一种三重人工模拟酶的制备方法及其产品和应用

1.本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种三重人工模拟酶的制备方法及其产品和应用。


背景技术：

2.同型半胱氨酸，也称作高半胱氨酸，是一种含有巯基的氨基酸，是人体新陈代谢的重要中间产物。正常情况下，同型半胱氨酸会被人体分解代谢，浓度停留在较低水平。但是由于一些原发性和继发性的原因，会使其在体内进行堆积，导致心脑血管疾病的发病率大幅度提高。因此，同型半胱氨酸是一项重要的人体健康指标。目前，对同型半胱氨酸进行检测，主要采用荧光偏振法或免疫法测定，同位素法和色谱法也被使用。但是，目前的这些传统检测方法普遍存在检测时间长，操作复杂，灵敏度低等问题。
3.近年来发现，某些纳米材料具有与天然酶类似的催化活性，作为人工模拟酶引起了人们的极大兴趣。例如最初发现的四氧化三铁纳米粒子具有与辣根过氧化酶(hrp)相似的催化活性，能够催化酶底物如3,3’,5,5
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四甲基联苯胺(tmb)等与双氧水发生氧化还原反应，生成蓝色的氧化产物。随后陆续发现，很多纳米材料均具有模拟酶活性，包括过渡金属纳米材料、贵金属纳米材料、碳纳米材料等。与天然酶相比，纳米材料具有稳定性高、催化活性高及廉价易得等优点，特别是避免了天然酶的不稳定和易变性特征，增加了其在过程催化和酶促动力学领域应用的前景，因而这些具有模拟酶活性的纳米材料在分析化学中具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种三重人工模拟酶的制备方法及其产品和应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用本发明制备的三重人工模拟酶可实现对同型半胱氨酸的高灵敏度检测。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种三重人工模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)haucl4溶液和ctab溶液混合，再加入nabh4溶液，得到金纳米棒的种子溶液；
8.(2)haucl4溶液和十六烷基三甲基溴化铵溶液混合后，加入agno3溶液和h-rgo，再加入还原剂，最后再加入所述金纳米棒的种子溶液，反应得到go-au；
9.(3)在所述go-au上连接mp-11，即得所述三重人工模拟酶。
10.进一步地，所述还原剂为抗坏血酸。
11.本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的三重人工模拟酶。
12.本发明还提供上述的三重人工模拟酶在同型半胱氨酸检测中的应用。
13.本发明还提供一种根据上述的三重人工模拟酶进行同型半胱氨酸检测的方法，包括以下步骤：
14.(1)绘制标准曲线
15.在已知同型半胱氨酸浓度的血浆中再加入同型半胱氨酸，分别配置成不同梯度浓度的同型半胱氨酸的混合溶液，再分别经检测操作后，利用紫外分光光度计在620nm下检测紫外吸收信号，绘制得到标准曲线；
16.所述检测操作包括：
17.a在所述同型半胱氨酸的混合溶液中加入双氧水，反应后，再加入二硫苏糖醇溶液，反应后，再加入上述的三重人工模拟酶，反应后制成检测液；
18.b3,3',5,5'-四甲基联苯胺和双氧水混合后，加入所述检测液，反应后即可利用紫外分光光度计进行检测；
19.(2)样品检测
20.待测样品经步骤(1)所述的检测操作后，利用紫外分光光度计在620nm下检测紫外吸收信号，根据所述标准曲线，得到所述待测样品的同型半胱氨酸浓度。
21.进一步地，在步骤a中，加入所述双氧水后的反应时间为1h。
22.进一步地，在步骤a中，加入所述二硫苏糖醇溶液后的反应时间为12h。
23.进一步地，在步骤a中，加入所述三重人工模拟酶后的反应时间为6h。
24.进一步地，在步骤b中，所述反应的时间为1h。
25.本发明公开了以下技术效果：
26.本发明设计合成了基于石墨烯、mp-11和金纳米花的三重人工模拟酶，该人工模拟酶有极佳的类过氧化物酶催化性质，可高效地催化3,3’,5,5
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四甲基联苯胺(tmb)与双氧水的反应，生成蓝色的氧化物。当与高半胱氨酸结合时会使该人工模拟酶的催化活性大幅度降低，且降低幅度与高半胱氨酸呈线性相关。因此，通过测定蓝色氧化物的紫外吸光度，可以评估血浆中高半胱氨酸的浓度。
27.本发明基于该三重人工模拟酶对底液3,3',5,5'-四甲基联苯胺和双氧水的催化作用以及与同型半胱氨酸的结合作用，构建了以人工模拟酶代替天然过氧化物酶的方法高灵敏性检测人血浆中的同型半胱氨酸浓度。本发明利用三重人工模拟酶优良的催化性能，高效地催化双氧水对3,3',5,5'-四甲基联苯胺进行氧化，产生蓝色氧化产物，在紫外分光光度计的检测下，在620nm处有明显吸收峰。mp-11的催化铁中心与同型半胱氨酸巯基可以特异性结合，当三重人工模拟酶结合人血浆中的同型半胱氨酸后，会导致mp-11的催化活性急剧降低，蓝色氧化产物的浓度降低，在紫外分光光度计的检测下，620nm处的吸收峰明显降低。通过此方法可实现对同型半胱氨酸高灵敏度检测，与传统检测方法相比，有检测时间短，操作简单，灵敏度高等优点。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为石墨烯与金纳米花的透射电镜表征图，其中(a)为石墨烯，(b)为石墨烯-金纳米花复合物；
30.图2为mp-11结合go-au过程的示意图；
31.图3为go-au-mp-11与同型半胱氨酸反应前后催化信号对比，其中，曲线1为反应前，曲线2为反应后；右上角两个溶液瓶为曲线对应的反应前后的溶液实物，1为蓝色，2为无色透明；
32.图4为不同浓度下同型半胱氨酸与go-au-mp-11结合后，催化h2o2氧化tmb比较，从a-g同型半胱氨酸浓度不断增加，可以得到线性方程，其中(a)为为不同半胱氨酸浓度下的信号曲线，(b)为线性方程。
