5-15％，或者10-12％。百分比这样计算，确定在两个序列中均存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，匹配位置的数目除以参考序列中位置的总数目并将结果乘以100以产生序列相同性的百分比。
[0384]
变体还可以或者可选地基本上与天然基因或者其部分或互补物同源。这类多核苷酸变体能够在中等严格条件下与编码天然抗体的天然存在的dna序列(或互补序列)杂交。
[0385]
合适的“中等严格条件”包括在5x ssc、0.5％sds、1.0mm edta(ph 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃、5x ssc下杂交过夜；然后在65℃下洗涤2次20分钟，每次用含有0.1％sds的2x、0.5x和0.2x ssc。
[0386]
如本文所用，“高度严格条件”或“高严格性条件”是：(1)采用低离子强度和高温洗涤，例如在50℃下0.015m氯化钠/0.0015m柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间采用变性剂，如甲酰胺，例如在42℃下具有750mm氯化钠、75mm柠檬酸钠的具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲可/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/在ph 6.5的50mm磷酸钠缓冲液的50％(v/v)甲酰胺；或者(3)采用42℃下的50％甲酰胺、5x ssc(0.75m nacl、0.075m柠檬酸钠)、50mm磷酸钠(ph 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x denhardt’s溶液、超声处理的鲑鱼精dna(50μg/ml)、0.1％sds和10％硫酸葡聚糖，在42℃下于0.2x ssc(氯化钠/柠檬酸钠)中以及在55℃下的50％甲酰胺中洗涤，然后在55℃下由含有edta的0.1x ssc组成的高严格性洗涤。技术人员会认识到怎样调整温度、离子强度等，必要时调整诸如探针长度等的因素。
[0387]
本领域技术人员会理解，作为遗传密码简并性的结果，有许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。但是，本发明特别考虑由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸。而且，包含本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围之内。等位基因是作为一个或多个突变的结果而改变的内源基因，例如核苷酸的缺失、添加和/或取代。所得的mrna和蛋白可以但不必具有改变的结构或功能。等位基因可以利用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定。
[0388]
本发明的多核苷酸可以利用化学合成、重组方法或pcr获得。化学多核苷酸合成的方法是本领域公知的，并且不必在本文中详述。本领域技术人员可以使用本文所提供的序列和商业dna合成仪制备期望的dna序列。
[0389]
为了利用重组方法制备多核苷酸，如本文进一步讨论的，可以将包含期望序列的多核苷酸插入合适的载体，然后将所述载体引入合适的宿主细胞用于复制和扩增。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入宿主细胞。通过直接吸收、胞吞、转染、f-接合或电穿孔引入外源多核苷酸来转化细胞。一旦引入，所述外源多核苷酸可以作为非整合载体(例如质粒)维持在细胞内或者整合入宿主细胞基因组。这样扩增的多核苷酸可以通过本领域公知的方法从宿主细胞分离。参见例如sambrook et al.，1989。
[0390]
或者，pcr允许复制dna序列。pcr技术是本领域公知的，并且如美国专利号4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202以及pcr:the polymerase chain reaction，mullis et al.eds.，birkauswer press，boston(1994)所述。
[0391]
rna可以通过使用适当载体中的分离的dna并将其插入合适的宿主细胞来获得。当
细胞复制物和dna转录为rna时，然后可以利用本领域技术人员公知的方法分离所述rna，例如上文sambrook et al.，1989所示。
[0392]
合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或者可以选自本领域可用的大量克隆载体。虽然所选的克隆载体可以根据预期使用的宿主细胞变化，但是可用的克隆载体一般具有自我复制的能力，可以具有特定限制性内切核酸酶的单一靶标，和/或可以携带可以用于选择含有所述载体的克隆的标记的基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如puc18、puc19、bluescript(例如pbs sk )及其衍生物、mp18、mp19、pbr322、pmb9、cole1、pcr1、rp4、噬菌体dna以及穿梭载体，如psa3和pat28。这些和许多其他克隆载体可从商业供应商获得，例如biorad、strategene和invitrogen。
[0393]
表达载体一般是含有本发明的多核苷酸的可复制的多核苷酸构建体。这暗示表达载体必须作为附加体或者作为染色体dna的整合部分在宿主细胞中可复制。合适的表达载体包括但不限于质粒，病毒载体，包括腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒，粘粒，以及pct公开第wo 87/04462号中公开的表达载体。载体组件一般可以包括但不限于一种或多种以下组件：信号序列；复制起点；一个或多个标记基因；合适的转录控制元件(例如启动子、增强子和终止子)。为了表达(即，翻译)，通常还需要一种或多种翻译控制元件，例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
[0394]
可以通过许多适当方法中的任一种将含有所关注的多核苷酸的载体引入宿主细胞，包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其他物质转染；微粒轰击；脂转染；以及感染(例如当所述载体是感染物质时，如痘苗病毒)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特征。
[0395]
本发明还提供包含本文所述任何多核苷酸的宿主细胞。能够过量表达异源dna的任何宿主细胞可以用于分离编码所关注的抗体、多肽或蛋白的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于cos、hela和cho细胞。还参见pct公开第wo 87/04462号。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(例如大肠杆菌或枯草杆菌)和酵母(例如酿酒酵母、裂殖酵母；或者乳酸克鲁维酵母)。优选地，宿主细胞以比宿主细胞中相应的内源性所关注的抗体或蛋白(如果存在)高约5倍，更优选地，高10倍，甚至更优选地，高20倍的水平表达cdna。筛选特异性结合bcma或bcma结构域(例如结构域1-4)的宿主细胞通过免疫测定或facs进行。可以鉴定过量表达所关注的抗体或蛋白的细胞。
[0396]
使用双特异性抗体的方法[治疗应用]
[0397]
本发明的抗体(例如bcma、cd3或双特异性的)和抗体缀合物(例如bcma抗体-药物缀合物)可用于各种应用，包括但不限于治疗性治疗方法和诊断性治疗方法。
[0398]
在一方面，本发明提供一种治疗个体中与bcma表达相关的疾病状况的方法。在一些实施方案中，治疗个体中与bcma表达相关的疾病状况的方法包括向有此需要的个体施用有效量的包含如本文所述的bcma抗体或bcma抗体缀合物的组合物(例如药物组合物)。与bcma表达相关的疾病状况包括但不限于不正常的bcma表达、改变或异常的bcma表达、表达bcma的恶性细胞以及增值性病症(例如癌症)或自身免疫性病症。
[0399]
在另一方面，本发明提供一种治疗b-细胞相关癌症或表达肿瘤抗原的恶性细胞的方法。在一些实施方案中，提供一种治疗由此需要的个体中的b-细胞相关癌症的方法，所述方法包括a)提供如本文所述的双特异性抗体，以及b)向所述患者施用所述双特异性抗体。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体中与表达肿瘤抗原的恶性细胞相关的疾病状况的方法，所述方法包括向由此需要的个体施用有效量的包含如本文所述的双特异性抗体的药物组合物。
[0400]
因此，在一些实施方案中，提供一种治疗个体中的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的包含如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性抗体)或bcma抗体缀合物的组合物。如本文所用，癌症可以是b-细胞相关癌症，包括但不限于多发性骨髓瘤、恶性浆细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、kahler’s病和骨髓性白血病、浆细胞白血病、浆细胞瘤、b-细胞幼淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、b-细胞非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)、慢性髓性白血病(cml)、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、前体b-淋巴细胞淋巴瘤、髓性白血病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原发性纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、淋巴结边缘区b细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大b-细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、富含t细胞/组织细胞的大b-细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性皮肤弥漫性大b-细胞淋巴瘤(腿型)、老年人ebv阳性弥漫性大b-细胞淋巴瘤、炎症相关的弥漫性大b-细胞淋巴瘤、血管内大b-细胞淋巴瘤、alk阳性大b-细胞淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、hhv8相关的多中心castleman病中产生的大b-细胞淋巴瘤、未分类的具有弥漫性大b-细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤中间特征的b-细胞淋巴瘤、未分类的具有弥漫性大b-细胞淋巴瘤和经典霍奇金淋巴瘤中间特征的b-细胞淋巴瘤以及其他b-细胞相关淋巴瘤。
