靶向人内源性反转录病毒的抗反转录病毒药物的制作方法

靶向人内源性反转录病毒的抗反转录病毒药物
1.本技术是申请日为2015年5月27日、申请号为“201580027652.7”、发明名称为“靶向人内源性反转录病毒的抗反转录病毒药物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及一种新颖的靶向人内源性反转录病毒(human endogenous retrovirus)的抗反转录病毒药物。


背景技术：

3.人内源性反转录病毒(herv)是复杂和异质的基因元件(genetic elements)的多拷贝(multicopy)家族，该基因元件是通过插入生殖细胞而进入某些物种的基因组的原始反转录病毒感染(ancestral retroviral infections)的残余物。herv元件总共占约8％的人基因组，且当herv元件已保留转录活性，其很少引起完全的反转录病毒的基因组表达且几乎不被预期为由完全具有功能的原病毒拷贝(proviral copies)引起。
4.多发性硬化症(multiple sclerosis)相关的反转录病毒元件(msrv)(其为w型人内源性反转录病毒家族(herv-w)之一)首先分离自罹患多发性硬化症的患者的细胞。msrv通常潜伏于个体的基因组中，但当被共同因子(例如某些常见病毒)触发时，其可被再活化并可进一步表达herv-w家族的包膜蛋白。本发明人先前研究了此机制并揭露其是各种疾病的发展和进展中主要的触发和恶化因子，所述疾病诸如多发性硬化症(ms)、精神分裂症(sz)、双极性情感疾患(bipolar disorder(bp))、单极性或精神性抑郁(psychotic depression)、临床孤立综合征(clinically isolated syndrome)(cis，具神经症状)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)(cidp)、癫痫、牛皮癣、癌症、炎症性胰腺炎和糖尿病(例如i型或ii型糖尿病)。
5.尽管有来自herv的所有结构性反转录病毒基因的可能表达，即编码基质、衣壳(capsid)及核蛋白壳前体多蛋白质的gag基因，与编码反转录病毒酶(包括蛋白酶、反转录酶及整合酶(integrase)前体多蛋白质)的pol基因一起，及与编码来自相同herv的包膜前体蛋白的env基因一起，迄今没有发现来自herv的感染性的反转录病毒拷贝。
6.此外，与外源性感染性反转录病毒相反，herv存在于每个人类个体的所有细胞的dna，因此，传统用于治疗人反转录病毒的治疗性分子无法排除受体细胞亚群内对应的原病毒(provirus)。在这些内源性元件上的许多细胞及基因的限制也使其受非-反转录病毒分子机制的控制，从而不经过传统的反转录病毒的通路。在各种机制中，已知涉及基因沉默(gene silencing)、受细胞性启动子/增强子的基因控制、或herv序列和细胞基因间的基因重组。并未期待传统的外源性反转录病毒有如此特征，因此并非容易用于目前存在的抗反转录病毒疗法。
7.在这种情况下，无法期待传统外源性反转录病毒的治疗能完全控制病原性herv的表达，从而无法期待对herv相关的疾病(如果有的话)具有最佳疗效。
8.因此，在靶向herv病毒的新颖的抗反转录病毒的治疗策略上长期感到未满足的需
求。
9.发明简述
10.本发明人已令人惊讶地发现不可预料的靶向来自herv-w家族的内源性元件的抗herv效果可减少并抑制herv-w的表达。因此，在第一个方面，本发明涉及一种抗体、其片段或衍生物，其用作靶向属于人内源性反转录病毒(herv)的病毒的抗反转录病毒药物，其中该抗体靶向herv-w包膜蛋白(herv-w env)。优选地，该抗体、片段或衍生物用于预防和/或治疗herv-w相关的疾病。更优选地，该抗体用于预防和/或治疗多发性硬化症(ms)或慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)。更优选地，该抗体为单克隆人源化抗体，其中重链(hc)具有seq id no：9的氨基酸序列且轻链(lc)具有seq id no：10的氨基酸序列。
11.在第二个方面，本发明涉及一种组合物，其包含(优选由以下组成)：靶向herv-w包膜蛋白(herv-w env)的抗体、其片段或衍生物和反转录病毒的反转录酶(reverse-transcriptase)抑制药，其用作靶向属于人内源性反转录病毒(herv)的病毒的抗反转录病毒药物。
12.在第三个方面，本发明涉及靶向herv-w包膜蛋白(herv-w env)的抗体、其片段或衍生物和反转录病毒的反转录酶抑制药作为联合制剂同时、分别或连续用于治疗herv-w相关的疾病的方法，优选的疾病选自：多发性硬化症(ms)、精神分裂症(sz)、双极性情感疾患(bp)、单极性或精神性抑郁、临床孤立综合征(cis，具神经症状)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、癫痫、牛皮癣、癌症、炎症性胰腺炎及糖尿病，诸如i型或ii型糖尿病。
13.在第四个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含至少一种选自seq id no：11-28的寡核苷酸。
14.在第五个方面，本发明涉及一种靶向herv-w包膜蛋白(herv-w env)的抗体、其片段或衍生物，其作为一种靶向属于人内源性反转录病毒(herv)的病毒(优选为herv-w家族，更优选为msrv)的抗反转录病毒药物用于罹患herv-w相关疾病的患者，其中该患者以一种方法鉴别，该方法包含步骤i)：在生物样品中检测和/或定量herv-w。
15.发明详述
16.定义
17.如本文中使用，术语“人内源性反转录病毒”和“herv”是指包含通常称为“herv-w”的属于w型内源性反转录病毒家族的病毒的人内源性反转录病毒。
[0018]“herv-w”是人内源性反转录病毒的家族，该家族是在最初发现“与多发性硬化症相关的反转录病毒”(msrv，首次分离自患有多发性硬化症的患者的人反转录病毒)的人基因组中被解开。因此，当研究提及“lm7”(描述来自ms的首个分离物)、“ms-反转录病毒”、“msrv”、“合胞素(syncytin)”、“herv-w 7q”、“ervw-e1”、“ervw-e2”、“来自x染色体的herv-w拷贝”或“herv-w”，其皆指herv-w元件。
[0019]
如本文中使用，术语“msrv”是指herv-w家族之一的特定内源性反转录病毒。在本发明的上下文中，表述“herv-w”和“msrv”均是指herv-w元件。具体而言，表述“herv-w env”和“msrv-env”均指相同的包膜蛋白。典型地，氨基酸序列中的最终少数变化不会阻止治疗用途的特定抗env抗体的结合，尤其是具有seq id no：9的氨基酸序列的重链(hc)并具有seq id no：10的氨基酸序列的轻链(lc)的抗体。
[0020]
如本文中使用，表述“与herv-w相关的疾病”是指与herv-w(优选herv-w包膜蛋白)
