一种提高
γ-聚谷氨酸产量的液体发酵方法
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种提高γ-聚谷氨酸产量的液体发酵方法。
背景技术：
2.γ-聚谷氨酸由d-和l-谷氨酸单元组成，它们通过γ-酰胺键聚合。由于γ-聚谷氨酸主链中存在许多游离羧基，因此具有优异的吸水性和保湿性。此外，这种分子是可生物降解的且无毒的。因此，γ-聚谷氨酸已被开发用于各种潜在的工业应用，例如水凝胶、絮凝剂、增稠剂、分散剂、药物输送、化妆品和饲料添加剂。传统提高γ-聚谷氨酸产量的方法是通过改变发酵培养基，筛选新菌种。改变发酵培养基方法提高幅度有限，筛选新菌种方法费时费力。而本发明另辟蹊径。通过不同菌种混合培养方式提高γ-聚谷氨酸产量从没报道过的。
技术实现要素：
3.本发明的目的是提供一种不同菌混合培养方式提高γ-聚谷氨酸产量的方法，是将枯草芽孢杆菌菌液添加入副地衣芽孢杆菌发酵液中，使γ-聚谷氨酸产量提高。
4.优选的，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332；所述的副地衣芽孢杆菌为副地衣芽孢杆菌bacillus paralicheniformis atcc 9945a。
5.优选的，所述的方法包括以下步骤：将副地衣芽孢杆菌bacillus paralicheniformis atcc9945a接入发酵培养基中发酵7-56h，然后加入枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332菌液继续发酵16-113h。
6.优选的，所述的发酵培养基每升含有：柠檬酸12g、甘油80g、l-谷氨酸20g、氯化铵7g、磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、二水氯化钙0.15g和一水硫酸锰0.104g，余量为水，ph 6.5。
7.优选的，所述的枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332菌液接入发酵培养基中的接种量为体积分数1-10％。
8.本发明的枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332和副地衣芽孢杆菌bacillus paralicheniformis atcc 9945a均为市售产品，购买于北京中原合聚经贸有限公司。
9.本发明还提供上述的液体发酵方法在提高γ-聚谷氨酸产量中的应用。
10.本发明通过不同菌的混合培养，利用枯草芽孢杆菌来提高副地衣芽孢杆菌产γ-聚谷氨酸的产量，该方法比只有副地衣芽孢杆菌纯种的发酵γ-聚谷氨酸的产量提高30-89％。这种发酵γ-聚谷氨酸的方法有别于传统纯种的发酵方法。
具体实施方式
11.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
12.以下实施例中的枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332和副地衣芽孢杆菌bacillus paralicheniformis atcc 9945a均为市售产品，购买于北京中原合聚经贸有限公司。
13.实施例1：
14.菌种的活化：将副地衣芽孢杆菌bacillus paralicheniformis atcc 9945a菌种和枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332菌种分别接种在固体培养基斜面上，37℃培养16～24h，得到活化的菌种。所述的固体培养基的成分：蛋白胨10g/l，牛肉膏3g/l，氯化钠5g/l，琼脂20g/l，余量为水，ph 7.0～7.2；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
15.副地衣芽孢杆菌种子液的制备：取2环上述活化的副地衣芽孢杆菌菌种，接入装有50ml发酵培养基的300ml三角瓶中，37℃，100rpm振荡培养18h，得到副地衣芽孢杆菌种子液。所述的发酵培养基的成分：柠檬酸12g/l，甘油80g/l，l-谷氨酸20g/l，氯化铵7g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水硫酸镁0.5g/l，二水氯化钙0.15g/l，一水硫酸锰0.104g/l，六水氯化铁0.04g/l，余量为水，调ph为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
16.枯草芽孢杆菌种子液的制备：取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50ml培养基的300ml三角瓶中，37℃，100rpm振荡培养16h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的培养基的成分：蛋白胨10g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，余量为水，ph7.0；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
17.液体摇瓶发酵：发酵培养基分装50ml入300ml三角瓶，将副地衣芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数10％接入到发酵培养基中，发酵温度37℃，在摇床振荡培养7h，摇床转速200r/min。再将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5％接入到上述发酵培养基中，继续发酵。发酵温度37℃，在摇床振荡培养113h，摇床转速200r/min。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为33.34g/l。
18.实施例2：
19.菌种的活化和副地衣芽孢杆菌种子液的制备步骤与实施例1相同。
20.枯草芽孢杆菌种子液的制备：取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50ml培养基的300ml三角瓶中，37℃，100rpm振荡培养16h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的培养基的成分：蛋白胨10g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，余量为水，ph7.0；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
21.液体摇瓶发酵：发酵培养基分装50ml入300ml三角瓶，将副地衣芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数1％接入到发酵培养基中，发酵温度37℃，在摇床振荡培养56h，摇床转速100r/min。再将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数1％接入到上述发酵培养基中，继续发酵。发酵温度37℃，在摇床振荡培养16h，摇床转速100r/min。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为35.24g/l。
