一种三酮脱氢物的制备方法与流程

1.本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及一种三酮脱氢物的制备方法。


背景技术：

2.地夫可特为甾体抗炎药，是一种白色或类白色结晶粉末，属于肾上腺皮质激素及促肾上腺皮质激素药物，具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫等药理作用，相当于波尼松龙的10-20倍，氢化可的松的40倍。在临床上具有非常重要的作用，可用于危重疾病的急救，适用于肾上腺皮质机能机能减退、自身免疫性疾病等。
3.其中，1,2位脱氢工序是地夫可特生产过程中的一个关键步骤，其对地夫可特的质量和收率具有重要影响。而17α
–
羟基孕甾-4-烯-3,11，20-三酮脱氢物是地夫可特合成中的重要一环，传统的脱氢方法为化学方法脱氢，存在效率低，环境污染大的问题。
4.如下为17α
–
羟基孕甾-4-烯-3,11，20-三酮的结构式：
[0005][0006]
因此，开发一种新型的脱氢方法制备三酮脱氢物，以提高地夫可特的合成效率，实现环境友好发展，是本领域技术人员亟需解决的一项技术问题。


技术实现要素：

[0007]
本发明目的在于提供一种三酮脱氢物的制备方法，该方法显著提高了三酮物脱氢物的转化效率。
[0008]
本发明提供一种三酮脱氢物的制备方法，包括以下步骤：
[0009]
利用简单节杆菌将三酮物生物转化为三酮脱氢物。
[0010]
作为本技术方案优选地，包括以下步骤：
[0011]
s1、将三酮物与水混合搅拌打浆，制成三酮物浆液；
[0012]
s2、将所述三酮物浆液投入到简单节杆菌的发酵培养液中进行生物转化，得到三酮脱氢物。
[0013]
在本发明的转化方法中，首先，将三酮物与水混合搅拌打浆，制成三酮物浆液，以提高三酮物的分散度；然后，将三酮物浆液投入到简单节杆菌的发酵培养液中进行生物转化，简单节杆菌属节杆菌属，具有较强的脱氢能力，三酮物底物通过细胞膜，在简单节杆菌胞内酶的作用下，完成生物转化。该生物转化方法可专一的将17α
–
羟基孕甾-4-烯-3,11，20-三酮的1,2位氢脱去导入双键，转化率高达90％，避免或减少了强酸、强碱以及有毒有害化学品的使用，改善了操作条件，降低了生产成本，符合绿色发展的理念。
[0014]
在本发明中，可以采用本领域的常规方法对简单节杆菌进行培养，并且可以根据
实际需求对简单节杆菌进行逐级扩大培养。
[0015]
作为本技术方案优选地，步骤s1具体包括，将三酮物与水混合搅拌打浆，得到浆料；向所述浆料中加入分散剂，高温灭菌，制成三酮物浆液；
[0016]
其中，所述三酮物与水的质量比为1：(2-3)；
[0017]
所述浆料与所述分散剂的质量比为1：(0.01-0.05)。
[0018]
因简单节杆菌的生物酶为胞内酶，底物必须透过细胞膜才能有效转化，当底物的水溶性很差时，就限制了转化反应的投料量和高投料量下的底物转化率，因此，为提高底物的水溶性，可向浆料中加入分散剂，以促使底物高度分散，加速底物溶解和底物分子的传递，并保持底物/浆料的稳定性，进而提高三酮物转化反应活性。研究表明，使用2-3倍的水作为三酮物的打浆液，对发酵体系没有毒害作用，且更有利于发酵转化底物；当浆料与所述分散剂的质量比为1：(0.01-0.05)时，三酮物底物的分散效果最佳。
[0019]
作为本技术方案优选地，所述分散剂包括吐温80、聚醚消泡剂和二氧六环中的任意一种或多种。
[0020]
具体地，本发明所使用的分散剂为吐温80、聚醚消泡剂和二氧六环中的任意一种或多种，在上述分散剂的作用下，浆液体系的化学势降低，整个底物体系也趋于更加稳定，进而保证了反应体系的稳定性。
[0021]
作为本技术方案优选地，所述搅拌打浆时，控制搅拌速度为100-150r/min，打浆时间为20min-60min。
[0022]
对于三酮物的打浆方式不作限定，具体地，在搅拌打浆时，可以控制搅拌的速度为100-150r/min中的任意数值，并优选为120r/min，打浆的时间为20min-60min中的任意数值，并优选为40min。
[0023]
作为本技术方案优选地，所述高温灭菌的温度为121-125℃，时间为20-35min。
[0024]
作为本技术方案优选地，步骤s2具体包括，将所述三酮物浆液分次投入到简单节杆菌的发酵培养液中进行生物转化，得到三酮脱氢物；
[0025]
其中，所述三酮物浆液的总投加浓度为所述发酵培养液的2-4％。
[0026]