[0401]
在一些实施方案中，提供一种抑制具有表达bcma的恶性细胞的个体中的肿瘤生长或发展的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的包含如本文所述的bcma抗体、cd3-bcma双特异性抗体或bcma抗体缀合物的组合物。在其他实施方案中，提供一种抑制个体中表达bcma的细胞转移的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的包含如本文所述的bcma抗体、cd3-bcma双特异性抗体或bcma抗体缀合物的组合物。在其他实施方案中，提供一种诱导个体中的恶性细胞的肿瘤消退的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的包含如本文所述的bcma抗体、cd3-bcma双特异性抗体或bcma抗体缀合物的组合物。
[0402]
在一些实施方案中，提供一种治疗个体中的自身免疫性病症的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的包含如本文所述的bcma抗体、cd3-bcma双特异性抗体或bcma抗体缀合物的组合物。
[0403]
如本文所用，自身免疫性病症包括但不限于系统性红斑性狼疮、类风湿性关节炎、糖尿病(i型)、多发性硬化、addison’s病、脂泻病、皮肌炎、graves’病、桥本甲状腺炎、桥本脑病、重症肌无力、恶性贫血、反应性关节炎、干燥综合征、急性播散性脑脊髓炎、无丙种球蛋白血症、肌萎缩性侧索硬化症、关节强硬性脊椎炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特应性变态反应、特应性皮炎、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性周围神经病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性内分泌多腺体综合征、自身免疫性孕酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫
癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、白塞氏病、castleman’s病、冷凝集素病、克罗恩病、皮肌炎、嗜酸性筋膜炎、胃肠道类天疱疮、goodpasture’s综合征、格林-巴利综合征、化脓性汗腺炎、特发性血小板减少性紫癜、嗜睡症、寻常型天疱疮、恶性贫血、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、风湿热、颞动脉炎、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化的结缔组织疾病、脉管炎以及韦格纳肉芽肿。
[0404]
在另一方面，本发明提供有效量的包含如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的组合物(例如药物组合物)用于治疗有此需要的个体中与bcma表达相关的疾病状况(例如癌症或自身免疫性病症)。在一些实施方案中，提供有效量的包含如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的组合物(例如药物组合物)用于抑制具有表达bcma的恶性细胞的个体中的肿瘤生长或发展。在一些实施方案中，提供有效量的包含如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的组合物(例如药物组合物)用于抑制有此需要的个体中表达bcma的恶性细胞的转移。在一些实施方案中，提供有效量的包含如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的组合物(例如药物组合物)用于诱导具有表达bcma的恶性细胞的个体中的肿瘤消退。
[0405]
在另一方面，本发明提供如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物用于治疗有此需要的个体中与bcma表达相关的疾病状况(例如癌症或自身免疫性病症)。在一些实施方案中，提供如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物用于抑制具有表达bcma的恶性细胞的个体中的肿瘤生长或发展。在一些实施方案中，提供如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物用于抑制有此需要的个体中表达bcma的恶性细胞的转移。在一些实施方案中，提供如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物用于诱导具有表达bcma的恶性细胞的个体中的肿瘤消退。
[0406]
在另一方面，本发明提供如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物在制造用于治疗与bcma表达相关的疾病状况(例如癌症或自身免疫性病症)的药物中的用途。在一些实施方案中，提供如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物在制造用于抑制肿瘤生长或发展的药物中的用途。在一些实施方案中，提供如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物在制造用于抑制表达bcma的恶性细胞转移的药物中的用途。在一些实施方案中，提供如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物在制造用于诱导肿瘤消退的药物中的用途。
[0407]
在另一方面，提供一种检测、诊断和/或监测与bcma表达相关的疾病状况的方法。例如可以用可检测部分如显像剂和酶-底物标记标记如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)。如本文所述的抗体还可以用于体内诊断测定，如体内成像(例如pet或spect)，或者染色试剂。
[0408]
在一些实施方案中，本文描述的方法进一步包括用额外形式的疗法治疗个体的步骤。在一些实施方案中，额外形式的疗法是额外的抗癌疗法，包括但不限于化疗、辐射、手术、激素疗法和/或额外的免疫疗法。
[0409]
在一些实施方案中，额外形式的疗法包括施用除如本文所述的抗体(例如bcma或
cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物以外的一种或多种治疗剂。所述一种或多种治疗剂可以是化疗剂，包括但不限于二抗(例如抗vegf(血管内皮生长因子)抗体(例如)、抗her2抗体(例如)、抗cd25抗体、抗cd33抗体、抗cd20抗体(例如)、抗粘蛋白样糖蛋白抗体、抗tnf抗体和/或表皮生长因子受体(egfr)抗体(例如))、血管发生抑制剂、细胞毒剂(例如蒽环类(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、戊柔比星和米托蒽醌)、紫杉烷(例如紫杉醇和多西他赛)、多拉司他汀、多卡米星、烯二炔、格尔德霉素、美登素、嘌呤霉素、长春花生物碱(例如长春新碱)、拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷)、tubulysin、嘧啶类似物(例如氟尿嘧啶)、含铂剂(例如顺铂、卡铂和奥沙利铂)、烷化剂(例如美法仑、环磷酰胺或卡莫司汀)和哈米特林)、免疫调节剂(例如泼尼松和来那度胺)、抗炎剂(例如地塞米松)、芳化酶抑制剂(例如阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、伏氯唑、福美坦或睾内酯)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米如([(1r)-3-甲基-1-[[(2s)-1-氧代-3-苯基-2-[(吡嗪基羰基)氨基]propy-l]氨基]丁基]硼酸或卡非佐米)以及其他试剂如他莫昔芬。
[0410]
例如在一些实施方案中，提供一种治疗多发性骨髓瘤的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的组合物，所述组合物包含如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体以及一种或多种治疗剂如化疗剂(例如多柔比星或卡非佐米)或沙利度胺或其衍生物(例如来那度胺)。在一些实施方案中，所述一种或多种其他治疗剂选自硼替佐米(例如)、美法仑、泼尼松、多柔比星、来那度胺、沙利度胺、泼尼松、卡莫司汀、依托泊苷、顺铂、环磷酰胺、卡非佐米和长春新碱。在一些实施方案中，所述其他治疗剂是硼替佐米(例如)、美法仑、来那度胺卡非佐米、多柔比星或泼尼松。因此，提供一种治疗多发性骨髓瘤的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的组合物，所述组合物包含如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物以及选自硼替佐米、来那度胺、卡非佐米和多柔比星的一种或多种其他治疗剂。在一些实施方案中，所述患者对以前的多发性骨髓瘤疗法复发或难以治疗。
[0411]
所述抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物可以通过任何合适的途径向个体施用。本领域技术人员应当理解本文描述的实例不是为了限制而是说明可用的技术。因此，在一些实施方案中，所述抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物按照已知的方法向个体施用，如静脉内施用，例如作为团或通过在一段时间内连续输注，通过肌肉内、腹腔内、脑脊髓内(intracerebrospinal)、颅内、透皮、皮下、关节内、舌下、滑膜内、通过吹入、鞘内、口服、吸入或体表途径。施用可以是全身的，例如静脉内施用，或者是局部的。可商购的液体制剂的雾化器，包括喷射雾化器和超声波雾化器可用于施用。液体制剂可以直接雾化，而冻干粉可以在重建之后雾化。或者，可以利用氟碳制剂和定量吸入器将所述抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物雾化，或者作为冻干和研磨粉末吸入。
[0412]
在一实施方案中，所述抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物通过位点特异性或靶向局部递送技术施用。位点特异性或靶向局部递送技术的实例包括所述抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的各种可植入的贮存来源或
者局部递送导管，如灌注导管、留置导管或针导管，合成移植物，外膜包裹，分流管和支架或者其他可植入的装置，位点特异性载体，直接注射或直接应用。参见例如pct公开第wo 00/53211号和u.s.pat.no.5,981,568。
[0413]