表达有关的病理病症。典型地，该herv-w相关的疾病为一种慢性炎症性疾病。如本文中使用，术语“慢性炎症性疾病”是指其中持续性或复发性炎症由组织损伤涉及的先天免疫和/或后天免疫驱动和/或可从促炎性分子的过表达在局部或全身性检测到的任何疾病。
[0021]
优选地，所述herv-w相关的疾病选自：多发性硬化症(ms)、精神分裂症(sz)、双极性情感疾患(bp)、单极性或精神性抑郁、临床孤立综合征(cis，具神经症状)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、癫痫、牛皮癣、癌症、炎症性胰腺炎和糖尿病，诸如i型或ii型糖尿病。更优选地，所述herv-w相关的疾病选自多发性硬化症(ms)和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)，两者皆为脱髓鞘病(demyelinating diseases)。
[0022]
如本文中使用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”，如本文使用，是指转逆转、缓和、抑制该术语应用的疾病或病况的进展，或预防该术语应用的疾病或病况，或逆转、缓和、抑制该术语应用的疾病或病况的一种或多种症状的进展、或预防该术语应用的疾病或病况的一种或多种症状。
[0023]
如本文中使用，术语“预防”是指防止尚未出现能够临床诊断的临床症状、典型病变或生理功能障碍的患者发生疾病或病况。
[0024]
如本文中使用，“抗体”或“免疫球蛋白”具有相同意义，且在本发明中被相等地使用。如本文使用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学上的活性部分，即，含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。同样地，术语“抗体”不仅包含完整抗体分子，也包含抗体片段，以及抗体衍生物。
[0025]
如本文中使用，表述“抗体片段”是指模拟高变异区(hypervariable region)的抗体的一部分，诸如cdr(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)。根据本发明的抗体片段保留该抗体的结合亲和性及特异性。这种片段是该抗体的功能性同等物且其结合实质上与该抗体相同的表位(epitope)。抗体片段的实例包括但不限于重链、轻链、vl、vh、fv、fab、fab’、f(ab)2、及f(ab')2。
[0026]
如本文中使用，表述“抗体衍生物”是指与至少一个不同于天然序列的序列(例如，另一物种的接头(linker)序列等)融合的本发明的抗体片段，优选包括该抗体的至少一个cdr，优选该抗体的至少一个cdr3，该衍生物对herv-w env的结合亲和性和特异性与本发明的抗体相当。根据本发明的衍生物保留该抗体的结合亲和性和特异性。这种衍生物是该抗体的功能性同等物且其结合实质上与该抗体相同的表位。抗体衍生物的实例包括但不限于scfv、(scfv)2及双体(diabodies)。
[0027]
在天然的抗体中，两条重链(hc)藉由二硫键彼此连接且各重链与轻链(lc)藉由二硫键连接。轻链有两种类型，λ(l)及κ(k)。有5种主要重链类别(或同型(isotype))，其决定抗体分子的功能活性：igm、igd、igg、iga和ige。各链含有可区别的序列结构域(sequence domains)。
[0028]
典型地，轻链包括两个结构域：可变结构域(vl)和恒定结构域(cl)。重链包括四个结构域：一个可变结构域(vh)和三个恒定结构域(ch1、ch2及ch3，总体称为ch)。轻链的可变区(vl)和重链的可变区(vh)均决定抗原性表位特异性的结合位点。轻链的恒定区结构域(cl)及重链的恒定区结构域(ch)赋予重要的生物性质，诸如抗体链联合(antibody chain association)、分泌、经胎盘的移动性(trans-placental mobility)、补体结合、和与fc受体(fcr)的结合。fv片段是免疫球蛋白的fab片段的n-端部分，且由一条轻链和一条重链的
可变部分组成。抗体的特异性存在于抗体结合位点与抗原性表位之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变异区或互补决定区(cdr)的残基构成。偶尔，来自非高变异区或框架区(fr)的残基影响整个结构域的结构，从而影响结合位点。互补决定区或cdr是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然fv区的结合亲和性和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链及重链各具有三个cdr，分别称为l-cdr1、l-cdr2、l-cdr3及h-cdr1、h-cdr2、h-cdr3。因此抗原结合位点包括六个cdr，包含各来自重链和轻链v区的cdr组。框架区(fr)是指cdr之间插入的氨基酸序列。
[0029]
如本文中使用，术语“嵌合抗体”是指：包含来自任何物种(优选小鼠)的抗体的vh结构域和vl结构域，和人抗体的ch结构域及cl结构域的抗体。
[0030]
依据本发明，“人源化抗体”是指具有来自人抗体的可变区框架和恒定区但保留来自任何物种(优选小鼠)抗体的cdr的抗体。
[0031]
术语“fab”意指具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中在用蛋白酶、木瓜酶处理igg所获得的片段之中，h链的n-端侧的约一半及整个l链透过二硫键结合在一起。
[0032]
如本文中使用，术语“f(ab')2”是指具有约100,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中在用蛋白酶、木瓜酶处理igg所获得的片段之中，其经由绞链区(hinge region)的二硫键稍大于fab键。
[0033]
如本文中使用，术语“fab'”是指具有约50,000的分子量且抗原结合活性的抗体片段，其通过切断f(ab')2的绞链区的二硫键而获得。
[0034]
表述“单链fv”或“scfv”是指多肽，其为共价连接的vh：：vl异二聚体(heterodimer)，且通常从包括通过编码肽的接头连接的vh和vl编码基因的基因融合来表达。“dsfv”是由二硫键稳定的vh：：vl异二聚体。二价和多价抗体片段可由单价scfv的联合而自发形成，或可藉由将单价scfv通过肽接头偶联而产生(例如二价sc(fv)2)。
[0035]“双体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其片段在同一肽链(vh-vl)中包含连接至轻链可变结构域(vl)的重链可变结构域(vh)。通过使用太短以至于不能够在相同链上的两个结构域间成对的接头，结构域被迫与另一链的互补结构域成对并产生两个抗原结合位点。
[0036]
