鉴定西瓜种皮裂纹性状的分子标记、方法、引物对、试剂盒及其应用

1.本发明涉及鉴定西瓜种皮裂纹性状的分子标记、方法、引物对、试剂盒及其应用，属于分子标记辅助育种技术领域。


背景技术：

2.西瓜(citrullus lanatus)为葫芦科西瓜属一年蔓生草本植物，在我国及世界范围内广泛栽培，是世界上重要的水果型蔬菜之一。西瓜除果肉可以食用之外，其种子及种皮富含的不饱和脂肪酸(以亚油酸为主)对人体具有保健作用及营养价值。亚油酸具有降血脂、抗血栓、提高大脑记忆力和注意力等多种功能，对人体具有重要的保健作用。因此，对西瓜种皮性状进行研究，在西瓜育种中具有重要的研究价值。
3.indel分子标记是由于核苷酸片段存在缺失或插入序列，致使pcr扩增后产生片段长度多态性的一种分子标记，该类标记在基因组中分布广泛，操作简便，结果易于观察，在相同物种不同材料中具有普遍适用性。


技术实现要素：

4.为了更好地鉴定西瓜种皮裂纹性状，获得与西瓜种皮裂纹性状紧密连锁的染色体区段及分子标记，本发明提供了一种与西瓜种皮裂纹性状紧密连锁的indel分子标记，所述indel分子标记为核苷酸序列如seq id no.1所示的117bp核苷酸片段和核苷酸序列如seq id no.2所示的128bp核苷酸片段；所述seq id no.1与种皮无裂纹性状紧密连锁，所述seq id no.2与种皮裂纹性状紧密连锁。
5.本发明还提供了引物对在鉴定西瓜种皮裂纹性状中的应用，所述引物对包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物，所述应用为利用引物对扩增西瓜基因组dna获得扩增产物，再通过检测扩增产物来鉴定西瓜种皮是否有裂纹。
6.进一步地限定，所述西瓜基因组dna取自幼苗期、抽蔓期或结果期的任一一个时期。
7.进一步地限定，所述应用中检测扩增产物是通过聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测，若扩增产物为117bp的一个片段，或者同时包含117bp和128bp两个片段，则判定具有种皮无裂纹性状；若扩增产物为128bp的一个片段，则判定具有种皮裂纹性状。
8.本发明还提供了一种鉴定西瓜种皮裂纹性状的方法，包括如下步骤：
9.(1)提取待测西瓜的基因组dna；
10.(2)以步骤(1)获得的基因组dna为模板，利用引物对进行pcr扩增，获得pcr产物；所述引物对包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物；
11.(3)通过检测pcr产物，判断西瓜种皮是否有裂纹。
12.进一步地限定，步骤(3)所述判断方法为利用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测pcr产物，若pcr产物为117bp的一个片段，或者同时包含117bp和128bp两个片段，则判定具有种皮无裂纹性状；若pcr产物为128bp的一个片段，则判定具有种皮裂纹性状。
13.本发明还提供了上述方法在西瓜种皮裂纹性状辅助鉴定、辅助育种及西瓜种皮裂纹性状筛选中的应用。
14.本发明还提供了一种用于鉴定西瓜种皮裂纹性状的试剂盒，所述试剂盒含有引物对；所述引物对包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物。
15.本发明还提供了一种上述试剂盒的使用方法，利用所述引物对对西瓜基因组dna进行扩增，获得pcr产物，再利用聚丙烯酰氨凝胶电泳对pcr产物进行检测。
16.本发明还提供了上述试剂盒在西瓜种皮裂纹性状辅助鉴定、辅助育种及西瓜种皮裂纹性状筛选中的应用。
17.本发明的有益效果：
18.在明确西瓜种皮裂纹性状遗传规律基础之上，利用基因组重测序和bsa-seq技术快速获得与西瓜种皮裂纹性状紧密连锁的染色体区段，通过在遗传群体中进行验证，于上述染色体区段内开发indel分子标记，该标记位于西瓜种皮裂纹性状关键基因seed crack定位区间内，与该性状紧密连锁。通过分子标记辅助选择的方法，在西瓜苗期提取待测西瓜样品基因组dna即可对西瓜种皮裂纹性状进行分子标记辅助选择，提高了育种的准确性和效率。该分子标记可应用于籽用西瓜分子育种，为西瓜种皮形态分子鉴定提供了行之有效的分子育种工具。
19.本发明利用亲本重测序数据开发和获得的与西瓜种皮裂纹性状紧密连锁的分子标记设计引物对。由于不同西瓜材料中该分子标记片段存在的短序列插入和缺失的多态性，通过获得的引物对对西瓜幼苗基因组dna进行pcr扩增，利用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测pcr产物片段大小，可以对西瓜种皮是否具有裂纹性状进行苗期分子鉴定。该鉴定方法在苗期提取待测西瓜样本的基因组dna即可实现西瓜种皮裂纹性状的鉴定，操作简便，育种准确度及效率高，为西瓜种皮形态分子标记辅助选择育种提供了行之有效的育种工具及技术。
