用于荧光成像的系统和方法与流程

用于荧光成像的系统和方法
1.优先权声明
2.本技术要求于2020年4月1日提交的序列号为63/003,383的美国专利申请的优先权，其内容通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.包括图像对准和发光光强度校正的图像处理是用于若干程序的数据处理步骤之一，所述程序诸如基于光的脱氧核糖核酸(dna)测序、具有多种染料的免疫组织化学和其他基于图像的程序。图像处理可以包括在x和y方向上的图像移动、旋转、拉伸和强度校正。执行此类图像处理以在不同的测序循环中对准多个测序图像，以确定dna簇的序列。


技术实现要素：

4.我们在此描述了在用于微流控装置(例如，微流控室或流动池)的荧光成像的背景下使用的对准系统和方法。对准标记可以由荧光材料、反光材料或在荧光图像中显得较暗的材料形成。这些对准标记可以形成对准图案，可以极大地促进多幅图像的对准，提高计算效率和处理时间。例如，多幅图像的处理(例如对准)与边合成边测序(sbs)过程相关，其中在sbs过程的多个循环中在多个发射波长处捕获多幅图像。结合这些图像，可以生成微流控室的衬底上dna簇的位置和标识图。这些多幅图像可以使用固定的对准模式对准，从而极大地促进对准并减少sbs过程的计算负担。
5.在一个方面，用于分析样品荧光的微流控装置包括第一衬底；和第二衬底，其中所述第二衬底是光学透明的；粘结层，设置于所述第一衬底与所述第二衬底之间；以及限定在所述第一衬底和所述第二衬底之间的微流控室。所述第一衬底和所述第二衬底以及所述粘结层形成所述微流控室的壁。所述微流控装置包括与所述微流控室的所述壁中的至少一个结合的寡核苷酸；并且荧光材料设置在所述微流控室的所述壁中的至少一个上并形成对准图案。
6.实施例可以包括以下特征中的一个或以下特征中的两个或更多个的任意组合。
7.所述荧光材料包括设置在所述微流控通道的至少一个壁上的光致抗蚀剂。
8.所述荧光材料包括结合或粘附到所述微流控通道的至少一个壁的荧光分子。
9.所述荧光材料设置在由所述第一衬底形成的所述微流控通道的第一壁、由第二衬底形成的所述微流控通道的第二壁上，或两者上。
10.所述荧光材料设置在由所述粘结层形成的所述微流控通道的侧壁上。
11.所述荧光材料部分地嵌入所述微流控通道的至少一个壁中。
12.所述荧光材料包括由荧光团标记的寡核苷酸标记的参考寡核苷酸。每个参考寡核苷酸由两个或更多个荧光团标记的寡核苷酸标记。
13.所述对准图案包括预定图案或随机图案。
14.样品的荧光在多个发射波长处被检测，并且其中所述荧光材料至少在所述多个发射波长之一处发荧光。
15.在一个方面，一种用于分析样品荧光的系统包括微流控装置和荧光显微镜，所述荧光显微镜配置为捕获所述微流控装置的所述微流控室中的测序反应的荧光图像。所述微流控装置包括第一衬底；和第二衬底，其中所述第二衬底是光学透明的；粘结层，设置于所述第一衬底与所述第二衬底之间；以及限定在所述第一衬底和所述第二衬底之间的微流控室。所述第一衬底和所述第二衬底以及所述粘结层形成所述微流控室的壁。所述微流控装置包括与所述微流控室的所述壁中的至少一个结合的寡核苷酸；以及荧光材料，设置在所述微流控室的所述壁中的至少一个上并形成对准图案。所述微流控装置的方面可以包括前述特征中的一个或前述特征中的两个或更多个的任意组合。
16.在一个方面，制造用于分析样品的荧光的微流控装置的方法包括以对准图案将荧光材料设置在第一衬底的表面上；将寡核苷酸结合到所述第一衬底的表面或在第二衬底上；以及用粘结层将所述第一衬底附接至所述第二衬底。微流控室限定在所述第一衬底和所述第二衬底之间，且所述第一衬底的表面、所述第二衬底的表面和粘结层形成的所述微流控室的壁。所述第一衬底或所述第二衬底中的至少一个是光学透明的。
17.实施例可以包括以下特征中的一个或以下特征中的两个或更多个的任意组合。
18.将所述荧光材料设置在所述第一衬底的表面上包括将光致抗蚀剂设置在所述第一衬底上。
19.将所述荧光材料设置在第一衬底的表面上包括将荧光分子设置在第一衬底上。
20.所述方法包括使用光刻法在所述荧光材料的层中限定所述对准图案。
21.所述方法包括在所述第一衬底的表面上以对准图案印刷所述荧光材料。
22.所述方法包括在所述第一衬底中限定所述对准图案；以及至少部分地用所述荧光材料填充限定的图案。所述方法包括在所述第一衬底中蚀刻所述对准图案。
23.将所述寡核苷酸设置在所述第一衬底的表面上或所述第二衬底的表面上包括：将所述寡核苷酸结合到所述第一衬底的表面上或结合到所述第二衬底的表面上。