如本文中使用，表述“本发明的抗体”是指：针对(即，特异性结合)herv-w包膜蛋白(herv-w env)，优选针对w型人内源性反转录病毒家族(herv-w)的herv-w包膜蛋白，更优选针对msrv的包膜蛋白，更优选针对msrv包膜蛋白的胞外结构域的抗体。优选地，本发明的抗体包含seq id no：1-6所述的全部6个cdr。
[0037]
如本文中使用，本文使用的术语“生物样品”是指以体外评估为目的而获得的任何生物样品。在本发明中，样品或患者样品可包含任何体液或疾病特异性组织和病变。体液的实例包括血液、血清、血浆、乳头抽吸液(nipple aspirate fluid)、尿液、唾液、关节液及脑脊髓液(csf)。疾病特异性组织和损伤的实例包括ms脑斑、cidp神经活检或糖尿病胰腺活检。
[0038]
用作抗反转录病毒药物的抗体
[0039]
当与病理病症相关时，尤其当表达该herv-w家族的多发性硬化症相关的(msrv)元件时，在某些个体中发生病原性herv-w表达。已经表明当暴露于免疫系统或神经胶细胞
(neuroglial cells)时，这涉及包膜蛋白作为herv-w-编码的蛋白质中唯一的病原性角色，尽管患者中存在herv-w gag-编码的抗原。
[0040]
迄今，治疗策略在于用人源化抗体中和herv-w包膜蛋白，以预防和抑制与herv-w相关的人类疾病中其免疫炎性及神经病原性效果。因此，此治疗方式是针对炎症性级联的上游和目标细胞毒性效应的上游，尤其是起因于ms中枢神经是统(cns)中具损伤修复潜力的病变来源中具髓鞘再生封锁(remyelination blockade)的炎症性脱髓鞘级联的上游。
[0041]
本发明人已评估了人源化igg4抗体，其选择性结合msrv的包膜蛋白的胞外结构域，其因在i期临床试验的健康志愿者中的安全性及药物动力学被称为“gnbac1”。此抗体也已在ms患者中评估一年，在两个平行组中每4周重复输注6mg/kg或2mg/kg的gnbac1抗体。在后来的ms患者的iia期临床试验中，于处理6个月后首次用定量rt-pcr(qrt-pcr)测试herv-w生物标记的研究之前及期间，本发明人已获得来自患者的血液样品，以研究随着gnbac1处理，特异性herv-w env和pol mrna的表达。
[0042]
获得的结果显示gnbac1抗体在体内对herv-w env蛋白中和的完全未预期且未知的效果。
[0043]
实际上，本发明人发现，用该抗体治疗的人类患者已显示对herv-w反转录病毒的基因组表达本身的抑制效果，其并不限于表达如gnbac1特异靶向的包膜蛋白的env基因。实际上，本发明人的结果无可置疑地指出，在治疗三个月和六个月后，相较于在相同患者治疗前测量的水平，env mrna(编码herv-w包膜蛋白)和pol mrna(编码herv-w酶，包括反转录酶)两者的水平显示平行且逐步的减少。
[0044]
因此，用gnbac1治疗6个月后已观察到对herv-w表达的显著抗反转录病毒的效果，且平行影响env和pol基因的表达。由于并未预期反转录病毒的herv-w rna表达受到herv-w包膜蛋白表达的调节，而是来自编码完全不相关的抗原蛋白质的pol基因的mrna，本发明人断定herv-w env(或msrv-env)的未知效果对与其疾病相关的表达的herv-w基因调节产生积极效果，如在患有ms的患者中所见，且在本发明人进行的iia期临床试验中的患者中已被gnbac1中和(参见实施例1)。此效果与在免疫和神经系统的已知herv-w env病理学效果完全不相关。
[0045]
因此，在第一个方面，本发明涉及一种抗体、其片段或衍生物，其用作靶向属于人内源性反转录病毒(herv)的病毒的抗反转录病毒药物，其中该抗体、片段或衍生物针对herv-w包膜蛋白(herv-w env)。
[0046]
如本文中使用，表述“靶向属于人内源性反转录病毒(herv)的病毒的抗反转录病毒药物)”是指能够抑制属于人内源性反转录病毒(herv)的病毒的表达和/或复制的抗体、其片段或衍生物。更具体而言，该表述是指抗体能够：
[0047]-完全或部分压制或抑制属于herv，优选属于herv-w家族的病毒的复制。典型地，该复制的压制或抑制是普遍且完全的；或
[0048]-完全或部分压制或抑制属于人内源性反转录病毒(herv)，优选属于人内源性反转录病毒w型(herv-w)家族的病毒的表达，或该病毒的包膜蛋白的表达。
[0049]
优选地，该病毒属于w型人内源性反转录病毒家族(herv-w)。更优选地，该病毒为msrv。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体针对msrv的包膜蛋白。
[0050]
在一个优选的实施方案中，根据本发明的抗反转录病毒药物完全或部分压制或抑
制属于herv的病毒(优选属于herv-w的病毒)的env-和/或pol-编码的蛋白质的表达。
[0051]
本发明人已经表明，靶向msrv的特异性包膜蛋白导致抑制或压制病毒表达的出于意料的效果。如前所述，msrv牵涉数种疾病的发作和发展。因此，本发明的抗体极有希望用于治疗herv-w相关的疾病，优选与herv-w包膜蛋白(herv-w env)表达有关的病理。
[0052]
优选地，该herv-w相关的疾病选自多发性硬化症(ms)、精神分裂症(sz)、双极性情感疾患(bp)、单极性或精神性抑郁、临床孤立综合征(cis，具神经症状)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、癫痫、牛皮癣、癌症、炎症性胰腺炎和糖尿病，诸如i型或ii型糖尿病。
[0053]
更优选地，该herv-w相关的疾病选自多发性硬化症(ms)和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)。
[0054]
在一个实施方案中，本发明还涉及一种用于预防和/或治疗选自以下的疾病的试剂：多发性硬化症(ms)、精神分裂症(sz)、双极性情感疾患(bp)、单极性或精神性抑郁、临床孤立综合征(cis，具神经症状)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、癫痫、牛皮癣、癌症、炎症性胰腺炎和糖尿病诸如i型或ii型糖尿病，其中该药剂由针对herv-w包膜蛋白(herv-w env)的抗体或其片段或衍生物组成。在这个具体的实施方案中，该抗体阻止herv-w表达。
[0055]
在一个实施方案中，本发明的抗体、片段或衍生物包含如seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、及seq id no：6所示的6个cdr的每一个。
[0056]
在一个实施方案中，本发明的抗体、片段或衍生物包含：
[0057]-轻链，其中可变结构域包含如seq id no：1所示的cdr-l1、如seq id no：2所示的cdr-l2和如seq id no：3所示的cdr-l3的3个cdr的每一个；和
[0058]-重链，其中可变结构域包含如seq id no：4所示的cdr-h1、如seq id no：5所示的cdr-h2和如seq id no：6所示的cdr-h3的3个cdr的每一个。
