一种蛹虫草生物活性肽及其分离方法和应用以及一种多肽口服液

1.本发明涉及生物提取技术领域，尤其涉及一种蛹虫草生物活性肽及其分离方法和应用以及一种多肽口服液。


背景技术：

2.蛹虫草(cordyceps militaris)，又名北冬虫夏草、北虫草、蛹草等，隶属真菌门(fungi)虫草科(cordycipitacea)虫草属(cordyceps)，与野生冬虫夏草同属肉座菌目(hypocreales)，其天然资源的世界性分布数量较少。我国是世界上第一个用昆虫蛹人工大批量培养蛹虫草菌子实体的国家，因蛹虫草营养丰富，药食兼备，于2006年获得了国家卫生部“新资源食品”批文。目前已被开发成多种类型的食品和保健品上市，如虫草饮料、虫草酸奶等，且随着人们对健康生活和疾病预防意识的不断提高，将蛹虫草应用到食品和保健品的研究也逐渐增多。
3.蛹虫草的生物活性成分种类多，含量丰富，既包含蛋白质、糖和脂肪等基本营养成分，还含有多种功能成分，如虫草素、虫草酸，除此之外还含有18种氨基酸、多种维生素和30多种微量元素。有研究报道表明，蛹虫草作为一种新兴中药材具有抗疲劳、免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗感染和延缓衰老、抑菌等药理作用。
4.目前对于蛹虫草的研究，主要集中在虫草素、虫草酸和虫草多糖方面，蛹虫草中蛋白质含量高达60％，蛹虫草中的蛋白质具有一般蛋白质的特点，也是大分子物质，不易被消化吸收，在现实生活中，往往在提取虫草多糖和虫草素的过程中蛋白质被丢弃，虫草蛋白质的利用率较低，造成蛋白质的大量浪费。
5.多肽对人体生理作用的主要表现有：调节激素分泌、提高免疫力、抗癌、抗氧化、抗疲劳、降血压等，因其功效可作为功能食品、特医食品、保健品的原材料。蛹虫草多肽作为深加工的主要方向之一，可延伸蛹虫草的产业链条，有助于蛹虫草行业持续优质发展。但是，目前关于蛹虫草多肽的提取分离及在保健品中应用的研究较少。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种蛹虫草生物活性肽及其分离方法和应用以及一种多肽口服液。本发明提供的方法多肽得率高，所得多肽的抑菌和抗氧化活性好，所得多肽口服液影响均衡，本发明解决了目前虫草加工中蛋白质大幅浪费的问题，提高了虫草类产品的附加值，延长了虫草产业链，为虫草产业的发展做出了贡献。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.一种蛹虫草生物活性肽的分离方法，包括以下步骤：
9.使用水对所述蛹虫草子实体进行超声波提取，将所得提取液进行酸沉，得到虫草粗蛋白；所述超声波提取的ph值为7.5～8.5，料液比为0.5～1g:10～25ml，提取次数为2～3次，每次提取的时间为1～2h；
10.将所述虫草粗蛋白溶于水中，得到蛋白溶液，将所述蛋白溶液和酶混合进行酶解，得到蛹虫草生物活性肽；所述酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶；所述酶解的温度为45～60℃，ph值为5.5～8.0，时间为2～4h。
11.优选的，所述超声波提取的温度为45～55℃，所述超声波提取的超声功率为80～120w；调节所述超声波提取的ph值用的试剂为氢氧化钠溶液。
12.优选的，所述超声波提取前，还包括将所述蛹虫草子实体依次进行干燥和粉碎。
13.优选的，所述蛋白溶液中的蛋白浓度为8～16mg/ml，所述复合酶的添加量为5000～8000u/ml，所述复合酶中酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的活力比为4:3。
14.优选的，所述酶解后，还包括将所得酶解液依次进行灭酶活和第一离心，得到第一上清液，将所述第一上清液和三氯乙酸混合，然后再次进行第二离心，所得第二上清液为蛹虫草生物活性肽的溶液。
15.优选的，得到蛹虫草生物活性肽的溶液后，还包括将所述蛹虫草生物活性肽的溶液进行超滤，所述超滤为：采用分子量为30kda、10kda和3kda的超滤膜对所述蛹虫草生物活性肽的溶液依次进行超滤。
16.本发明还提供了上述方案所述分离方法得到的蛹虫草生物活性肽。
17.本发明还提供了上述方案所述的蛹虫草生物活性肽在食品和保健品中的应用以及在制备抗肿瘤药物中的应用。
18.本发明还提供了一种蛹虫草多肽口服液，包括以下质量分数的组分：20～40％，蜂蜜3～7％，柠檬酸1～5％，白砂糖5～10％，余量的水；所述多肽为权利要求7所述的蛹虫草生物活性肽。
19.优选的，所述蛹虫草多肽口服液中还包括黄原胶0.02～0.06％，edta-2na 0.1～0.3％。
20.本发明提供了一种蛹虫草生物活性肽的分离方法，包括以下步骤：使用水对所述蛹虫草子实体进行超声波提取，将所得提取液进行酸沉，得到虫草粗蛋白；所述超声波提取的ph值为7.5～8.5，料液比为0.5～1g:10～25ml，提取次数为2～3次，每次提取的时间为1～2h；将所述虫草粗蛋白溶于水中，得到蛋白溶液，将所述蛋白溶液和酶混合进行酶解，得到蛹虫草生物活性肽；所述酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶；所述酶解的温度为45～60℃，ph值为5.5～8.0，时间为2～4h。本发明采用超声波提取的方法从蛹虫草子实体中提取蛋白质，通过对超声波提取条件的严格控制，提高蛋白质的提取率，得到虫草粗蛋白后，本发明采用复合酶对蛋白质进行酶解，并对酶解条件进行严格控制，提高蛋白质的水解度和多肽得率，且所得多肽的肽段分子量集中，易于收集。实施例结果表明，本发明提供的方法多肽得率达到67.15mg/g，且得到的蛹虫草生物活性肽抗菌性和抗氧化活性高，还具有一定的抗癌活性，在食品和保健品中具有广阔的应用前景。
