一种贵州蓝莓蜜的产地溯源和鉴别方法与流程

1.本发明涉及蜂蜜检测技术领域，具体涉及一种贵州蓝莓蜜的产地溯源和鉴别方法。


背景技术：

2.蜂蜜为蜜蜂科昆虫中华蜜蜂(apis cerana cerana，简称中蜂)或意大利蜜蜂(apis mellifera ligustica，简称意蜂)所酿的蜜，在2020版《中国药典》中有收载。蜂蜜是天然产物，而非标准化产品，其性状特征、营养成分、气味、色泽等感官和理化指标等与产地、季节及生产方式，尤其是蜜源植物品种密切相关。蜜蜂采集源于蜜源植物的花蜜和花粉是蜂蜜中各类元素的重要来源，不同植物来源和地理来源的蜂蜜营养成分含量不同，其经济价值差异较大。全球各地产出的蜂蜜也各有差异，各国使用的蜂蜜产品标准确保了其作为食品的安全性和规范性，质量等级则进一步为消费者提供了购买决策参考。
3.中国地域辽阔，气候类型多样，蜜粉源植物资源丰富且分布较广，蜜源植物的分布具有一定的地域特征，不同地域具有不同蜜源植物，经蜜蜂采集后形成具有地方特色的蜂蜜，可以成为各地的地理标志产品和原产地保护产品。许多国家和地区针对名优蜂蜜已建立了原产地保护、地理标识和传统特色保护制度。欧盟等国家和地区建立了相关制度，保护特定地区的地理标志产品和原产地保护产品。
4.贵州位于中国西南部，属亚热带高原山区，气候温暖湿润，地貌类型多样，地表组成物质及土壤类型复杂。独特的地理位置、山水林田湖草生态系统及南部喀斯特丘陵成就了贵州丰富而独特的生物多样性。贵州黔东南地区是中国蓝莓种植的主产区之一，贵州麻江县主要种植的蓝莓品种为兔眼蓝莓。蜜蜂授粉有助于蓝莓的坐果和结实，对蓝莓产量与品质有明显提高，同时还可以产出品味独特的蓝莓蜜。在每年的3月到4月蓝莓开花期间，每群中蜂可采集蓝莓蜜约1.82kg。贵州蓝莓蜜颜色为浅琥珀色，风味独特，具有酸度高、易结晶等特点，含15种酚酸和黄酮类化合物，以槲皮素含量为最高，并具有一定的自由基清除能力，但这些指标均无法实现贵州蓝莓蜜的真实性鉴别及产地溯源。
5.生物技术之dna条形码(dna barcoding)和基于高通量测序技术的dna宏条形码(dnameta
‑
barcoding)技术可以快速、准确地鉴定蜜源植物及蜂蜜中每个dna分子序列，更准确的获得混合花粉鉴定结果，用于推断蜂蜜中植物来源和地理来源，且无论单花和多花蜜的植物组成均可用于推断其地理来源。
6.开发有效的蜂蜜溯源鉴别技术以及蜂蜜成熟度的品控技术，可防止利用名优商品的品牌，以次充好来谋取高额利润，混淆蜂蜜品种，扰乱蜂蜜市场，为蜂蜜溯源及品质评价提供依据，对发展地方特色蜂蜜产业的具有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种贵州蓝莓蜜的产地溯源和鉴别方法，该方法利用dna条形码技术检测贵州蓝莓蜜的产地特征、鉴别贵州蓝莓蜜并进行贵州蓝莓蜜的真实性和成熟
度检测。
8.为实现上述目的，本发明采用dna条形码技术建立贵州蓝莓蜜产地植物背景数据库，采用基于高通量测序技术的dna宏条形码技术快速、准确地鉴定贵州蓝莓蜜中每一种花粉的dna条形码序列以确定贵州蓝莓蜜中的花粉种类，并确定蜂蜜中主要及辅助蜜粉源植物dna占比，以贵州蓝莓蜜产地植物背景库来确定其中蜜源植物的地域特征，以此进行贵州蓝莓蜜的定性检测。将主要蜜源植物蓝莓的花粉经镜检计数后提取dna进行pcr扩增测序，得到特异性片段，针对该特异性片段设计特异性引物/taqman探针进行qpcr扩增，得到判定贵州蓝莓蜜的ct阈值及相应花粉数量阈值，进行贵州蓝莓蜜的鉴别、真实性及品控检测，以此进行贵州蓝莓蜜的定量检测。