24.在一个方面，一种用于分析样品的微流控装置包括第一衬底；第二衬底，其中所述第二衬底是光学透明的；粘结层，设置于所述第一衬底与所述第二衬底之间；以及限定在所述第一衬底和所述第二衬底之间的微流控室。所述第一衬底和所述第二衬底以及所述粘结层形成所述微流控室的壁。所述微流控装置包括与所述微流控室的所述壁中的至少一个结合的一组寡核苷酸，其中该组寡核苷酸的每条链包括用于簇生成(例如，桥式扩增)的引物；和结合到所述微流控室的所述壁中的至少一个上的一组参考寡核苷酸，其中该组参考寡核苷酸配置为产生对准标记。在一些实施例中，所述第一衬底和/或所述第二衬底在多个发射波长中的每个处是光学透明的。
25.实施例可以包括以下特征中的一个或以下特征中的两个或更多个的任意组合。
26.该组参考寡核苷酸的每条链包括两个或更多个用于边合成边测序的阅读引物。
27.该组参考寡核苷酸的每条链包括用于边合成边测序的阅读引物，其中所述阅读引物不同于所述第一组寡核苷酸的所述阅读引物。
28.该组参考寡核苷酸配置为具有比dna簇的平均信号强度更高的信号强度。
29.该组参考寡核苷酸被荧光染料标记。
30.该组参考寡核苷酸被荧光猝灭剂标记。
31.在一个方面，制造用于分析样品荧光的微流控装置的方法包括：将第一组寡核苷
酸结合到第一衬底的表面，其中所述第一组寡核苷酸包括用于簇生成(例如，桥式扩增)的引物。所述方法包括将第二组寡核苷酸结合到所述第一衬底的表面或第二衬底的表面，其中所述第二组寡核苷酸配置为产生对准图案。所述方法包括用粘结层将所述第一衬底附接到所述第二衬底，使得微流控室限定在所述第一衬底和所述第二衬底之间，并且使得所述第一衬底的表面、所述第二衬底的表面和所述粘结层形成所述微流控室的壁。所述第一衬底或所述第二衬底中的至少一个在多个发射波长中的每个处是光学透明的。
32.在一个方面，微流控装置包括第一衬底；第二衬底；第一粘结层，设置于所述第一衬底与所述第二衬底之间；以及限定在所述第一衬底和所述第二衬底之间的第一微流控通道。所述第一衬底和所述第二衬底以及所述第一粘结层形成所述第一微流控通道的壁。所述微流控装置包括第三衬底；第二粘结层，设置于所述第二衬底与所述第三衬底之间；以及限定在所述第二衬底和所述第三衬底之间的第二微流控通道。所述第二衬底和所述第三衬底以及所述第二粘结层形成所述第二微流控通道的壁。
33.实施例可以包括以下特征中的一个或以下特征中两个或更多个的任意组合。
34.所述微流控装置包括寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述第一微流控通道的所述壁中的至少一个和所述第二微流控通道的所述壁中的至少一个结合，其中所述第一组寡核苷酸包括用于桥接以进行扩增的引物。
35.入口和出口限定在所述第一衬底中。
36.入口限定在所述第一衬底中并且出口限定在所述第三衬底中。
37.所述第一微流控通道和所述第二微流控通道以流体方式并联连接。
38.所述第一微流控通道和所述第二微流控通道以流体方式串联连接。
39.所述微流控装置包括第四衬底；第三粘结层，设置于所述第三衬底与所述第四衬底之间；以及第三微流控通道，限定在所述第三衬底和所述第四衬底之间。所述第三衬底和所述第四衬底以及所述第三粘结层形成所述第三微流控通道的壁。出口限定在所述第四衬底中。所述第一微流控通道、所述第二微流控通道和所述第三微流控通道以流体方式串联。
40.所述第一微流控通道、所述第二微流控通道和所述第三微流控通道以流体方式串联连接。
41.所述第一衬底、所述第二衬底、所述第三衬底和/或所述第四衬底是光学透明的。
42.在一方面，用于分析样品荧光的微流控装置包括：由第一内表面和第二内表面限定的微流控室；与所述微流控室的所述第一内表面结合的第一组寡核苷酸；以及固定到所述微流控室的一个或更多个对准标记，形成用于所述第一内表面的对准图案。
43.实施例可以包括以下特征中的一个或以下特征中的两个或更多个的任意组合。
44.所述对准标记是荧光标记、反光标记或暗标记。所述荧光标记由荧光团形成。所述反光标记由反光材料形成。所述暗标记由荧光猝灭剂形成。所述暗标记是通过去除位于暗标记处的一个或更多个寡核苷酸形成的。
45.所述对准标记由一组参考寡核苷酸形成。所述参考寡核苷酸的每条链具有两个或更多个阅读引物，用于边合成边测序。所述参考寡核苷酸的每条链都有阅读引物，用于边合成边测序。所述参考寡核苷酸的每条链中的所述阅读引物不同于用于样品分析的阅读引物。所述参考寡核苷酸由荧光猝灭剂标记。所述参考寡核苷酸由荧光团标记。
46.所述对准标记沉积在所述第一内表面上或嵌入所述第一内表面中。
47.所述微流控室包括第二内表面，并且第二组寡核苷酸结合到所述微流控室的所述第二内表面，其中一个或更多个对准标记形成用于所述第二内表面的对准图案。所述微流控室包括第三内表面，并且第三组寡核苷酸结合到所述微流控室的所述第三内表面，其中一个或更多个对准标记形成用于所述第三内表面的对准图案。所述微流控室包括第四内表面，并且第四组寡核苷酸结合到所述微流控室的所述第四内表面，其中一个或更多个对准标记形成用于所述第四内表面的对准图案。所述微流控室包括第五内表面，并且第五组寡核苷酸结合到所述微流控室的所述第五内表面，其中一个或更多个对准标记形成所述第五内表面的对准图案。所述微流控室包括第六内表面，并且第六组寡核苷酸结合到所述微流控室的所述第六内表面，其中一个或更多个对准标记形成用于所述第六内表面的对准图案。