所述抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的各种制剂可以用于施用。在一些实施方案中，所述抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物可以纯(neat)施用。在一些实施方案中，所述抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物以及药学可接受的赋形剂可以在各种制剂中。药学可接受的赋形剂是本领域已知的，并且是促进药理学有效物质的施用的相对惰性物质。例如赋形剂可以给予形式或一致性，或者充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、湿润和乳化剂、改变渗透压的盐、成胶囊剂和皮肤渗透促进剂。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂以及制剂在remington，the science and practice of pharmacy 21st ed.mack publishing，2005中示出。
[0414]
在一些实施方案中，配制这些药剂用于通过注射(例如腹腔内、静脉内、皮下、肌肉内等)施用。因此，这些药剂可以与药学可接受的媒介物如盐水、林格氏液、葡萄糖溶液等组合。特定剂量施用方案，即剂量、时间和重复会取决于特定个体和该个体的病史。
[0415]
如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物可以利用任何合适的方法施用，包括通过注射(例如腹腔内、静脉内、皮下、肌肉内等)。如本文所述，所述抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物还可以通过吸入施用。通常，对于抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的施用，初始候选剂量可以是约2mg/kg。为了本发明的目的，典型的每日剂量可以范围为约任何3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或更多，取决于上文提到的因素。例如可以使用约1mg/kg、约2.5mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg和约25mg/kg的剂量。对于在几天或更长时间内重复施用，根据疾病状况，治疗是持续的，直至期望的症状抑制出现或者直至达到足够的治疗水平，例如抑制或延迟肿瘤生长/发展或癌细胞的转移。示例性剂量施用方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，然后约1mg/kg的所述抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的每周维持剂量，或者然后每隔一周约1mg/kg的维持剂量。其他示例性剂量施用方案包括施用增加的剂量(例如1mg/kg的初始剂量并逐步增加至一个或多个更高的剂量每周或更长时间)。其他剂量方案也是可用的，取决于从业人员希望达到的药物动力学衰变模式。例如在一些实施方案中，考虑一周1-4次剂量施用。在其他实施方案中，考虑每个月一次或每隔一个月一次或每三个月一次剂量施用。这种疗法的进展通过常规技术和测定很容易监测。剂量施用方案(包括使用的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物)可以随时间变化。
[0416]
为了本发明的目的，抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的适当剂量取决于采用的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物、待治疗的症状的类型和严重程度、药剂是否为了治疗目的施用、以前的疗法、患者的临床历史和对药剂的反应、患者对施用药剂的清除率以及主治医师的自行决定权。通常医师施用抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物直至达到实现期望结果的剂量。剂量和/或频率可以随治疗过程变化。经验考虑如半衰期一般有助于剂量的确定。例如与人免疫系统相容的抗体如人源化抗体或全人抗体可以用来延长抗体的半衰期和防止抗体被宿主的
免疫系统攻击。施用频率可以随治疗过程确定和调整，并且一般但不是必需基于症状的治疗和/或抑制和/或缓解和/或延迟，例如肿瘤生长抑制或延迟等。或者，抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的持续缓释制剂可以是合适的。实现缓释的各种制剂和装置是本领域已知的。
[0417]
在一实施方案中，可以在已给予抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的一次或多次施用的个体中凭经验确定抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的剂量。给予个体增加剂量的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物。为了评价效力，可以追踪疾病的指标。
[0418]
按照本发明中的方法施用抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物可以是连续或间歇的，取决于例如受体的生理条件、施用的目的是治疗性或预防性的以及技术人员已知的其他因素。抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的施用可以在预先选择的时间中是基本上连续的，或者可以是一系列的间隔剂量。
[0419]
在一些实施方案中，可以存在一种以上抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物。可以存在至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种不同或更多种抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物。通常，这些抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物可以具有不互相不利影响的互补活性。例如可以使用一种或多种以下抗体：针对bcma或cd3上的一个表位的第一bcma或cd3抗体以及针对bcma或cd3上的不同表位的第二bcma或cd3抗体。
[0420]
按照本发明使用的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的治疗制剂通过混合具有期望纯度的抗体与任选存在的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(remington，the science and practice of pharmacy 21st ed.mack publishing，2005)来制备用于储存，为冻干制剂或水溶液形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度对受体是无毒的，并且可以包含缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁基或苄基醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如edta；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子如钠；金属复合物(例如zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0421]
包含抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物的脂质体通过本领域已知的方法制备，如epstein，et al.，proc.natl.acad.sci.usa 82:3688，1985；hwang，et al.，proc.natl acad.sci.usa 77:4030，1980；以及u.s.pat.no.4,485,045和4,544,545所述。u.s.pat.no.5,013,556中公开了具有增加的循环时间的脂质体。特别可用的脂质体可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和peg-衍生化磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂质组合物产生。可以将脂质体挤压通过定义孔径的过滤器以产生具有期望直径的脂质体。
[0422]
活性成分还可以包埋在通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，分别例如
羟甲基纤维素或明胶微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，在胶体药物递送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或者在粗乳剂(macroemulsion)中。remington，the science and practice of pharmacy 21st ed.mack publishing，2005中公开了这类技术。
[0423]
可以制备缓释制品。缓释制品的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质是成形物品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(u.s.pat.no.3,773,919)、l-谷氨酸和7乙基-l-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-丙烯乙酸酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如lupron depot tm
(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙立德组成的可注射微球)、蔗糖乙酸酯异丁酸酯和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。
[0424]
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过例如无菌过滤膜过滤容易地完成。治疗性抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物组合物一般置于具有无菌接入端口的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
[0425]
本发明的组合物可以在单位剂型中，如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂、或者栓剂，用于口服、肠胃外或直肠施用，或者通过吸入或吹入施用。
[0426]
