一种植物源胺氧化酶及其提取方法和应用

1.本发明涉及一种植物来源的胺氧化酶的提取方法及其在食品体系中的应用，可应用于食品加工领域，属于活性分子提取技术领域。


背景技术：

2.食品中的生物胺通常是由于游离氨基酸被微生物中的氨基酸脱羧酶降解产生，主要包括组胺、色胺、腐胺、尸胺、酪胺、苯乙胺、亚精胺和精胺等。在一定时间内当生物胺的摄入量远远超过人体可分解生物胺的限量时，则会引起生理机能的改变，引起头痛、心悸、心跳加速、面部潮红等一系列不良反应，严重甚至危及生命。生物胺引起的食品安全问题已经得到了广泛的重视。生物控制法是指通过抑制氨基酸脱羧酶活性、添加可使生物胺降解的物质来控制生物胺含量，这样的控制方法安全可靠，且稳定保持食品的质量安全和其固有风味。
3.胺氧化酶是生物胺代谢中的关键酶，其分离纯化和降解特性一直是近年来国内外生物胺降解研究的热点。应用胺氧化酶解决食品中生物胺含量高的问题具有良好的前景。目前对于胺氧化酶的研究主要来源于微生物，筛选具备生物胺降解能力的菌种，将其作为发酵食品的发酵剂进行生物胺控制，对组胺、苯乙胺、酪胺等多种生物胺具有一定的降解能力。
4.植物在生长发育过程中，胺氧化酶参与调节植物体内的多胺，而多胺是植物在细胞生长、种子萌发、器官发育等过程中起着重要的作用。胺氧化酶参与植物体内细胞壁的形成、应对环境胁迫已经氮代谢等过程。因此到目前为止，国内外对植物胺氧化酶的研究报道还在不断增加。研究内容包括酶的分离纯化过程、催化特性、细胞定位、生理生化功能以及分子特征等方面。还有环境胁迫对植物体内生物胺及胺氧化酶活性的影响。不同物种和组织之间其胺氧化酶活性不同。很少有对于植物源胺氧化酶的应用研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于解决食品中的生物胺含量较高的问题，提供一种植物来源的胺氧化酶粗酶液及其制备方法，并研究其酶学性质。
6.本发明所述植物源胺氧化酶的提取，包含以下步骤：植物组织培养和植物组织中胺氧化酶的提取。提取完成后，还测定了胺氧化酶降解生物胺的酶活。
7.进一步的，步骤（一）植物组织培养的具体操作为：选取大小均匀、籽粒饱满的豆科植物种子，用蒸馏水冲洗干净,在20℃—35℃条件下用蒸馏水浸种催芽1-3天。将浸泡后的种子以大致相同的间隔均匀播于发芽床，在20-35℃恒温箱中培养,定时浇水，保持环境湿度适宜。待种子发芽3-5cm后结束培养。
8.步骤（二）从植物中提取胺氧化酶粗酶液的具体操作为：取下步骤（一）得到的植物芽苗，加入3-5倍的提取液，放入匀浆机内粉碎。四层纱布过滤，滤液在0-10℃、7000-12000r/min离心10-30min，取上清液即为粗酶提取液。
9.本发明还研究了该酶的酶学性质研究。比较不同反应温度、不同反应ph及不同温度处理后的步骤（二）所得的粗酶液的以九种食品中常见生物胺为底物时的降胺酶活，确定该酶的酶学性质。
10.优选的，本发明步骤（一）加入的提取液是磷酸钾缓冲液。
11.本发明还提供所述胺氧化酶在降低生物胺含量方面的应用，具体操作如下：取粗酶液与生物胺混合液进行混匀，混合物于30-40℃条件下静置8-24h；于10000r/min的速度离心5-10min，取上清液。以添加同体积pbs而不添加酶液，同样条件下放置为对照。测定生物胺含量。
12.本发明的有益效果：本发明所提供的酶是植物来源的酶，安全性更高；在以食品中常见的生物胺为底物时，能够检测到明显的酶活性。且该降胺酶对食品中常见的几种生物胺具有较强的降解能力。可用于多种生物胺含量较高的食品中，例如高组胺鱼类制品、谷物发酵制品、豆类发酵制品、奶类发酵制品、肉类发酵制品、果蔬发酵制品、水产品发酵制品、发酵茶等常见的氨基酸、蛋白质含量较高的食物中，降解生物胺。
13.本发明制备工艺简单，且环境友好，发明角度新颖，并且为胺氧化酶的应用提供了新的思路。
附图说明
14.图1为花生中粗酶提取液活性随温度变化。
15.图2为花生中粗酶提取液活性随ph变化。
16.图3花生粗酶提取液的降解生物胺效果。
具体实施方式
17.实施例一：从花生中提取胺氧化酶本实施案例从花生中进行胺氧化酶提取，具体步骤如下：选取大小均匀、籽粒饱满的豆科植物种子，用蒸馏水冲洗干净,在35℃条件下用蒸馏水浸种催芽1-3天。将浸泡后的种子以大致相同的间隔均匀播于发芽床，在35℃恒温箱中培养,定时浇水，保持环境湿度适宜。待种子发芽3-5cm后结束培养。
18.取下步骤（一）得到的植物芽苗，加入3倍的1m磷酸钾缓冲液(ph7.0)，放入匀浆机内粉碎。四层纱布过滤，滤液在4℃、9500r/min离心15min，取上清液即为粗酶提取液。
19.实施例二：测定花生胺氧化酶提取液的粗酶液性质胺氧化酶活性的测定方法如下：取 ph 7.0的磷酸缓冲溶液，加入过氧化物酶溶液、愈创木酚溶液、九种生物胺混合溶液。
20.取上述混合溶液于96孔板中，设置酶标仪反应温度25-55℃，上机前加入胺氧化酶提取液，测定10-30min内反应体系在470nm处的吸光度变化。在这里规定一个胺氧化酶活力单位（u）为酶反应体系中每分钟的a
470
增加值为0.01所需的酶量。
21.ph7.0条件下比较粗酶提取液在25、30、35、40、45、50、55、60℃条件下胺氧化酶的活性，以最高值为100%，作出曲线。在40℃条件下测定粗酶提取液在ph为5.5、6.0、6.5、7.0、
7.5、8.0时的胺氧化酶活性。以最高值为100%，作出曲线曲线见图1。
22.另外，测定45、55、65、75、85、95摄氏度处理后的残余酶活，30min测一次，测定2h。以最高值为100%，作出曲线，曲线见图2。
23.本实施案例中，花生胺氧化酶粗提液的最适ph是6.5，最适温度是45℃。
24.实施案例三：验证花生中胺氧化酶粗提液的降胺效果处理组具体操作步骤为，取粗酶液2ml与1ml生物胺混合液进行混匀，混合物于40℃条件下静置24h；于10000r/min的速度离心5min，取上清液，用高效液相色谱法测定生物胺含量。
25.未处理组是生物胺磷酸钾只加入缓冲液处理24小时。
26.本实施案例得到花生中提取胺氧化酶粗酶液具有明显降胺效果，结果见图3。花生中的粗酶提取液对于苯乙胺中的降解率达到了99.54%，对于九种生物胺总量降解率达到61.83%当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。