48.在一个方面，对一组感兴趣的核酸进行测序的方法包括将该组感兴趣的核酸设置到微流控装置，并允许该组核酸与所述微流控室中的所述寡核苷酸随机杂交。所述方法包括：扩增所述感兴趣的核酸，从而形成dna簇；提供阅读引物和标记的dntp以启动边合成边测序；拍摄由荧光标记的dna簇的图像，用于边合成边测序的多个循环；通过对准标记对准图像，从而识别不同图像上dna簇的位置；以及确定感兴趣的核酸的序列。所述微流控装置包括由第一内表面和第二内表面限定的微流控室；第一组寡核苷酸与所述微流控室的所述第一内表面结合；以及固定在所述微流控室上的一个或更多个对准标记，形成所述第一内表面的对准图案。
49.在一个实施例中，所述方法包括调节荧光显微镜的焦平面，从而拍摄不同内表面上的dna簇的图像。
50.在附图和以下描述中阐述了一个或更多个实施方式的细节。从描述和附图以及从权利要求中，其他特征和优点将是显而易见的。
附图说明
51.图1a是衬底的示意图，该衬底上具有dnc簇。
52.图1b-1d是图1a的衬底在不同测序循环的荧光图像的示意图。
53.图1e是组合荧光图像的示意图。
54.图2a是具有荧光分子和对准图案的衬底的示意图。
55.图2b-2d是图2a的衬底在不同测序循环的荧光图像的示意图。
56.图2e是组合荧光图像的示意图。
57.图3是示例性对准图案的图。
58.图4是用于边合成边测序的微流控系统的图。
59.图5a-5e是微流控装置的截面图。
60.图6是用于制造微流控装置的流程图。
61.图7a和7b是边合成边测序(sbs)过程的示意图。
62.图8a和8b是dna簇的图。
63.图9a和9b是参考寡核苷酸的图。
64.图10是具有暗标记的荧光图像。
65.图11a-11c是微流控装置的图。
具体实施方式
66.我们在此描述了在荧光成像环境中使用的对准系统和方法。对准图案可以由荧光材料、反光材料或在所述装置的荧光图像中呈现暗色的材料形成。对准图案可以促进多幅图像的对准，实现多幅图像的计算效率和快速处理。例如，多幅图像的处理(例如对准)与边合成边测序(sbs)过程相关，其中图像在两个或更多个(例如，2、3或4个)发射波长处捕获，贯穿多个所述sbs过程的循环。组合所述图像产生了所述微流控装置的所述衬底上的dna簇的位置和标识图。这些多幅图像使用固定的对准图案对准，从而促进对准并减少所述sbs过程的计算负担。
67.在典型的边合成边测序(sbs)过程中，为所述感兴趣的核酸生成dna文库。所述dna文库中的所述序列可以是所述感兴趣的核酸的片段。接头(例如，右接头和/或左接头)可以添加到所述dna文库中的所述序列中。
68.寡核苷酸固定在微流控室的衬底表面上。所述dna文库中的所述序列可以通过所述接头与所述寡核苷酸杂交。一旦连接，桥式扩增可以产生相同的dna链，形成dna簇。有些将成为正向链。其余的是反向链。在一些实施例中，dna聚合酶沿着来自所述dna文库的dna原始链移动，产生互补链。然后所述原始链被冲走，只留下反向链。在所述反向链的顶部，有一个接头序列。dna链弯曲并附接到与顶部接头序列互补的所述寡核苷酸。聚合酶附接到所述反向链以形成与所述原始链相同的互补链。然后使双链dna变性，使得每条链可以分别附接到锚定到所述衬底的寡核苷酸序列。最后，一个簇(即表面上的一个点)中的dna链来自单一来源(克隆扩增)。在克隆扩增结束时，在一些实施例中，从所述衬底中去除所有反向链，仅留下正向链用于边合成边测序(sbs)。
69.在边合成边测序开始时，引物附接到所述正向链接头引物结合位点，并且聚合酶将标记的dntp添加到dna链。dntp可以被荧光团标记。由于dntp中的阻断基团，每个反应循环只能添加一个碱基。在一些实施例中，所述荧光团可以充当阻断基团。来自荧光标记的dntp的荧光可以提供新添加到序列中的dnpt的标识。在一些实施例中，使用四色化学。四个碱基中的每个都可以有一个独特的荧光标记。在一些实施例中，使用双色化学。两个碱基具有独特的荧光标记。一个碱基具有两种荧光标记的组合。最后一个碱基没有标记。具有适当数量的通道(例如，一个通道、三个通道、四个通道等)的成像系统可用于记录每个循环期间的荧光。在一些实施例中，来自每个通道的图像可以重叠或合并。在每个反应循环之后，所述装置记录每个簇的荧光。一旦记录颜色，去除荧光团并添加另一个dntp。这个循环可以重复多次，直到序列被确定。
70.当dna文库中的序列与沉积在衬底表面上的所述寡核苷酸杂交时，它们通常以随机模式与所述寡核苷酸杂交。在测序过程中，每个dna簇都用荧光标记进行标记，该荧光标记唯一地识别所述簇中的最后一个碱基。通过使用不同激发波长对衬底进行荧光成像来对dna簇进行测序。根据所述簇中最后一个碱基的标识，用每个激发波长照射衬底激发所述dna簇相应的子集。由于所述dna簇是随机分布的，为了处理这些荧光图像，这些图像需要正确对准。