[0059]
上述互补决定区(cdrs)如表1所示：
[0060]
表1：根据本发明的抗体的cdr结构域
[0061]
结构域seq id no：序列cdr-l11ser ala ser ser ser val ser tyr met tyrcdr-l22arg thr ser asn leu ala sercdr-l33gln gln tyr gln ser leu pro leu thrcdr-h14asp tyr glu met hiscdr-h25ala val ala pro glu thr gly gly thr ala tyr asn gln lys phe lys glycdr-h36thr val val pro phe ala tyr
[0062]
在一个实施方案中，本发明的抗体、片段或衍生物包含：
[0063]-如seq id no：7所示的轻链可变区(vl)；和
[0064]-如seq id no：8所示的重链可变区(vh)。
[0065]
上述轻链和重链可变区如表2所示：
[0066]
表2：根据本发明的抗体的轻链及重链可变区
[0067][0068]
在一个实施方案中，本发明的抗体、片段或衍生物选自fv、fab、f(ab')2、fab'、dsfv、scfv、sc(fv)2、双体、和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0069]
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体为单克隆抗体。本发明的单克隆抗体为单价、双价、多价、单特异性、双特异性、或多特异性。在另一个实施方案中，针对herv-w env的抗体是结合片段或偶联物(conjugate)。例如，本发明的抗体可与生长抑制剂、细胞毒性剂、或前药活化酶结合。
[0070]
也期望就效应子(effector)功能修饰本发明的抗体，例如以增强抗体的抗原-依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)。这可通过在抗体fc区中引入一或多个氨基酸替换来实现。或者或另外地，可以在fc区引入半胱胺酸残基，从而使得在此区中形成链间二硫键。如此产生的同型二聚体(homodimeric)抗体可能具有改进的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀死和/或抗体-依赖的细胞毒性(adcc)(caron pc.等1992；和shopes b.1992)。
[0071]
本发明的抗体的氨基酸修饰的另一类型可用于改变抗体的原始糖基化(glycosylation)模式。“改变”是指删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分(carbohydrate moieties)，和/或添加一个或多个不存在于该抗体的糖基化位点。抗体的糖基化通常是n-连接。“n-连接”是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸(其中x是除了脯氨酸之外的任何氨基酸)是碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列任一者的存在产生可能的糖基化位点。通过改变氨基酸序列容易完成对抗体添加糖基化位点，从而其含有一个或多个上述三肽序列(对于n-连接的糖基化位点)。
[0072]
在另一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆人源化抗体，更优选igg4人源化的单克隆抗体。
[0073]
所述人源化抗体可通过获得编码cdr结构域的核酸序列来制备：将其插入动物细胞用的表达载体，所述载体具有编码与人抗体相同的重链恒定区和与人抗体相同的轻链恒定区的基因，并通过将表达载体引入动物细胞来表达该表达载体。人源化抗体表达载体可以是编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存在于分别载体的类型或者是两个基因存在于相同载体的类型(串联型)。就人源化抗体表达载体建构的容易性、引入动物细胞的
容易性、以及在动物细胞中抗体h和l链的表达水平之间的平衡而言，更优选串联型的人源化抗体表达载体。串联型的人源化抗体表达载体的实例包括pkantex93、pee18等。基于常规重组dna和基因转染技术的制备人源化抗体的方法是本领域众所皆知的。可用本领域已知的各种技术将抗体人源化，包括例如cdr-接枝、镶面(veneering)或表面重修(resurfacing)、和链替换(chain shuffling)。用于制备这种抗体的一般重组dna技术也是已知的。
[0074]
因此，本发明的一个实施方案涉及单克隆人源化抗体，其包含：
[0075]-轻链，其中可变结构域包含如seq id no：1所示的cdr-l1、如seq id no：2所示的cdr-l2和如seq id no：3所示的cdr-l3的3个cdr的每一个；和
[0076]-重链，其中可变结构域包含如seq id no：4所示的cdr-h1、如seq id no：5所示的cdr-h2和如seq id no：6所示的cdr-h3的3个cdr的每一个。
[0077]
在一个具体的实施方案中，所述人源化抗体的重链(hc)具有如seq id no：9所示的氨基酸序列，且所述抗体的轻链(lc)具有如seq id no：10所示的氨基酸序列。该特异性抗体在本文中称为“gnbac1”。
[0078]
上述重链及轻链如表3所示：
[0079]
表3：人源化抗体的hc及lc
[0080][0081][0082]
用作抗反转录病毒药物的组合物
[0083]
本发明人进一步调查了本发明抗体的新的未显露的抗反转录病毒效果。为此目的，他们评估了它对表达herv-w gag、pol和env-编码的蛋白质的细胞培养物的体外效果，如在蛋白免疫印迹分析中用特异性抗体检测。
[0084]
本发明人已经确认，除了在用gnbac1治疗的患者中pol rna水平降低之外，与herv-w反转录酶(rt)对应的pol蛋白质的表达在于gnbac1存在下培养的细胞中看起来较不
重要。此外，rt已知通过从表达的rna产生反转录病毒dna的额外拷贝来放大反转录病毒的表达。然后，这些新产生的反转录病毒dna拷贝可以表达对应的rna，从而通过这种表达本身的产物藉由倍增表达拷贝来放大反转录病毒元件的总体表达，例如来自pol rna的rt。
[0085]
因此，他们认为，gnbac1和反转录病毒的反转录酶抑制剂诸如迭氮胸苷(azidothymidine，azt)的组合对herv-w表达可以产生更好的抑制效果，尤其在先前所示的其rt表达上。
[0086]
对此进一步研究，出乎意料地，这种针对herv-w env的抗体和反转录病毒的反转录酶抑制药物的组合在这种产出细胞中消除了herv-w rt蛋白质的表达。
[0087]
