羟基蛋氨酸锌及其在增强巨噬细胞吞噬功能上的应用的制作方法

1.本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及羟基蛋氨酸锌及其在增强巨噬细胞吞噬功能上的应用。


背景技术：

2.巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞属于吞噬细胞，在机体免疫功能中发挥着重要的角色。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2-3周，多用做原代培养，难以长期生存。已有的研究表明，生物机体内的巨噬细胞可以随着微环境的变化而改变它们的表型和免疫功能，不断根据自身受到的刺激来改变自己的生理状态和免疫活性，从而更好的保证生物体机体和组织的健康。不同的刺激物质包括机体自身蛋白分子、小分子物质、真菌和细菌的提取物等能够刺激并激活巨噬细胞，从而增强巨噬细胞免疫反应和吞噬能力。
3.羟基蛋氨酸又名蛋氨酸羟基类似物，是一种酸性很强的深褐色粘稠液体有机酸，含水量约为12％，有硫化物气味，易溶于水，相对密度为1.22-1.23(120℃)，ph值为1-2，存在20％的二聚体和3％的多聚体。目前，已有羟基蛋氨酸锌的制备方法的研究，例如中国专利申请号200310110456.5添加剂羟基蛋氨酸锌微量元素的制备方法，公开了一种添加剂羟基蛋氨酸锌微量元素的制备方法，其特点是：液体羟基蛋氨酸与氧化锌溶液以摩尔比为1:1，在温度80-90℃下，控制ph值6-8，常压条件下反应1.5-2小时，生成羟基蛋氨酸锌螯合物，经离心分离、水洗、烘干、粉碎、包装成成品。但是这样的制备方法，由于羟基蛋氨酸中二聚体和多聚体的存在，制备羟基蛋氨酸锌时，氧化锌或氢氧化锌与羟基蛋氨酸开始时很难进行混合，反应也很难起来，但一旦两者发生反应，反应就会很剧烈，反应速度又很快，一方面会使反应容器内的压力迅速增加，且产生大量的热量，从而造成反应速度、压力和温度难以控制，而温度过高，产物羟基蛋氨酸锌会发生分解或焦化；另一方面，一部分物料(如氧化锌或氢氧化锌或中间产物等)极容易被包裹成大团或大块，无法充分参与反应，造成反应原料量相对不足，反应不充分，中间产物较多，产品纯度不高，从而影响产物得率和质量，而且物料被包裹成大团或大块后，里面的水份在干燥时很难蒸发出来，影响物料整体干燥，使物料干燥时间大大延长，导致整个生产时间比较长，影响了产量。
4.在大多数脊椎动物细胞中，吞噬作用是保护机体处于健康状态的措施而非摄食的手段，吞噬作用的强弱是表现巨噬细胞免疫功能强弱及活性的重要标志，通过免疫细胞的吞噬作用，可以直接研究免疫学中巨噬细胞的相关作用，并深入揭示细胞吞噬这一动态过程。


技术实现要素：

5.针对现有技术中巨噬细胞的免疫反应和吞噬能力不稳定的问题，本发明提供了羟基蛋氨酸锌及其在增强巨噬细胞吞噬功能上的应用，制备得到一种羟基蛋氨酸锌，应用到
巨噬细胞中，可以增强巨噬细胞免疫反应和吞噬能力。
6.本发明的目的通过以下技术方案来实现：
7.羟基蛋氨酸锌的制备方法，包括如下步骤：
8.1)将羟基蛋氨酸、氧化锌和水混合于密闭容器中，再加入相当于水质量0.3-0.5％的甘油硬脂酸酯，进行高压反应，所述的羟基蛋氨酸与氧化锌的摩尔比为2:(1.1-1.2)，水的添加量为羟基蛋氨酸和氧化锌总质量的3-8％；高压反应的压力控制在0.15-0.5mpa，反应温度控制在120-180℃，反应时间为0.5-1.0h；
9.2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
10.3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，得到羟基蛋氨酸锌，羟基蛋氨酸锌的粒径为400-800um，羟基蛋氨酸锌的孔隙率为60-70％。
11.本发明中：
12.步骤1)中所述的羟基蛋氨酸与氧化锌的摩尔比为2:(1.1-1.2)，氧化锌过量，目的是促使羟基蛋氨酸酸反应更彻底，提高羟基蛋氨酸的利用率，降低羟基蛋氨酸锌的生产成本，同时，由于羟基蛋氨酸粘度高，氧化锌适当过量也可降低产物的粘度。