22.实施例3：
23.菌种的活化和副地衣芽孢杆菌种子液的制备步骤与实施例1相同。
24.枯草芽孢杆菌种子液的制备：取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50ml培养基的300ml三角瓶中，37℃，200rpm振荡培养24h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的培
养基的成分：蛋白胨10g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，余量为水，ph7.0；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
25.液体摇瓶发酵：发酵培养基分装50ml入300ml三角瓶，将副地衣芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5％接入到发酵培养基中，发酵温度37℃，在摇床振荡培养27h，摇床转速250r/min。再将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数10％接入到上述发酵培养基中，继续发酵。发酵温度37℃，在摇床振荡培养48h，摇床转速200r/min。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为43.77g/l。
26.实施例4：
27.菌种的活化和副地衣芽孢杆菌种子液的制备步骤与实施例1相同。
28.枯草芽孢杆菌种子液的制备：取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50ml培养基的300ml三角瓶中，37℃，200rpm振荡培养30h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的培养基的成分：所述的培养基的成分：蛋白胨10g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，余量为水，ph7.0；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
29.液体摇瓶发酵：发酵培养基分装50ml入300ml三角瓶，将副地衣芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5％接入到发酵培养基中，发酵温度37℃，在摇床振荡培养48h，摇床转速200r/min。再将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5％接入到上述发酵培养基中，继续发酵。发酵温度37℃，在摇床振荡培养24h，摇床转速200r/min。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为48.39g/l。
30.对比例1：
31.菌种的活化和副地衣芽孢杆菌种子液的制备步骤与实施例1相同。
32.液体摇瓶发酵：发酵培养基分装50ml入300ml三角瓶，将副地衣芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数10％接入到发酵培养基中，发酵温度37℃，在摇床振荡培养120h，摇床转速200r/min。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为25.66g/l。
33.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
γ-聚谷氨酸产量的液体发酵方法
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种提高γ-聚谷氨酸产量的液体发酵方法。
背景技术：
2.γ-聚谷氨酸由d-和l-谷氨酸单元组成，它们通过γ-酰胺键聚合。由于γ-聚谷氨酸主链中存在许多游离羧基，因此具有优异的吸水性和保湿性。此外，这种分子是可生物降解的且无毒的。因此，γ-聚谷氨酸已被开发用于各种潜在的工业应用，例如水凝胶、絮凝剂、增稠剂、分散剂、药物输送、化妆品和饲料添加剂。传统提高γ-聚谷氨酸产量的方法是通过改变发酵培养基，筛选新菌种。改变发酵培养基方法提高幅度有限，筛选新菌种方法费时费力。而本发明另辟蹊径。通过不同菌种混合培养方式提高γ-聚谷氨酸产量从没报道过的。
技术实现要素：
3.本发明的目的是提供一种不同菌混合培养方式提高γ-聚谷氨酸产量的方法，是将枯草芽孢杆菌菌液添加入副地衣芽孢杆菌发酵液中，使γ-聚谷氨酸产量提高。
4.优选的，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332；所述的副地衣芽孢杆菌为副地衣芽孢杆菌bacillus paralicheniformis atcc 9945a。
5.优选的，所述的方法包括以下步骤：将副地衣芽孢杆菌bacillus paralicheniformis atcc9945a接入发酵培养基中发酵7-56h，然后加入枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332菌液继续发酵16-113h。
6.优选的，所述的发酵培养基每升含有：柠檬酸12g、甘油80g、l-谷氨酸20g、氯化铵7g、磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、二水氯化钙0.15g和一水硫酸锰0.104g，余量为水，ph 6.5。
7.优选的，所述的枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332菌液接入发酵培养基中的接种量为体积分数1-10％。
8.本发明的枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332和副地衣芽孢杆菌bacillus paralicheniformis atcc 9945a均为市售产品，购买于北京中原合聚经贸有限公司。
9.本发明还提供上述的液体发酵方法在提高γ-聚谷氨酸产量中的应用。
10.本发明通过不同菌的混合培养，利用枯草芽孢杆菌来提高副地衣芽孢杆菌产γ-聚谷氨酸的产量，该方法比只有副地衣芽孢杆菌纯种的发酵γ-聚谷氨酸的产量提高30-89％。这种发酵γ-聚谷氨酸的方法有别于传统纯种的发酵方法。
具体实施方式
11.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
12.以下实施例中的枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332和副地衣芽孢杆菌bacillus paralicheniformis atcc 9945a均为市售产品，购买于北京中原合聚经贸有限公司。
13.实施例1：
14.菌种的活化：将副地衣芽孢杆菌bacillus paralicheniformis atcc 9945a菌种和枯草芽孢杆菌bacillus subtilis atcc 21332菌种分别接种在固体培养基斜面上，37℃培养16～24h，得到活化的菌种。所述的固体培养基的成分：蛋白胨10g/l，牛肉膏3g/l，氯化钠5g/l，琼脂20g/l，余量为水，ph 7.0～7.2；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
