一种用于颅骨修复的生物活性SBS材料及其制备方法和应用

一种用于颅骨修复的生物活性sbs材料及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于颅骨生物材料及组织工程领域，具体涉及一种用于颅骨修复的生物活性sbs材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.颅内恶性肿瘤、外伤性脑损伤、大面积脑梗死或中风、先天性颅骨畸形等神经性疾病引起的颅内切除术容易造成颅骨缺损，使脑组织失去保护。且患者若在开颅手术后未进行颅骨成形术治疗容易出现严重的并发症，如神经功能障碍、脑变形以及致命的脑脊液渗漏，这严重了影响患者的生活。因此，颅内切除术后通常需要进行颅骨修补，随之带来的是颅骨缺损重建的难题。
3.自体移植材料主要包括自体颅骨和人体其余部位的骨瓣，被认为是颅骨修补术的最适成形材料。但从人体髂骨、肋骨、胸骨等部位切除骨瓣时会导致供区发病，引起继发性损伤问题的限制。且取出体外后自体骨存在保存难和伦理问题，故来自自体的骨瓣并不可取。
4.相比之下，异种合成材料作为人工颅骨，由于具有手术时间短、无供体部位发病率、易于获取、批次一致性好和无伦理问题等优点而受到广泛关注。目前，钛网、羟基磷灰石(ha)、氧化铝陶瓷、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)和聚醚醚酮(peek)是常见的合成颅骨修补材料。尽管这些材料已成功应用于颅骨成形术，但在临床上仍存在一定的问题。感染控制能力差和骨整合能力不足是其主要问题。其它缺点，如高成本、高3d打印温度(对于peek)、导热性(对于钛网)、脆性(对于ha和氧化铝陶瓷)和放热燃烧反应(对于pmma)也在一定程度上阻碍了它们的发展。
5.同时，值得注意的是颅骨成形术后存在2类主要并发症，其一是手术部位感染，感染率高达33％。一般而言，感染与生物膜的形成高度相关。生物膜是粘附在伤口或植入物表面的聚集细菌群，其对抗生素的耐药性比浮游细菌高10到1000倍，这正是生物膜感染相关疾病难以治疗的关键所在。因此，内在的抗菌特性对于植入物防止感染和控制早期感染至关重要。其二是骨整合不良，移位风险的增加与其紧密相关。因而，亟需开发一种具有生物活性的sbs颅骨成形材料。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于颅骨修复的生物活性sbs材料及其制备方法和应用，本发明制备得到的sbs材料具有良好的杀菌效果和促进成骨基因表达和矿化能力，可有效解决现存颅骨修补材料所存在的感染控制能力差和骨整合能力不足等问题。
7.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
8.一种用于颅骨修复的生物活性sbs材料的制备方法，包括：在sbs(聚(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯))基底上共价连接醛改性后的季铵盐壳聚糖，然后再在其表面固定聚多巴胺改
性沸石咪唑酯骨架-8和聚多巴胺改性羟基磷灰石即可。
9.进一步地，季铵盐壳聚糖的制备方法如下：
10.将5g cs(壳聚糖)溶于180ml去离子水中，随后滴加900μl乙酸溶液(0.5％v/v)，并在55℃下搅拌1h；滴加5795μl氯化缩水甘油三甲基铵到上述混合液中，并在55℃下反应18h；反应结束后，以4500r/min的速度离心溶液20min，然后将上清液进行过滤处理，并将滤液在乙醇/丙酮混合液(1:1，v/v)中进行醇沉；最后将沉淀在室温下于真空干燥箱中干燥3d得到qcs(季铵盐壳聚糖)。
11.进一步地，季铵盐壳聚糖采用天然醛类化合物进行改性。
12.进一步地，天然醛类化合物为原儿茶醛、紫苏醛或香草醛等，其改性过程为：
13.称取0.5g的qcs溶于40ml mes溶液(ph＝5.5)中，搅拌过夜；将1g原儿茶醛溶于30ml水/甲醇混合液(2:1，v/v)中，室温下搅拌3.5h，然后将溶液加入到上述qcs溶液中；将250mg nabh4缓慢加入到混合液中直到没有气泡产生，并将溶液ph值调为5.5，搅拌过夜；反应结束后，将得到的产物放入透析袋中(mwco 3500)，并在酸性水溶液中(ph 5.0,hcl)透析2d，最后冷冻干燥即可得到qcsc(原儿茶醛改性季铵盐壳聚糖)。