13.步骤1)中所述水的添加量为羟基蛋氨酸和氧化锌总质量的5-10％，优选水的添加量为羟基蛋氨酸和氧化锌总质量的8％，加入适量水，一方面，降低反应物的粘度，有利反应物混合均匀，有利于提高产率，另一方面，在密闭容器中的反应提供足够的蒸汽压，有利于的介孔的形成；如果水的添加量过低，则混合效果降低，且不能提供足够的蒸汽，水的添加量过高，降低了反应物的浓度，会降低反应速度，而且，水量过多，产生的蒸汽多，不利于反应压力的控制，更不利于后续的瞬间卸压。
14.步骤1)中所述高压反应的压力控制在0.3-0.7mpa，控制适当的压力提高反应速度，同时，有利于容器中的水形成蒸汽并进入到产物颗粒中，压力太低，蒸汽不能顺利进入颗粒内部，压力太高，不利于形成颗粒，产物颗粒的粒径减少，降低了产物的性能，优选地，压力控制在0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mpa。
15.步骤2)中所述将高压反应的密闭容器瞬间卸压，通过将密闭反应容器中压力瞬间卸除，使反应产物颗粒中的蒸汽瞬间冲出，由于是瞬间卸压，颗粒中中蒸汽位置没有被填充，形成介孔，从而得到高活性，如果卸压时间太长，颗粒中蒸汽不能瞬间溢出，随着反应容器中压力和温度缓慢降低，颗粒中孔洞结构坍塌，得不到高活性。
16.步骤3)所述的真空干燥，真空度为0.04-0.08mpa，温度为80-120℃，真空干燥时间为1-2h。
17.步骤3)所述的羟基蛋氨酸锌，通过控制羟基蛋氨酸锌的粒径为400-800um，提高产物颗粒的粒径，有利于提高产物流动性，减少产物粘壁性，同时，能有效降低生产和使用过程中粉尘量，提供干净的劳动环境；进一步优选地，所述粒径为400-600um。
18.本发明还涉及采用上述羟基蛋氨酸锌的制备方法得到的羟基蛋氨酸锌，羟基蛋氨酸锌的粒径为400-800um，羟基蛋氨酸锌的孔隙率为50-60％。
19.同时，本发明还涉及上述羟基蛋氨酸锌在增强巨噬细胞吞噬功能上的应用。
20.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
21.1、本发明所述的羟基蛋氨酸锌的制备方法，通过将密闭反应容器中压力瞬间卸除，使反应产物颗粒中的蒸汽瞬间冲出，由于是瞬间卸压，颗粒中中蒸汽位置没有被填充，
形成介孔，从而得到高活性，如果卸压时间太长，颗粒中蒸汽不能瞬间溢出，随着反应容器中压力和温度缓慢降低，颗粒中孔洞结构坍塌，得不到高活性。
22.2、本发明所述的羟基蛋氨酸锌的制备方法，通过在高压反应过程中加入甘油硬脂酸酯，会随着水形成蒸汽并进入到产物颗粒中，在后续瞬间卸压的过程中，甘油硬脂酸酯会进入到颗粒中，利用甘油硬脂酸酯在耐热性好、粘度高、耐水解好的特点，具有很强的乳化性能和特殊的稳定性，可以支撑产物颗粒介孔的形成，防止颗粒中孔洞结构坍塌，从而得到高活性。
23.3、本发明得到的的羟基蛋氨酸锌，使羟基蛋氨酸锌产物与溶液的接触面积增加，促进了羟基蛋氨酸锌溶解速度，有效提高了羟基蛋氨酸锌的吸收利用率；但当孔隙率过高，产物的溶解速度过快，产物在短时间内被大量吸收，然而，有机体在短时间对羟基蛋氨酸锌的利用率有限，羟基蛋氨酸锌得不到利用而浪费，同时，给细胞造成了巨大负担。因此，保持一定孔隙率，通过控制羟基蛋氨酸锌的孔隙率为50-60％适合在增强巨噬细胞吞噬功能上的应用。
附图说明
24.图1是本发明实施例1制备得到的羟基蛋氨酸锌颗粒的介孔的放大图；
25.图2是本发明实施例2制备得到的羟基蛋氨酸锌颗粒的介孔的放大图。
具体实施方式
26.以下通过实施例进一步详细描述本发明，但这些实施例不应认为是对本发明的限制。
27.实施例1：
28.羟基蛋氨酸锌的制备方法，包括如下步骤：
29.1)将羟基蛋氨酸、氧化锌和水混合于密闭容器中，再加入相当于水质量0.4％的甘油硬脂酸酯，进行高压反应，所述的羟基蛋氨酸与氧化锌的摩尔比为2:1.1，水的添加量为羟基蛋氨酸和氧化锌总质量的8％；高压反应的压力控制在0.5mpa，反应温度控制在120℃，反应时间为1.0h；
30.2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