9.具体地，本发明提供以下技术方案：
10.本发明提供一种贵州蓝莓蜜的产地溯源和鉴别方法，该方法包括：
11.建立贵州蓝莓蜜的产地植物背景数据库；
12.将贵州蓝莓蜜中不同种类的植物花粉分离，将各植物花粉提取dna后分别进行dna条形码扩增，将获得的dna条形码序列在所述产地植物背景数据库中比对，确定贵州蓝莓蜜的蜜源植物种类，并计算各种蜜源植物花粉的dna条形码扩增产物在所有蜜源植物花粉dna条形码扩增产物中的含量百分比；
13.将蓝莓作为主要蜜源植物，针对蓝莓花粉的dna条形码序列设计特异性引物和探针，利用所述特异性引物和探针进行pcr扩增，确定贵州蓝莓蜜中蓝莓花粉的dna含量阈值，根据所述阈值鉴别待测蜂蜜或检测待测蜂蜜的真实性、成熟度。
14.上述方法中，所述背景数据库的建立包括：采集以贵州蓝莓蜜蜂场为中心半径5千米范围内的植物样本，获得所述植物样本的dna条形码序列，根据dna条形码序列鉴定各植物样本所属物种。
15.其中，植物样本包括花和叶。植物样本的采集时间涵盖从蜜蜂采集花蜜到蜂蜜酿造成熟的整个周期。
16.上述建立贵州蓝莓蜜的产地植物背景数据库的方法能够更好地保证产地植物背景库的全面和完整性。
17.对于植物的dna条形码，本发明选择叶绿体trnl基因片段。
18.本发明发现，以叶绿体trnl基因片段作为蜂蜜产地植物的dna条形码能够更好地保证蜂蜜产地溯源和鉴别的准确性。
19.优选地，所述trnl基因片段使用的扩增引物如seq id no.1
‑
2所示。
20.本发明基于dna技术对作为地理标志产品和原产地保护产品的原产地蜂蜜进行了溯源和品控研究，依据定性定量分析结果对贵州蓝莓蜜进行界定，以确保蜂蜜的产地准确及品质可控。本发明提供的贵州蓝莓蜜的产地溯源和鉴别方法中，首先构建了贵州蓝莓蜜的产地植物背景数据库，通过对蜂场半径5千米内的植物进行采集，采集时间涵盖整个蜂蜜酿造周期，建立一个尽可能完善的产地植物背景数据库，以满足使用dna条形码技术和dna宏条形码技术时，对得到的未知靶标与参考数据库中己被鉴定的靶标进行比对而获知物种信息的要求。本发明的方法在传统孢粉学的基础上使用dna条形码(trnl序列)技术，通过对植物dna条形码的测序与比对分析实现物种的快速鉴定。
21.上述方法中，贵州蓝莓蜜中植物花粉的分离包括：将贵州蓝莓蜜与水混合后，根据
不同花粉的沉降速率不同将混合花粉进行分离，再经显微镜观察，分离获得单一种类的花粉。
22.本发明中，蜂蜜中所含植物花粉种类的确定需要将花粉进行分离：根据不同花粉的体积、重量不同，沉降速度不同的原理分离混合花粉，并在显微镜下观察花粉的单一性，将单一种类的花粉液分别提取dna后再进行pcr扩增。本发明发现一个混合花粉的样品依花粉混杂程度可分离为数十甚至上百个单一花粉种类的样品。现有技术中均未见将蜂蜜中混合花粉进行分离的步骤，但本发明发现该步骤对于蜂蜜的产地溯源必不可少。若不进行花粉分离，则不同物种间模板dna的拷贝数或者dna的浓度不同可能造成一些物种过量扩增，而另外一些物种扩增量较低的现象。而花粉分离可避免样品中其他类群的扩增子掩盖了某些未能扩增的特定类群，可使样品中各物种dna均能够得到扩增，保证后期分析蜜源植物组成的准确性。