21.本发明还提供了一种蛹虫草多肽口服液，组成成分包括多肽液、蜂蜜、柠檬酸、白砂糖和水。本发明提供的蛹虫草多肽口服液口感好，营养均衡，适用于各年龄人群服用，在饮料市场中极具开发潜力。
22.本发明通过超声波提取和酶解得到蛹虫草多肽，并利用该蛹虫草多肽研制了一种多肽口服液，不仅可以解决目前虫草加工中蛋白质的大幅浪费的问题，而且为蛹虫草相关功能产品的研发提供原料，提高了虫草类产品的附加值，延长了虫草产业链，为虫草产业的
发展做出贡献。
附图说明
23.图1为不同ph对虫草蛋白提取率的影响；
24.图2为不同提取时间对虫草蛋白提取率的影响；
25.图3为不同料液比对虫草蛋白提取率的影响；
26.图4为不同提取次数对虫草蛋白提取率的影响；
27.图5为超声提取法和加热回流提取法的蛋白质提取率对比图；
28.图6为不同蛋白酶水解对多肽得率的影响；
29.图7为酶解温度对多肽得率的影响；
30.图8为酶添加量对多肽得率的影响；
31.图9为ph值对多肽得率的影响；
32.图10为酶解时间对多肽得率的影响；
33.图11为虫草多肽溶液对羟自由基的清除作用的测试结果；
34.图12为虫草多肽溶液对dpph自由基的清除作用的测试结果。
具体实施方式
35.本发明提供了一种蛹虫草生物活性肽的分离方法，包括以下步骤：
36.使用水对所述蛹虫草子实体进行超声波提取，将所得提取液进行酸沉，得到虫草粗蛋白；所述超声波提取的ph值为7.5～8.5，料液比为0.5～1g:10～25ml，提取次数为2～3次，每次提取的时间为1～2h；
37.将所述虫草粗蛋白溶于水中，得到蛋白溶液，将所述蛋白溶液和酶混合进行酶解，得到蛹虫草生物活性肽；所述酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶；所述酶解的温度为45～65℃，ph值为5.5～8.0，时间为2～4h。
38.本发明使用水对所述蛹虫草子实体进行超声波提取，将所得提取液进行酸沉，得到虫草粗蛋白。本发明对所述蛹虫草子实体的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的蛹虫草子实体即可，在本发明的具体实施例中，所述蛹虫草子实体优选为山西农业大学山西功能食品研究院自培养的蛹虫草子实体，所述蛹虫草子实体中蛋白质的质量分数优选为60～72％，更优选为64～71.5％。在本发明中，所述超声波提取前，优选先将所述蛹虫草子实体依次进行干燥和粉碎，本发明对所述干燥没有特殊要求，以充分干燥为准；所述粉碎具体为将干燥后的蛹虫草子实体粉碎至0.2mm以下。
39.在本发明中，所述超声波提取的ph值最优选为8，料液比最优选为1g:25ml(即蛹虫草的质量和水的体积之比)，提取次数最优选为2次，每次提取的时间最为1.5h，将两次提取所得提取液合并，按照上述条件进行超声波提取，蛋白质提取率最高。在本发明中，所述超声波提取的温度优选为45～55℃，更优选为50℃，所述超声波提取的超声功率优选为80～120w，更优选为100w；所述超声波提取优选在超声波清洗器中进行；调节所述超声波提取的ph值用的试剂为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度优选为1mol/l；在本发明中，所述水优选为蒸馏水。
40.在本发明的具体实施例中，优选先将蛹虫草和水按照上述料液比混合，浸泡30min
后，使用氢氧化钠溶液调节料液的ph值至8，然后将所得混合料液置于超声波清洗器中进行提取，第一次提取完成后，将液体分离，剩余固体物质添加蒸馏水后再次进行超声波提取，具体的提取条件和第一次超声波提取时相同，两次超声提取完毕后，将所得提取液合并。
41.超声提取后，本发明优选将所得提取液离心并收集上清液，然后对所得上清液进行酸沉。在本发明中，所述离心的转速优选为5000r/min，离心的时间优选为10min。在本发明中，所述酸沉的ph值优选为4，本发明优选使用盐酸溶液(浓度优选为1mol/l)将离心所得上清液的ph值调节为4，使其中的蛋白质发生沉淀，然后再通过静置和离心将所得固体沉淀物分离，之后将所得固体沉淀物水洗至ph值为7，即得到所述虫草粗蛋白。