14.进一步地，sbs基底上共价连接改性后的季铵盐壳聚糖的过程为：
15.(1)将sbs基底置于硅烷偶联剂中，经等离子表面处理后清洗，制得sbs-si基底；
16.(2)将sbs-si基底置于原儿茶醛改性季铵盐壳聚糖溶液中，于50～70℃浸泡30～50h即可。
17.进一步地，硅烷偶联剂为三甲氧基硅烷(gptms)或kh560等。
18.进一步地，原儿茶醛改性季铵盐壳聚糖溶液的浓度为0.5～2mg/ml。
19.进一步地，sbs基底由直径为1.75mm的sbs细丝经3d打印制成。
20.进一步地，3d打印时使用的3d打印机为自制设备，其喷头温度为210℃，床温为110℃。
21.进一步地，聚多巴胺改性沸石咪唑酯骨架-8的制备方法为：
22.将2-甲基咪唑加入至乙酸锌溶液中，再加入盐酸多巴胺，搅拌反应4～6h后，以10000～14000r/min的速度离心10～15min，收集并洗涤固相产物，再于60～80℃干燥即可。
23.进一步地，乙酸锌溶液2-甲基咪唑的终浓度为1～2m；盐酸多巴胺加入后的终浓度为0.5～2mg/ml。
24.进一步地，聚多巴胺改性羟基磷灰石的制备过程为：
25.(1)将ca(no3)2·
4h2o溶液和(nh4)2hpo4溶液混合，调节其ph值为10后，于70～80℃下搅拌反应4～6h；反应结束后静置24h，收集并洗涤固相产物，然后过滤后冷冻干燥20～30h，再将其置于300～400℃煅烧2～5h，最后使用100～200目筛子进行筛选，即可获得纳米羟基磷灰石；
26.(2)将纳米羟基磷灰石溶液与盐酸多巴胺溶液混合，搅拌4～6h后，以10000～14000r/min的速度离心10～15min，收集并洗涤固相产物，再于60～80℃干燥即可。
27.进一步地，纳米羟基磷灰石溶液与盐酸多巴胺溶液的体积比为1:1；其中，纳米羟基磷灰石溶液中纳米羟基磷灰石的含量为10～15mg/ml，盐酸多巴胺溶液中盐酸多巴胺的含量为10～15mg/ml。
28.进一步地，ca(no3)2·
4h2o溶液和(nh4)2hpo4溶液的浓度均为0.5m，且两者混合时
的体积比为1.67。
29.上述方法制备得到的用于颅骨修复的生物活性sbs材料。
30.上述生物活性sbs材料在制备颅骨形成材料中的应用。
31.本发明的有益效果：
32.1、本发明采用聚(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)制备颅骨修补材料的基底，可有效解决基于钛网、聚醚醚酯、聚甲基丙烯酸甲酯的颅骨修补材料，价格昂贵、不耐冲击、环境温度对大脑热冲击等问题。
33.2、本发明利用原儿茶醛改性季铵盐壳聚糖、聚多巴胺改性沸石咪唑酯骨架、聚多巴胺改性羟基磷灰石作为原料，其中，原儿茶醛改性季铵盐壳聚糖赋予了材料良好的杀菌性能；而聚多巴胺改性沸石咪唑酯骨架、聚多巴胺改性羟基磷灰石则为促进材料抗菌、促骨分化和矿化性能的成分。
附图说明
34.图1为sbs、sbs-qcsc、pha/pzif-8@sbs-qcsc基底的图片；
35.图2为sbs、sbs-qcsc、pha/pzif-8@sbs-qcsc基底的红外光谱图.；
36.图3为生物活性sbs材料的抗菌活性sem实验结果图；
37.图4为生物活性sbs材料的促成骨分化能力实验结果图。
具体实施方式
38.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
39.实施例1
40.一种生物活性sbs颅骨形成材料的制备方法，包括以下步骤：
41.(1)制备原儿茶醛改性季铵盐壳聚糖
42.s1、将5g cs溶于180ml去离子水中，随后滴加900μl乙酸溶液(0.5％v/v)，并在55℃条件下搅拌1h。接着滴加5795μl氯化缩水甘油三甲基铵到上述混合液中，并在55℃下反应18h。之后以4500r/min的速度离心混合液20min，并将得到的上清液进行过滤处理，过滤后的溶液在乙醇/丙酮(1:1，v/v)混合溶液中进行醇沉。最后将得到的沉淀在室温下于真空干燥箱中干燥3d得到qcs。
