1.本发明涉及菌株培育技术领域，具体涉及具有粘膜免疫调节作用的重组枯草芽孢杆菌的制备方法及重组枯草芽孢杆菌及应用。
背景技术：
2.枯草芽孢杆菌是一种无致病性的安全微生物，其发酵过程会产生有抑菌作用的细菌素，在医药卫生以及畜牧行业中应用非常广泛。目前，枯草芽孢杆菌大都应用于调节肠道微生物菌群，虽然枯草芽孢杆菌有粘膜免疫的相关功能，但也都是建立在调节肠道微生物菌群的前提之上的。
3.粘膜免疫是近几年来人们研究的热点内容，粘膜是与抗原接触的第一个部位，粘膜局部免疫和全身系统免疫对于防御病原体进入机体至关重要。随着分子生物学、细胞生物学和遗传学的渗透，现代免疫学深入到分子和基因水平。
4.绝大多数的病毒感染是通过粘膜途径，病毒感染的细胞和上皮细胞的粘膜面接触后发生的病毒穿胞运输是病毒侵入粘膜的重要方式之一。病毒通过穿胞方式穿过粘膜屏障，然后经由粘膜下的树突状细胞将病毒散布到相应的靶细胞。体外研究表明，粘膜免疫诱导体液免疫应答效应的主要过程是产生分泌型免疫球蛋白a(siga)，siga主要存在于唾液、乳液、胃肠液、呼吸道分泌液等是粘膜部位抵抗病原微生物和有害物质的第一道防线。siga主要通过阻抑黏附、免疫排除、溶解细菌、中和病毒等机制来行使其多种生物功能。siga除了为粘膜表面提供一个免疫屏障防止微生物的黏附外，还具有抗炎症和调理作用。
5.目前，尚未有具有特异性粘膜免疫调节功能的枯草芽孢杆菌的制备工艺。
技术实现要素：
6.为解决现有技术存在的不足，本发明提供了具有粘膜免疫调节作用的重组枯草芽孢杆菌的制备方法。
7.本发明的技术方案为：
8.具有粘膜免疫调节作用的重组枯草芽孢杆菌的制备方法，包括如下步骤：
9.s1：将枯草芽孢杆菌的外壳蛋白cotc启动子重组到pus186质粒中，同时将ltb蛋白重组在pgex载体上；将重组后的pus186质粒与pgex载体进行再重组后，表达出pus186-cotc-ltb质粒。
10.s2：将pus186-cotc-ltb质粒转化到枯草芽孢杆菌中，使ltb蛋白被定向表达于枯草芽孢杆菌的芽孢壁，获得重组枯草芽孢杆菌。
11.重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌由上述的制备方法制备。
12.进一步的，所述重组枯草芽孢杆菌具有粘膜免疫调节作用。
13.本发明所达到的有益效果为：
14.ltb是由肠产毒型大肠埃希氏杆菌大肠杆菌不耐热肠毒素b亚基，其分子量约为
11.6kd，由两个α螺旋和六个β片层结构组成，其n端和c端各有一个半胱氨酸残基，可形成二硫键连接两个末端。ltb能促进t细胞的活化与分化或诱导th1和th2型细胞因子的分泌而呈现调节粘膜免疫的功能。
15.通过本发明方法制备出的重组枯草芽孢杆菌与现有枯草芽孢杆菌相比，
16.1、本发明重组枯草芽孢杆菌具有粘膜免疫调节作用。
17.2、本发明重组枯草芽孢杆菌能显著提高siga水平，与传统枯草芽孢杆菌相比，使用本发明重组枯草芽孢杆菌的肠粘膜siga(单位：ug/g port)含量为12.42，不使用者其含量为9.16，使用后提高35.59％。
18.3、本发明重组枯草芽孢杆菌能增强畜禽抵抗能力，减少畜禽发病机会。具体的，使用本发明重组枯草芽孢杆菌的胸腺指数、法氏囊指数、脾脏指数分别为0.63％、0.41％、0.18％，不使用者分别为0.59％、0.36％、0.15％，分别提高了6.78％、14.29％、20.00％
19.本发明重组枯草芽孢杆菌的可应用于口服免疫调节剂中，使用方便。
具体实施方式
20.为便于本领域的技术人员理解本发明，下面结合实施例说明本发明的具体实施方式。
21.实施例1
22.具有粘膜免疫调节作用的重组枯草芽孢杆菌的制备方法，包括如下步骤：
23.s1：将枯草芽孢杆菌的外壳蛋白cotc启动子重组到pus186质粒中，同时将ltb蛋白重组在pgex载体上。将重组后的pus186质粒与pgex载体进行再重组后，表达出pus186-cotc-ltb质粒。上述重组方法采用本领域通用的重组方法进行。
24.s2：将pus186-cotc-ltb质粒转化到枯草芽孢杆菌中，使ltb蛋白被定向表达于枯草芽孢杆菌的芽孢壁，获得重组枯草芽孢杆菌。