23.上述方法中，待测蜂蜜的鉴别方法如下：以待测蜂蜜的dna为模板，利用所述特异性引物和探针进行荧光定量pcr，若荧光定量pcr的ct值不高于所述阈值，则判断所述待测蜂蜜为贵州蓝莓蜜，若荧光定量pcr的ct值高于所述阈值，则判断所述待测蜂蜜为非贵州蓝莓蜜或贵州蓝莓蜜的掺假蜂蜜。
24.进一步地，本发明提供用于鉴别贵州蓝莓蜜的特异性引物探针组，其中，特异性引物的序列如seq id no.3
‑
4所示，探针的序列如seq id no.5所示。
25.本发明还提供含有所述特异性引物探针组的试剂盒。该试剂盒可用于贵州蓝莓蜜的鉴别、真实性和成熟度检测。
26.本发明提供上述特异性引物探针组或试剂盒的如下任一种应用：
27.(1)在鉴别贵州蓝莓蜜中的应用；
28.(2)在检测贵州蓝莓蜜的真实性中的应用；
29.(3)在检测贵州蓝莓蜜的成熟度中的应用。
30.本发明提供一种贵州蓝莓蜜的鉴别或真实性检测方法，该方法包括：以待测蜂蜜的dna为模板，利用序列如seq id no.3
‑
4所示的特异性引物和序列如seq id no.5所示的探针进行荧光定量pcr，若每15.0g待测蜂蜜的荧光定量pcr的ct值为24
‑
29，则判断所述待测蜂蜜为贵州蓝莓蜜，若每15.0g待测蜂蜜的荧光定量pcr的ct值大于29，则判断所述待测蜂蜜为非贵州蓝莓蜜或为贵州蓝莓蜜的掺假蜂蜜。
31.上述方法中，还可根据根据花粉dna浓度与ct值的关系以及花粉dna浓度与花粉数量的关系，计算得到贵州蓝莓蜜中含有的主要蜜源植物花粉数量的阈值，根据主要蜜源植物花粉数量的阈值鉴别待测蜂蜜。
32.作为另一种实施方式，本发明提供一种贵州蓝莓蜜的鉴别或真实性检测方法，该方法包括：对待测蜂蜜中的蓝莓花粉数量进行检测，若每15.0g待测蜂蜜中蓝莓花粉数量为300
‑
1800粒，则判断所述待测蜂蜜为贵州蓝莓蜜，若每15.0g待测蜂蜜中蓝莓花粉数量小于300粒，则判断所述待测蜂蜜为非贵州蓝莓蜜或为贵州蓝莓蜜的掺假蜂蜜。
33.本发明提供一种贵州中蜂蓝莓蜜的成熟度检测方法，该方法包括：以待测蜂蜜的dna为模板，利用序列如seq id no.3
‑
4所示的特异性引物和序列如seq id no.5所示的探针进行荧光定量pcr，若每15.0g待测蜂蜜的ct值为24～25，则判断为封盖成熟的中蜂蓝莓蜜，若每15.0g待测蜂蜜的ct值为26～29，则判断为未封盖成熟的中蜂蓝莓蜜；
34.作为另一种实施方式，本发明提供一种贵州中蜂蓝莓蜜的成熟度检测方法，该方法包括：对待测蜂蜜中的蓝莓花粉数量进行检测，若每15.0g待测蜂蜜中蓝莓花粉数量为1000～1800粒，则判断为封盖成熟的中蜂蓝莓蜜，若每15.0g待测蜂蜜中蓝莓花粉数量小于1000粒，则判断为未封盖成熟的中蜂蓝莓蜜。
35.上述方法中，荧光定量pcr的反应程序如下：94℃、3min；92℃、30s，60℃、50s，72℃、30s，72℃、2min，40个循环。