具体地，采用分次投加三酮物浆液方法，可减少底物对简单节杆菌生物细胞的毒害作用，保证生物细胞的通透性。研究发现，当三酮物浆液的总投加浓度为发酵培养液的2-4％有利于提高三酮物的生物转化水平，并且这里的浓度优选为3％。
[0027]
作为本技术方案优选地，所述分次投入的次数为2次，第一次投料量占总投料量的20-40％，第二次投料量占总投料量的60-80％；
[0028]
优选地，所述第一次投料和所述第二次投料的时间间隔为20-30h。
[0029]
在本发明中，首先向发酵培养液中投入总投料量的20-40％，此时，底物可诱导简单节杆菌大量产生1,2位脱氢酶，并且能够避免一次投料后底物对菌种的毒害作用，更加有利于三酮物的转化，
[0030]
作为本技术方案优选地，所述生物转化时，控制温度为30-34℃，时间为30-48h。
[0031]
本发明对生物转化的条件不作严格限制，具体地，可以控制生物转化时的温度为30-34℃，时间为30-48h。经过上述生物转化后，三酮脱氢物的转化率高达85-90％。
[0032]
在本发明中，还可以包括：对生物转化后的发酵培养液进行分离、纯化，得到三酮脱氢物。
[0033]
而对发酵培养液的分离、纯化方式不作严格限制，可以采用本领域的常规方法。
[0034]
作为本技术方案优选地，在第一次投料前加入有机溶剂；
[0035]
优选地，所述有机溶剂的添加量为所述发酵培养液体积的4-5％；
[0036]
优选地，所述有机溶剂为甲醇和乙醇中的任意一种或两种；
[0037]
优选地，所述有机溶剂的投加时间为第一次投料前1-2h。
[0038]
在第一次投料前，为进一步提高底物的分散度，防止物料打结，影响转化效率，可向发酵培养液中加入4-5％体积的有机溶剂。因有机溶剂对微生物菌株的生长有毒害作用，因此，需将有机溶剂的添加量控制5％以内。并且，这里的有机溶剂为甲醇和乙醇中的任意一种或两种，并且投加时间为第一次投料前1-2h。
[0039]
本发明利用简单节杆菌将三酮物生物转化为三酮脱氢物具有以下优点：
[0040]
1、使用生物转化的方法可将17α
–
羟基孕甾-4-烯-3,11，20-三酮一步转化为三酮脱氢物，转化率高达90％，而化学1,2位脱氢一般采用二氧化硒法，会使产品中带有少量二氧化硒难以除尽，需多步才可完成，且收率远低于80％，因此，该方法提高了转化率，减少了副反应；
[0041]
2、该生物转化方法可专一的将17α
–
羟基孕甾-4-烯-3,11，20-三酮的1,2位氢脱去导入双键，因此，简单节杆菌将三酮物转化为三酮脱氢物具有优异的立体选择性和区域选择性；
[0042]
3、该生物转化方法相比于化学方法，避免或减少了强酸、强碱以及有毒有害化学品的使用，改善了操作条件，降低了生产成本，符合绿色发展的理念。
附图说明
[0043]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0044]
图1为本发明实施例2所制得三酮脱氢物的谱图；
[0045]
图2为本发明实施例3所制得三酮脱氢物的谱图；
[0046]
图3为本发明实施例4所制得三酮脱氢物的谱图。
具体实施方式
[0047]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0048]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0049]
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技
术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0050]
实施例1
[0051]
s11、将三酮物与水以质量比1:2进行混合，随后在搅拌速度为100r/min下进行搅拌打浆，搅拌打浆时间为60min，得到浆料；
[0052]
向浆料中加入聚醚消泡剂分散剂，且浆料与分散剂的质量比为1：0.01，搅拌混匀后，升温至121℃左右灭菌25min，随后降温至常温，得到三酮物浆液；
[0053]
s12、首先向发酵培养液中投加4％甲醇，1h后将处理好浆料分2次投入到简单节杆菌的发酵培养液中，浆料总投加浓度为发酵培养液的3％，其中，第一次投料量占总投料量的20％，24h后投加剩余浆料，于30℃、150r/min的条件下培养48h，得到三酮脱氢物。
[0054]
实施例2
[0055]
s21、将三酮物与水以质量比1:3进行混合，随后在搅拌速度为150r/min下进行搅拌打浆，搅拌打浆时间为20min，得到浆料；
[0056]