25.通过上述方法制备的重组枯草芽孢杆菌具有粘膜免疫调节作用。
26.具体的，严格按照spf环境饲养spf小白鼠，设空白对照组、重组枯草芽孢杆菌组，分别在第0、1、2天；15、16、17天；30、31、32天用灌胃针经口给与5
×
109枯草芽孢杆菌(对照组不灌服)，于45天进行肠道包含内容物siga检测。
27.检测结果如下：本发明重组枯草芽孢杆菌能显著提高siga水平，与空白对照组相比，使用本枯草芽孢杆菌的肠粘膜siga(单位：ug/g port)含量为12.42，不使用者其含量为9.16，使用后提高35.59％。
28.另外，选择1日龄健康aa肉鸡480只，随机分为4个处理，每个处理6个重复，每个重复20只。对照组饲喂基础日粮，不添加任何成分；实验组在对照组基础日粮的基础上添加重组枯草芽孢杆菌。于42天实施安乐死后进行屠宰检测免疫器官指数。
29.检测结果如下：使用本发明重组枯草芽孢杆菌的胸腺指数、法氏囊指数、脾脏指数分别为0.63％、0.41％、0.18％，不使用者分别为0.59％、0.36％、0.15％，分别提高了6.78％、14.29％、20.00％。
30.另外，实验对象：湖北某养猪场。实验方案：对照组65头，基础饲料喂养；实验组73头，基础饲料 添加有本发明中的重组枯草芽孢杆菌。
31.表1：实验组和对照组数据比对
[0032] 实验组(73头)对照组(65头)初重(千克/头)9.829.91末重(千克头)35.1232.86增重(千克/头)25.3022.95吃料总量(千克)2787.652327.33吃料量(千克/头)38.1935.81料重比1.511.56死淘数量13死淘率1.25％4.29％
[0033]
由表1可以看出，实验组每头猪比对照组多吃料2.38千克，提高比例为6.65％；实验组每头猪增重比对照组增加2.35千克，增加比例为10.24％；实验组料重比比对照组降低0.05，降低比例为3.21％。实验组死淘猪只比对照组少2头，减少比例为66.67％。
[0034]
由此可以证明，在饲料中添加本发明中的重组枯草芽孢杆菌，可以降低猪的死淘率。
[0035]
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
技术特征：
1.具有粘膜免疫调节作用的重组枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：将枯草芽孢杆菌的外壳蛋白cotc启动子重组到pus186质粒中，同时将ltb蛋白重组在pgex载体上；将重组后的pus186质粒与pgex载体进行再重组后，表达出pus186-cotc-ltb质粒；s2：将pus186-cotc-ltb质粒转化到枯草芽孢杆菌中，使ltb蛋白被定向表达于枯草芽孢杆菌的芽孢壁，获得重组枯草芽孢杆菌。2.重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌由权利要求1所述的制备方法制备。3.根据权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌可应用于口服免疫调节剂。
技术总结
本发明涉及菌株培育技术领域，具体涉及具有粘膜免疫调节作用的重组枯草芽孢杆菌的制备方法及重组枯草芽孢杆菌及应用。方法包括S1：将枯草芽孢杆菌的外壳蛋白CotC启动子重组到pUS186质粒中，同时将LTB蛋白重组在pGEX载体上；将重组后的pUS186质粒与pGEX载体进行再重组后，表达出pUS186-CotC-LTB质粒。S2：将pUS186-CotC-LTB质粒转化到枯草芽孢杆菌中，使LTB蛋白被定向表达于枯草芽孢杆菌的芽孢壁，获得重组枯草芽孢杆菌。通过本方法制备的重组枯草芽孢杆菌具有粘膜免疫调节作用，可应用于口服免疫调节剂。用于口服免疫调节剂。
技术研发人员：庄学昌
受保护的技术使用者：山东邦盛达生物科技有限公司
技术研发日：2021.11.30
技术公布日：2022/3/3
再多了解一些
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