43.s2、称取500mg qcs溶于40ml mes溶液(ph＝5.5)中，搅拌过夜。将1g原儿茶醛溶于30ml水/甲醇(2:1，v/v)混合液中，并在室温条件下搅拌3.5h，然后将溶液加入到上述qcs溶液中。将250mg nabh4缓慢加入到混合液中直到没有气泡产生。将溶液ph值调为5.5并搅拌过夜。反应结束后，将得到的产物放入透析袋中(mwco 3500)并在酸性水溶液中(ph 5.0,hcl)连续透析2d，最后冷冻干燥即可得到qcsc。
44.(2)制备聚多巴胺改性沸石咪唑酯骨架-8
45.将2-甲基咪唑(2m)加入到以tris-缓冲液(10mm，ph＝8.5)作为溶剂的乙酸锌溶液(0.08m)中，然后以最终浓度为1mg/ml立即将盐酸多巴胺加入到混合液中，并在搅拌下反应
4h。将得到的pzif-8悬浮液以10000r/min的速度离心10min。之后将得到的沉淀洗涤3次，并在60℃干燥12h，即可得到pzif-8纳米颗粒。
46.(3)制备聚多巴胺改性羟基磷灰石
47.s1、将浓度均为0.5m的ca(no3)2·
4h2o溶液和(nh4)2hpo4溶液以1.67的体积比混合，并用nh3·
h2o将混合液的ph值调为10，之后在70℃下搅拌反应4h。反应结束后，将悬浮液静置24h，并将得到的沉淀洗涤3次，过滤后冷冻干燥24h。将沉淀物在300℃下煅烧2h，并使用200目筛子进行筛选，即可获得纳米羟基磷灰石。
48.s2、将10ml含上述制备的纳米羟基磷灰石(100mg)的tris-缓冲液(10mm)和10ml含盐酸多巴胺(100mg)的tris-缓冲液(10mm)混合并搅拌4h以获得pha悬浮液。将悬浮液以10000r/min速度离心10min，并将得到的沉淀洗涤3次，然后在60℃下干燥12h，得到pha纳米颗粒。
49.(4)制备sbs基底
50.将sbs制备成直径为1.75mm的细丝，然后通过3d打印进行加工。将得到的打印产品用乙醇冲洗3次，并在40℃下干燥2h即可得到3d打印的sbs基底。
51.(5)制备生物活性sbs材料
52.s1、将sbs基底(21mm
×
21mm
×
1mm)置于100μl gptms中，并用等离子体清洗机处理7min。将处理后的基底用乙醇和水交替冲洗3次得到sbs-si基底。将qcsc溶于mes溶液中，其最终浓度为1mg/ml。然后在55℃下将上述sbs-si基底在qcsc溶液(ph 5.5)中浸泡36h得到sbs-qcsc基底。
53.s2、将sbs-qcsc基底在pha悬浮液中浸泡40min，接着在pzif-8悬浮液中浸泡40min，期间用tris-缓冲液(10mm)洗涤sbs-qcsc基底3次。前述步骤重复3次循环后，对基底进行最后一次冲洗，即可得到生物活性sbs颅骨成形材料(pha/pzif-8@sbs-qcsc基底)。
54.实施例2
55.一种生物活性sbs颅骨形成材料的制备方法，包括以下步骤：
56.(1)制备原儿茶醛改性季铵盐壳聚糖
57.s1、将5g cs溶于180ml去离子水中，随后滴加900μl乙酸溶液(0.5％v/v)，并在55℃条件下搅拌1h。接着滴加5795μl氯化缩水甘油三甲基铵到上述混合液中，并在55℃下反应18h。之后以4500r/min的速度离心混合液20min，并将得到的上清液进行过滤处理，过滤后的溶液在乙醇/丙酮(1:1，v/v)混合溶液中进行醇沉。最后将得到的沉淀在室温下于真空干燥箱中干燥3d得到qcs。
58.s2、称取500mg qcs溶于40ml mes溶液(ph＝5.5)中，搅拌过夜。将1g原儿茶醛溶于30ml水/甲醇(2:1，v/v)混合液中，并在室温条件下搅拌3.5h，然后将溶液加入到上述qcs溶液中。将250mg nabh4缓慢加入到混合液中直到没有气泡产生。将溶液ph值调为5.5并搅拌过夜。反应结束后，将得到的产物放入透析袋中(mwco 3500)并在酸性水溶液中(ph 5.0,hcl)连续透析2d，最后冷冻干燥即可得到qcsc。