42.得到虫草粗蛋白后，本发明将所述虫草粗蛋白溶于水中，得到蛋白溶液，将所述蛋白溶液和酶混合进行酶解，得到蛹虫草生物活性肽。在本发明中，所述水优选为蒸馏水，所述蛋白溶液的蛋白浓度优选为10mg/ml，所述酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶，所述复合酶中碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的活力比优选为4:3，本发明采用上述比例的复合酶对虫草粗蛋白进行水解，水解度高，肽段分子量集中，易于收集。在本发明的具体实施例中，可以先将碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照比例混合得到复合酶，然后再进行使用，或者将两种酶分别进行添加，两种添加方式都可以，本发明不做具体限定；所述复合酶的添加量优选为5000～8000u/ml，更优选为6000u/ml，所述酶解的温度最优选为55℃，ph值最优选为7，酶解时间最优选为3h，在上述条件下进行酶解，多肽得率最高。在本发明的具体实施例中，优选先将所述蛋白溶液的温度和ph值调节至上述范围内，然后再加入复合酶进行充分震荡，之后在水浴条件下进行酶解；调节所述蛋白溶液的ph值用的试剂优选为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度优选为0.1mol/l。
43.酶解完成后，本发明优选还包括将所得酶解液依次进行灭酶活和第一离心，得到第一上清液，将所述第一上清液和三氯乙酸混合，然后再次进行第二离心，所得第二上清液为蛹虫草生物活性肽的溶液。在本发明中，所述灭酶活的方法优选为将所得酶解液置于沸水中10min，以使酶失去活性；所述第一离心和第二离心的转速均优选为3500r/min，离心时间均优选为15min；在本发明中，所述第一上清液和三氯乙酸的用量比优选为5:1～3:1，更优选为4:1；本发明向第一上清液中加入三氯乙酸，使第一上清液中未水解的蛋白质沉淀下来，从而在第二离心过程中将其去除，在本发明的具体实施例中，优选重复三次加入三氯乙酸的步骤，以保证蛋白质沉淀完全。
44.在本发明中，第二离心所得上清液即为蛹虫草生物活性肽的溶液，其中溶剂为水。在本发明的具体实施例中，若想要得到不同浓度的蛹虫草生物活性肽溶液，优选将上述所得上清液浓缩，得到浸膏后再加水溶解，根据目标浓度加入不同的水量，从而得到不同浓度的蛹虫草生物活性肽的溶液。
45.在本发明的具体实施例中，得到上述蛹虫草生物活性肽的溶液后，本发明优选还包括将所述蛹虫草生物活性肽的溶液进行超滤，所述超滤为：采用分子量为30kda、10kda和3kda的超滤膜对所述蛹虫草生物活性肽的溶液依次进行超滤，得到滤液后，本发明优选将收集得到的滤液进行抽真空浓缩，得到不同分子量的虫草多肽；在本发明的具体实施例中，在进行超滤前，还优选采用无纺布滤纸对所述蛹虫草生物活性肽的溶液进行粗滤，以除去大分子杂质，防止杂质阻塞超滤膜。本发明通过上述超滤可获得4个组分：组分i》30kda、10kda《组分ii《30kda、3kda《组分iii《10kda和组分iv《3kda，各组分中蛹虫草多肽浓度优选
为：组分i 32.13mg/ml、组分ii 13.35mg/ml、组分iii 9.86mg/ml、组分iv 36.62mg/ml。本发明通过采用上述三种超滤膜依次进行超滤，实现不同大小的多肽进行分离，该方法不仅具有操作简便，可重复利用，节省能耗，产品回收率高等优点，还可以实现大批量工业化分离，并能保持多肽的生物学活性。
46.本发明还提供了上述方案所述分离方法得到的蛹虫草生物活性肽。
47.本发明还提供了上述方案所述的蛹虫草生物活性肽在食品和保健品中的应用以及在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明对所述应用的具体方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法即可。
48.本发明还提供了一种蛹虫草多肽口服液，包括以下质量分数的组分：多肽20～40％，优选为30％，蜂蜜3～7％，优选为5％，柠檬酸1～5％，优选为4％，白砂糖5～10％，优选为8％，余量的水；所述多肽为上述方案所述的蛹虫草生物活性肽；在本发明的具体实施例中，优选将上述方案中酶解后得到的蛹虫草生物活性肽的溶液(即第二上清液)浓缩成浸膏，然后再加水溶解，得到多肽含量为30％的多肽液，然后再向其中加入蜂蜜、柠檬酸和白砂糖，即得到所述蛹虫草多肽口服液。
49.在本发明中，所述蛹虫草多肽口服液中优选还包括黄原胶0.02～0.06％，优选为0.04％(质量分数)，edta-2na 0.1～0.3％，优选为0.2％(质量分数)，所述黄原胶和edta-2na为稳定剂，通过加入黄原胶和edta-2na，能够提高口服液的稳定性，避免发生沉降。
50.在本发明中，所述蛹虫草多肽口服液的制备方法优选包括：按照配方将所述蛹虫草多肽口服液的原料混合，然后分装在玻璃瓶中，之后进行微波灭菌。在本发明中，所述玻璃瓶的体积优选为50ml，所述微波灭菌的功率为20kw，时间为3min，温度为75℃。
51.本发明提供的虫草多肽口服液产品为橘黄色，呈均匀半透明状，无絮状物和沉淀；口感爽滑，甘甜清爽，无涩味；具蚕蛹与虫草纯正香味，菌落总数为81cfu/g，未检出致病菌，总糖度为9.12
°
bx，总酸度为5.16。经检验，该口服液且营养均衡，适宜各年龄人群饮用，通过检测各项理化指标及微生物学指标都符合国家标准，在饮料市场中极具开发潜力。
52.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
53.实施例1虫草蛋白的提取