在平行且同时的培养中，通过蛋白免疫印迹在未处理细胞中检测到阳性herv-w rt以及在用gnbac1或azt单独处理的细胞中轻微或部分减少，证实了该观察结果的特异性和显著性：在相同条件下，中和herv-w env蛋白质的gnbac1抗体和azt的组合消除了该herv-w rt蛋白质的检测。
[0088]
因此，在第二个方面，本发明涉及一种用作针对属于人内源性反转录病毒(herv)的病毒的抗反转录病毒药物的组合物，包含：
[0089]-根据本发明的抗体、片段或衍生物；和
[0090]-反转录病毒的反转录酶抑制药物。
[0091]
优选地，所述反转录病毒的反转录酶抑制药物选自迭氮胸苷、恩替卡韦(entecavir)、拉米夫定(lamivudine)、阿德福韦(adefovir)、索氟布韦(sofosbuvir)、地丹诺辛(didanosine)、替诺福韦(tenofovir)、阿巴卡韦(abacavir)、拉米夫定、司他夫定(stavudine)、恩曲他滨(emtricitabine)、扎西他宾(zalcitabine)、替比夫定(telbivudine)、和地丹诺辛。更优选地，所述反转录病毒的反转录酶抑制药物是迭氮胸苷(azt)。所有先前公开的技术数据可适用于本文。
[0092]
本发明的组合物对于herv-w病原性表达的治疗干涉提供未不可预料的新颖的角度。该治疗是以下组合：
[0093]-一种针对herv-w env的抗体，诸如gnbac1；和
[0094]-一种针对反转录酶本身和/或其活性的分子，诸如azt，
[0095]
被证实在与herv-w相关的疾病中抑制herv-w rt表达非常有用。
[0096]
因此，本发明还涉及一种用于预防和/或治疗herv-w相关的疾病的组合物，其包含：
[0097]-根据本发明的抗体、片段或衍生物；和
[0098]-反转录病毒的反转录酶抑制药物。
[0099]
本发明还涉及一种组合物，其包含：
[0100]-根据本发明的抗体、片段或衍生物；和
[0101]-反转录病毒的反转录酶抑制药物，
[0102]
用于预防和/或治疗选自以下的疾病：多发性硬化症(ms)、精神分裂症(sz)、双极性情感疾患(bp)、单极性或精神性抑郁、临床孤立综合征(cis，具神经症状)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、癫痫、牛皮癣、癌症、炎症性胰腺炎和糖尿病诸如i型或ii型糖尿病。更优选地，该疾病选自多发性硬化症(ms)和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)。
[0103]
所有先前公开的技术数据可适用于本文。
[0104]
在第三个方面，本发明涉及针对herv-w包膜蛋白(herv-w env)的抗体或其片段或衍生物，和反转录病毒的反转录酶抑制药物，优选迭氮胸苷作为联合制剂同时、分别或连续用于治疗herv-w相关的疾病的方法中，优选地，疾病选自多发性硬化症(ms)、精神分裂症(sz)、双极性情感疾患(bp)、单极性或精神性抑郁、临床孤立综合征(cis，具神经症状)、慢性脱髓鞘多发性神经炎(cidp)、癫痫、牛皮癣、癌症、炎症性胰腺炎和糖尿病诸如i型或ii型糖尿病。
[0105]
所有先前公开的技术数据可适用于本文。
[0106]
根据本发明的试剂盒
[0107]
在患有疾病的患者中这些herv-w元件的表达和/或其在疾病特异性组织和病变中的检测，鉴别并定义herv-w相关疾病或症状的一般分类。它还反映herv-w在疾病发展期间及其治疗期间的生物活性。
[0108]
因此，具有改善的敏感性、具有特定的疾病特异性、或在患herv-w相关疾病或症状的患者中具有临床特征特定相关的herv-w的检测，对诊断识别及层次化以及对患者的追踪和治疗监测具有重要价值。因此，发明人已经从一组引物、探针和pcr程序选择并发展出一种引物和探针的试剂盒，其显示可用于检测患者中herv的表达的存在和/或测量其表达水平。
[0109]
因此，在第四个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含至少一个、优选至少两个、优选至少三个、优选至少四个、优选至少五个、优选至少六个、优选至少七个、优选至少八个、优选至少九个、优选至少十个选自seq id no：11-28的寡核苷酸。
[0110]
优选地，所述试剂盒包含至少seq id no：17和/或18，或seq id no：19、和20。
[0111]
或者，所述试剂盒包含：
[0112]-seq id no：19、20、23、24和25；或
[0113]-seq id no：17、18、23、24和25；或
[0114]-seq id no：19、20、14、15、16、23、24和25；或
[0115]-seq id no：17、18、14、15、16、23、24和25。
[0116]
更优选地，本发明试剂盒包含如seq id no：11-28所示的所有寡核苷酸。通常，所述试剂盒意图用于进行pcr，或更具体地，定量pcr(qpcr)分析。因此，该试剂盒优选还包含来自参考细胞基因的最适于rna或dna相对定量和各种指示的引物和/或探针。
[0117]
所述试剂盒优选进一步包含：
[0118]-seq id no：26、27和28；或
[0119]-对gusb基因特异性的序列；或
[0120]-对rnase p基因特异性的序列；或
[0121]-对用qpcr的相对定量的参考细胞基因特异性的序列。
[0122]
所述试剂盒可用于监测属于w型人内源性反转录病毒家族(herv-w)的病毒(包含msrv但也包含其他herv-w亚型)的检测和/或定量。更具体地，本发明的试剂盒可用于检测和/或定量编码herv-w env的序列，如那些编码herv-w pol多蛋白质，包括rt。通常，在患者中检测和/或定量herv-w包含：
[0123]
(i)检测和/或定量特异性herv-w rna、dna或抗原，优选在体液或疾病特异性组织
和病变中检测，
[0124]
(ii)检测和/或定量来自血液或具病变或功能障碍的器官的细胞或组织中升高的dna或rna的拷贝数。
[0125]
因此，在第五个方面，本发明涉及针对herv-w包膜蛋白(herv-w env)的抗体、其片段或衍生物在患有herv-w相关的疾病的患者中用作针对属于herv的病毒(优选herv-w，更优选msrv)的抗反转录病毒药物的用途，其中所述患者通过包含步骤i)在生物样品中检测及和/或定量herv-w的方法鉴定。
[0126]
因此，在该具体的实施方案中，医师能够调整并优化对罹患herv-w相关的疾病的患者的适当医疗照护。监测herv-w表达的存在和/或表达水平对随访护理(follow-up care)和临床决策非常适合。实际上，医师可确定对每一患者最佳的策略的适当治疗。
[0127]
通常，可以根据本领域技术人员已知的常规技术进行步骤i)的检测和/或定量。通常，所述步骤i)包含：将患者的生物样品与选择的试剂例如探针、引物、配体(ligands)或抗体接触，从而检测在样品中原始的目标核酸或蛋白质的存在。优选地，用根据本发明的试剂盒进行所述步骤i)的检测herv-w的存在和/或定量herv-w。