为了制备固体组合物如片剂，将主要活性成分与药学载体混合以形成包含本发明的化合物或其无毒的药学可接受的盐的均匀混合物的固体预配制组合物，所述药学载体例如常规的压片成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，以及其他药学稀释剂例如水。当提到这些预配制组合物是均匀的时，表示活性成分均匀地分散于整个组合物中，从而组合物可以容易地细分为同等有效的单位剂型，如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将此固体预配制组合物细分为含有0.1-约500mg的本发明的活性成分的上述类型的单位剂型。可以将新组合物的片剂或丸剂包衣或者复合以提供具有持久作用优点的剂型。例如所述片剂或丸剂可以包含内剂量组分和外剂量组分，后者为覆盖前者的封套形式。这两个组分可以由肠溶层分隔，所述肠溶层用来阻止在胃中崩解并允许所述内组分完整地通过进入十二指肠或延迟释放。各种物质可以用于这类肠溶层或包衣，这类物质包括许多聚合酸以及聚合酸与这类物质如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的混合物。
[0427]
特别地，合适的表面活性剂包括非离子剂如聚氧乙烯山梨醇酐(例如tween
tm 20、40、60、80或85)和其他山梨醇酐(例如span
tm 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物会方便地包含0.05-5％表面活性剂，并且可以是0.1-2.5％。应当理解可以添加其他成分，例如甘露醇或其他药学可接受的媒介物，如果必需。
[0428]
可以利用可商购的脂肪乳剂如intralipid
tm
、liposyn
tm
、infonutrol
tm
、lipofundin
tm
和lipiphysan
tm
制备合适的乳剂。可以将活性成分溶解于预混乳液组合物中，或者可以将其溶解于油(例如大豆油、红花油、棉子油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，并且在与磷脂(例如蛋黄磷脂(egg phospholipid)、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合时形成乳液。应当理解可以添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以便调整乳剂的张力。合适的乳剂通常包含多达20％油，例如5-20％。脂肪乳剂可以包含0.1-1.0μm，特别是0.1-0.5μm的脂肪滴，并且具有5.5-8.0范围中的ph。
[0429]
乳液组合物可以是通过混合抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物与intralipid
tm
或其组分(大豆油、蛋黄磷脂、甘油和水)制备的那些组合物。
[0430]
用于吸入或吹入的组合物包括药学可接受的、水性或有机溶剂中的溶液或悬浮液，或者它们的混合物，以及粉末。液体或固体组合物可以包含如上文所示的合适的药学可接受的赋形剂。在一些实施方案中，为了局部或全身效应，通过口服或鼻呼吸途径施用组合物。在优选无菌的药学可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体雾化。雾化的溶液可以从雾化装置直接呼吸，或者可以将雾化装置连接至面罩、帐篷或间歇正压呼吸器。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当方式递送制剂的装置施用，优选口服或鼻部施用。
[0431]
组合物
[0432]
本发明的方法中使用的组合物包含有效量的如本文所述的抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物。在前面的章节和下文中还描述了这类组合物的实例以及怎样配制。在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物。例如bcma抗体或cd3-bcma双特异性抗体识别人bcma或cd3-bcma。在一些实施方案中，bcma或cd3-bcma抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，bcma抗体或cd3-bcma抗体包含能够触发期望的免疫应答如抗体介导的裂解或adcc的恒定区。在其他实施方案中，bcma抗体或cd3-bcma抗体包含不触发不需要或不可取的免疫应答如抗体介导的裂解或adcc的恒定区。
[0433]
应当理解所述组合物可以包含一种以上抗体(例如bcma或cd3-bcma双特异性的)或bcma抗体缀合物(例如识别bcma或者cd3和bcma的不同表位的bcma抗体或cd3-bcma双特异性抗体的混合物)。其他示例性组合物包含一种以上识别相同表位的bcma抗体、cd3-bcma抗体或bcma抗体缀合物，或者结合bcma(例如人bcma)或者cd3和bcma(人cd3和bcma)的不同表位的不同物种的bcma抗体、cd3-bcma双特异性抗体或bcma抗体缀合物。
[0434]
本发明中使用的组合物可以进一步包含药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(remington:the science and practice of pharmacy 21st ed.，2005，lippincott williams and wilkins，ed.k.e.hoover)，为冻干制剂或水溶液形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在剂量和浓度下对受体是无毒的，并且可以包含缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁基或苄基醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如edta；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子如钠；金属复合物(例如zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。本文进一步描述了药学可接受的赋形剂。
[0435]
试剂盒
[0436]
本发明还提供用于本方法的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个包含如本文所述的bcma抗体、cd3-bcma双特异性抗体或bcma抗体的容器以及按照本文所述发明的任何方法使用的说明书。通常，这些说明书包含施用bcma抗体、cd3-bcma双特异性抗体或bcma抗体缀合物用于上述治疗性治疗的描述。
[0437]
涉及如本文所述的bcma抗体、cd3-bcma双特异性抗体或bcma抗体缀合物的用途的说明书一般包括关于预期治疗的剂量、剂量施用计划和施用途径的信息。所述容器可以是
单位剂量、散包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页(例如试剂盒中所包含的纸张)上的书面说明书，但是也可以接受机器可读的说明书(例如磁或光存储盘上的说明书)。
[0438]
本发明的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑与特定装置联合使用的包装，例如吸入器、鼻施用装置(例如喷雾器)或者诸如微型泵的输液装置。试剂盒可以具有无菌接入端口(例如所述容器可以是具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。所述容器也可以具有无菌接入端口(例如所述容器可以是具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。所述组合物中至少一种活性剂是bcma抗体、cd3-bcma双特异性抗体或bcma抗体缀合物。所述容器可以进一步包含第二药学活性剂。
[0439]
试剂盒可以任选提供额外的组分如缓冲液和解释性信息。通常，所述试剂盒包含容器以及在所述容器上或与之相关的标签或包装插页。
[0440]
提供以下实施例仅用于说明目的，并且不是为了以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文显示和描述的修改之外的本发明的各种修改从前面的描述对本领域技术人员会变得清楚，并且属于所附权利要求的范围。
实施例
[0441]
实施例1：在25℃和/或37℃下确定hbcma/人igg相互作用的动力学和亲和力这个实施例在25℃和37℃下确定各种抗bcma抗体的动力学和亲和力。
[0442]
所有实验均在bio-rad proteon xpr36表面等离子共振生物传感器(bio-rad，hercules，ca)上进行。与abdiche，et al.，anal.biochem.411，139-151(2011)中描述的相似，利用胺-偶联方法在bio-rad glc传感器芯片上制备抗bcma抗体的阵列。固定的分析温度为25℃，并且运行缓冲液为hbs-t (10mm hepes，150mm nacl，0.05％tween-20，ph 7.4)。通过以30μl/min的流速注射1mm ecd和0.25mm nhs的混合物3分钟，将通道以分析物(水平)方向激活。通过在配体(垂直)方向以10mm乙酸盐ph 4.5缓冲液中20μg/ml注射1.5分钟(30μg/ml)将igg固定在激活点上。通过在分析物方向以30μl/min注射1m乙醇胺，ph 8.5 3分钟封闭激活的表面。
[0443]
hbcma结合分析的分析温度为37℃或25℃，在补充了1mg/ml bsa的hbs-t 的运行缓冲液中。动力学滴定方法用于如abdiche等人描述的相互作用分析。利用从低至高浓度的一系列注射以分析物方向注射hbcma(人bcma)分析物。使用的浓度为0.08nm、0.4nm、2nm、10nm和50nm(5-元系列，具有5-倍稀释因子和50nm的最高浓度)。给定分析物稀释液的结合时间为2分钟。在50nm hbcma注射之后立即监测解离2小时。在hbcma分析物注射之前，在hbcma分析物循环利用相同的结合和解离时间注射缓冲液5次以制备缓冲液空白传感图用于双参考目的(如myszka，j.mol.recognit.12，279-284(1999)中描述的双参考)。
[0444]
传感图是双参考的，并且在bia评价软件版本4.1.1(ge lifesciences，piscataway，nj)中拟合至1:1langmuir与质量运输动力学滴定模型。传感图和拟合在图1中示出，并且本发明的各种抗bcma抗体的动力学和亲和力参数在表6a-6c中示出。
[0445]
表6a
[0446]
样品ka(1/ms)kd(1/s)t
1/2
(min)kd(pm)
a02_rd4_6nm_c011.2e 062.8e-0541124a02_rd4_6nm_c161.1e 066.2e-0518759combo_rd4_0.6nm_c296.6e 061.4e-048321l3py/h3taq2.6e 061.4e-048453
[0447]
表6b
[0448]
[0449]
[0450]
[0451]
[0452][0453]
表6c*
[0454]
[0455]
[0456][0457]
*结合分析在37℃下进行。
[0458]
实施例2：人抗bcma抗体在bcma阳性肿瘤细胞上的流式细胞术
[0459]
这个实施例证实本发明的各种bcma抗体结合bcma阳性肿瘤细胞。
[0460]