71.图1a是具有dna簇的衬底100的示意图。例如，所述衬底100是用于dna的sbs分析的微流控装置的腔室的所述壁。每个点代表所述衬底上一个dna簇的物理位置。这些dna簇可以在测序期间通过荧光进行标记。
72.图1b-1d是在sbs过程期间拍摄的所述衬底100的荧光图像110a、110b、110c(统称为图像110)的示意图。每个点代表相同发射波长的荧光信号的位置。在每幅图像中，取决于在所述测序循环期间添加到分子的碱基的标识，图1a中描绘的荧光分子的子集在图像110的特定发射波长下发出荧光。在特定发射波长发出荧光的分子的子集对于每张图像都不同。在图像110b-d中看不到具有不同碱基的其他dna簇。因此，每幅图像110仅示出存在于所述衬底100上的所有荧光分子的子集。
73.参考图1e，为了基于成像配准dna簇的位置，将多幅图像110对准并堆叠以生成组合图像130。理想的组合图像130将包括代表所述衬底100上每个dna簇102的位置的点。在现实世界条件下，并非所有dna簇都被检测到，因此所述组合图像130中缺少一些分子，如通过将所述组合图像130与所述衬底100和图1a中的分子的示意图比较可以看出的。为了准确性和完整性，必须使用多幅图像110，例如十幅或更多幅图像。多幅图像的对准和堆叠涉及对一幅或多幅图像施加x和y方向偏移、旋转一幅或多幅图像、拉伸一幅或多幅图像或其他适当的图像处理技术。在一些示例中，图像110中荧光信号的强度和/或图像110之间的任何漂移可以使图像处理技术费时和/或影响技术的准确性。
74.为了便于在诸如sbs过程的荧光分析过程中对准多幅图像，用一个或更多个对准标记来标记衬底，诸如微流控装置的壁或衬底。这些对准标记可以包括例如荧光标记、反光标记和/或暗标记。这些对准标记可以形成对每个测序周期的图像可见的对准图案(例如，在同一测序周期中不同通道的合并图像)，因此在要对准的所有图像中可见。在一些实施例中，每个通道的所有图像首先由所述对准标记对准。然后对准每个通道的经对准图像以生成dna簇的图谱。与没有对准标记的图像相比，具有对准标记的图像可以通过分析更少的像素来对准，从而减少对准过程中花费的计算资源并加快该过程的速度。
75.图2a是具有带有对准标记的荧光分子的衬底200的示意图。例如，所述衬底200是用于dna的sbs分析的微流控装置的腔室的所述壁。每个点代表所述衬底上一个dna簇的物理位置。所述对准标记在所述衬底200上形成十字形状的对准图案204。在一些实施例中，所述对准标记可以由在所述衬底200将被成像的所有波长下发荧光或反光的材料形成。在一些示例中，对准标记由在拍摄图像的所有波长下看起来比周围衬底更暗的材料形成。在一些实施例中，每个对准标记仅包括一个荧光团。在一些实施例中，每个对准标记包括两个或更多个荧光团。如本文所用，“荧光团”是指包括官能团或由其组成的分子，其吸收特定吸收光谱内的能量并在不同(但同样特定的)发射光谱中重新发射能量(例如，诸如光)。在一些实施例中，用作标记的荧光团包括但不限于荧光素、级联蓝、六氯荧光素、四氯荧光素、tamra、rox、fam、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、德克萨斯红(texas red)、曙红(eosin)、可从马萨诸塞州沃尔瑟姆的thermo fisher scientific获得的dylight fluor家族，以及来自俄勒冈州尤金的molecular probes的alexa fluor家族。在一些实施例中，荧光团是荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白)。在一些实施例中，所述对准标记是暗点，在该暗点处去除寡核苷酸，因此不能将标记的dntp添加到所述暗点。
76.图2b-2d是在所述测序循环期间拍摄的衬底200的荧光图像210a、210b、210c(统称为图像210)的示意图。每个点代表在所述发射波长下的荧光信号的位置。对于每个测序周期，所述对准图案204可以在所有图像210中可见。
77.参考图2e，为了基于成像配准所有荧光分子的位置，对准并堆叠多幅图像210以生
成组合图像230。在所有图像210中可见的所述对准图案204有助于对准，降低对准所涉及的计算能力并且使图像处理能够更快地进行。
78.在一个具体的示例中，图1b-1d和图2b-2d是3000x3000像素大小。为了对准图1b-1d的图像110，对准算法搜索几乎所有的3000x3000像素。相反，为了对准图2b-2d的图像210，对准算法可以仅搜索每幅图像的一部分，例如，仅两行(3000像素 3000像素)，来识别所述对准图案204的位置。通过存在的所述对准图案204实现的搜索幅度的这种减小可以实现计算能力的降低，并且导致计算速度比没有对准图案时的图像对准快例如至少或大约1000、1500、2000或3000倍。