附图说明
20.图1为实施例1中西瓜种皮裂纹性状关键基因的定位结果图；
21.图2为实施例4中引物对对种皮无裂纹材料和种皮裂纹材料进行pcr扩增产物检测的电泳结果图，其中，1-10号泳道为f2群体中，表型为光滑种皮材料(117bp)，11-20号泳道为f2群体中，种皮裂纹材料(128bp)，21-28号泳道为f2群体中，表型为光滑种皮材料(同时包含117bp和128bp)，29-34泳道为自然群体中种皮光滑西瓜材料(117bp)，35-42泳道为自然群体中种皮裂纹西瓜材料(128bp)，marker泳道中，两条片段分别为100bp片段和250bp片段。
具体实施方式
22.以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，实施本发明的过程、条件、实验方法及试剂等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和市场常规
产品，本发明没有特别限制内容。
23.基因组dna的提取方法：
24.基因组dna提取方法参照murray等(1980)的方法(murray m.,thompson w.f.,rapid isolation of high molecular weight plant dna[j].nucl.acid.res.,1980,8:668-673.)，并在此基础上进行改良。
[0025]
具体步骤如下：
[0026]
①
将采集的幼嫩真叶用无菌水洗净擦干后，取0.2g放入1.5ml离心管中，加入液氮充分研磨至白色粉末，加入800μl 65℃预热的2％的ctab溶液(2％ctab，100mmol/ltris-hcl ph＝8.0)，1.4mol/l nacl，20mmol/l edta ph＝8.0，2％β-巯基乙醇)充分混匀，65℃水浴1h，每隔10min轻摇一次。
[0027]
②
取出离心管，待冷却至室温，13000rpm离心10min。贴壁吸出上清液置于新离心管中，为防止机械剪切力损坏dna，转移所用的枪头需提前用剪刀减去尖端部分，扩大吸液口。
[0028]
③
贴壁加入750μl氯仿：异戊醇(24：1，v/v)溶液，充分混匀，静止10min后，13000rpm离心10min。
[0029]
④
取出离心管，采用上述相同的处理方法用枪头贴壁吸出700μl上清液置于新离心管中。
[0030]
⑤
贴壁加入700μl氯仿：异戊醇(24：1，v/v)溶液，轻轻摇动离心管使溶液充分和混合，静止10min后13000rpm离心10min。
[0031]
⑥
贴壁吸出650μl上清液置新管中，加入2μl rnase(10mg/ml)混匀，放置37℃水浴2h。
[0032]
⑦
贴壁加入650μl氯仿：异戊醇(24：1，v/v)溶液，充分混合，静止10min后13000rpm离心10min。
[0033]
⑧
贴壁吸出550μl上清液置新管中加入-20℃预冷的550μl异丙醇(贴壁加入)，盖紧离心管盖，上下颠倒数次后置于-20℃冰箱静止60min。
[0034]
⑨
取出离心管，于离心机中13000rpm离心10min，小心弃去上清液，保留离心管底部沉淀物。
[0035]
⑩
用预冷的70％乙醇清洗沉淀三次，并将离心管置于超净工作台中，无菌风吹干后加入200μl ddh2o溶解，于-20℃中保存备用。
[0036]
实施例1：与西瓜种皮裂纹性状紧密连锁的分子标记及其获取方法
[0037]
a.供试材料的选取：所述的供试材料包括母本(种皮无裂纹)和父本(种皮裂纹)、f1代和f2代群体。
[0038]
所述的母本材料为：cream of saskatchewan(简称“cos”)，栽培种西瓜，种皮无裂纹；
[0039]
所述的父本材料为：pi 192938，栽培种西瓜，种皮裂纹；
[0040]
上述母本和父本均公开于shi liu,zhongqi gao,xuezheng wang,feishi luan,zuyun dai,zhongzhou yang,qian zhang.nucleotide variation in the phytoene synthase(clpsy1)gene contributes to golden flesh in watermelon(citrullus lanatus l.).theor appl genet 135,185
–