通过流式细胞术在bcma-表达细胞(kms12bm、l363、mm1s和kms12pe)上评价就小鼠igg2a中表达的人抗hbcma的结合。将250,000个细胞在100ul结合缓冲液(pbs(磷酸缓冲盐水) 0.2％bsa(牛血清白蛋白))中用0.5ug抗体温育，然后用alex fluor 647缀合的抗小鼠igg(biolegend)温育。表7示出通过各种bcma抗体(例如combo_rd4_0.6nm_c29、a02_rd4_6nm_c01、a02_rd4_6nm_c16和p6e01/h3taq)，bcma阳性肿瘤细胞上的mfi(平均荧光强度)。
[0461]
表7
[0462][0463]
实施例3：抗bcma adc在bcma阳性细胞中的细胞毒性
[0464]
这个实施例说明抗bcma adc在bcma阳性细胞中的效力。
[0465]
人抗bcma(l3.py/p6e01、l3.py/h3.taq、combo_rd4_0.6nm_c29、a02_rd4_6nm_c01和a02_rd4_6nm_c16)表达为用含有谷氨酰胺的转谷氨酰胺酶(“q”)标签(例如lcq05、h7c、n297a、n297q、n297a/h7c、n297q/lcq05)工程化的人igg1亚型，用于2、4和6的药物抗体比例(dar)。分别地，tg17对应于seq id no:472(llqgpp)；lcq05对应于seq id no:474(ggllqgpp)，h7c对应于seq id no:454(llqg)，并且如表8所示与aclys-val-cit-pabc-aur0101(乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基)、氨基-peg6-c2-aur3377或氨基-peg6-c2-aur0131缀合。在一个实例中，可以在轻链、重链或者轻链和重链的组合工程化转谷氨酰胺酶标签。在其他实例中，在抗体的位点如在人igg的位置297(eu编号方案)工程化转谷氨酰胺酶标签(例如q)。例如在本发明的bcma抗体的位置297处用谷氨酰胺或丙氨酸取代野生型氨基酸天冬酰胺(n)(n297q或n297a)。然后通过微生物转谷氨酰胺酶催化的在特异性位点(例如重链或轻链的羧基末端或氨基末端、位置297、或者在抗体的另一位点)携带靶向谷氨酰胺或谷氨酰胺标签的抗bcma抗体和有效载荷的含胺衍生物(例如mmad、aur0101、aur3377或aur0131)之间的转酰胺反应实现抗bcma抗体缀合至aur0101、aur3377和aur0131。在某些情况下，用氨基酸精氨酸代替在位置222、340或370(按照eu编号方案)处的野生型氨基酸赖氨酸(“k222r”、“k340r”或“k370r”)。例如据发现k222r取代具有令人惊讶的效果，导致更多的同源抗体和有效载荷缀合物，更好的抗体和有效载荷之间的分子间交联，和/或与抗体轻链c-末端上的谷氨酰胺标签的链间交联显著减少。
[0466]
在转酰胺反应中，抗体上的谷氨酰胺充当酰基供体，并且含胺化合物充当酰基受
体(胺供体)。将浓度为1-150μm的纯化的抗bcma抗体用范围为5μm-15mm的5-100摩尔过量酰基受体在10-1000mm nacl、和25mm mes、hepes[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸]或ph范围6.2-8.8的tris hcl缓冲液中的0.23-0.55％(w/v)茂原链轮丝菌(streptoverticilliμm mobaraense)转谷氨酰胺酶(activa
tm
，ajinomoto，japan)的存在下温育。对单独的酰基受体衍生物调整反应条件，并且通常对75mm nacl，25mm tris hcl，ph 8.5中的33μm抗体、0.67mm衍生物和0.378％(w/v)转谷氨酰胺酶观察到最佳效率和特异性。在20-37摄氏度下温育1-24小时之后，利用本领域技术人员已知的标准色谱方法在丁基琼脂糖高效(丁基hp)树脂(ge healthcare，waukesha，wi)上纯化抗体，如来自ge healthcare的商业疏水相互作用色谱。
[0467]
然后将靶标表达(mm1.s、kms12bm和l363)细胞以3000个细胞/孔接种在透明底板上。将细胞用4-倍系列稀释的抗体-药物缀合物处理，一式三份。在处理之后96小时通过发光细胞生存力测定96(promega，madison wi)确定细胞生存力。相对细胞生存力确定为未处理对照的百分比。通过prism软件计算ec50。表8显示通过转谷氨酰胺酶标签和接头缀合至细胞毒剂0101、3377和0131的本发明的所有人抗bcma抗体在bcma表达细胞中均发挥有效的细胞杀死活性。
[0468]
表8
[0469]
[0470][0471]
实施例4：抗bcma adc在原位多发性骨髓瘤模型中诱导肿瘤消退
[0472]
这个实施例说明抗bcma adc在mm1s原位多发性骨髓瘤模型中的体内效力。
[0473]
用原位模型中表达萤光素酶和gfp(绿色荧光蛋白)的多发性骨髓瘤细胞系mm1.s进行bcma adc的体内效力研究。将1
×
107个mm1.s lucgfp细胞通过尾静脉静脉内注射入6-8周龄雌性cb17/scid动物。腹腔内注射d-萤光素(regis technologies，morton grove，il)(15mg/ml，200ul/动物)，然后用异氟烷麻醉随后全身生物发光成像(bli)使得能够监测肿瘤负荷。通过利用ivis spectrμm ct(perkin elmer，ma)成像捕获肿瘤细胞表达的萤光素酶和萤光素之间的相互作用发出的生物发光信号并利用living image4.4(caliper life sciences，alameda，ca)定量为总通量(光子/sec)。当对于所有动物总通量达到平均1-3e6时，将动物随机分组，并且通过团尾静脉注射施用单一剂量的在抗体轻链c-末端与1)lcq05/k222r-vc0101缀合的人抗bcma抗体和对照缀合物。当它们表现出后肢瘫痪时将动物终止，这是mm1.s原位模型的终点。图2显示与阴性对照(nnc)相比，3mg/kg的单一剂量的各种人抗bcma adc抑制肿瘤发展，包括p6e01/p6e01-aclys-val-cit-pabc-aur0101；p5a2_vhvl-aclys-val-cit-pabc-aur0101；p5c1_vhvl-aclys-val-cit-pabc-aur0101；p4g4-aclys-val-cit-pabc-aur0101；和p1a11-aclys-val-cit-pabc-aur0101。
[0474]
这个研究证实用bcma-adc处理抑制多发性骨髓瘤的发展。
[0475]
实施例5：抗bcma adc在原位多发性骨髓瘤模型中诱导肿瘤消退和抑制
[0476]
这个实施例也说明抗bcma adc在mm1.s原位多发性骨髓瘤模型中的体内效力。
[0477]
用原位模型中表达萤光素酶和gfp的多发性骨髓瘤细胞系mm1.s进行bcma adc的体内效力研究。将1
×
107个mm1.s lucgfp细胞通过尾静脉静脉内注射入6-8周龄雌性cb17/scid动物。腹腔内注射d-萤光素(regis technologies，morton grove，il)(15mg/ml，200ul/动物)，然后用异氟烷麻醉随后全身生物发光成像(bli)使得能够监测肿瘤负荷。通过利用ivis spectrμm ct(perkin elmer，ma)成像捕获肿瘤细胞表达的萤光素酶和萤光素之间的相互作用发出的生物发光信号并利用living image 4.4(caliper life sciences，alameda，ca)定量为总通量(光子/sec)。当对于所有动物总通量达到平均1-3e6时，将动物随机分组；1)h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-3377，2)n297q/k222r-aclys-val-cit-pabc-aur0101，3)lcq05/k222r-aclys-val-cit-pabc-aur0101，4)h7c/n297a/k222r
–
氨基-peg6-c2-0131，5)n297q/k222r/lcq05-aclys-val-cit-pabc-aur0101，和6)对照缀合物lcq04/k222r-aclys-val-cit-pabc-aur0101。通过团尾静脉注射施用单一剂量的人抗bcma adc和对照缀合物。当它们表现出后肢瘫痪时将动物终止，这是mm1.s原位模型的终点。图3显示单一剂量的与1)h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-0131和2)h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-3377缀合的人抗bcma l3.py/p6e01抗体导致肿瘤消退。单一剂量的与1)n297q/
k222r-aclys-val-cit-pabc-aur0101，2)lcq05/k222r-aclys-val-cit-pabc-aur0101，和3)n297q/k222r/lcq05-aclys-val-cit-pabc-aur0101缀合的人抗bcma l3.py/p6e01抗体导致肿瘤抑制。
[0478]
因此，这个研究证实用bcma-adc处理诱导消退并抑制多发性骨髓瘤的发展。
[0479]
实施例6：抗bcma adc在原位多发性骨髓瘤模型中诱导肿瘤抑制
[0480]
这个实施例也说明抗bcma adc在kms12bm原位多发性骨髓瘤模型中的体内效力。
[0481]
用原位模型中表达萤光素酶和gfp的多发性骨髓瘤细胞系kms12bm进行bcma adc的体内效力研究。将6-8周龄雌性nsg动物用100cgy辐照，并且在辐照后24小时，通过尾静脉静脉内注射1
×
107个kms12bm lucgfp细胞。腹腔内注射d-萤光素(regis technologies，morton grove，il)(15mg/ml，200ul/动物)，然后用异氟烷麻醉随后全身生物发光成像(bli)使得能够监测肿瘤负荷。通过利用ivis spectrμm ct(perkin elmer，ma)成像捕获肿瘤细胞表达的萤光素酶和萤光素之间的相互作用发出的生物发光信号并利用living image 4.4(caliper life sciences，alameda，ca)定量为总通量(光子/sec)。当对于所有动物总通量达到平均5e6时，将动物随机分组；1)h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-3377，2)n297q/k222r-aclys-val-cit-pabc-aur010，3)lcq05/k222r-aclys-val-cit-pabc-aur0101，4)h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-0131，5)n297q/k222r/lcq05-aclys-val-cit-pabc-aur0101，和6)对照缀合物lcq04/k222r-aclys-val-cit-pabc-aur0101。通过团尾静脉注射施用单一剂量的人抗bcma adc和对照缀合物。当它们减掉超过15％总体重时将动物终止，这是kms12bm原位模型的终点。图4显示单一剂量的与1)h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-3377，2)n297q/k222r-aclys-val-cit-pabc-aur0101，3)lcq05/k222r-aclys-val-cit-pabc-aur0101，4)h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-0131，和5)n297q/k222r/lcq05-aclys-val-cit-pabc-aur0101缀合的人抗bcma l3.py/p6e01抗体导致肿瘤抑制。