[0128]
所有先前公开的技术数据可适用于此。
[0129]
药物组合物
[0130]
本发明进一步的目的涉及一种药物组合物，其包含有效剂量的针对herv-w包膜蛋白(herv-w env)的抗体和任选地包含反转录病毒的反转录酶抑制药物。
[0131]
如上述的本发明的任一治疗剂可与药学上可接受的赋形剂、和任选的缓释基质例如生物可降解聚合物组合以形成治疗组合物。
[0132]“药学上”或“药学上可接受”是指如有需要当向哺乳动物，尤其是人类施用时，不会产生副作用、过敏或其他不适当反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料(encapsulating material)或任何形式的配制辅助剂。
[0133]
药物组合物的形式、施用途径、剂量和给药方案(regimen)当然取决于待治疗的病况、疾病严重性、患者的年龄、重量及性别等。
[0134]
本发明的药物组合物可配制为用于局部、口服、鼻内、眼内、静脉内、肌肉内或皮下施用等。
[0135]
优选地，此药物组合物含有媒介(vehicle)，其对于能够被注射的制剂是药学可接受的。这些特别可以是等渗的、灭菌的盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠，氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或为干燥的，尤其是冷冻干燥的组合物，其视情况当添加灭菌水或生理盐水时允许构成可注射溶液。
[0136]
施用剂量可随各种参数来调整，尤其随所用的施用模式、相关病理学或期望的治疗持续时间来调整。
[0137]
为了制备药物组合物，可将有效量的针对herv-w包膜蛋白(herv-w env)的抗体溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质。
[0138]
适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的灭菌粉末。在所有情况下，此形式必须是无菌的且必须是存在可容易注射(easy syringability)程度的流动。其在制造及
储存的条件下必须是稳定的，且必须保存防止微生物诸如细菌及真菌的污染作用。
[0139]
可在与表面活性剂例如羟基丙基纤维素适当混合的水中制备呈游离碱或药理学上可接受的盐类的活性化合物的溶液。也可在甘油、液体聚乙二醇或其混合物及油中制备分散液。在储存及使用的平常条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
[0140]
在配制时，以与剂量制剂(dosage formulation)相容的方式且以治疗有效的量施用溶液。此制剂容易以各种剂型施用，诸如上述可注射溶液的形式，但也可使用药物释放胶囊等。
[0141]
优选地，本发明的针对herv-w包膜蛋白(herv-w env)的抗体或其片段及其衍生物可在其溶解、储存及向患者注射的缓冲液中配制。优选地，该缓冲液包含20mm组氨酸、5％蔗糖、和0.01％聚山梨醇酯20且ph为6.0。用于gnbac1静脉施用的制剂的一个实例示于实施例3。
[0142]
对于水溶液的肠胃外施用，例如溶液可被适当地缓冲且用充分的盐水或葡萄糖首先使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适于静脉内、肌肉内、皮下及腹膜内施用。就此点而论，鉴于本文的公开，可以使用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解于1ml的等渗nacl溶液，也可添加至1000ml的皮下灌注(hypodermoclysis)液体或在提议的输注位置注射(参见例如，remington's pharmaceutical sciences第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据待治疗患者的病况，必然会发生剂量上的一些变动。无论如何，负责施用的人将决定对个别患者适当的剂量。
[0143]
除了配制用于肠胃外施用(例如静脉内或肌肉内注射)的化合物，其他药学上可接受的形式包括，例如，口服施用的片剂或其他固体；时间释放胶囊；和目前使用的任何其他形式。
[0144]
根据本发明的治疗方法和监测方法
[0145]
本发明还涉及一种通过向患者施用针对herv-w包膜蛋白(herv-w env)的抗体来抑制所述患者中属于人内源性反转录病毒(herv)的病毒的表达和/或复制的方法。
[0146]
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种通过向患者施用针对herv-w包膜蛋白(herv-w env)的抗体、其片段或衍生物来预防和/或治疗患有选自以下疾病的患者的方法：多发性硬化症(ms)、精神分裂症(sz)、双极性情感疾患(bp)、单极性或精神性抑郁、临床孤立综合征(cis，具神经症状)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、癫痫、牛皮癣、癌症、炎症性胰腺炎及糖尿病诸如i型或ii型糖尿病，其中该抗体用作靶向herv(优选靶向herv-w，更优选靶向msrv)的抗反转录病毒药物。
[0147]
本发明还涉及一种治疗患有herv-w相关疾病的患者的方法，包含下列步骤：
[0148]
1)通过用本发明的试剂盒在生物样品中检测和/或定量属于人内源性反转录病毒(herv)家族的病毒(优选herv-w，更优选msrv)来预测患者的预后；和然后
[0149]
2)如果该步骤1)显示人内源性反转录病毒(herv)的表达，则本发明的方法包含步骤3)，其向所述患者提供本发明的抗体、片段或衍生物。
[0150]
本发明还涉及一种监测患有herv-w相关疾病的患者对治疗的反应的方法，该方法包含下列步骤：
[0151]
a.用根据本发明的抗体、片段或衍生物治疗该病患；然后
[0152]
b.在该病患的生物样品中检测和/或定量herv-w。
[0153]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种监测患有herv-w相关疾病的患者对治疗的反应的方法，该方法包含在该病患的生物样品中检测和/或定量herv-w的步骤。优选地，该病患包含根据本发明的抗体、片段或衍生物。表述“包含抗体的患者”是指用抗体治疗且在该患者的血液、组织、或器官中存有可检测量的该抗体的患者。通常，在检测和/或定量herv-w的步骤之前向患者提供或施用该抗体、片段或衍生物。
[0154]
根据本发明，在监测患有herv-w相关疾病的患者对治疗的反应的情况下，生物样品可以是体液诸如血液、脑脊髓液、尿液、或在疾病特异性组织及病变中诸如ms脑斑、cidp神经生检、或糖尿病胰腺活检。
[0155]