向浆料中加入吐温80分散剂，且浆料与分散剂的质量比为1：0.05，搅拌混匀后，升温至121℃左右灭菌25min，随后降温至常温，得到三酮物浆液；
[0057]
s22、首先向发酵培养液中投加5％乙醇，1h后将处理好浆料分2次投入到简单节杆菌的发酵培养液中，浆料总投加浓度为发酵培养液的3％，其中，第一次投料量占总投料量的40％，30h后投加剩余浆料，于32℃、150r/min的条件下培养32h，得到三酮脱氢物。
[0058]
实施例3
[0059]
s31、将三酮物与水以质量比1:2进行混合，随后在搅拌速度为130r/min下进行搅拌打浆，搅拌打浆时间为30min，得到浆料；
[0060]
向浆料中加入吐温80分散剂，且浆料与分散剂的质量比为1：0.03，搅拌混匀后，升温至121℃左右灭菌25min，随后降温至常温，得到三酮物浆液；
[0061]
s32、首先向发酵培养液中投加4％甲醇，2h后将处理好浆料分2次投入到简单节杆菌的发酵培养液中，浆料总投加浓度为发酵培养液的4％，其中，第一次投料量占总投料量的30％，25h后投加剩余浆料，于34℃、150r/min的条件下培养40h，得到三酮脱氢物。
[0062]
实施例4
[0063]
s41、将三酮物与水以质量比1:3进行混合，随后在搅拌速度为120r/min下进行搅拌打浆，搅拌打浆时间为20min，得到浆料；
[0064]
向浆料中加入聚醚消泡剂分散剂，且浆料与分散剂的质量比为1：0.03，搅拌混匀后，升温至121℃左右灭菌25min，随后降温至常温，得到三酮物浆液；
[0065]
s42、首先向发酵培养液中投加4％甲醇，1.5h后将处理好浆料分2次投入到简单节杆菌的发酵培养液中，浆料总投加浓度为发酵培养液的3％，其中，第一次投料量占总投料量的3％，24h后投加剩余浆料，于32℃、150r/min的条件下培养48h，得到三酮脱氢物。
[0066]
实施例5
[0067]
s51、将三酮物与水以质量比1：3进行混合，随后在搅拌速度为150r/min下进行搅拌打浆，搅拌打浆时间为20min，得到浆料；
[0068]
向浆料中加入聚醚消泡剂分散剂，且浆料与分散剂的质量比为1：0.03，搅拌混匀后，升温至121℃左右灭菌25min，随后降温至常温，得到三酮物浆液；
[0069]
s52、首先向发酵培养液中投加4％乙醇，1.5h后将处理好浆料分2次投入到简单节杆菌的发酵培养液中，浆料总投加浓度为发酵培养液的3％，其中，第一次投料量占总投料量的30％，24h后投加剩余浆料，于32℃、150r/min的条件下培养36h，得到三酮脱氢物。
[0070]
测试方法：
[0071]
仪器：254nm紫外检测器高效液相色谱仪；
[0072]
色谱柱：长为0.25m，内径为4.6mm、内填5μm c18的不锈钢柱；
[0073]
流速:1.0ml/min；
[0074]
流动相的配制：量取过滤的乙腈、水，按乙腈-水＝460：580进行配制，混合均匀，超声脱气15min；
[0075]
对照品溶液的配制：称取三酮脱氢物对照品10mg(9.5mg-10.5mg)，置于10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，放置备用；
[0076]
供试品溶液的配制：称取供试品10mg(9.5mg-10.5mg)，置于10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，放置备用；
[0077]
操作：用流动相以流速1.0ml/min平衡色谱柱约30min，取供试品溶液20μl、对照品溶液20μl注入色谱仪(各1针)。
[0078]
理论板数按三酮脱氢物对照品峰计算应不低于2000。按峰面积归一化法计算各杂质的百分含量。在供试品溶液的色谱图中：任何小于0.05％的溶剂峰及杂质峰可忽略不计。
[0079]
按照上述方法对实施例1-5所制得的三酮脱氢物的转化率进行测试，测试结果如下：
[0080]
表1实施例1-5产物转化率
[0081] 实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5转化率84.685.186.386.788.9
[0082]
由表1可以得出，本发明三酮脱氢物的生物转化方法，转化率均在84.6％以上，最高可达88.9％，并且整个转化过程中，均未使用有毒有害化学品，提高了收率，降低了生产成本，符合绿色发展的理念。
[0083]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。