36.本发明的技术效果在于：本发明提供的方法通过dna条形码技术与孢粉学结合的定性定量检测方法确定贵州蓝莓蜜的地域特征、物种鉴定和植物组成。利用本发明提供的特异性引物和探针结合荧光定量pcr能够实现贵州蓝莓蜜的鉴别以及贵州蓝莓蜜的真实性和品控检测。该方法可作为贵州蓝莓蜂蜜地域、蜜源和品质鉴别的重要手段，用于贵州蓝莓蜜与其他不同种类、不同产地和不同品质蜂蜜的甄别，为规范贵州蓝莓蜜市场、开发地理标志产品及地域特色蜂蜜提供了有效的方法。
附图说明
37.图1为本发明实施例2中蓝莓花粉的镜检形态，其中，箭头指示为蓝莓花粉。
38.图2为本发明实施例3中采用特异性引物和taqman探针进行荧光定量pcr扩增的扩增曲线，其中，1：蓝莓trnl序列；2
‑
26：25种植物trnl序列27：空白对照。
39.图3为本发明实施例3中不同浓度蓝莓花粉dna的扩增曲线。
40.图4为本发明实施例3中13种蜂蜜的qpcr扩增曲线。
具体实施方式
41.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
42.实施例1 贵州蓝莓蜜产地植物背景数据库的建立
43.在蓝莓花期采集贵州麻江地区蓝莓种植园各蜂场半径5千米范围内的植物样本(包括花和叶)，采集时间涵盖从蜜蜂采集花蜜到蜂蜜酿造成熟的整个周期。
44.提取各植物样本的基因组dna，采用如seq id no.1
‑
2所示的引物对叶绿体基因组中trnl条形码片段进行pcr扩增。
45.引物序列如下：
46.seq id no.1(f 5
’‑3’
)：cgaaatcggtagacgctacg；
47.seq id no.2(r 5
’‑3’
)：ggggatagagggacttgaac。
48.pcr扩增反应程序如下：
49.92℃、3min；92℃、30s，58℃、30s，72℃、45s，35个循环；72℃、5min。
50.对pcr产物进行dna测序、序列校对、去除引物及低质量区后进行拼接，最终获得各样本的dna条形码序列。采用blast方法对各序列准确性进行判断，采用mega x软件，进行多序列比对，比较trnl序列的变异位点，最后，通过比对genebank数据鉴定植物物种，利用全部植物样本所获得的各dna条形码序列及其对应的植物物种信息构建贵州蓝莓蜜产地植物trnl条形码片段的背景数据库，结果如表1所示。
51.表1 贵州麻江蓝莓蜜产地植物背景库
[0052][0053][0054]
注：√表示测出。
[0055]
实施例2 贵州蓝莓蜜的蜜源植物组成检测
[0056]
1、贵州蓝莓蜜中花粉的分离、基因组dna的提取及pcr扩增
[0057]
称量1.0g蜂蜜样品放置到5ml离心管中，平行取样至少3次。分别加水稀释，根据不同花粉体积和重量不同，沉降速度不同的原理分离混合花粉，并在光镜下观察花粉的单一性，该混合花粉的样品分离出百余个样品，其中蓝莓花粉的镜检形态如图1所示(400倍光学显微镜)。将单一种类的花粉液提取dna后，利用序列如seq id no.1
‑
2所示的引物分别进行pcr扩增行pcr扩增。
[0058]
各pcr产物在1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，扩增产物切胶回收后采用miseq测序平台进行高通量测序，并使用qiime2和abyss软件对测序结果进行系统分析，将测序结果在实施例1建立的蜂蜜的产地植物背景数据库中进行比对，确定蜜源植物的种类，并计算各种蜜源植物花粉的dna条形码扩增产物在所有蜜源植物花粉的dna条形码扩增产量总量中的含量百分比。