通常，检测和/或定量的步骤b.可根据本领域技术人员熟知的常规技术进行。通常，该步骤b.包含将患者的生物样品与选择试剂诸如探针、引物、配体或抗体接触，从而检测在样品中原始的目标核酸或蛋白质的存在。优选地，该步骤b.的检测herv-w的存在和/或测量herv-w的表达水平用根据本发明的试剂盒进行。
[0156]
所有先前公开的技术特征可适用于此。
附图说明
[0157]
图1
[0158]
(a)用qpcr的不同引物对和探针检测入组时herv-w env和pol的转录水平。
[0159]
(b)包括于2mg/ml组(空白圆圈)和6mg/ml组(空白四方形)的并行病患中，用“env”和“uno”引物和探针的herv-w env转录。
[0160]
(c)包括于2mg/ml组(空白圆圈)和6mg/ml组(空白四方形)的并行病患中，用“uno2”、“syn”和“pol”引物和探针的herv-w env转录。
[0161]
纵轴表示各患者目标rna的相对表达(与gus b之比)，横轴表示用于相同样品的不同qpcr程序。
[0162]
图2：用qpcr的不同引物对和探针检测入组时ms的不同临床形式之间的herv-w env和pol转录水平的差异(a)“env”程序、(b)“uno”程序、(c)“uno2”程序、(d)“syn”程序、(e)“pol”程序。
[0163]
纵轴表示各患者目标rna的相对表达(与gus b之比)，横轴表示ms的不同临床形式：原发进行性(primary progressive)(ppms)、复发-缓解型(relapsing-remitting)(rrms)和次发进行性(secondary progressive)(spms)。
[0164]
图3：用qpcr的特定引物对和探针检测herv-w env和pol转录水平及入组时ms患者的临床参数之间的相关性，(a)“syn”程序显示合胞素-型herv-w表达和疾病持续时间之间的负相关：皮尔逊相关检验(pearson’s correlation test)r＝-0.96；p＝0.009；(b)“syn”程序显示合胞素-型herv-w表达和疾病进展指数(progression index)之间的正相关：皮尔逊相关检验r＝0.95；p＝0.014；(c)“pol”程序也显示herv-w型pol基因(编码蛋白酶、反转录酶和整合酶)的表达和疾病进展指数之间的正相关：皮尔逊相关检验r＝0.95；p＝0.048。
[0165]
纵轴表示以年计算的疾病持续时间(a)或进展指数(b&c)；横轴表示各患者的目标rna的相对表达(与gus b之比)。
[0166]
图4：在gnc002的前6个月期间与herv-w相关的转录物水平的变化。数据表示在2mg/kg组(a)、6mg/kg组(b)、和所有包括在gnc002(c)的患者中，对于各个与herv-w相关的
转录物，平均目标rna相对于gus b的表达。虚线表示入组时对应转录物的水平。纵轴表示在各qpcr程序的病患中目标rna的平均相对表达(与gus b之比)。横轴表示向患者注射gnbac1的数目。
[0167]
图5：在gnc002的前6个月期间与herv-w相关的转录物水平的变动。数据表示在包括于gnc002的所有患者中，对于各herv-w转录物，平均目标rna相对于gus b的表达。说明了伴随于来自包括ms治疗至第6次注射之日，herv-w env和pol转录物水平的变化，用qpcr的不同引物对和探针测量的来自各患者数据的长须图(whiskers plots)(10-90百分比)(a)“env”程序、(b)“uno”程序、(c)“uno2”程序、(d)“syn”程序、(e)“pol”程序。
[0168]
纵轴表示对于各qpcr程序的患者组中，目标rna的平均相对表达(与gus b之比)。横轴表示收集血液样品之前，向患者注射gnbac1的次数(因此，“1”对应于任何注射前的状态；“3”第二次注射后4周的状态；和“6”第五次注射后4周的状态。
[0169]
图6：通过蛋白质免疫印迹用特异性抗体检测的ch2细胞自发表达gag、pol和env-编码的herv-w蛋白质。
[0170]
用针对herv-w gag、pol和env-编码的抗原的各特异性抗体检测到的条带的显著分子量如泳道右侧所示，其对应各抗原的细胞提取物。a、b及c中的左泳道表示用于估算kda的分子量标记。
[0171]
(a)herv-w gag多蛋白质及裂解产物，包括典型的约30kda的衣壳蛋白。
[0172]
(b)herv-w pol多蛋白质及裂解产物，包括典型的约55kda的反转录酶蛋白质。
[0173]
(c)herv-w包膜蛋白、裂解产物及多聚体(multimers)，包括约45和35kda的su(表面)和tm(跨膜)裂解单元。检测到具有潜在变化的糖基化env产物，所述变化是在约75和80kda检测的单体条带之间的糖基化。55kda对应于无糖基化单体，二聚体为约100kda。约160kda的条带可能是糖基化二聚体或非糖基化三聚体。
[0174]
图7：在用或不用gnbac1和/或azt处理的ch2培养中herv-w pol-编码的反转录酶蛋白质。
[0175]
用针对herv-w pol-编码的抗原的特异性抗体检测到的条带的显著分子量示于蛋白质免疫印迹的右侧。蛋白质免疫印迹泳道的数目(1至6)示于图下。
[0176]
1)用gnbac1和azt的组合治疗
[0177]
2)仅用azt治疗
[0178]
3)仅用gnbac1治疗
[0179]
4)模拟处理细胞(mock-treated cells)(无处理)
[0180]
5)空孔
[0181]
6)分子量标记
具体实施方式
[0182]
实施例1：在用gnbac1治疗的患有多发性硬化症的患者中人内源性反转录病毒w型mrna表达的抑制
[0183]
gnbac1是针对与多发性硬化症有关的反转录病毒的包膜蛋白(msrv-env)的igg4单克隆抗体，所述包膜蛋白是herv-w家族的内源性反转录病毒的元件的成员，因此也称为herv-w env。在健康自愿者中进行的i期临床试验中，gnbac1已显示良好的安全性概况和线
性药物动力学。
[0184]
目前的gnc002iia期临床试验在10位ms患者中进行以评估2和6mg/kg的gnbac1的安全性概况(safety profile)和药物动力学。gnc002由12个月的纵向研究构成，其中每个月施用gnbac1。
[0185]
本分析是在gnc002的前6个月期间收集的样品上进行，其中与herv-w相关的转录物水平是在入组患者的外周血单个核细胞(pbmc)中用实时定量聚合酶链反应(rt-qpcr)评估。用以下不同的引物/探针组评估herv-w转录物：msrv-env、herv-w-uno、herv-w-uno2。
[0186]
材料和方法
[0187]
在4ml cpt vacutainer管中收集样品，根据geneuro在gnc002laboratory manual中提供的程序处理、储存及运送。
[0188]
来自10位患者的冷冻pbmc是由参与gnc002研究的2个招募中心提供。
[0189]
化学品和生物材料
[0190][0191][0192]
软件
[0193]-biorad cfx manager 2.0：pcr执行及分析