技术特征：
1.一种植物源胺氧化酶的提取方法，其特征在于，包括下列步骤：植物组织培养和植物组织中胺氧化酶的提取。2.根据权利要求1所述的植物源胺氧化酶的提取方法，其特征在于，步骤（一）植物组织培养的的具体操作为：选取大小均匀、籽粒饱满的豆科植物种子，用蒸馏水冲洗干净,在20℃—35℃条件下用蒸馏水浸种催芽1-3天，将浸泡后的种子以大致相同的间隔均匀播于发芽床，在20-35℃恒温箱中培养,定时浇水，保持环境湿度适宜，待种子发芽3-5cm后结束培养。3.根据权利要求1所述的植物源胺氧化酶的提取方法，其特征在于，步骤（二）从植物中提取胺氧化酶粗酶液的具体操作为：取下步骤（一）得到的植物芽苗，加入3-5倍的提取液，放入匀浆机内粉碎，四层纱布过滤，滤液在0-10℃、7000-12000r/min离心10-30min，取上清液即为粗酶提取液。4.上述任一项权利要求所述的方法制备的植物源胺氧化酶。5.权利要求4所述的植物源胺氧化酶在降解生物胺上的应用。

技术总结
本发明公开了一种植物源胺氧化酶及其提取方法和应用，包括下列步骤：植物组织培养和植物组织中胺氧化酶的提取。本发明所提供的酶是植物来源的酶，安全性更高；在以食品中常见的生物胺为底物时，能够检测到明显的酶活性。且该降胺酶对食品中常见的几种生物胺具有较强的降解能力。可用于多种生物胺含量较高的食品中，例如高组胺鱼类、虾酱、鱼露、红酒、发酵蔬菜、啤酒、火腿、咸鱼、辣发酵茶等高组胺鱼类制品、谷物发酵制品、豆类发酵制品、奶类发酵制品、肉类发酵制品、果蔬发酵制品、水产品发酵制品、发酵茶这些常见的氨基酸、蛋白质含量较高的食物中，降解其中的生物胺。降解其中的生物胺。


技术研发人员：徐莹 魏倩岚 汪东风 孙逊 罗克 马双
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2022.03.01
技术公布日：2022/5/30