54.1、本实施例通用的提取过程为：称取5g蛹虫草干粉于250ml的锥形瓶中，按相应的料液比向锥形瓶中加入蒸馏水，浸泡30min，然后用1mol/l naoh溶液将料液的ph调到目标ph值，调好后放到超声波清洗器中，超声功率设置为100w，温度设为50℃，按照要求的次数和时间进行超声提取，合并提取液，将合并后的提取液进行离心(5000r/min)10min，收集上清液，进行蛋白质含量的测定，并计算蛋白提取率。
55.蛋白质含量的测定方法如下：
56.采用凯氏定氮法测定：取1ml样品至消化管中，加入6g硫酸钾、0.4g硫酸铜和20ml硫酸于消化炉中进行消化。当温度至420℃时，继续消化1h，至液体呈绿色透明状，冷却后加入50ml水，于自动凯氏定氮仪进行测定。其中蛋白质含量依式i计算：
[0057][0058]
式i中：x为样品中蛋白质的质量(g/100g)；
[0059]v1
：为滴定试样所消耗的盐酸滴定液的体积(ml)；
[0060]v2
：为空白对照消耗盐酸滴定液的体积(ml)；
[0061]
c：为盐酸滴定液的浓度(mol/l)；
[0062]
0.0140为消耗lml浓度为lmol/l的盐酸对应的氮的质量
[0063]
m：为试样的质量(g)
[0064]v3
：为吸取消化液的体积(ml)
[0065]
f：为氮换算蛋白质的系数，此处取6.25，100为换算系数。
[0066]
蛋白质提取率按照式ii计算：
[0067][0068]
2、将ph值、提取时间、料液比和提取次数作为蛋白质提取率的4个影响因素，进行单因素试验。
[0069]
(1)ph值对虫草蛋白提取率的影响
[0070]
称取5g蛹虫草干粉于250ml的锥形瓶中，按1g:20ml的料液比向锥形瓶中加入蒸馏水，浸泡30min后用1mol/l naoh溶液调节料液的ph值为：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，调好后放到超声波清洗器中，超声提取1h，提取液离心后，收集上清液，进行蛋白质含量的测定并计算蛋白质提取率，研究料液的ph对蛋白质提取效果的影响。
[0071]
测试结果如图1所示。根据图1可以看出，虫草蛋白的提取率受ph影响很大，开始时随着ph的升高，蛋白质的提取率升高，当ph＝8.0时，蛹虫草蛋白的提取率达到最高值，而当ph值大于8.0时，提取率呈下降趋势；这是因为蛋白质在碱性溶液中易发生酸式水解，能增加蛋白质的溶解性，而当ph值过高会使蛋白质出现脱氨基、脱羧基、肽键断裂及蛋白质分子间发生缩合反应等问题使蛋白质变性，并产生一些有毒有害的物质，因此本发明以ph 8.0作为虫草蛋白提取的最佳条件。
[0072]
(2)提取时间对虫草蛋白提取率的影响
[0073]
称取5g蛹虫草干粉于250ml的锥形瓶中，按1g:20ml的料液比向锥形瓶中加入蒸馏水，浸泡30min后用1mol/l naoh溶液将料液的ph调到8.0，调好后放到超声波清洗器中，分别控制提取时间为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h和3.0h，提取液离心后，收集上清液，进行蛋白质含量的测定并计算蛋白质提取率，研究提取时间对蛋白质提取效果的影响。
[0074]
测试结果如图2所示。根据图2可以看出，利用超声波提取虫草蛋白时，其提取率受超声提取时间影响较为明显，随着时间的推移，蛋白的提取率持续增高，在0.5～2.5h内虫草多肽蛋白提取率升高的幅度较大，而当提取时间到2.5h后，提取率增加的幅度变小。原因是超声波提取时在1.5h时细胞完全破壁，蛋白质溶出率较高，随着时间的延长，溶解度达到饱和状态，有效成分的溶出逐渐减少，提取率增加的幅度逐渐降低。为了防止时间过长导致蛋白质变性以及考虑到成本问题，本发明以提取时间为1.5h作为虫草蛋白提取最佳的条件。
[0075]
(3)料液比对虫草蛋白提取率的影响
[0076]
称取5g蛹虫草干粉于250ml的锥形瓶中，ph调至8.0，改变虫草干粉和水的比例(单位为g/ml)分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40和1:45，超声提取1h，提取液离心后，收集上清液，进行蛋白质含量的测定并计算蛋白质提取率，研究料液比对蛋白质提取效果的影响。
[0077]
测试结果如图3所示。根据图3可以看出，利用超声波提取虫草蛋白时，其提取率受到不同料液比的影响，随着料液比的增加，蛋白质的提取率持续升高，当液料比在1:15～1:25之间时，蛋白质提取率增长的幅度较大，之后增长幅度逐渐降低，考虑到提取过程中溶剂的使用量及后续的浓缩，为了节约成本，故本发明选择料液比为1:25作为虫草蛋白提取最佳条件。
[0078]
(4)超声提取次数对虫草蛋白提取率的影响
[0079]
称取5g蛹虫草干粉于250ml的锥形瓶中，按1g:20ml的料液比向锥形瓶中加入蒸馏水，浸泡30min后用1mol/l naoh溶液将料液的ph调到8.0，调好后放到超声波清洗器中，超声提取次数分别为：1次、2次、3次，每次超声提取1h，提取2次和3次时应合并提取液，合并后的提取液进行离心，收集上清液，进行蛋白质含量的测定并计算蛋白质提取率，研究超声提取次数对蛋白质提取效果的影响。
[0080]