79.具有对准图案的图像可以具有其他优点。例如，即使荧光强度低(例如，如图像210c中所描绘的)或将受污染的荧光颗粒引入到所述衬底上，仍可以处理图像。可以跨图像对强度进行归一化，便于图像比较和组合。不需要确定荧光分子的绝对位置，因为所述对准图案204具有已知位置并且可以在图像处理之后计算相对于所述对准图案204的分子位置。此外，可以使用更少的图像来确定分子位置，例如，大约或少于15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5幅图像。
80.此外，在传统方法中，成像处理依赖于所述衬底上检测到的荧光分子来对准图像。所述检测到的荧光分子的密度有上限。如果检测到的荧光分子的密度太高，对准图像可能会非常具有挑战性。传统方法中所述dna簇的密度通常高达100万/mm2。由于本文所述的方法依赖于所述对准标记，因此本文所述的方法可以进一步将所述dna簇的密度增加到至少或大约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5百万/mm2。这可以大大提高测序效率。
81.还可以使用对准图案的其他配置(例如，形状)。图3示出了对准图案的示例配置。对准图案可以是以各种配置和在所述衬底上的不同位置布置的直线图案，例如实线或点线或虚线。对准图案可以是独立的点。对准图案可以是曲线。图3的所述对准图案是例如使用本文所述的沉积和/或图案化技术形成在所述衬底上的预定义图案。在一些示例中，对准图案是荧光材料的随机布置，也如本文所述。在一些实施例中，所述对准图案可以呈现为圆形、环形、椭圆形、矩形、正方形、对称、不对称、三角形、多边形等。所述对准标记可以布置成规则的重复图案，包括例如六边形或直线图案。在一些实施例中，所述图案可以是三角形、六边形或甚至不规则的。在一些实施例中，所述对准标记需要具有适当的宽度(例如，线的宽度、正方形的宽度或点的直径)。在一些实施例中，宽度为约0.5至约10μm、约0.5至约5μm、约0.5至约2μm、约1至约10μm、约1至约5μm，或约1至约2μm。在一些实施例中，宽度为约或至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μm。
82.图4是用于对微流控装置402中的样品进行荧光分析的微流控系统400的示例。所述微流控装置402包括衬底404，其中限定了所述微流控室406。在一些示例中，所述衬底404包括多个部件，例如，顶部衬底、底部衬底和粘结层，如图5a-5e所示，如在此讨论的。微流控通道408a、408b(统称为通道408)流体连接到所述微流控室406，例如，可操作为流体流入或流出所述微流控室406的入口和/或出口。所述微流控室406比所述通道408宽；在一些示例中，所述微流控室406是宽度类似于入口和/或出口通道宽度的细长通道。在一些示例中，所述微流控室404是分支通道。在一些示例中，所述微流控装置402包括多个入口通道、多个出口通道或两者；或者只有既可作为入口又可作为出口的单个通道。
83.定位荧光显微镜450以捕获所述微流控室406的至少一部分的图像。所述荧光显微
镜450用一个或更多个激发波长的光照射所述微流控室406并在多个发射波长中的每个处捕获图像。选择所述激发波长以激发所述微流控室406中的荧光分子，例如荧光团标记的dna，并且发射波长是荧光团发射荧光的波长。所述衬底404在激发和发射波长处是光学透明的。
84.所述微流控装置402包括对准图案420，其在捕获到的分子图像的所有发射波长处可见。在所有荧光图像中所述对准图案420的一致存在使得图像能够基于所述图案420对准。在一些示例中，所述对准图案420由被用于照明的至少一个激发波长激发的材料(本文称为“荧光材料”)形成。在一些示例中，所述对准图案420由诸如金属的材料形成，该材料(此处称为“反光材料”)在所有多个发射波长处是反光的。当使用反光材料时，可以使用强度低得多的单独背景光源在成像过程中照亮所述对准标记。例如，可以将微弱的红色led放置在适当的角度，并且光线会被相机反射和捕获。同时，来自所述dna簇的红色荧光将被具有不同波长的另一光源激发。
85.在一些示例中，所述对准图案420由在所有多个发射波长的图像中看起来比周围衬底402更暗的材料(本文称为“暗材料”)形成。结合图5a-5e，提供了关于用于所述对准图案420的材料的进一步细节。如本文所用，术语“暗”旨在指由检测器检测到的与检测器检测到的背景信号相比是微不足道的期望信号量。例如，当物体的特征的信噪比非常低，例如小于1时，可以认为该物体的特征是暗的。在一些实施例中，暗点不会产生任何数量的期望信号(即没有产生或检测到信号)。在一些实施例中，相对于背景非常低量的信号可以被认为是暗的。