59.(2)制备聚多巴胺改性沸石咪唑酯骨架-8
60.将2-甲基咪唑(2m)加入到以tris-缓冲液(10mm，ph＝8.5)作为溶剂的乙酸锌溶液(0.08m)中，然后以最终浓度为0.5mg/ml立即将盐酸多巴胺加入到混合液中，并在搅拌下反应4h。将得到的pzif-8悬浮液以10000r/min的速度离心10min。之后将得到的沉淀洗涤3次，
并在60℃干燥12h，即可得到pzif-8纳米颗粒。
61.(3)制备聚多巴胺改性羟基磷灰石
62.s1、将浓度均为0.5m的ca(no3)2·
4h2o溶液和(nh4)2hpo4溶液以1.67的体积比混合，并用nh3·
h2o将混合液的ph值调为10，之后在70℃下搅拌反应4h。反应结束后，将悬浮液静置24h，并将得到的沉淀洗涤3次，过滤后冷冻干燥24h。将沉淀物在300℃下煅烧2h，并使用200目筛子进行筛选，即可获得纳米羟基磷灰石。
63.s2、将10ml含上述制备的纳米羟基磷灰石(100mg)的tris-缓冲液(10mm)和10ml含盐酸多巴胺(150mg)的tris-缓冲液(10mm)混合并搅拌4h以获得pha悬浮液。将悬浮液以10000r/min速度离心10min，并将得到的沉淀洗涤3次，然后在60℃下干燥12h，得到pha纳米颗粒。
64.(4)制备sbs基底
65.将sbs制备成直径为1.75mm的细丝，然后通过3d打印进行加工。将得到的打印产品用乙醇冲洗3次，并在40℃下干燥2h即可得到3d打印的sbs基底。
66.(5)制备生物活性sbs材料
67.s1、将sbs基底(21mm
×
21mm
×
1mm)置于100μl gptms中，并用等离子体清洗机处理7min。将处理后的基底用乙醇和水交替冲洗3次得到sbs-si基底。将qcsc溶于mes溶液中，其最终浓度为1.5mg/ml。然后在55℃下将上述sbs-si基底在qcsc溶液(ph 5.5)中浸泡36h得到sbs-qcsc基底。
68.s2、将sbs-qcsc基底在pha悬浮液中浸泡40min，接着在pzif-8悬浮液中浸泡40min，期间用tris-缓冲液(10mm)洗涤sbs-qcsc基底3次。前述步骤重复3次循环后，对基底进行最后一次冲洗，即可得到生物活性sbs颅骨成形材料(pha/pzif-8@sbs-qcsc基底)。
69.实施例3
70.一种生物活性sbs颅骨形成材料的制备方法，包括以下步骤：
71.(1)制备紫苏醛改性季铵盐壳聚糖
72.s1、将5g cs溶于180ml去离子水中，随后滴加900μl乙酸溶液(0.5％v/v)，并在55℃条件下搅拌1h。接着滴加5795μl氯化缩水甘油三甲基铵到上述混合液中，并在55℃下反应18h。之后以4500r/min的速度离心混合液20min，并将得到的上清液进行过滤处理，过滤后的溶液在乙醇/丙酮(1:1，v/v)混合溶液中进行醇沉。最后将得到的沉淀在室温下于真空干燥箱中干燥3d得到qcs。
73.s2、称取500mg qcs溶于40ml mes溶液(ph＝5.5)中，搅拌过夜。将1g紫苏醛溶于30ml水/甲醇(2:1，v/v)混合液中，并在室温条件下搅拌3.5h，然后将溶液加入到上述qcs溶液中。将250mg nabh4缓慢加入到混合液中直到没有气泡产生。将溶液ph值调为5.5并搅拌过夜。反应结束后，将得到的产物放入透析袋中(mwco 3500)并在酸性水溶液中(ph 5.0,hcl)连续透析2d，最后冷冻干燥即可得到qcsc。
74.(2)制备聚多巴胺改性沸石咪唑酯骨架-8
75.将2-甲基咪唑(2m)加入到以tris-缓冲液(10mm，ph＝8.5)作为溶剂的乙酸锌溶液(0.08m)中，然后以最终浓度为1.5mg/ml立即将盐酸多巴胺加入到混合液中，并在搅拌下反应4h。将得到的pzif-8悬浮液以10000r/min的速度离心10min。之后将得到的沉淀洗涤3次，并在60℃干燥12h，即可得到pzif-8纳米颗粒。
76.(3)制备聚多巴胺改性羟基磷灰石
77.s1、将浓度均为0.5m的ca(no3)2·
4h2o溶液和(nh4)2hpo4溶液以1.67的体积比混合，并用nh3·