[0482]
因此，这个研究进一步证实用bcma-adc处理诱导消退并抑制多发性骨髓瘤的发展。
[0483]
实施例7：mm1s原位模型中抗bcma adc的剂量反应曲线
[0484]
这个实施例进一步说明抗bcma adc在mm1s原位多发性骨髓瘤模型中的体内效力。
[0485]
用原位模型中表达萤光素酶和gfp的多发性骨髓瘤细胞系mm1.s进行bcma adc的体内效力研究。将1
×
107个mm1.s lucgfp细胞通过尾静脉静脉内注射入6-8周龄雌性cb17/scid动物。腹腔内注射d-萤光素(regis technologies，morton grove，il)(15mg/ml，200ul/动物)，然后用异氟烷麻醉随后全身生物发光成像(bli)使得能够监测肿瘤负荷。通过利用ivis spectrμm ct(perkin elmer，ma)成像捕获肿瘤细胞表达的萤光素酶和萤光素之间的相互作用发出的生物发光信号并利用living image 4.4(caliper life sciences，alameda，ca)定量为总通量(光子/sec)。当对于所有动物总通量达到平均1.2e6时，将动物随机分组；1)0.1mg/kg h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-0131，2)0.38mg/kg h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-0131，3)0.75mg/kg h7c/n297a/k222-氨基-peg6-c2-0131，4)1.5mg/kg h7c/n297a/k222r-氨基-peg6-c2-0131，和5)3mg/kg对照缀合物n297q/k222r-aclys-vc-0101。通过团尾静脉注射施用单一剂量的人抗bcma adc和对照缀合物。当它们表现出后肢瘫痪时将动物终止，这是mm1.s原位模型的终点。图5显示单一剂量的与上述1)-4)组缀合的人抗bcma combo_rd4_0.6nm_c29抗体在0.1mg/kg开始导致肿瘤消退，并且在0.75mg/kg
开始导致肿瘤抑制长达100天。
[0486]
因此，这个研究证实用bcma-adc处理在多发性骨髓瘤中诱导肿瘤消退和肿瘤抑制。
[0487]
实施例8：异源二聚体抗体的产生和纯化
[0488]
这个实施例描述本发明的异源二聚体抗体的产生和纯化。
[0489]
将人特异性抗cd3抗体的可变区克隆至分别包含以下突变221r、228r和k409r；或者223r、225r、228r和k409r且称作higg1 rrr或igg2δa-rrrr的人igg1或igg2δa中。
[0490]
将抗靶标抗体的可变区克隆至分别包含以下突变221e、228e、l368e或者223e、225e、228e和l368e且称作higg1eee或higg2δa-eeee的人igg1或igg2δa中。
[0491]
通过如国际专利申请号pct/us2011/036419(wo2011/143545)所述将具有higg1rrr或igg2δa-rrrr突变的抗cd3 igg1或igg2δa与具有higg1eee或higg2δa-eeee突变的抗靶标抗体在具有1mm或2mm gsh的pbs中于37℃下温育24hr来制备异源二聚体。如下文所述，通过离子交换色谱纯化异源二聚体。
[0492]
通过离子交换色谱纯化所有异源二聚体。简单地说，在装有弱阳离子交换dionex propac wcx-10g(4x50mm)柱的agilent 1100四元泵lc系统(agilent inc，santa clara，ca，usa)上进行fc-异源和fc-同源二聚体的分析离子交换分离。将蛋白在5％缓冲液a(20mm mes ph 5.4)中注射，并且在25％-75％缓冲液b(20mm mes ph 5.4和500mm nacl)梯度中以1ml/min流速在20分钟时间中洗脱。在装有弱阳离子交换dionex propac wcx-10g(4x250mm)柱的akta explorer(ge)上进行大规模fc-异源二聚体纯化。将蛋白在5％缓冲液a(20mm mes ph 5.4)中注射，并且在15％-75％缓冲液b(20mm mes ph 5.4和500mm nacl)梯度中以1ml/min流速在20分钟时间中洗脱。
[0493]
实施例9：在25℃和/或37℃下确定hcd3/人igg相互作用的动力学和亲和力
[0494]
这个实施例在25℃和37℃下确定各种抗cd3抗体的动力学和亲和力。
[0495]
所有实验均在bio-rad proteon xpr36表面等离子共振生物传感器(bio-rad，hercules，ca)上进行。与abdiche，et al.，anal.biochem.411，139-151(2011)中描述的相似，利用胺-偶联方法在bio-rad glc传感器芯片上制备抗cd3抗体的阵列。固定的分析温度为25℃，并且运行缓冲液为hbs-t (10mm hepes，150mm nacl，0.05％tween-20，ph 7.4)。通过以30μl/min的流速注射1mm ecd和0.25mm nhs的混合物3分钟，将通道以分析物(水平)方向激活。通过在配体(垂直)方向以10mm乙酸盐ph4.5缓冲液中20μg/ml注射1.5分钟(30μg/ml)将igg固定在激活点上。通过在分析物方向以30μl/min注射1m乙醇胺，ph 8.5 3分钟封闭激活的表面。
[0496]
hcd3结合分析的分析温度为37℃或25℃，在补充了1mg/ml bsa的hbs-t 的运行缓冲液中。动力学滴定方法用于如abdiche等人描述的相互作用分析。利用从低至高浓度的一系列注射以分析物方向注射hcd3(人cd3)分析物。使用的浓度为0.08nm、0.4nm、2nm、10nm和50nm(5-元系列，具有5-倍稀释因子和50nm的最高浓度)。给定分析物稀释液的结合时间为2分钟。在50nm hcd3注射之后立即监测解离2小时。在hcd3分析物注射之前，在hcd3分析物循环利用相同的结合和解离时间注射缓冲液5次以制备缓冲液空白传感图用于双参考目的(如myszka，j.mol.recognit.12，279-284(1999)中描述的双参考)。
[0497]
传感图是双参考的，并且在bia评价软件版本4.1.1(ge lifesciences，
piscataway，nj)中拟合至1:1langmuir与质量运输动力学滴定模型。本发明的各种抗cd3抗体的动力学和亲和力参数在表9中示出。
[0498]
表9
[0499][0500]
实施例10：人抗cd3双特异性抗体在b细胞和cd8 t细胞上的流式细胞术
[0501]
这个实施例证实抗cd3-抗cd20双特异性抗体在cd20 细胞中的效力。
[0502]
在charles river laboratories，preclinical services nevada按照机构动物护理和使用委员会进行食蟹猴研究。将动物(n＝2)通过静脉内团注射用剂量为500ug/kg、100ug/kg、20ug/kg、2ug/kg、0.2ug/kg或0.02ug/kg的双特异性抗cd20/h2b4抗体剂量施用。每天两次和在每个血液采集时间点观察动物。从不用于i.v.剂量施用的外周血管采集用于流式细胞术和细胞因子分析的血液至k2edta管中。
[0503]
通过流式细胞术测量外周血中的b细胞和t细胞确定效力。在所示时间点采集全血并保持在4℃下直至分析。在室温下用ack缓冲液(gibco)裂解红细胞5分钟，并且通过离心沉淀白细胞。将细胞在4℃下用pbs 2％fbs中的包含荧光标记的识别cyno cd19(beckman coulter)、cd45、cd4、cd8、ki67(bd biosciences)的抗体的混合物染色1hr。对于ki67分析，将细胞首先用cd4和cd8染色，然后根据制造商的说明书用bd cyotfix/cytoperm试剂盒(bd biosciences)固定/透化，随后对ki67细胞内染色。染色之后立即进行在bd lsrii流式细胞仪上获得细胞。
[0504]
在图6a-6f中将所得的b细胞计数作图为研究前b细胞计数的百分比。用低至2ug/kg的剂量实现了单一剂量之后延长的b细胞消耗。在所有剂量均看到b细胞消耗。消耗效果的持续时间是剂量依赖性的。
[0505]
在图7a-7f中将所得的cd8 t细胞计数作图为研究前cd8 t细胞计数的百分比。初始重新定位之后，在研究期间t细胞水平恢复至基线水平或之上。
[0506]
实施例11：人抗cd3双特异性抗体在cd8 t细胞上的流式细胞术
[0507]
这个实施例证实单价抗cd3抗体对t细胞动力学和激活的效力。
[0508]
如实施例3所述进行食蟹猴研究并通过流式细胞术测量外周血中的t细胞来确定效力。将食蟹猴(n＝2)用抗cd20/h2b4或nnc(非特异性抗体)/h2b4以0.2ug/kg每周i.v.剂量施用。与cd20靶向双特异性抗体相反，如通过流式细胞术测量的，nnc/h2b4对血液中的cd8 t细胞动力学具有很少至没有效果。将ki67用作t细胞激活的标记。
[0509]
在图8a和8b中将所得的t细胞计数作图为研究前t细胞计数的百分比。在用cd20/h2b4双特异性抗体剂量施用的食蟹猴中，ki67 t细胞增加并在剂量后第3天和第7天之间达到峰值，表明t细胞激活。但是，在用nnc/h2b4剂量施用的食蟹猴中，ki67 t细胞没有增加。
[0510]
实施例12：人抗cd3双特异性抗体在b细胞上的流式细胞术
[0511]
这个实施例证实抗cd3臂亲和力对b细胞消耗的影响。
[0512]
如实施例10所述进行食蟹猴研究并通过流式细胞术测量外周血中的t细胞来确定效力。用与具有不同亲和力的4种抗cd3抗体臂配对的抗cd20臂制备双特异性抗体。在0.2ug/kg的单一i.v.剂量之后，通过流式细胞术测量外周血中的b细胞来确定效力。
[0513]
在图9a-9d中，将所得的b细胞计数作图为研究前b细胞计数的百分比。b细胞消耗的效力与抗cd3臂亲和力相关。
[0514]
实施例13：双特异性抗体在bcma阳性细胞的t-细胞介导的杀死上的体外研究
[0515]
这个实施例说明抗bcma/cd3 higg2δa双特异性在bcma阳性细胞中的体外细胞毒性。
[0516]
如实施例8所述将人抗bcma(p5a2、a02_rd4_0.6nm_c01、a02_rd4_6nm_c16，p5c1、c01_rd4_6nm_c12、combo_rd4_0.6nm_c22、combo_rd4_0.6nm_c29、l3py/h3taq和a02_rd4_6nm_c01)抗体表达为用eeee工程化的人igg2da用于双特异性交换。
[0517]