86.在图4的示例中，所述对准图案420限定在由所述衬底404的底部形成的所述微流控室406的底壁上。在一些示例中，所述对准图案420可以限定在所述微流控室406的顶部或侧壁，或在其中限定了所述微流控室406的所述衬底404的外表面上。所述对准图案的示例位置示于图5a-5e中，如在本文中讨论的。
87.在一些示例中，所述微流控系统400用于dna的sbs分析。在这些示例中，寡核苷酸设置在所述微流控室406的一个或更多个壁上，例如通过共价键固定在一个或更多个壁上。在一些示例中，寡核苷酸与所述衬底上的活性硅烷基部分共价结合。
88.图5a-5e示出了微流控装置500的一部分的截面图。图5a-5e中的每一者示出了用于所述微流控装置500中的对准标记的不同位置。所述对准标记可以形成各种对准图案。
89.所述微流控装置500具有第一衬底502和第二衬底504。粘结层508设置在所述第一衬底502和所述第二衬底504之间并且粘附到衬底502、504两者上。微流控室506限定在所述衬底502、504之间，使得所述第一衬底502和所述第二衬底504分别形成所述微流控室506的顶壁510和底壁512，并且所述粘结层508形成所述微流控室506的侧壁514。所述微流控室508以流体方式连接到一个或更多个入口或出口通道，未示出。所述衬底502、504中的一者或两者在用于所述微流控装置500的荧光成像的激发和发射波长下是光学透明的。例如，所述衬底502、504中的一者或两者由玻璃或透明的塑料形成。
90.寡核苷酸(未示出)例如通过共价键合设置在所述微流控室506的底壁510上。在一些示例中，寡核苷酸可以设置在所述微流控室506的其他壁上，例如顶壁512。由于荧光显微镜的有限焦深，底壁510和顶壁512的图像可以分开拍摄，从而使一个微流控装置可以测序的dna簇的数量增加一倍。在一些实施例中，底壁510和顶壁512之间的距离至少或约为1、2、
3、4或5μm。
91.在图5a的具体示例中，所述第一对准标记520可以是荧光标记、反光标记或暗标记。在一些实施例中，所述对准标记可以由荧光材料、反光材料或暗材料形成，固定在所述微流控室506的底壁510上。
92.类似地，所述第二对准标记520可以是荧光标记、反光标记或暗标记。在一些实施例中，所述对准标记可以由荧光材料、反光材料或暗材料形成，固定在所述微流控室506的上壁512上。所述对准标记520、522可以形成相同或不同的对准图案(例如，形状)。
93.在一些示例中，用于对准图案的荧光材料包括光致抗蚀剂，诸如环氧基光致抗蚀剂，诸如su-8、az系列正性光致抗蚀剂、shipley 1800系列光致抗蚀剂、可光成像印刷电路板(pcb)焊接标记，或其他合适的可光成像光致抗蚀剂。对准图案可以通过光致抗蚀剂层的光刻图案化、光致抗蚀剂材料的丝网印刷或激光印刷、或通过其他合适的沉积和/或图案化方法来形成。
94.在一些示例中，用于对准模式的荧光材料包括例如荧光团和/或荧光团标记的dna或蛋白质。荧光分子也可以通过丝网印刷、激光印刷或其他适当的沉积技术设置在所述微流控室506的所述壁上。
95.用于对准图案的反光材料包括例如金属的图案化薄膜，例如铬、金或铂。对准图案可以通过薄金属膜的光刻图案化、丝网印刷、激光印刷、三维(3d)打印或用于形成金属图案的其他合适方法来形成。
96.所述对准标记也可以由暗材料(例如，碳纳米管或荧光猝灭剂)或暗点形成。可以通过去除或破坏点处的寡核苷酸来生成用于对准模式的暗点。例如，表面上的所述寡核苷酸可以以某种方式，例如通过激光，来燃烧或去除，以产生没有dna分子可以结合的区域。该区域在测序过程中总是会显得很暗，并且可以很容易地识别它们以进行对准。
97.在图5b的具体示例中，第一对准标记530由例如设置在所述微流控室506的顶壁512上并部分嵌入其中的材料，诸如荧光材料、反光材料或暗材料限定。第二对准标记532由例如设置在所述微流控室506的底壁510上并部分嵌入其中的材料，诸如荧光材料、反光材料或暗材料限定。所述对准标记530,532可以形成相同或不同的对准图案。
98.为了形成设置在所述微流控室506的顶壁512上并且部分嵌入其中的所述对准标记530，例如通过光刻和蚀刻、激光蚀刻或用于去除材料的另一适当工艺在顶壁512中限定凹陷。所述对准图案的材料例如通过对均匀薄膜材料的丝网印刷、激光印刷、光刻和蚀刻或用于沉积图案的另一适当工艺沉积到所述凹陷中。
99.在图5c的特定示例中，第一对准标记540由例如设置在所述第一衬底502的外表面上的材料，诸如荧光材料或反光材料限定。第二对准标记542由例如设置在所述微流控室506的底壁510上并部分嵌入其中的材料，诸如荧光材料或反光材料限定。所述对准标记540、542可以形成相同或不同的对准图案。此外，在一些实施例中，所述对准标记540和顶面512需要足够小，以便它们可以符合相同的荧光显微镜焦深。
100.在图5d的具体示例中，对准标记550由例如设置在所述微流控室506的侧壁514上的材料，诸如荧光材料或反光材料限定。在图5d的示例中，所述材料设置在所有侧壁514上。在一些示例中，所述材料可以设置在少于所有的侧壁上。荧光材料可以合并到侧壁514中，例如，通过将荧光团标记的粘合剂(例如，压敏粘合剂或环氧树脂粘合剂)合并到结合材料