[0059]
对贵州中蜂蓝莓蜜中的dna条形码序列进行扩增和测序、比对分析，结果显示，中蜂采集的蜂蜜中占比最高的蜜源植物为杜鹃花科越橘属的蓝莓，其次为柏科侧柏属的侧柏、茄科茄属的马铃薯及菊科多属植物，占比大于1％的有13个科15个属植物，详见表2。
[0060]
表2 中蜂蓝莓蜜蜜源植物组成
[0061][0062]
对贵州意蜂蓝莓蜜中的dna条形码序列进行扩增和测序、比对分析，结果显示，意蜂采集的蜂蜜中占比最高的蜜源植物为杜鹃花科越橘属的蓝莓，其次为菊科多属植物，蔷薇科火棘属的火棘，柏科侧柏属的侧柏及松科松属的马尾松，dna占比>1％的有14科17个属植物，详见表3。
[0063]
表3 意蜂蓝莓蜜蜜源植物组成
[0064][0065]
贵州蓝莓蜜中独特的植物组成基于产地独特的地理环境及特色植物，其他地域不具有可复制性。菊科鼠曲草属植物鼠曲草作为蓝莓蜜中重要的辅助蜜粉源，其营养和药效可提升贵州蓝莓蜜的功效。
[0066]
实施例3 贵州蓝莓蜜的鉴别、真实性和成熟度评价
[0067]
1、特异性引物、探针设计以及荧光定量pcr方法
[0068]
根据实施例2确定的各种蜜源植物的dna占比，以dna占比最高的植物——蓝莓(主要蜜源植物)的花粉的dna条形码序列(trnl序列)为目的序列，使用步骤1构建的蜂蜜产地植物的背景数据库，找到蓝莓花粉trnl目标差异片段区，应用primer premier 5.0引物设计软件设计并合成特异性引物及特异性taqman探针。
[0069]
特异性引物序列如下：
[0070]
seq id no.3(f，5
’‑3’
)：ggcaaacaaataaagattcc；
[0071]
seq id no.4(r，5
’‑3’
)：tcgacgaaagaattccta。
[0072]
特异性taqman探针序列如下：
[0073]
seq id no.5(p，5
’‑3’
)：fam
‑
tctaccaacgcagtcaactccat
‑
bhq1。
[0074]
按照表4所示的荧光定量pcr反应体系，针对特异性引物及taqman探针进行退火温
度优化：设置8组退火温度：56、57、58、59、60、61、62、63℃。通过qpcr的ct值和扩增曲线的结果确定退火温度为60℃。
[0075]
优化后的qpcr反应条件为94℃、3min；92℃、30s，60℃、50s，72℃、30s，72℃、2min，40个循环。每个样品做3次平行。
[0076]
表4 taqman荧光定量pcr反应体系
[0077][0078]
为了验证设计引物和探针的特异性，选取背景库中26种植物，使用dp320植物基因组dna提取试剂盒提取植物dna。验证特异性引物及taqman探针的特异性，结果如图2所示。蓝莓花粉dna浓度为18.3ng/μl，通过蓝莓蜜taqman探针特异性qpcr检测方法检测蓝莓花粉dna，有扩增曲线，反应呈阳性，ct值为28.60，呈s形荧光扩增曲线；其他25种植物及空白对照均为阴性反应，均无荧光值增长，未见特异性荧光扩增曲线，说明所设计的蓝莓特异性引物和taqman探针具有较强的特异性，该引物和探针只对蓝莓花粉具有特异性，能够出现扩增曲线，背景库中其他植物未出现扩增。