利用pan t细胞分离试剂盒，人(miltenyi，san diego ca)负选择来自pbmc的cd3 t细胞。将靶标表达(kms12pe、l363和molp8)细胞和cd3 t-细胞分别以20000和100000个细胞/孔接种在透明u-底板上。将细胞用10-倍系列稀释的双特异性抗体处理，一式三份。在处理之后20小时通过cytotox非放射性细胞毒性测定(promega，madison wi)确定细胞死亡。细胞毒性确定为未处理的效应子加上靶对照孔的百分比。通过prism软件计算ec50。表10显示所有人抗bcma_h2b4双特异性抗体均在bcma表达细胞中发挥细胞杀死活性。
[0518]
表10
[0519]
[0520]
und是未确定的；n/a是ec50不可以确定。
[0521]
实施例14：小鼠杂交瘤克隆的抗cd3抗体的体外表征
[0522]
这个实施例说明人/食蟹猴pbmc细胞中克隆自小鼠杂交瘤的抗cd3的体外t细胞激活/增殖用于抗体筛选。
[0523]
人抗cd3抗体克隆自免疫的小鼠，表达为小鼠igg1，并且通过a蛋白亲和珠纯化。通过ficoll(密度：1.083g/ml，ge)密度梯度离心从获得自当地血库的血液过滤器制备人/食蟹猴外周血单核细胞(hu/cypbmc)。通过在室温下于lck缓冲液(155mm nh4cl，10mm khco3，100mm edta；gibco)中温育3分钟去除红细胞。将细胞以600g离心5min。丢弃包含裂解的红细胞的上清液，并且将pbmc在50ml 1xpbs/1％bsa/1mm edta中洗涤两次。将沉淀的细胞在培养基x-vivo-15(无血清培养基(lonza))中调整至107个细胞/ml，并且将pbmc以106(100ul)/孔接种至圆底96孔组织培养板。将所选ab从1000ng至1ng/ml 10x系列稀释用于与人pbmc混合，并且从5000ng至200ng/ml 5x系列稀释用于与食蟹猴pbmc混合。对于通过3h-胸苷掺入分析pbmc t细胞增殖，一式三份进行2天培养。在培养的最后16h期间，添加3h-胸苷(0.5mci/孔)，并且测量掺入。将细胞收获并裂解，将dna捕获在玻璃-纤维滤器上。通过在闪烁β-计数器上计数，放射性(cpm)作为增殖的度量。
[0524]
图10a和10b显示所选抗cd3 1a4、1c10、2b4和7a3抗体在人和食蟹猴pbmc(外周血单核细胞)上具有胸苷掺入读数。表11示出通过biacore测量的它们的kd。体外表征显示抗cd3 1c10和2b4抗体与阳性对照sp34抗cd3抗体(bd biosciences)相似。
[0525]
表11从80nm-0.64nm拟合的数据的抗xcd3e ab/bsc_hcd3ed动力学结果
[0526]
配体kakdt
1/2
(min)kd(nm)ucht1( )1.80e 05《8.55e-04》13.5《4.742b43.74e 052.74e-034.217.331c102.96e 052.37e-034.888.00sp34( )2.84e 053.04e-033.8010.737a3*
ꢀꢀꢀ
82.701a4*
ꢀꢀꢀ
99.97
[0527]
注意：
[0528]
仅对令人满意的动力学拟合报道数据。( )＝阳性对照
[0529]
*动力学确定是粗略估计，因为抗体是异源的。仅测量稳定状态亲和力。
[0530]
实施例15：双特异性抗体对t细胞介导的杀死的体外研究
[0531]
这个实施例说明与健康供体分离的pan t细胞混合的sw480中的抗epcam/cd3双特异性的体外细胞毒性。
[0532]
a：抗cd抗体h2b4-1d、tk、hnpstk和yaestk
[0533]
如实施例8所述将人抗cd3(h2b4-1d(或h2b4)、h2b4-tk(或h2b4-vh-wt vl_tk)、h2b4-hnpstk(或h2b4-vh-hnps vl_tk)和h2b4-yaestk(或h2b4-vh-yaes vl_tk))抗体和人抗epcam抗体表达为用rrrr或eeee工程化的人igg2da用于双特异性交换。
[0534]
选择sw480作为靶细胞系用于细胞杀死测定，并且效应细胞和人t细胞纯化自人外周血单核细胞(hupbmc)。将靶标和效应细胞接种在96-孔圆底板中，在包含5％胎牛血清(fbs)的细胞培养基中。靶细胞的数量保持恒定在2x104个细胞/孔。将3ug-3pg/ml的双特异
性抗体的10-倍系列稀释液一式三份添加至细胞。总反应体积为200ul。将反应温育48和72小时。对于细胞毒性分析，通过cytotox非放射性细胞毒性测定试剂盒(promega，g1780)定量测量在细胞裂解时释放的稳定胞质酶乳酸脱氢酶(ldh)。在vmax动态酶标仪(molecular devices)上于490nm下读取平板。对培养基背景以及靶标和效应细胞的自发裂解校正光密度值。根据下式计算特异性细胞毒性：
[0535]
[％特异性裂解＝样品的490nm读数-e t混合对照的490nm读数)/(总t裂解的490nm读数-培养基对照的490nm读数)x100％]
[0536]
图11a和11b显示所有人抗epcam_h2b4双特异性抗体在体外环境中均具有细胞杀死活性，并且通过t细胞激活标记监测抗体介导的t细胞激活。表12a示出它们的ec50。表12b示出双特异性抗体形式的biacore kd。
[0537]
表12a
[0538]
第2天:ec50(nm)h2b4-1d_ep537.1h2b4-tk_ep405.3h2b4-hnpstk_ep424.7h2b4-yaestk_ep1126
[0539]
表12b在37℃下抗cd3 higg2da双特异性动力学的总结表
[0540]
样品id-bschigg2daka(1/ms)kd(1/s)t1/2(min)kd(nm)h2b4-1d_ep5.86e 052.37e-020.4940.4h2b4-tk_ep6.87e 052.13e-020.5431.0h2b4-hnpstk_ep7.54e 052.35e-020.4931.2h2b4-yaestk_ep4.74e 052.58e-020.4554.4
[0541]
b：抗cd抗体m25a8、h25a8-b12和h25a8-b13
[0542]
如实施例8所述将人抗cd3 h2b4(h2b4_1d)和h25a8(m25a8、h25a8-b12和h25a8-b13)以及人抗epcam抗体表达为用rrrr或eeee工程化的人igg2da用于双特异性交换。
[0543]
图11c和11d显示所有人抗epcam_抗cd3双特异性抗体在体外环境中均具有细胞杀死活性，并且通过t细胞激活标记监测抗体介导的t细胞激活。表12c示出体外细胞杀死的ec50。表12d示出在37℃下双特异性抗体形式的biacore动力学。表12e示出利用sec-mals(大小排阻色谱与多角度光散射)和dsc(差式扫描量热法)的体外表征。
[0544]
表12c：体外细胞杀死的ec50
[0545]
第1天：ec50(nm)h2b4-1d_ep52.9m25a8_ep127.6h25a8-b12_ep99.36h25a8-b13_ep57.11
[0546]
表12d：在37℃下抗cd3 higg2da双特异性动力学的总结表
[0547]
样品id-bschigg2daka(1/ms)kd(1/s)t1/2(min)kd(nm)h25a8-b5_ep1.29e 065.81e-020.2045.0
h25a8-b8_ep1.19e 062.22e-020.5218.7h25a8-b12_ep1.15e 062.41e-020.4821.0h25a8-b13_ep1.20e 062.19e-020.5318.3h25a8-c8_ep1.20e 063.01e-020.3825.1h2b4-1d_ep5.86e 052.37e-020.4940.4
[0548]
表12e：体外表征
[0549][0550]
实施例16：双特异性抗体在原发性骨髓瘤患者样品的t-细胞介导的杀死上的体外研究
[0551]
这个实施例说明抗bcma/cd3双特异性在原发性骨髓瘤细胞中的体外细胞毒性。
[0552]
如实施例8所述将人抗bcma(p5a2、a02_rd4_0.6nm_c01、a02_rd4_6nm_c16、combo_rd4_0.6nm_c29和p6e01 l3py/h3taq)和人抗cd3(h2b4)抗体表达为用eeee或rrrr工程化的人igg2da用于双特异性交换。
[0553]
将来自骨髓瘤患者的总骨髓单核细胞以导致3000-5000个骨髓瘤细胞/孔的总骨髓单核细胞数量接种在透明的u-底板中。将细胞用10-倍系列稀释的双特异性抗体处理。处理之后5天，利用cd138和cd38的抗体(biolegend，ca)通过流式细胞术确定总活细胞。将细胞用抗体在4
°
下于pbs 0.5％fbs中温育30分钟。将细胞洗涤，并且将pbs中的fixable viability dye efluor 780(ebioscience，inc.，ca)添加至细胞在4
°
下30分钟。在bd流式细胞仪上细胞采集之前，将细胞洗涤并添加countbright绝对计数珠(molecular probes，or)。活细胞百分比利用计数珠确定为处理vs未处理孔中的活细胞计数。通过prism软件计算ec50。
[0554]
表13a显示所有人抗bcma_h2b4双特异性抗体对骨髓瘤患者样品均具有细胞杀死活性，并且患者t细胞是功能效应细胞。表13b显示一种抗bcma双特异性对多个骨髓瘤患者样品的杀死具有不同的效应子比靶标(e:t)比例。
[0555]
表13a
[0556][0557]
表13b
[0558][0559]
实施例17：来自用抗bcma/cd3双特异性抗体施用的食蟹猴的抗体分泌细胞的elispot。
[0560]
这个实施例说明具有抗bcma/cd3双特异性抗体的食蟹猴中的igg分泌细胞消耗。
[0561]
将食蟹猴(n＝2)通过静脉内团注射用双特异性抗bcma_cd3抗体(h2b4-vh-hnps vl_tk)、a02_rd4_0.6nm_c01/h2b4和combo_rd4_0.6nm_c29/h2b以两个剂量剂量施用，第1天和第8天，100ug/kg和300ug/kg。每天两次和在每个血液采集时间点观察动物。在第-6、4和10天采样外周血单核细胞(pbmc)。当动物尸检时在第10天采集骨髓样品。
[0562]
将血液收集至包含肝素钠和密度梯度的bectoncpt
tm
细胞制备管中，然后在离心之后于梯度界面收集pbmc。
[0563]
通过用约5ml的100％胎牛血清(fbs)冲洗收集骨髓样品(来自股骨)，然后通过将冲洗的骨髓悬浮在50ml缓冲液中制备单细胞悬浮液。
[0564]
将细胞利用cellometer vision计数，并且用完全rpmi 1640培养基调整至对于pbmc 5x106个细胞/ml和对于骨髓细胞2x106个细胞/ml的浓度。利用来自mabtech的elispot
basic
试剂盒(#3850-2hw-plus)将总igg分泌细胞计数。简单地说，将pbmc或骨髓细胞以特定浓度(5x105/孔的pbmc和2x105/孔的骨髓细胞)添加至一式三份的孔中，然后将细胞在板中系列稀释。温育过夜之后，将板洗涤并添加生物素化的检测抗体。将板温育2小时并添加链霉抗生物素蛋白-hrp 1小时。利用tmb底物溶液使igg斑点可见，并且利用immunospot成像分析系统(ctl)和immunospot 5.1软件计数。数据表示为来自一式三份样品的igg分泌细胞的平均( /-sd)数量。
[0565]