31.3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，真空度为0.6mpa，温度为100℃，真空干燥时间为1.5h，得到羟基蛋氨酸锌，羟基蛋氨酸锌的粒径为400-600um，羟基蛋氨酸锌的孔隙率为60.74％。
32.实施例2：
33.羟基蛋氨酸锌的制备方法，包括如下步骤：
34.1)将羟基蛋氨酸、氧化锌和水混合于密闭容器中，再加入相当于水质量0.3％的甘油硬脂酸酯，进行高压反应，所述的羟基蛋氨酸与氧化锌的摩尔比为2:1.2，水的添加量为羟基蛋氨酸和氧化锌总质量的5％；高压反应的压力控制在0.3mpa，反应温度控制在110℃，反应时间为1.0h；
35.2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
36.3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，真空度为0.04mpa，温度为120
℃，真空干燥时间为2h，得到羟基蛋氨酸锌，羟基蛋氨酸锌的粒径为400-600um，羟基蛋氨酸锌的孔隙率为59.20％。
37.实施例3：
38.羟基蛋氨酸锌的制备方法，包括如下步骤：
39.1)将羟基蛋氨酸、氧化锌和水混合于密闭容器中，再加入相当于水质量0.5％的甘油硬脂酸酯，进行高压反应，所述的羟基蛋氨酸与氧化锌的摩尔比为2:1.15，水的添加量为羟基蛋氨酸和氧化锌总质量的10％；高压反应的压力控制在0.7mpa，反应温度控制在150℃，反应时间为0.5h；
40.2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
41.3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，真空度为0.08mpa，温度为80℃，真空干燥时间为1h，得到羟基蛋氨酸锌，羟基蛋氨酸锌的粒径为400-800um，羟基蛋氨酸锌的孔隙率为57.33％。
42.实施例4：
43.羟基蛋氨酸锌的制备方法，包括如下步骤：
44.1)将羟基蛋氨酸、氧化锌和水混合于密闭容器中，再加入相当于水质量0.45％的甘油硬脂酸酯，进行高压反应，所述的羟基蛋氨酸与氧化锌的摩尔比为2:1.1，水的添加量为羟基蛋氨酸和氧化锌总质量的6％；高压反应的压力控制在0.4mpa，反应温度控制在130℃，反应时间为0.6h；
45.2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
46.3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，真空度为0.05mpa，温度为90℃，真空干燥时间为1.2h，得到羟基蛋氨酸锌，羟基蛋氨酸锌的粒径为400-800um，羟基蛋氨酸锌的孔隙率为50.54％。
47.对比例1：
48.现有常规羟基蛋氨酸锌(粒径400-700um的实心颗粒)。
49.对比例2：
50.和实施例1相比，步骤1)中没有加入甘油硬脂酸酯，其他同实施例1。
51.实验例：
52.锌对腹腔巨噬细胞吞噬功能影响，研究羟基蛋氨酸锌对腹腔巨噬细胞吞噬功能影响，测定巨噬细胞胞内camp、cgmp含量及camp/cgmp水平。
53.1材料及方法
54.1.1实验动物模型建立
55.断奶1-3d纯系wistar大鼠，按照吴嘉惠等报道方法建立大鼠缺锌、高锌模型。动物分实施例1组、对比例1组、对比例2组及空白对照组(缺锌组)，喂养4周后活杀。
56.使用实施例1制备的羟基蛋氨酸锌，对比例1得到的常规实心羟基蛋氨酸锌、对比例2得到的羟基蛋氨酸锌。
57.1.2主要试剂
58.lps(细菌脂多糖sigma)；zymosan(酵母多糖zasigma)；rpmi-1640(gibco)；h-camp、h-cgmp药盒(中国原子能研究所产品)。
59.金黄色葡萄球菌悬液，金黄色葡萄球菌atcc31240株接种于肉汤培养管中，37℃孵
化48h，离心，冷hbss液洗3次，rpmi-1640调细胞浓度至5
×
107/ml。
60.1.3大鼠腹腔巨噬细胞分离及处理
