一种基于胞嘧啶的花菁探针及其制备方法和应用

1.本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于胞嘧啶的花菁探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.鱼精蛋白(protamine)是一种低分子量蛋白质，在生理条件下具有正电荷，最初是从鲑鱼和其他鱼类的精子中分离出来的。鱼精蛋白具有促进细胞繁殖，促进肝功能发展以及抑制肿瘤生长和繁殖等功能，在医学和医疗保健中具有重要的应用。鱼精蛋白被广泛用作肝素拮抗剂，鱼精蛋白中的碱性精氨酸特征性的胍基与肝素的磺酸盐基团静电络合形成稳定的离子对络合物，使其丧失抗凝活性。它是美国食品和药物管理局(fda)批准的唯一可逆转肝素抗凝活性的聚阳离子药物。
3.此外，鱼精蛋白具有很强的抗菌活性。由于其广谱、高效和安全的抑菌活性，也可以作为一种天然的食品防腐剂。因此，开发一种简单、经济有效的方法来检测鱼精蛋白的含量是重要且有益的。迄今为止，已经开发了一系列检测鱼精蛋白的方法，包括高效液相色谱法，荧光法和电化学分析法。其中，小分子荧光探针由于透膜性能强、灵敏度高、操作简单、可用于活体检测，近年来已经成为检测完整生物样本理想而不可缺少的辅助工具。
4.目前，相继报道了一系列能够检测鱼精蛋白的荧光探针。这些探针可以由纳米材料如铜纳米簇，硅-金双杂交纳米探针等组成。但此类探针的作用机制只能局限于鱼精蛋白和肝素之间的强亲和力，检测目标绕不开鱼精蛋白和肝素的相互作用，而且最重要的是这些探针对鱼精蛋白的检测限普遍偏高，毒性大。因此，研究出一种简便、经济、灵敏、低毒的有机小分子荧光传感器是非常必要的。


技术实现要素：

5.为了克服现有荧光传感器的选择性低和灵敏度较低，毒性较大的不足，本发明提供了一种近红外有机小分子荧光探针，该探针的结构式为：
6.7.本发明还提供了一种基于胞嘧啶的花菁探针的制备方法：
8.(1)蓝绿色固体cy5.5染料的制备；
9.(2)将蓝绿色固体cy5.5染料溶于二氯甲烷(dcm)，然后逐滴加入草酰氯，随后加入n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，在常温下搅拌20～40分钟，最后除去溶剂得到酰氯化的cy5.5；
10.其中，cy5.5与草酰氯的摩尔当量比为1:2～1:4。
11.(3)将步骤(2)中的产物溶于dmf中，然后加入胞嘧啶，随后加入三乙胺(net3)并在常温下搅拌24～36小时，最后通过薄层色谱法提纯得到最终的花菁探针cy5.5-cytosine。
12.其中，酰氯化的cy5.5与胞嘧啶的摩尔当量比为：1:2～1:4，酰氯化的cy5.5与三乙胺的摩尔当量比为：1:2～1:6。
13.展开剂为体积比为40:1～30:1的二氯甲烷和甲醇的混合物。
14.以上制备方法的化学反应为：
[0015][0016]
本发明还提供了一种上述染料探针的应用：所制备的基于胞嘧啶的花菁探针在磷酸缓冲盐溶液(pbs)与表面活性剂十二烷基硫酸钠(sds)的混合溶液(pbs-sds)条件下，快速简便地检测鱼精蛋白。
[0017]
其中，混合溶液为浓度10mm的缓冲溶液pbs与浓度4mm的表面活性剂sds的混合溶液(其中pbs与sds体积比为12:1～39:1)。
[0018]
花菁染料cy5.5是一种长共轭的荧光基团，受到特定波长的激发能够产生强的荧光。当靶点受体胞嘧啶和鱼精蛋白相互作用后会引起电子传导，使荧光强度有了显著的增
强，从而达到检测鱼精蛋白的目的。
[0019]
本发明的有益效果在于：本发明原料容易获得，合成方法较为简单，反应条件易于控制，反应结束后通过简单的后处理就能够得到纯的产物；作为鱼精蛋白检测的化学传感器，基于胞嘧啶的花菁探针灵敏度高、可以识别出鱼精蛋白，例如在pbs-sds混合溶液中可以荧光识别鱼精蛋白。
附图说明：
[0020]
图1为实施例1在鱼精蛋白溶液中加入制备的探针(0.04mm)前后荧光强度变化的光谱图(λex＝675nm)。
[0021]