测试结果如图4所示。根据图4可以看出，超声波提取虫草蛋白时，蛋白质的提取率还受到提取次数的影响，当提取第2次时，蛋白质提提取率明显高于提取1次的，当提取次数为3次时，提取率达到最高，但提取3次和2次比较，提取率提高的幅度较小。在工业化生产上，为了能最大化的将原料中的蛋白质提取出来，需要对原料进行多次提取，而提取2次和提取3次蛋白质的提取率接近，为了节约成本，并考虑到后续的浓缩时间，固本实验选择提取2次作为虫草蛋白提取的最佳条件。
[0081]
3、超声波提取虫草蛋白正交实验
[0082]
通过上述单因素实验研究超声波提取虫草蛋白的四个因素对提取率的影响，依据单因素实验的结果，再以ph、提取时间、料液比和提取次数四个因素设计正交试验，实验参数见表1。
[0083]
表1蛹虫草子实体蛋白质提取率正交试验因素水平表
[0084][0085]
正交实验结果见表2。
[0086]
表2超声波提取蛹虫草蛋白正交试验结果
[0087]
[0088][0089]
由表2中的正交试验结果分析可以看出：以虫草蛋白提取率为评价指标，极差大小依次为a》c》d》b，表明ph(a)对虫草蛋白的提取率影响最大，其次是提取时间(c)，影响较小的是料液比(b)和提取次数(d)，而且ph(a)和提取时间(c)对蛋白质提取率的影响较为显著，料液比(b)和提取次数(d)的影响不显著。依据正交试验结果再结合单因素实验的结果，确定超声提取蛹虫草蛋白质条件最佳的组合为a2b2c3d2，即ph＝8.0，料液比＝1:25，提取时间1.5h，提取2次。
[0090]
按照上述最佳条件对蛹虫草干粉进行提取，蛋白提取率为51％，将最优条件下得到的蛋白提取液用0.1mol/l的盐酸溶液将所得蛋白提取液的ph值调节至4，然后进行静置和离心，得到固体产物，将所得固体产物水洗至ph值为7，得到虫草粗蛋白，将所得虫草粗蛋白作为原料进行后续的酶解实验。
[0091]
对比例1回流法提取
[0092]
称取5g蛹虫草干粉于250ml的锥形瓶中，按1g:20ml的料液比向锥形瓶中加入蒸馏水，浸泡30min后用1mol/l naoh溶液将料液的ph调到8.0，调好后放到50℃热回流提取装置中进行提取，提取3次，每次提取时间为1h，合并提取液，将合并后的提取液进行离心(5000r/min)10min，收集上清液，按照实施例1中的方法进行蛋白质含量的测定，结果表明，蛋白质提取率仅为36.77％，图5为超声提取法和回流提取法的蛋白质提取率的对比图。可以看出，本发明采用超声波提取法，能够显著提高蛋白提取率，可能是因为超声波法能够在短时间内使虫草细胞破壁，使蛋白质更好的提取出来，提取率提升至50％以上，而且超声波提取比加热回流法操作简单，提取时间短，副产物少，较大程度的节约了生产成本。
[0093]
实施例2虫草多肽的制备和分离纯化
[0094]
1、本实施例通用的酶解方法为：将虫草粗蛋白溶于蒸馏水中，制成10mg/ml的蛋白溶液，按照不同酶的最佳酶解条件，设置最佳酶解温度、调节最佳ph值，加入蛋白酶充分震荡后，置水浴中进行酶解，酶解完成后，置沸水浴中灭酶活10min，酶解液离心(3500r/min)
15min，收集上清液，利用三氯乙酸(tca)沉淀上清液中未水解的蛋白质，离心(3500r/min)15min，收集上清液，最后测定上清液中多肽的浓度，并计算多肽得率，多肽浓度的测试方法和实施例1中蛋白质含量的测定方法相同，多肽得率的计算方法与式ii相同。
[0095]
2、蛋白酶的选择
[0096]
选用碱性蛋白酶(适宜温度为50～60℃，适宜ph值为9～11)、中性蛋白酶(适宜温度为45～50℃，适宜ph值为6～7.5)、木瓜蛋白酶(适宜温度为55～65℃，适宜ph值为6～7)、胰蛋白酶(适宜温度为37℃，适宜ph值为7.8～8.5)和胃蛋白酶(适宜温度为37℃，适宜ph值为1～3)五种蛋白酶，加酶量均为3000u/g，并依据不同酶的特性，设定酶解条件，并调至最适温度和ph值，对虫草蛋白进行酶解，以多肽得率为指标，筛选出最佳蛋白酶。
[0097]
所得结果如图6所示。通过选择的5种蛋白酶在各自的最适反应条件下，对虫草蛋白溶液进行酶解，因5种酶的酶切位点的差异，酶解的效果也会不同，而所得到的多肽的活性及得率会存在差异。由图6可以看出，5种酶对蛋白的酶解效果有显著差异，其中碱性蛋白酶的酶解效果最好，多肽得率最高。综合实验结果，选取复合酶系水解，采用用碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶(4:3)对蛹虫草蛋白进行水解。采用上述复合酶进行以下的单因素实验，在进行实验时，先将碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照比例混合，然后再进行使用。
[0098]
3、将酶解温度、加酶量、ph值和酶解时间作为多肽得率的4个影响因素，进行单因素试验。
[0099]
(1)酶解温度对虫草多肽得率的影响
[0100]
设置蛋白酶解温度依次为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，在底物蛋白浓度10mg/ml，酶(上述复合酶)添加量3000u/g，酶解液ph 7.0，酶解时间为2h的条件下，按上述酶解工艺进行酶解，研究不同温度对虫草多肽得率的影响。