[0079]
2、标准曲线的建立
[0080]
取蓝莓花粉加水稀释，在光镜下使用血球计数板计数，重复5次。取相同花粉数量的花粉液提取dna并测定dna的浓度，采用四倍梯度稀释得到各液体的花粉数量和dna浓度(0.07～66.5ng/μl)，以上述dna为模板，按表4所示的反应体系和上述优化后的反应程序进行qpcr，在60℃收集荧光信号，得到花粉dna扩增曲线，结果如图3所示。
[0081]
在线性范围内以花粉dna浓度的lg值与ct值回归得到线性方程；同时，以花粉dna浓度值为x轴，花粉数为y轴，得到线性回归方程。以花粉dna浓度为中间转化关系，由qpcr扩增的ct值计算出所对应的花粉粒数量。实验重复3次，各浓度3个平行，结果如下：
[0082]
将得到的蓝莓花粉dna浓度lg值与ct值函数关系y＝
‑
5.6205x 65.285(r2＝0.9950)，以及蓝莓花粉dna浓度与花粉数的函数关系y＝77.107x
‑
6.1772(r2＝0.9987)相结合，以蓝莓花粉dna浓度为中间转化关系，得到蓝莓花粉数与ct值之间的关系公式：
[0083][0084]
式中：p为样品所含花粉数，a为样品的花粉dna扩增得到的ct值。由于lg浓度单位pg/ml，花粉dna浓度单位ng/μl，结果需
×
10
‑6为对应花粉数。
[0085]
3、贵州蓝莓蜜的真实性阈值和成熟度阈值的确定
[0086]
采购不同生产厂家及各地蜂农的标签或自述为单品种/百花蜂蜜的多种品级或品牌的蜂蜜样本200个，包括贵州蓝莓蜜(75个样本)、加拿大蓝莓蜜(10个样本)、椴树蜜(11个
样本)、枣花蜜(11个样本)、柑橘蜜(10个样本)、荔枝蜜(11个样本)、黄芪蜜(10个样本)、荆条蜜(11个样本)、洋槐蜜(11个样本)和野菊花蜜(10个样本)等单花蜜和3个百花蜜(各10个样本)共13个蜂蜜品种，利用上述qpcr方法进行检测。部分蜂蜜样本的检测结果如图4和表5所示。将200个样本的检测结果进行统计，结果显示，15.0g贵州蓝莓蜜荧光定量pcr的ct值均小于29，其他品种蜂蜜包括加拿大蓝莓蜜qpcr扩增曲线的ct值均大于30，与贵州蓝莓蜜可明显区分，判定为非贵州蓝莓蜜。
[0087]
由此确定的贵州蓝莓蜜的真实性指标界定如下：15.0g蓝莓蜜的ct值在24～29，蓝莓花粉数量在300～1800粒，非蓝莓蜜的其他蜂蜜样品的ct值＞29，在ct≤29时无扩增，可与贵州蓝莓蜜明显区分鉴别。
[0088]
其中，15.0g封盖成熟中蜂蜜的ct值在24～25，未封盖中蜂蜜或非中蜂蜜的ct值在26～29。贵州蓝莓蜜中中蜂成熟蜜(中蜂封盖蓝莓蜜)与非成熟蜜(中蜂未封盖蓝莓蜜)能够明确区分，但意蜂封盖和中蜂未封盖蓝莓蜜无法区分。
[0089]
由此确定的贵州中蜂蓝莓蜜的成熟度指标界定如下：15.0g封盖成熟蜜的ct值在24～25，蓝莓花粉数量在1000～1800粒，未封盖蜜或非中蜂蜜的ct值在26～29，蓝莓花粉数量在1000粒以下。
[0090]
表5 蓝莓蜜的鉴别及品质判定
[0091]
[0092][0093]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。