图2为实施例1制备的探针在pbs-sds中与不同浓度的鱼精蛋白(10μgl-1
～300μgl-1
)作用后的荧光光谱图(λex＝675nm)。
[0022]
图3为实施例1制备的探针的氢谱。
具体实施方式
[0023]
下面结合实施例对本发明做进一步描述，但不限于此。
[0024]
实施例1
[0025]
(1)2-萘肼盐酸盐(0.2500g，1.29mmol)、3-甲基-2-丁酮(0.1107g，1.29mmol)在乙酸(4ml)和氮气保护条件下115℃回流2小时，反应结束后除去溶剂，用石油醚和乙酸乙酯的展开剂(体积比4:1)过硅胶柱，得到中间体1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚(0.2318g，1.11mmol，产率为86.05％)。
[0026]
(2)将1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚(0.2318g，1.11mmol)、6-溴己酸(1.0293g，5.3mmol)在乙腈(4ml)和氮气保护条件下105℃回流30小时，除去溶剂后用1.5ml二氯甲烷溶解随后加入1.5ml乙醚析出固体后过滤收集固体得到产物3-(5-羧基戊基)-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-鎓(0.3305g，1.02mmol，产率为91.89％)。
[0027]
(3)将3-(5-羧基戊基)-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-鎓(0.3305g，1.02mmol)、n-[(1e，3e)-3-(苯基亚氨基)丙-1-烯-1-基]苯胺(0.2493，1.12mmol)溶于4ml乙酸和4ml乙酸酐的混合溶液，在氮气下115℃回流3.5小时，反应结束后除去溶剂，得到粗品固体3-(5-羧基戊基)-1,1-二甲基-2-((1e，3e)-4-(n-苯基乙酰胺)丁烷-1,3-二烯-1-基)-1h-苯并[e]吲哚-3-鎓(0.5053g，1.02mmol，产率为99.99％)。
[0028]
(4)将3-(5-羧基戊基)-1,1-二甲基-2-((1e，3e)-4-(n-苯基乙酰胺)丁烷-1,3-二烯-1-基)-1h-苯并[e]吲哚-3-鎓(0.5053g，1.02mmol)与3-(5-羧基戊基)-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-鎓(0.3305g，1.02mmol)溶于4ml乙酸和4ml吡啶的混合溶液，在氮气下115℃回流1.5小时，反应结束后除去溶剂，用二氯甲烷和甲醇的展开剂(体积比10:1)过硅胶柱，得到蓝色固体cy5.5染料(0.4874g，0.71mmol，产率为69.87％)。
[0029]
(5)将花菁染料cy5.5(0.1366g，0.20mmol)溶于4ml二氯甲烷中，然后逐滴加入草酰氯(0.0508g，0.40mmol)，随后加入1滴dmf常温下搅拌25分钟，通过旋转蒸发仪除去多余的溶剂，随后加入5ml dmf将其溶解，并加入胞嘧啶(0.0445g，0.40mmol)，然后再加入三乙胺(0.0607g，0.60mmol)在常温下搅拌24小时，减压除去溶剂后得到蓝色固体，薄层色谱法(展开剂体积比：二氯甲烷：甲醇＝30:1)分离提纯后得到最终产物cy5.5-cytosine
(0.1217g，0.14mmol，产率为70.00％)。
[0030]
具体应用方法为：做两组平行实验，对照组：向96孔板中加入2μl浓度为30mgl-1
鱼精蛋白、198μl的pbs-sds混合溶液；实验组：向96孔板中加入2μl浓度为30mgl-1
鱼精蛋白、196μl的pbs-sds混合溶液(pbs浓度为9.5mm，sds浓度为0.2mm，二者体积比为19:1)和2μl的基于胞嘧啶的花菁探针(浓度为4
×
10-3
moll-1
)，将每个孔的溶液混合均匀，使得每个孔中探针的浓度为0.04mm，鱼精蛋白的浓度为300μgl-1