[0101]
所得结果如图7所示。由图7可知，虫草多肽的得率和酶解的温度有很大的关系，当酶解温度为55℃时，蛹虫草多肽得率最高，当温度继续升高时，多肽得率呈降低的趋势；其原因和酶作为蛋白质的稳定性有关系，当温度升高到一定水平，酶的活力会降低甚至失活，不同的酶，活性不一样，作用位点不一样，所以酶解的最佳温度不同。
[0102]
(2)蛋白酶的加酶量对虫草多肽得率的影响
[0103]
蛋白酶(上述复合酶)的加酶量按照1000u/g、2000u/g、3000u/g、4000u/g、5000u/g进行添加，在底物蛋白浓度10mg/ml，酶解温度50℃，酶解液ph值为7.0，酶解时间2h的条件下，按上述酶解工艺进行酶解，研究不同加酶量对虫草多肽得率的影响。
[0104]
所得结果如图8所示。由图8可知，虫草多肽的得率与加酶量也有关系，随着酶用量的不断增大，多肽的产量也不断增加，当酶的用量增加至6000u/ml时，蛹虫草多肽的得率达到最大，但当加酶量继续增加时，多肽得率开始降低，可能是因为继续增大酶用量会导致酶相互附着，降低酶与底物的传质效率，反而降低反应效率。
[0105]
(3)酶解液的ph值对虫草多肽得率的影响
[0106]
将蛋白溶液的ph值依次调为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在底物蛋白浓度10mg/ml，酶添加量3000u/g，酶解温度50℃，酶解时间2h的条件下，按上述酶解工艺进行酶解，研究不同ph值对虫草多肽得率的影响。
[0107]
所得结果如图9所示。由图9可知，ph也是影响酶解效果的关键因素，在ph为7.5时，蛹虫草蛋白的酶解效率最高，随着ph升高，多肽得率呈降低趋势，其主要原因是ph过高或过
低会导致酶失活，ph的变化影响活性位点的基团解离和底物的解离。
[0108]
(4)酶解时间对虫草多肽得率的影响
[0109]
将酶解时间分别设置为1h、2h、3h、4h、5h，在底物蛋白浓度10mg/ml，酶添加量3000u/g，酶解ph值为7.0，酶解温度为50℃的条件下，按上述酶解工艺进行酶解，研究不同的酶解时间对虫草多肽得率的影响。
[0110]
所得结果如图10所示。由图10可知，在酶解的初始阶段，多肽得率随着酶解时间的延长而升高，当酶解时间达到3h时，多肽得到达到最高值，但随着时间继续延长，多肽得率不再升高，反而有下降的趋势。因此，最佳酶解时间为3h。
[0111]
4、虫草多肽酶解正交实验
[0112]
通过单因素实验，筛选出温度、加酶量、ph值、酶解时间四个因素中对虫草多肽酶解得率影响较大的三个因素水平，进行正交实验，最后确定出虫草多肽酶解的最佳工艺。
[0113]
实验参数见表3。
[0114]
表3蛹虫草多肽酶解正交试验因素水平表
[0115][0116]
正交实验结果见表4。
[0117]
表4蛹虫草多肽酶解正交试验结果与分析
[0118]
[0119][0120]
由表4中的正交试验结果可以看出，影响蛹虫草多肽得率的关键要素是ph值。根据正交实验结果结合单因素实验结果，可得到蛹虫草多肽酶解的最佳条件组合：a1b2c2d2，即温度55℃，ph值为7.0，酶添加量6000u/ml，酶解时间为3h。
[0121]
按照上述最佳条件对粗虫草蛋白进行酶解，具体步骤为：将虫草粗蛋白溶于蒸馏水中，制成10mg/ml的蛋白溶液，调节最佳ph值为7.0，加入复合酶(碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶＝4:3)充分震荡后，复合酶添加量6000u/ml，置55℃水浴中进行酶解，酶解时间为3h，酶解完成后，置沸水浴中灭酶活10min，酶解液离心(3500r/min)15min，收集上清液，利用三氯乙酸(tca)沉淀上清液中未水解的蛋白质，离心(3500r/min)15min，收集上清液，该上清液即为虫草多肽溶液，经计算，在最佳条件下的多肽得率为134.30mg/g(即从每1g蛹虫草子实体中提取得到的多肽的含量为134.30mg)。将所得虫草多肽溶液进行后续实验。
[0122]
实施例3超滤法分离虫草多肽
[0123]
采用分子切割量为30kda、10kda、3kda的三种滤膜对蛹虫草蛋白酶解产物(即实施例2中最佳条件下得到的虫草多肽溶液)进行了过滤。为了防止大分子的杂质堵塞滤膜，采用无纺布滤纸对虫草蛋白酶解液进行粗虑除去大分子杂质；然后采用30kda、10kda、3kda三种超滤膜依次对虫草蛋白酶解液进行分离，并收集分离的滤液，将滤液进行抽真空浓缩，最后测定分离的虫草多肽的含量。
[0124]
通过分子切割量为30kda，10kda，3kda的三种的超滤膜分别对虫草多肽进行分离，可获得4个组分：组分i》30kda、10kda《组分ii《30kda、3kda《组分iii《10kda和组分iv《3kda。将各组分进行抽真空浓缩，所得到的浓缩液采用凯氏定氮法测定浓度，蛹虫草多肽各组分的浓度分别为：组分i 32.13mg/ml、组分ii 13.35mg/ml、组分iii 9.86mg/ml、组分iv 36.62mg/ml。
[0125]
实施例4蛹虫草多肽生物活性的测试
[0126]