200(2022).https://doi.org/10.1007/
[0059]
实施例3：一种鉴定西瓜种皮裂纹性状的方法
[0060]
一种鉴定西瓜种皮裂纹性状的方法，具体包括如下步骤：
[0061]
(1)提取待测西瓜样品叶片或其他组织的基因组dna。
[0062]
本发明的鉴定方法可以以不同时期的西瓜幼苗为材料，为不影响后续生长最佳时期，本实施例是以西瓜幼苗期(两叶一心期)的叶子为材料提取dna。
[0063]
(2)以步骤(1)获得的基因组dna为模板，利用引物对进行pcr扩增，获得pcr产物；所述引物对包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物。
[0064]
(3)利用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测pcr产物，若扩增产物为117bp的一个片段，或者同时包含117bp和128bp两个片段，则判定具有种皮无裂纹性状；若扩增产物为128bp的一个片段，则判定具有种皮裂纹性状。
[0065]
上述pcr反应体系为：上下游引物各1μl(引物浓度为2pm)，dna模板2μl(浓度为30ng/μl)10
×
pcr buffer 1μl(含mg2 15mm)，dntp 0.15μl(浓度为10mm)，taq酶0.1μl(5u/μl)，无菌去离子水6.75μl；
[0066]
上述pcr反应程序为：94℃预变性7min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存；
[0067]
pcr产物检测方法：分别取2μl pcr产物，加入2μl loading buffer，混匀后点入聚丙烯酰胺凝胶中，220v/400ma电泳，电泳时间为50-60min。
[0068]
利用本发明的鉴定方法可在西瓜幼苗期判断西瓜种皮裂纹性状，采样时间约为两叶一心时期；而采用常规育种需要在成熟期，收获西瓜果实采收种子，晒干后调查种皮是否具有裂纹，由此可见，利用本发明所述的鉴定方法可有效缩短育种时间，加快育种速度。
[0069]
实施例4：利用所获得的引物对对不同种皮裂纹性状的西瓜品种进行筛选
[0070]
为判断上述分子标记、引物对和鉴定方法鉴定种皮裂纹性状的准确性，选择实施例1所述f2代西瓜幼苗和自然群体的样品，按照实施例3所述的鉴定方法对各样品进行种皮裂纹性状鉴定，鉴定结果如图2所示，并于西瓜成熟期，收获西瓜果实采收种子，晒干后调查各单株种皮是否具有裂纹。
[0071]
图2中，1-10号泳道为f2群体中，表型为光滑种皮材料(117bp)，11-20号泳道为f2群体中，种皮裂纹材料(128bp)，21-28号泳道为f2群体中，表型为光滑种皮材料(同时包含117bp和128bp)，29-34泳道为自然群体中种皮光滑西瓜材料(117bp)，35-42泳道为自然群体中种皮裂纹西瓜材料(128bp)，marker泳道中，两条片段分别为100bp片段和250bp片段，鉴定结果及对西瓜种皮裂纹性状观察结果表明，种皮裂纹性状鉴定结果与实际种皮裂纹性状100％一致，进而了说明本发明所述分子标记、引物对及西瓜种皮裂纹性状鉴定方法的可行性和准确性。
[0072]
实施例5：一种用于鉴定西瓜种皮裂纹性状的试剂盒
[0073]
一种用于鉴定西瓜心室数的试剂盒包括如下试剂：watermelon seed crack-f(浓度为2pm)、watermelon seed crack-r(浓度为2pm)、10
×
pcr buffer(含mg
2
15mm)、dntp(浓度为10mm)、taq酶(5u/μl)和无菌去离子水。
[0074]
实施例6：一种用于鉴定西瓜种皮裂纹性状的试剂盒的使用方法
[0075]
(1)提取待测西瓜的基因组dna，并调节基因组dna浓度至30ng/μl。
[0076]
(2)按照如下pcr体系添加样品及试剂
[0077][0078]
(3)进行pcr扩增，pcr程序如下：94℃预变性7min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
[0079]
(4)利用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测pcr产物，通过检测结果判断西瓜种皮裂纹性状，具体为：若扩增产物为117bp的一个片段，或者同时包含117bp和128bp两个片段，则判定具有种皮无裂纹性状；若扩增产物为128bp的一个片段，则判定具有种皮裂纹性状。
[0080]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。