15.副地衣芽孢杆菌种子液的制备：取2环上述活化的副地衣芽孢杆菌菌种，接入装有50ml发酵培养基的300ml三角瓶中，37℃，100rpm振荡培养18h，得到副地衣芽孢杆菌种子液。所述的发酵培养基的成分：柠檬酸12g/l，甘油80g/l，l-谷氨酸20g/l，氯化铵7g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水硫酸镁0.5g/l，二水氯化钙0.15g/l，一水硫酸锰0.104g/l，六水氯化铁0.04g/l，余量为水，调ph为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
16.枯草芽孢杆菌种子液的制备：取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50ml培养基的300ml三角瓶中，37℃，100rpm振荡培养16h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的培养基的成分：蛋白胨10g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，余量为水，ph7.0；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
17.液体摇瓶发酵：发酵培养基分装50ml入300ml三角瓶，将副地衣芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数10％接入到发酵培养基中，发酵温度37℃，在摇床振荡培养7h，摇床转速200r/min。再将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5％接入到上述发酵培养基中，继续发酵。发酵温度37℃，在摇床振荡培养113h，摇床转速200r/min。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为33.34g/l。
18.实施例2：
19.菌种的活化和副地衣芽孢杆菌种子液的制备步骤与实施例1相同。
20.枯草芽孢杆菌种子液的制备：取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50ml培养基的300ml三角瓶中，37℃，100rpm振荡培养16h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的培养基的成分：蛋白胨10g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，余量为水，ph7.0；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
21.液体摇瓶发酵：发酵培养基分装50ml入300ml三角瓶，将副地衣芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数1％接入到发酵培养基中，发酵温度37℃，在摇床振荡培养56h，摇床转速100r/min。再将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数1％接入到上述发酵培养基中，继续发酵。发酵温度37℃，在摇床振荡培养16h，摇床转速100r/min。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为35.24g/l。
22.实施例3：
23.菌种的活化和副地衣芽孢杆菌种子液的制备步骤与实施例1相同。
24.枯草芽孢杆菌种子液的制备：取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50ml培养基的300ml三角瓶中，37℃，200rpm振荡培养24h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的培
养基的成分：蛋白胨10g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，余量为水，ph7.0；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
25.液体摇瓶发酵：发酵培养基分装50ml入300ml三角瓶，将副地衣芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5％接入到发酵培养基中，发酵温度37℃，在摇床振荡培养27h，摇床转速250r/min。再将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数10％接入到上述发酵培养基中，继续发酵。发酵温度37℃，在摇床振荡培养48h，摇床转速200r/min。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为43.77g/l。
26.实施例4：
27.菌种的活化和副地衣芽孢杆菌种子液的制备步骤与实施例1相同。
28.枯草芽孢杆菌种子液的制备：取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50ml培养基的300ml三角瓶中，37℃，200rpm振荡培养30h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的培养基的成分：所述的培养基的成分：蛋白胨10g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，余量为水，ph7.0；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，然后灭菌备用。
29.液体摇瓶发酵：发酵培养基分装50ml入300ml三角瓶，将副地衣芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5％接入到发酵培养基中，发酵温度37℃，在摇床振荡培养48h，摇床转速200r/min。再将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5％接入到上述发酵培养基中，继续发酵。发酵温度37℃，在摇床振荡培养24h，摇床转速200r/min。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为48.39g/l。
30.对比例1：
31.菌种的活化和副地衣芽孢杆菌种子液的制备步骤与实施例1相同。
32.液体摇瓶发酵：发酵培养基分装50ml入300ml三角瓶，将副地衣芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数10％接入到发酵培养基中，发酵温度37℃，在摇床振荡培养120h，摇床转速200r/min。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为25.66g/l。
33.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