对实施例2在最优条件下得到的虫草多肽溶液进行生物活性测试，将上述虫草多肽溶液浓缩，然后将所得浸膏溶解于水中，以配制不同浓度的虫草多肽溶液。
[0127]
具体的测试过程包括以下步骤：
[0128]
1、虫草多肽抗氧化活性的测定
[0129]
(1)虫草多肽对羟自由基(
·
oh)的清除作用
[0130]
运用水杨酸法对多肽清除羟自由基的作用进行测定，羟自由基(
·
oh)是一种强氧化剂，非常活跃。当h2o2与fe
2
离子反应时可释放出
·
oh，
·
oh与水杨酸反应生成二羟基苯甲酸(呈紫色)，于510nm波长处有最大吸收值，若加入能清除
·
oh作用的虫草多肽溶液，就会减少。
·
oh生成，溶液的吸光值就会降低。利用上述原理进行测试，具体为：向试管中依次
加入9mmol/l feso4溶液10ml，96mmol/l水杨酸-乙醇溶液1.0ml，虫草多肽溶液10ml，最后与8.8mmol/l h2o2溶液反应，在37℃恒温水浴30min，在510nm波长处吸光度a2。为了消除虫草多肽溶液本身吸收值的干扰，用1.0ml蒸馏水代替h2o2溶液，在510nm处测其吸光度a1；用10ml蒸馏水代替虫草多肽溶液，在510nm处测其吸光度a0。
[0131]
羟自由基(
·
oh)清除率计算公式如式iii所示：
[0132][0133]
式iii中：a1：未加h2o2时的吸光度值，a2：加虫草多肽溶液时的吸光度值，a0：空白对照的吸光度值
[0134]
图11为不同浓度的虫草多肽溶液对羟自由基的清除作用的测试结果。羟自由基的毒性极强，对人体会产生非常大的危害，在机体内，它可造成多种生物大分子被破坏，最后导致细胞坏死或突变。研究发现加入能清除经自由基的物质后这种损害会降低，所以研究多肽对
·
oh的清除作用在某些疾病的病因、衰老、肿瘤等方面有重要意义。由图11可知，本发明制备的多肽液对
·
oh自由基的清除能力与酶解液浓度成正比。
[0135]
(2)虫草多肽对dpph自由基的清除作用
[0136]
dpph法是测定抗氧化性的一种常用方法，dpph含有单电子及非常稳定的n中心的一种自由基，在无水乙醇中显紫色，于517nm波长处有最大的吸收值。当加入一种具有清除dpph自由基作用的清除剂时，可与dpph的单电子进行配对，使紫色消退，从而降低了dpph溶液的吸光度。利用上述原理进行测试，具体步骤为：用无水乙醇配制浓度为0.125mmol/l的dpph无水乙醇溶液，配制好的溶液避光保存。向试管中分别加入2ml多肽液和2ml dpph无水乙醇溶液，震荡混匀后避光反应30min，517nm处测吸光值a2。同时用无水乙醇代替dpph溶液测定吸光度a1；用无水乙醇代替样液，测定吸光度a0。
[0137]
dpph自由基清除率计算公式如式iv所示：
[0138][0139]
式iv中：a1：虫草多肽溶液与无水乙醇混合液的吸光度值；a2：虫草多肽溶液与dpph混合液的吸光度值；a0：dpph与无水乙醇混合液的吸光度值。
[0140]
图12为不同浓度的虫草多肽溶液对dpph自由基的清除作用的测试结果。dpph自由基其结构简单、反应易受控制，它是广泛用于检测天然物质抗氧化能力的评价指标之一。由图12可知，虫草多肽溶液在较低浓度下就表现出非常强的清除dpph自由基的能力，且虫草多肽溶液对dpph自由基的清除作用具有剂量依赖性。
[0141]
2、虫草多肽抗菌活性的测定
[0142]
水解酪蛋白琼脂(mha)培养基的制备：准确称取水解酪蛋白(m-h)培养基42g，然后加入1000ml蒸馏水，并加热使其充分的溶解，分装到250ml锥形瓶中后，置于高压蒸汽灭菌器中，121℃进行灭菌，时间为15min。
[0143]
以上培养基用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌测抑菌圈直径时使用。
[0144]
虫草多肽抑菌效果的测定：采用纸片扩散法测定其抑菌效果。首先通过涂布法将
细菌接种到平板上(使细菌在平板上能够形成一层均匀的菌膜)，然后将含有虫草多肽(5mg/100ml)的纸片贴在平板上，纸片吸水使多肽溶解后，多肽向纸片周围形成浓度递减的梯度，多肽浓度在一定的范围内会抑制细菌的生长，形成一个无细菌生长的透明圈(抑菌圈)，抑菌圈越大，表明抑菌效果越好。
[0145]
虫草多肽溶液的抑菌效果见表5。
[0146]
表5虫草多肽溶液的抑菌效果
[0147][0148]
根据表5中的数据可以看出，虫草多肽溶液对3种细菌均有不同程度的抑制作用，对于枯草芽抱杆菌的抑制作用稍差，这可能与枯草芽抱杆菌的结构及较强的抵抗力有关系。
[0149]
实施例5虫草多肽口服液的制备
[0150]
1、配方筛选
[0151]
采用实施例2在最优条件下得到的虫草多肽溶液为原料配制多肽口服液，在制备多肽口服液时，先将上述虫草多肽溶液浓缩为浸膏，然后按照所需多肽含量加水溶解，得到多肽液，再按照所需含量加入蜂蜜、柠檬酸和白砂糖，即得到多肽口服液。多肽口服液的成分包括多肽液、蜂蜜、柠檬酸和白砂糖，以感官评价为指标，采用正交试验确定最佳调配成分组合，正交试验的因素水平表如表6所示(余量为水)，口服液的感官评价评分表如表7所示：
[0152]
表6虫草多肽口服液调配成分正交试验因素及水平
[0153][0154]
表7口服液感官评价评分表
[0155][0156]