中。在一些示例中，荧光材料可以被合并到结合材料中，例如，通过使用激光，诸如紫外激光，以将结合材料转移到荧光材料上。
101.在图5e的具体示例中，第一对准标记560由例如完全嵌入所述第一衬底502中的材料，诸如荧光材料或反光材料限定。第二对准标记562由例如完全嵌入所述第二衬底504中的材料，诸如荧光材料或反光材料限定。这些对准标记可以具有相同的配置或可以是不同的配置。
102.图6示出了制造用于分析样品荧光的微流控装置的示例方法，例如用于sbs分析过程。所述微流控装置包括对准图案以促进多幅图像的对准。将荧光材料以对准图案设置在第一衬底的表面上(600)。在一些示例中，将光致抗蚀剂通过例如旋涂沉积在所述第一衬底的表面上，并使用光刻法图案化成所述对准图案。在一些示例中，使用丝网印刷、激光印刷、3d打印或另一种合适的沉积和/或图案化方法将光致抗蚀剂或荧光分子沉积到表面上。所述荧光分子可以是荧光团或用荧光团标记的一些其他分子(例如核酸、蛋白质)。在一些示例中，例如使用光刻和蚀刻在所述第一衬底中限定凹陷，并且所述凹陷填充有荧光材料，例如光致抗蚀剂或荧光分子。在一些实施例中，所述荧光材料在所述样品将被成像的一个或更多个波长处发出荧光。在一些实施例中，所述荧光材料在所述样品将被成像的所有多个波长处发出荧光。
103.在一些示例中，反光材料布置在对准图案而不是荧光材料中。所述反光材料可以是例如通过光刻和蚀刻、丝网印刷、激光印刷、3d打印或任何合适的沉积和/或图案化方法形成的图案化薄金属膜。
104.将寡核苷酸设置在与所述对准图案相同的表面上或所述衬底的不同表面上(602)。在一些实施例中，所述寡核苷酸通过共价键合固定在表面上。在一些实施例中，所述寡核苷酸固定在形成所述微流控室的表面上。
105.可以通过粘结层将所述第一衬底和所述第二衬底彼此附接(604)，使得在所述第一衬底和所述第二衬底之间限定微流控室。其上限定有所述对准图案的所述第一衬底的表面、所述第二衬底的表面和所述粘结层形成所述微流控室的所述壁。
106.参考图7a和7b，在一些示例中，寡核苷酸(例如，ssdna)既用于sbs分析又用作对准标记。图7a描绘了典型的sbs过程。寡核苷酸702固定在(例如，结合到)微流控室700的壁704上。所述寡核苷酸包括正向和反向引物(分别以黑色和灰色描绘)。使感兴趣的核酸(例如，dna)流过所述微流控室700，并与所述衬底上的寡核苷酸杂交。在一些实施例中，所述dna簇通过桥式扩增产生。给定簇发出荧光的波长由所述簇的最后一个核苷酸的标识控制。在多个波长处捕获所述微流控室700的荧光图像708，显示在每个波长处发出荧光的dna簇。
107.图7b描绘了sbs过程，其中固定的参考寡核苷酸(例如，单链dna(ssdna))用作对准标记。在这个过程中，寡核苷酸752固定在微流控室750的壁754上。所述寡核苷酸包括正向和反向引物两者(分别以黑色和灰色描绘)。
108.参考寡核苷酸760也固定在所述微流控室750的所述壁754上。所述参考寡核苷酸760在桥式扩增后形成dna簇。在一些实施例中，所述参考寡核苷酸具有两个或更多个阅读引物靶位点。在测序反应期间，为一条dna链合成两种或更多种核酸。结果，由所述参考寡核苷酸760形成的所述dna簇可以产生比由感兴趣的核酸756形成的周围dna簇更高强度的荧光信号。捕获所述微流控室700的荧光图像758，显示出由所述参考寡核苷酸760形成的所述
dna簇在图像758中显示为较亮的点。这些亮点可以用作对准标记。
109.参考图8a，所述参考寡核苷酸可以具有两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)用于测序的阅读引物靶位点。每个阅读引物靶位点之后的测序区域可以具有相同或不同的序列。在测序反应期间，合并两个或更多个荧光团标记的核苷酸。因此，图像中的点亮度要高得多。这些亮点可用作对准标记。
110.参考图8b，所述参考寡核苷酸(例如，ssdna)具有用于测序的不同阅读引物的靶位点。在参考簇的阅读引物存在的情况下，可以对参考簇进行几个测序周期(例如2-5个碱基)。参考簇的位置可以根据碱基组合来确定。然后可以使引物变性，并且可以使用标准阅读引物和参考簇的阅读引物进行常规测序循环。图像可以通过参考簇位置对准。
111.在一些实施例中，这些参考簇还可以通过在不存在用于参考簇的阅读引物的情况下进行测序反应而变成暗点。在一些实施例中，参考簇可以被荧光猝灭剂标记，例如可以与参考簇杂交的荧光猝灭剂标记的寡核苷酸(图9a)。