61.参照王宇飞等报道方法获取大鼠腹腔巨噬细胞，巨噬细胞纯度检查达94％，2％台盼蓝排斥染色法测细胞活力达95％，5％fbs rpmi-1640为腹腔巨噬细胞培养基，调细胞浓度为5
×
106/ml，冰浴备用。
62.1.4腹腔巨噬细胞吞噬功能检测
63.参照谢哲子报道方法进行测定。将制备的腹腔巨噬细胞悬液0.5ml与0.5ml金葡菌悬液混匀，37℃孵化培养2h，涂片，jenner-giemsa染色，油镜下检测500个巨噬细胞，结果以吞噬率及吞噬指数表示。
64.吞噬率＝阳性细胞(吞噬了细菌的腹腔巨噬细胞)/腹腔巨噬细胞数
×
100％
65.吞噬指数＝吞噬细菌总数/100个腹腔巨噬细胞
66.1.5腹腔巨噬细胞内camp、cgmp测定
67.取2ml腹腔巨噬细胞悬液(5
×
106/ml)，加入lps(终浓度5μg/ml)作用15min后移入camp测定管及cgmp测定管各1ml，样品中camp及cgmp用加热法提取。测定方法见药盒说明书。
68.2结果
69.2.1表1：锌对腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数的影响(x
±
s)
[0070] n吞噬率吞噬指数实施例1组1050.60
±
4.33a242.83
±
31.10a对比例1组1040.97
±
5.49b201.39
±
34.67b对比例2组1041.58
±
5.47b205.64
±
33.67b空白对照组1019.58
±
6.10c125.56
±
25.81cp值 《0.05《0.05
[0071]
实施例1组和对比例1组、对比例2组及空白对照组相比，吞噬率和吞噬指数差异显著。
[0072]
2.2表2：锌对腹腔巨噬细胞内camp/cgmp水平的影响
[0073][0074]
实施例1组和对比例1组、对比例2组及空白对照组相比，camp、cgmp和camp/cgmp差异显著。
[0075]
3讨论：
[0076]
3.1、通过实施1组和对比例组、空白对照组的比较，说明本发明得到的羟基蛋氨酸锌，是高活性羟基蛋氨酸锌，结果表明：在腹腔巨噬细胞吞噬功能实验中添加羟基蛋氨酸锌，使羟基蛋氨酸锌产物与溶液的接触面积增加，促进了羟基蛋氨酸锌溶解速度，有效提高
了羟基蛋氨酸锌的吸收利用率，维持细胞中锌含量水平，相比对比例1的现有常规羟基蛋氨酸锌、对比例2得到的现有羟基蛋氨酸锌，可以提高腹腔巨噬细胞的吞噬率及吞噬指数。
[0077]
原因分析是巨噬细胞被激活后发挥吞噬杀菌功能，巨噬细胞激活分为触发应答、启动兴奋及激活发展3阶段，病原体接触到静止巨噬细胞受体时作为第一信使，使胞内生成第二信使(camp/cgmp
↑
)，激发胞内生理生化反应，成为应答巨噬细胞，再受到lps第二类信号刺激，迅速引起胞内ca
2
浓度聚增，成为激发巨噬细胞，增强了腹腔巨噬细胞杀菌功能。
[0078]
3.2、通过实施1组和对比2组的比较，说明本发明在制备羟基蛋氨酸锌的过程中，通过在高压反应过程中加入甘油硬脂酸酯，会随着水形成蒸汽并进入到产物颗粒中，在后续瞬间卸压的过程中，甘油硬脂酸酯会进入到颗粒中，利用甘油硬脂酸酯在耐热性好、粘度高、耐水解好的特点，具有很强的乳化性能和特殊的稳定性，可以支撑产物颗粒介孔的形成，防止颗粒中孔洞结构坍塌，从而得到羟基蛋氨酸锌，在腹腔巨噬细胞吞噬功能实验中添加羟基蛋氨酸锌，可以使培养基中锌含量维持在一个稳定的水平，不会使巨噬细胞缺锌，也不会使巨噬细胞突然处于高锌环境下，从而影响巨噬细胞的性能，本发明羟基蛋氨酸锌有利于巨噬细胞吸收利用，满足巨噬细胞对锌的需要，对腹腔巨噬细胞内camp/cgmp水平产生积极影响。
[0079]
对比例2组巨噬细胞胞内camp浓度、camp/cgmp水平缺锌组明显降低，实施例1组明显升高。原因分析是对比例2组巨噬细胞经lps作用后胞内第二信使分子camp生成减少，camp/cgmp水平降低，导致呼吸爆发功能降低，巨噬细胞活化受抑；实施例1组巨噬细胞胞内camp含量、camp/cgmp水平较高，经lps作用后升高的camp及camp/cgmp水平可能引起胞内ca
2
浓度骤增，增强了腹腔巨噬细胞杀菌功能。
[0080]
通过实施例和对比例的基本性能的比较，说明实施例的制备方法明显优于对比例。