虫草多肽口服液主要从色泽、组织、气味、口感四个方面进行感官评价，其中色泽占20％，组织占20％，气味占30％，口感占30％，总得分＝色泽
×
20％ 组织
×
20％ 气味
×
30％ 口感
×
30％。
[0157]
正交试验结果见表8。
[0158]
表8虫草多肽口服液调配成分正交试验结果
[0159][0160]
由表8中的极差(r)可知，3种呈味物质对多肽口服液的口感影响存在差异，对于蛹虫草来说，最佳配方为：a2b3c4d2，即多肽含量为30％，蜂蜜为5％，柠檬酸为0.4％，白砂糖为8％；按此配方调配风味得到的口服液口感较好。
[0161]
2、稳定剂筛选
[0162]
按照实施例5确定的最优配方配制虫草多肽口服液，然后向虫草多肽口服液中添加黄原胶和edta-2na作为稳定剂，以离心完的沉淀层的厚度为判断依据确定2种稳定剂的添加量，结果如表9所示。
[0163]
表9稳定剂添加量对口服液稳定性的影响
[0164]
[0165]
由表9可以看出，沉淀层的厚度最小时口服液的稳定效果最好，对于蛹虫草来说，两种物质的添加量为：黄原胶为0.04％，edta-2na为0.2％时口感最好。将调配好的口服液以每瓶50ml的体积分装在玻璃瓶中，采用20kw的微波灭菌设备进行灭菌，作用时间是3分钟，温度为75℃。
[0166]
3、最优配方下多肽口服液的感官与质量指标评价
[0167]
对通过试验筛选出最佳配比的口服液(多肽30％，蜂蜜5％，柠檬酸0.4％，白砂糖8％，黄原胶0.04％，edta-2na 0.2％，余量的水)进行感官与质量指标评价，结果如表10所示，虫草多肽口服液的各项指标均达到了国家标准。
[0168]
表10虫草多肽口服液评价
[0169][0170]
表10中的结果显示，本发明提供的虫草多肽口服液的各项指标均达到了国家标准。
[0171]
实施例6
[0172]
对实施例5中最优配方的虫草多肽口服液的抗肿瘤活性进行测试，采用的细胞为骨肉瘤sao-s细胞株，膀胱癌t24细胞株，具体测试步骤如下：
[0173]
1、测试方法：
[0174]
细胞培养：sao-s细胞培养于含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的dmem培养基中，t24细胞培养于含10％胎牛血清的mccoy’s 5a培养基中，置37℃、5％co2及饱和湿度的恒温孵育箱中培养。取对数生长期的细胞，以0.25％胰酶消化制成细胞悬液进行实验。
[0175]
药物处理：将虫草多肽口服液过滤除菌，采用培养基稀释饮料浓度为3.125％、6.25％、12.5％、25％、50％。
[0176]
mtt法检测sao-s、t24细胞抑制率：sao-s细胞分别以5
×
103个/孔(24h)、3
×
103个/孔(48h)接种于96孔板中，t24细胞分别以7
×
103个/孔(24h)、4
×
103个/孔(48h)接种于96孔板中，每孔加入培养基100μl，置于37℃、5％co2培养箱中培养，细胞贴壁后弃去原培养基，实验组加入含有不同浓度饮料的培养基200μl，饮料终浓度分别为3.125％、6.25％、12.5％、25％、50％，阴性对照组加入等量培养基，并设立无细胞的培养基为调零组，每组设5个复孔。分别于加药24、48h后，弃上清，每孔加入100μl含0.5mg/ml mtt的培养基继续培养4h。小心吸去孔内培养液，每孔加入150μldmso，低速振荡10min，使结晶物充分溶解。酶标仪测定在490nm波长下的吸光值(od值)。分别计算饮料抑制sao-s、t24细胞的24、48h的生长抑制率及ic
50
，计算公式如式v和式vi所示：
[0177]
生长抑制率(％)＝(1-实验组平均od值/对照组平均od值)
×
100％式v；
[0178]
lgic
50
＝xm-i(p-(3-pm-pn)/4)
ꢀꢀꢀꢀ
式vi；
[0179]
式vi中：xm：lg最大剂量；i：lg(最大剂量/相临剂量)；p：阳性反应率之和；pm：最大
阳性反应率；pn：最小阳性反应率
[0180]
2、统计方法
[0181]
采用spss 23.0统计软件进行统计学分析，多组比较符合正态分布时采用单因素方差分析，方差齐采用lsd-t检验，方差不齐采用dunnett’s t3检验。不符合正态分布则采用非参检验。p《0.05差异有统计学意义。
[0182]
3、测试结果
[0183]
测试结果见表11～表12。
[0184]
表11虫草多肽口服液对骨肉瘤sao-s细胞的抑制率
[0185][0186]
注：*与对照组比较p《0.05
[0187]
表12虫草多肽口服液对膀胱癌t24细胞的抑制率
[0188][0189]
注：*与对照组比较p《0.05
[0190]
根据表11中的结果可以看出，随虫草多肽口服液浓度增加以及作用时间的延长，sao-s细胞增殖抑制率逐渐增加。根据表12中的结果可以看出，随虫草多肽口服液浓度增加以及作用时间的延长，t24细胞增殖抑制率逐渐增加。另外，本实验中最大浓度50％的虫草多肽口服液对sao-s、t24细胞24h的抑制率均达到50％以上，48h的抑制率均达到近90％，对两种细胞株抑制作用相当。
[0191]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。