112.参考图9a-9b，所述参考寡核苷酸(例如，ssdna)可以具有独特的序列。标记的寡核苷酸可以与所述参考寡核苷酸形成的dna簇中的单链dna杂交。在一些实施例中，所述寡核苷酸被荧光猝灭剂(例如，bhq-1(black hole quencher 1,3'))标记。在一些实施例中，所述荧光猝灭剂是3'-bbq-650(black berry quencher 650)，bhq-0(black hole quencher 0、3')、bhq-1(black hole quencher 1、3')、bhq-2(black hole quencher 2、3')、bhq-3(black hole quencher 3、3')),bhq-1(black hole quencher-1，5')，bhq-2(black hole quencher-2,5'),bhq-3(black hole quencher-3,5'),atto 540q,atto 575q,atto 612q、bbq-650nhs(black berry quencher 650nhs)、bbq-650-dt(black berry quencher 650dt)、bhq-1-nhs(black hole quencher 1nhs)、bhq-1-dt(black hole quencher 1dt),bhq-2-dt(black hole quencher 2dt),dabcyl quencher deoxythymidine dt,dabcyl quencher-3'，dabcyl-5',mgb 3'cdpi3，mgb-5'cdpi3，tamra nhs,tamra-3'(羧基四甲基罗丹明)或tamra-dt(羧基四甲基罗丹明-dt)。由于这些标记的寡核苷酸与参考dna簇结合，荧光猝灭剂可以形成图像上的对准标记(例如，暗运动)，其中在这些对准标记处或附近无法检测到荧光。
113.类似地，标记的寡核苷酸可以用一种或更多种荧光团(例如，荧光染料)标记。在一些实施例中，标记的寡核苷酸可以具有大约或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个荧光团分子。荧光团分子可以不同或相同。在一些实施例中，标记的寡核苷酸可以具有至少2、3或4种不同的荧光团分子。这些标记的寡核苷酸可以在图像中形成亮点。这些亮点可用于对准。在一些实施例中，标记的寡核苷酸包括在标记的dntp中用于测序反应的荧光团分子。结果，参考簇将始终在图像中形成一个亮点。
114.参考图10，在一些示例中，所述对准图案由暗点或比周围图像更暗的材料形成。图10示出了带有来自dna簇的荧光的荧光图像，该dna簇在捕获图像的波长处发出荧光。灰点(由箭头标识)代表暗对准标记。在一些示例中，所述暗对准标记是通过，例如以预定模式或随机模式，用荧光猝灭部分标记参考寡核苷酸形成的。在一些示例中，所述暗对准标记是通过变性或破坏所述衬底上的所述寡核苷酸的一部分来形成的，例如，通过，例如以预定图案或以随机图案，用激光照射所述寡核苷酸以燃烧寡核苷酸。在一些示例中，所述暗对准标记通过将凹陷蚀刻到所述衬底中而形成，使得所述凹陷在荧光图像中将显得暗。在一些示例
中，所述暗对准标记由看起来暗的图案化材料形成，例如吸收用于激发样品的波长的光的材料。
115.图11a-11c是多通道微流控装置的示意图。在这些装置中，多个通道垂直堆叠，使得例如形成所述装置的一个通道的顶壁的衬底也形成相邻通道的底壁。在单个微流控装置中具有多个垂直堆叠的通道增加了sbs过程中可以在其上生长dna簇的表面数量，从而增加了可以从单个微流控装置收集的数据量。对于具有用于数据生成的多于一个表面的微流控单元，在一些实施例中，荧光显微镜的焦深允许这些表面的图像被单独拍摄，而不会受到其他表面上的荧光的干扰。因此，可以针对适当的焦点平面和/或焦点深度调节荧光显微镜，并且可以为不同的表面拍摄图像。
116.具体参考图11a，多通道微流控装置10包括两个平行的微流控通道12、14。两个通道都连接到共同入口16和共同出口18，使得流体从所述入口16平行地沿着两个通道12、14流出所述出口18。所述微流控装置10由三个衬底20、22、24形成，每对衬底分别通过粘结层26、28彼此附接。
117.参考图11b，多通道微流控装置30包括串联连接的两个微流控通道32、34。流体通过入口36进入，沿所述通道32然后沿所述通道34流动，并从出口38流出。所述微流控装置30由三个衬底40、42、44形成，每对衬底分别通过粘结层46、48彼此附接。
118.参考图11c，多通道微流控装置50包括三个串联的微流控通道52、53、54。流体通过入口56进入，沿所述通道52、所述通道53、然后是所述通道54流动，并从出口58流出。所述微流控装置50由四个衬底60、62、64、65形成，每对衬底分别通过粘结层66、67、68彼此附接。所述微流控装置50具有六个可在其上进行sbs的表面。
119.可以为所述衬底的任何表面添加对准标记，如图11a-11c所示。
120.已经描述了本主题的特定实施例。其他实施例在所附权利要求的范围内。