所得的pbmc和骨髓中的igg分泌细胞计数分别在表14a和14b中示出。与剂量前相比在pbmc中以及与媒介物和阴性对照相比在骨髓中对抗bcma/cd3双特异性抗体均观察到igg分泌细胞的消耗。在骨髓中观察到剂量依赖性效应。
[0566]
表14a
[0567][0568]
表14b
[0569]
骨髓第10天
媒介物2614，80930.1mg/kg combo_rd4_0.6nm_c2935，180.3mg/kg combo_rd4_0.6nm_c2935，220.1mg/kg a02_rd4_0.6nm_c01996，9600.3mg/kg a02_rd4_0.6nm_c012170，930.3mg/kg nnc_2b41d5980，2893
[0570]
实施例18：抗bcma/cd3双特异性在mm1.s肿瘤模型中诱导肿瘤消退和抑制。
[0571]
这个实施例说明原位mm1.s骨髓瘤模型中的肿瘤消退和抑制。
[0572]
用表达萤光素酶和gfp的原位模型mm1.s进行bcma双特异性的体内效力研究。在肿瘤细胞注射前一天，利用rs 2000生物研究辐照器(rad source technolgies，ga)将小鼠用100cgy辐照。将5
×
106个mm1.s lucgfp细胞通过尾静脉静脉内注射入6-8周龄雌性nod/scid/il2rg-/-(nsg)动物。腹腔内注射d-萤光素(regis technologies，morton grove，il)(15mg/ml，200ul/动物)，然后用异氟烷麻醉随后全身生物发光成像(bli)使得能够监测肿瘤负荷。通过利用ivis spectrμm ct(perkin elmer，ma)成像捕获肿瘤细胞表达的萤光素酶和萤光素之间的相互作用发出的生物发光信号并利用living image 4.4(caliper life sciences，alameda，ca)定量为总通量(光子/sec)。当对于所有动物总通量达到平均15e6时，将动物通过团尾静脉注射2
×
107个扩增的来自pbmc的t细胞。简单地说，将购自allcells(alameda，ca)的pan-t细胞用人t细胞激活/扩增试剂盒(miltenyi，san diego，ca)激活。3天之后，每两天添加15u/ml的il2(ebioscience，san diego，ca)直至第11天。收获细胞，磁性去除激活/扩增珠，并且将细胞洗涤并重悬于pbs中。t细胞注射后一天，如上文所述将小鼠成像，并且将动物随机分为7组；0.03mg/kg和0.3mg/kg的a02_rd4_0.6nm_c01以及0.03mg/kg、0.1mg/kg和0.3mg/kg的combo_rd4_0.6nm_c29。将单一剂量的人抗bcma/cd3(h2b4-vh-wt vl_tk)双特异性和阴性(nnc)对照双特异性抗体通过团尾静脉注射施用。当它们表现出后肢瘫痪时将动物处死，这是mm1.s原位模型的终点。图12显示单一剂量的人抗bcma/cd3双特异性抗体以剂量依赖性方式导致肿瘤消退。
[0573]
实施例19：两个剂量的抗bcma/cd3双特异性在侵袭性molp8肿瘤模型中诱导模型消退
[0574]
这个实施例说明在原位molp8骨髓瘤模型中用两个剂量的抗bcma/cd3双特异性抗体肿瘤消退。
[0575]
用表达萤光素酶和gfp的原位模型molp8进行bcma双特异性的体内效力研究。将2
×
106个molp8 lucgfp细胞通过尾静脉静脉内注射入6-8周龄雌性nsg动物。腹腔内注射d-萤光素(regis technologies，morton grove，il)(15mg/ml，200ul/动物)，然后用异氟烷麻醉随后全身生物发光成像(bli)使得能够监测肿瘤负荷。通过利用ivis spectrμm ct(perkin elmer，ma)成像捕获肿瘤细胞表达的萤光素酶和萤光素之间的相互作用发出的生物发光信号并利用living image 4.4(caliper life sciences，alameda，ca)定量为总通量(光子/sec)。当对于所有动物总通量达到平均25e6时，随机分为3组(7只小鼠)；1)combo_rd4_0.6nm_c29，0.3mg/kg，2)combo_rd4_0.6nm_c29，0.3mg/kg，两个剂量，以及3)nnc_2b4，0.3mg/kg，两个剂量。如实施例18所述将动物通过团尾静脉用2
×
107个扩增的t细胞注射。t细胞注射后2天，将小鼠用双特异性抗体剂量施用。当它们表现出体重减轻超过15％时将动
物处死，这是molp8原位模型的终点。图13显示两个剂量的人抗bcma/cd3(h2b4-vh-wt vl_tk)双特异性抗体导致增加的肿瘤消退。
[0576]
实施例20：在原位molp8肿瘤模型中抗bcma/cd3双特异性与多发性骨髓瘤的护理标准组合
[0577]
这个实施例证实当与硼替佐米或来那度胺组合时对抗bcma/cd3双特异性抗体没有相反影响以及与组合的硼替佐米和来那度胺相比用抗bcma/cd3双特异性抗体更好的效力。
[0578]
用表达萤光素酶和gfp的原位模型molp8进行bcma双特异性的体内效力研究。将2
×
106个molp8 lucgfp细胞通过尾静脉静脉内注射入6-8周龄雌性nsg动物。腹腔内注射d-萤光素(regis technologies，morton grove，il)(15mg/ml，200ul/动物)，然后用异氟烷麻醉随后全身生物发光成像(bli)使得能够监测肿瘤负荷。通过利用ivis spectrμm ct(perkin elmer，ma)成像捕获肿瘤细胞表达的萤光素酶和萤光素之间的相互作用发出的生物发光信号并利用living image 4.4(caliper life sciences，alameda，ca)定量为总通量(光子/sec)。如实施例18所述将动物通过团尾静脉在第7天用2
×
107个扩增的t细胞注射。t细胞注射后2天，将小鼠成像并随机分为具有平均17e6总通量/组的5组(7只小鼠)：1)combo_rd4_0.6nm_c29，0.3mg/kg，2)combo_rd4_0.6nm_c29，0.3mg/kg和1mg/kg硼替佐米，3)combo_rd4_0.6nm_c29，0.3mg/kg和50mg/kg来那度胺，4)1mg/kg硼替佐米和50mg/kg来那度胺，以及5)媒介物。抗bcma/cd3(在pbs中)通过团尾静脉注射，硼替佐米(在pbs中)通过腹腔内注射施用，而来那度胺(30％peg400/5％丙二醇/0.5％tween80)通过口服管饲法。媒介物由30％peg400/5％丙二醇/0.5％tween80组成，其通过口服管饲法施用。当它们表现出体重减轻超过15％时将动物处死，这是molp8原位模型的终点。图14显示组合抗bcma/cd3(h2b4-vh-hnps vl-tk)双特异性抗体与硼替佐米或来那度胺对抗bcma/cd3双特异性抗体的效力没有负面影响。在这个模型中，抗bcma/cd3双特异性抗体单独或者与来那度胺或硼替佐米组合物比组合的来那度胺和硼替佐米更有效。
[0579]
实施例21：抗bcma/cd3双特异性与来那度胺、卡非佐米或多柔比星组合在opm2细胞系上的体外研究
[0580]
这个实施例说明与单独双特异性抗体相比，当与卡非佐米、多柔比星和来那度胺组合时抗bcma/cd3双特异性抗体活性对t细胞功能没有不利影响。
[0581]
利用pan t细胞分离试剂盒，人(miltenyi，san diego ca)负选择来自pbmc的cd3 t细胞。将opm2细胞和cd3 t-细胞分别以20000和100000个细胞/孔接种在透明的u-底板中。将opm2和cd3 t细胞首先用护理标准在37
°
下温育2小时。将1.56nm卡非佐米和6.25nm多柔比星在包含0.02％dmso的pbs中稀释。将来那度胺在包含0.1％dmso的pbs中稀释至195nm。将细胞用10-倍系列稀释的双特异性抗体处理。处理之后3天，利用cd138、cd4和cd8的抗体(biolegend)通过流式细胞术确定总活细胞。将细胞用抗体在4
°
下于pbs 0.5％fbs中温育30分钟。将细胞洗涤，并且将pbs中的fixable viability dye efluor 780(ebioscience，inc.，ca)添加至细胞在4
°
下30分钟。在bd流式细胞仪上细胞采集之前，将细胞洗涤并添加countbright绝对计数珠(molecular probes，or)。活细胞百分比利用计数珠确定为处理vs未处理孔中的活细胞计数。图15a、15b和15c分别显示在opm2细胞上卡非佐米、来那度胺和多柔比星对combo_rd4_0.6nm_c29-cd3(h2b4-vh-hnps vl-tk)双特异性抗
体的功能没有负面影响。
[0582]
实施例22：抗bcma/cd3双特异性与来那度胺和卡非佐米组合在kms12bm细胞系上的体外研究
[0583]
这个实施例说明与单独每种分子相比，当与卡非佐米和来那度胺组合时对抗bcma/cd3双特异性功能的协同效应。
[0584]
利用pan t细胞分离试剂盒，人(miltenyi，san diego ca)负选择来自pbmc的cd3 t细胞。将kms12bm细胞和cd3 t-细胞分别以20000和100000个细胞/孔接种在透明的u-底板中。将细胞用0.017nm抗bcma/cd3双特异性与卡非佐米和一定浓度范围的来那度胺组合处理。在包含0.02％dmso的pbs中稀释1.25nm卡非佐米。在包含0.1％dmso的pbs中稀释来那度胺，从4μm开始4-倍稀释。处理之后3天，利用cd138、cd4和cd8的抗体(biolegend，ca)通过流式细胞术确定总活细胞。将细胞用抗体在4
°
下于pbs 0.5％fbs中温育30分钟。将细胞洗涤，并且将pbs中的fixable viability dye efluor 780(ebioscience，inc.，ca)添加至细胞在4℃下30分钟。在bd流式细胞仪上细胞采集之前，将细胞洗涤并添加countbright绝对计数珠(molecular probes，or)。活细胞百分比利用计数珠确定为处理对未处理孔中的活细胞计数。图16显示在测试的浓度，卡非佐米、来那度胺和抗bcma/cd3(h2b4-vh-hnps vl-tk)双特异性抗体具有非常少的单一试剂细胞毒性功能。当将全部3种试剂组合时，在kms12bm细胞中在剂量依赖性来那度胺浓度观察到协同效应。
[0585]
虽然已参考各种应用、方法、试剂盒和组合物描述所公开的教学，但是应当理解可以在不背离本教学和以下要求保护的发明的情况下进行各种变化和修改。提供以上实施例以更好地说明所公开的教学，并且不是为了限制本文所提供的教学的范围。虽然已根据这些示例性实施方案描述本教学，但是技术人员会很容易理解这些示例性实施方案的许多变化和修改是可能的，无需过多实验。所有这类变化和修改均在本教学的范围内。
[0586]
本文所引用的全部文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等以及本文所引用的参考文献整体援引加入本文。在一篇或多篇加入的文献和相似材料(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所述技术等)与本技术不同或相冲突的情况下，以本技术为准。
[0587]
上文的描述和实施例详述本发明的某些具体实施方案并描述发明人预期的最佳模式。然而，应当理解无论在文中出现多么详细的描述，本发明可以许多方式实施，且本发明应当根据所附权利要求及其任何等价方式来理解。