具体实施方式
33.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
34.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
35.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
36.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
37.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
38.以下实施例中，使用的仪器装置包括：feitalosf200s透射电镜(thermoscientific)；uv-vis分光光度计(agilenttechnologiesco.ltd.,usa)；sz-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；kq-50b型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；所用试剂包括：羧基化修饰的石墨烯分散液(go，南京先丰纳米材料科技有限公司)；nabh4(上海化学试剂有限公司)；tmb混合液(biosharp生物科技公司)四氯金酸、微过氧化酶-11(mp-11)，辣根过氧化物酶(hrp)及二硫苏糖醇均购自sigma公司。实验所用试剂均为分析纯，水均为二次蒸馏水，pbs缓冲溶液(ph7.4)用磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和二次蒸馏水配置。
39.实施例1三重人工模拟酶的制备
40.首先合成石墨烯-金复合物(go-au)。
41.(1)制备金纳米棒的种子溶液
42.将1ml0.12mmhaucl4和1ml0.048mctab溶液混合，在不断搅拌中加入0.12ml新鲜配制的2.4mmnabh4，此时溶液颜色由黄色变为棕黄色，得到金纳米棒的种子溶液。种子溶液在使用前放置在27℃环境中2h。
43.(2)生长液的制备
44.将50ml0.2mmhaucl4和50ml0.048m十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液混合，然后于室温条件下加入2.5ml0.96mmagno3溶液和3.4mgh-rgo。之后，加入0.7ml0.01m抗坏血酸，此时溶液颜色从暗黄色变为无色。接着加入0.12ml步骤(1)配制好的种子溶液，于27℃条件下反应20min。上述溶液被移至30℃条件下再反应12h。反应产物经8500rpm离心25min后去除上清液，沉淀重新分散于10ml超纯水中，得到go-au溶液。go-au的电镜图见图1。
45.(3)在go-au的基础上通过连接mp-11得到三重人工模拟酶(go-au-mp-11)
46.首先用用pbs缓冲溶液配置0.186mg/ml的mp-11缓冲溶液。取1mlmp-11缓冲溶液与1ml合成好的go-au溶液混合，用pbs缓冲溶液稀释至10ml，在4℃的条件下搅拌12小时。洗去多余的mp-11，重新溶解于10mlpbs缓冲溶液中，即可得到三重人工模拟酶(go-au-mp-11)。mp-11结合go-au过程的示意图见图2。
47.效果验证
48.同型半胱氨酸是一种含有巯基的氨基酸，可与mp-11的催化中心铁原子特异性地结合，从而导致mp-11的催化活性降低或消失。用pbs缓冲溶液配置0.0011g/ml的同型半胱氨酸溶液，取相同体积的同型半胱氨酸溶液与三重人工模拟酶(go-au-mp-11)混合，在4℃的条件下搅拌3小时。如图3所示，当加入同型半胱氨酸后，模拟酶的催化活性有明显的降低，溶液颜色变为无色，说明go-au-mp-11对于检测同型半胱氨酸有非常好的效果。
49.实施例2血浆中同型半胱氨酸的检测
50.(1)绘制标准曲线
51.在已知同型半胱氨酸浓度的血浆中再加入同型半胱氨酸，分别配置成10μmol/l，20μmol/l，50μmol/l，70μmol/l，150μmol/l，200μmol/l同型半胱氨酸的混合溶液，依次编号a-g。在a-g号混合溶液中分别再加入同等体积的双氧水，反应1小时，使血浆中的其他酶灭活，再分别加入与上述的同型半胱氨酸的混合溶液同等体积的浓度为0.002g/l的二硫苏糖醇溶液，4℃条件下反应12小时，最后分别加入实施例1合成的同等体积的三重人工模拟酶(go-au-mp-11)反应6小时，制成检测液。取1ml3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)和双氧水的混合溶液，加入200μl检测液反应1小时后，利用紫外分光光度计在620nm下检测，绘制出标准曲线(见图4)。
52.(2)实际样本检测
53.取出待测样品1和2，分别通过步骤(1)的方法，测出紫外吸收信号分别为0.75及0.415，根据标准曲线和线性关系，测得待测物浓度分别为7.83μmol/l和12.01μmol/l，与化学发光结果相一致(分别为7.8μmol/l和12.9μmol/l)。
54.实施例3
55.以两种天然过氧化物酶(辣根过氧化物酶hrp和微过氧化物酶mp-11)作为对比实验，发现hrp的催化活性对同型半胱氨酸浓度不敏感，无法实现同型半胱氨酸的检测。单纯的mp-11对同型半胱氨酸检测的灵敏度也较低，最低只能检测到80μmol/l的同型半胱氨酸。
56.综上，本发明制备了一种三重人工模拟酶，材料中的石墨烯、金纳米花和mp-11之间的协同增强作用，使催化性能大大增加，从而提高了检测的灵敏度。当合成材料与同型半胱氨酸等含巯基的化合物结合时，巯基会与mp-11中发挥关键作用的铁中心特异性结合，从而导致催化性能极大地降低。当结合巯基与未结合巯基的材料与tmb和h2o2相遇，催化活性
会有明显的区别，溶液蓝色的深浅侧面反映了同型半胱氨酸的浓度，通过紫外分光光度计检测以及计算，可以检测同型半胱氨酸的浓度。
57.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。