，测出每孔中溶液的荧光强度。结果显示：含花菁探针溶液的荧光强度在720nm处是对照组的1200倍；从而表明花菁探针对于鱼精蛋白具有识别作用。
[0031]
图1为实施例1在鱼精蛋白溶液中加入制备的探针前后荧光强度变化的光谱图。图中显示，滴加探针前后，鱼精蛋白溶液荧光强度变化情况，当加入制备的探针后，在720nm处的荧光强度发生了显著的升高(箭头所指曲线)；而在该探针没有加入前，鱼精蛋白溶液荧光的很弱，从而显示出在该体系中探针对鱼精蛋白具有识别作用。
[0032]
图2为实施例1制备的探针在pbs-sds混合溶液与不同浓度的鱼精蛋白作用后的荧光光谱图。图2中显示，在0.01-0.3mgl-1
范围内荧光强度随着鱼精蛋白浓度的升高也不断增强。
[0033]
图3为实施例1制备的基于胞嘧啶的花菁探针的氢谱。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.4
–
8.41(s,2h),8.2
–
8.17(d,j＝8.5hz,2h),7.94
–
7.90(m,4h),7.63
–
7.59(m,2h),7.52
–
7.40(t,j＝7.5hz,4h),6.41
–
6.37(d,j＝13.7hz,2h),5.33
–
5.26(s,2h),4.22
–
4.18(d,j＝7.6hz,4h),3.68
–
3.61(s,9h),3.50
–
3.46(s,4h),2.38
–
2.34(d,j＝7.3hz,4h),2.1
–
2.09(s,12h),1.16
–
1.12(d,j＝6.5hz,4h).
[0034]
实施例2
[0035]
(1)将花菁染料cy5.5(0.1366g，0.20mmol)溶于6ml二氯甲烷中，然后逐滴加入草酰氯(0.1016g，0.80mmol)，随后加入2滴dmf常温下搅拌35分钟，通过旋转蒸发仪除去多余的溶剂，随后加入8ml dmf将其溶解，并加入胞嘧啶(0.0890g，0.80mmol)，然后再加入三乙胺(0.1214g，1.20mmol)在常温下搅拌30小时，减压除去溶剂后得到蓝色固体，薄层色谱法(展开剂体积比：二氯甲烷：甲醇＝30:1)分离提纯后得到最终产物cy5.5-cytosine(0.1200g，0.138mmol，产率为69.00％)。
[0036]
实施例3
[0037]
首先配制pbs-sds混合溶剂，将0.77mlsds(4mm)与9.23mlpbs(10mm)充分混合，此时，sds的浓度为0.3mm，pbs浓度为9.23mm。对照组中：加入已配置的pbs-sds混合溶液198μl，随后加入2μl探针cy5.5-cytosine母液。实验组中：加入已配置的pbs-sds混合溶液196μl，随后加入2μl鱼精蛋白，然后加入2μl探针cy5.5-cytosine母液，最后充分混合均匀，使得每个孔中探针cy5.5-cytosine的浓度为0.04mm，鱼精蛋白的浓度为0.3mgl-1
。过酶标仪测定，实验组的荧光强度为1000(a.u),对照组的荧光强度为3000(a.u)。对照组比实验组荧光值高2000(a.u)，背景荧光干扰大，不利于探针对鱼精蛋白的检测。
[0038]
实施例4
[0039]
首先配制pbs-sds混合溶剂，将0.25mlsds(4mm)与9.75mlpbs(10mm)充分混合，此时，sds的浓度为0.1mm，pbs浓度为9.75mm。对照组中：加入已配置的pbs-sds混合溶液198μl，随后加入2μl探针cy5.5-cytosine母液。实验组中：加入已配置的pbs-sds混合溶液196μ
l，随后加入2μl鱼精蛋白，然后加入2μl探针cy5.5-cytosine母液，最后充分混合均匀，使得每个孔中探针cy5.5-cytosine的浓度为0.04mm，鱼精蛋白的浓度为0.3mgl-1
。过酶标仪测定，实验组的荧光强度为1500(a.u),对照组的荧光强度为200(a.u)。对照组与实验组荧光差值为1200(a.u)，背景荧光对探针识别鱼精蛋白影响小，有利于鱼精蛋白的检测。