h2o将混合液的ph值调为10，之后在70℃下搅拌反应4h。反应结束后，将悬浮液静置24h，并将得到的沉淀洗涤3次，过滤后冷冻干燥24h。将沉淀物在300℃下煅烧2h，并使用200目筛子进行筛选，即可获得纳米羟基磷灰石。
78.s2、将10ml含上述制备的纳米羟基磷灰石(150mg)的tris-缓冲液(10mm)和10ml含盐酸多巴胺(100mg)的tris-缓冲液(10mm)混合并搅拌4h以获得pha悬浮液。将悬浮液以10000r/min速度离心10min，并将得到的沉淀洗涤3次，然后在60℃下干燥12h，得到pha纳米颗粒。
79.(4)制备sbs基底
80.将sbs制备成直径为1.75mm的细丝，然后通过3d打印进行加工。将得到的打印产品用乙醇冲洗3次，并在40℃下干燥2h即可得到3d打印的sbs基底。
81.(5)制备生物活性sbs材料
82.s1、将sbs基底(21mm
×
21mm
×
1mm)置于100μl kh560中，并用等离子体清洗机处理7min。将处理后的基底用乙醇和水交替冲洗3次得到sbs-si基底。将qcsc溶于mes溶液中，其最终浓度为1mg/ml。然后在55℃下将上述sbs-si基底在qcsc溶液(ph 5.5)中浸泡36h得到sbs-qcsc基底。
83.s2、将sbs-qcsc基底在pha悬浮液中浸泡40min，接着在pzif-8悬浮液中浸泡40min，期间用tris-缓冲液(10mm)洗涤sbs-qcsc基底3次。前述步骤重复3次循环后，对基底进行最后一次冲洗，即可得到生物活性sbs颅骨成形材料(pha/pzif-8@sbs-qcsc基底)。
84.实验例1
85.对本技术实施例1制备得到的生物活性sbs材料进行抗菌检测，具体操作步骤如下：
86.将sbs、sbs-qcsc、pha/pzif-8@sbs-qcsc材料(7mm
×
7mm
×
1mm)用75％无水乙醇进行灭菌，进一步将其浸泡在200ml的细菌悬浮液(2
×
107cfu/ml)中，并于37℃下培养48h。之后将材料取出并用pbs清洗，然后进行细菌固定和sem观察。得到的实验结果见图3。
87.根据图3可看出，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均在sbs材料上成簇生长，并形成了生物膜。相较于sbs材料，sbs-qcsc和pha/pzif-8@sbs-qcsc材料表面的细菌数量明显减少，表明其具有良好的抗菌性，且pha/pzif-8@sbs-qcsc材料的抗菌性尤为显著。与目前的颅骨成形材料相比，本发明制备得到的pha/pzif-8@sbs-qcsc颅骨成形材料具有内在的抗菌性。
88.实验例2
89.对本技术实施例1制备得到的生物活性sbs材料进行成骨分化能力检测，具体操作步骤如下：
90.将sbs、sbs-qcsc、pha/pzif-8@sbs-qcsc材料(7mm
×
7mm
×
1mm)用75％无水乙醇进行灭菌，之后将其置于48孔板中，进一步将mc3t3-e1细胞以5
×
104个细胞/孔的密度接种在材料上并进行培养。培养介质为含有50μg/ml l-抗坏血酸和10mmβ-甘油磷酸二钠水合物的完全培养基，每间隔2d换一次。培养7、14、21d后使用(thermo fisher scientific,usa)从每个基底上的mc3t3-e1细胞中提取总rna。然后使用逆转录系统试剂盒
(thermo fisher scientific，usa)对提取的总rna进行逆转录，最后进行rt-qpcr测序并采用2-δδct
法对数据进行处理分析mrna表达水平。得到的实验结果见图4。
91.根据图4可看出，相较于sbs与sbs-qcsc材料培养的mc3t3-e1细胞，pha/pzif-8@sbs-qcsc材料培养的mc3t3-e1细胞展示出显著增加的碱性磷酸酶(alp)、runt相关转录因子2(runx2)及i型胶原(col i)表达水平。alp、runx2及col i为成骨分化相关基因，其表达的mrna水平越高，表明细胞成骨分化能力越强，这也进一步表明本发明制备得到的pha/pzif-8@sbs-qcsc颅骨成形材料在促进成骨基因表达上具有显著优势。