[0194]-genex 5：pcr原始资料的修匀
[0195]-graph pad prism：制图
[0196]-sigmastat：统计分析
[0197]
使用的正态检验(normality test)是科摩哥洛夫-史密诺夫检验(kolmogorov-smirnov test)。如果数据是多参数的，以皮尔逊积差分析(pearson product moment analysis)或斯皮尔曼等级分析(spearman rank order analysis)确定相关性。
[0198]
程序(protocols)
[0199]
简言之，第一步骤是从pbmc样品提取总rna。样品是从收集在cpt管中的血液分离的pbmc且在0.5ml的dmso 10％胎牛血清中冷冻。解冻后，用冰冷pbs洗涤pbmc样品并用qiaamp rneasy mini试剂盒提取总rna。然后，通过反转录先前提取的总rna中含有的所有mrna来制备cdna。对这些cdna进行定量pcr，其中添加用作板内校正的内部标准(允许用多个板的实验的数值的标准化)。结果通过与gus b rna的表达之比表示为目标rna(msrv/herv-w)的相对表达，所述gus b rna是在ms群体中具有稳定表达水平的参考管家基因
(reference housekeeping gene)。
[0200]
引物和探针序列
[0201]
对照管家基因gus b所用的市售检测引物/探针组是taqman gene expression assay gusb(应用生物是统4448485)。是在gusb探针的5’端检测的荧光染料标签。
[0202]
设计msrv-env引物及探针以特异性检测msrv-env蛋白质而不是合胞素的序列编码。相反地，合胞素引物能够特异性扩增编码合胞素的序列，而非msrv-env。fam
tm
染料标签的荧光是在msrv-env和合胞素探针上测量。
[0203]
通过用其他内源性反转录病毒序列的对应区域类推，用geneuro设计uno2引物以识别假定具有潜在免疫抑制功能的msrv-env序列；然而，此处使用的术语(“免疫抑制胜肽/序列”)是定位反转录病毒的包膜蛋白中确定的结构域，其可能在许多反转录病毒中完全没有免疫抑制性。这些引物也可以与编码合胞素的序列杂交。
[0204]
用geneuro设计uno来结合编码msrv-env和合胞素的序列。对用uno及uno2引物扩增的序列没有设计探针，因此sybr绿色荧光能够定量这些序列的扩增。
[0205]
用geneuro设计msrv-pol引物和探针，其辨识编码msrv反转录酶的序列。用fam
tm
荧光报告基因定量msrv-pol探针杂交的检测。
[0206]
表4：在此生物标记研究中使用的所有引物和探针的序列
[0207][0208]
cfx温度循环器检测的荧光团(fluorophore)在探针的5’。对于没有探针的引物组，用插入的sybr绿色染料进行检测。
[0209]
结果的分析
[0210]
在分析中防止偏差的样品排除标准如下：
[0211]-提取和dnase处理后，样品的rna浓度低于10ng/μl
[0212]-对于一个样品，pcr三次重复的标准偏差高于0.2cq
[0213]-gus b的cq(定量循环(cycle of quantification))高于降解阈值(degradation cut-off)，其表明在此研究中rna并未到达预期的质量水平。如下计算降解阈值：平均值 2x所有个体gus b cq值的标准偏差
[0214]
用软件(multid analyses ab,sweden)将msrv/herv-w env基因和gus b的所有个体cq根据在每个实验板上添加的它们自己的内部标准标准化。
[0215]
如下计算各靶标rna在各样品中的相对表达：
[0216]
相对于gus b的靶标rna的相对表达＝2
(cq gus b
–
cq靶标rna)
[0217]
提取产量及样品排除
[0218]
提取后，用装置测定各样品的总rna浓度。排除总rna浓度低于10ng/μl的所有样品。定量总rna之前，使总rna经历dnase处理以消除最后残留于总rna制备物中的污染的基因组dna。在此dnase步骤后，通过无反转录的pcr控制各样品中不存在污染的基因组dna(nort ctrl n
°
1)。如果在此步骤中检测到基因组dna，使对应样品历经第二次dnase步骤，和第二次rna定量，以及第二次nort对照(nort ctrl n
°
2)。如果基因组dna仍存在于此制剂中，或如果在此额外的dnase处理后总rna低于10ng/μl，则最终排除此样品。
[0219]
用标准化原始数据和样品的排除
[0220]
为了协调从多个pcr微板收集的原始数据，用genex软件根据各微板上的内部标准物将所有原始数据标准化。将pcr三次重复的标准偏差大于0.2cq的样品从此研究排除。样品的质量用其gus b表达水平来反映。将大于降解阈值的所有样品从此研究排除。
[0221]
结果
[0222]
入组时herv-w相关的转录物水平
[0223]
在此研究的第一个时间点，在第一次施用gnbac1或安慰剂之前，从所有受试者的血液分离pbmc。因此，示于表5和图1的结果对应于该研究中各患者入组时，目标herv-w相关转录物的基础水平。
[0224]
表5：入组时herv-w相关的转录物水平
[0225][0226]
用“env”和“syn”qpcr程序的来自所有患者的结果分布是均匀的，但用uno及uno2
程序可见分布的差异，尽管用“uno2”特异性靶标检测的rna相对表达较低。
[0227]
在2mg/kg和6mg/kg组的病患之间以及参与此研究的两招募中心之间，没有观察到入组时herv-w转录物水平分布上的差异。
[0228]
用临床数据比较入组时herv-w env和pol的转录物水平
[0229]
根据表6总结的数据，评估入组时herv-w相关的转录物水平与临床参数的关联。
[0230]
表6：入组时herv-w相关的转录物水平和临床资料
[0231][0232][0233]
首先，这些结果证实下列事实：无论在不同qpcr程序中所用的引物和探针为何，以及无论是何种herv-w基因(env或pol)，最高herv-w rna水平皆在ppms患者中发现，且最低水平在spms患者中发现(图2)。这清楚地为患有两不同形式的进行性ms(ppms和spms)的患者的不同herv-w转录表达水平提供令人感兴趣的新信息。这对于rrms可能也是令人感兴趣的，但在此仅一例呈现中等的相对表达。
[0234]
这表明，ms患者中herv-w转录水平的定量具有诊断价值且可例如用于支持spms和ppms病例之间的区别诊断的目的。这也可以为ppms、spms及最终用于rrms的预后或治疗性监测用于分层化qpcr阈值。
[0235]
其次，尽管目前数量较低，当使用“syn”和“pol”程序时，在herv-w env和pol rna转录水平及疾病持续时间和/或进展指数之间已发现统计学上显著的相关。使用不同引物和探针的其他程序与临床参数并未产生显著相关，这凸显所选程序的价值，如图3所示。
[0236]
这表明，总体上为编码合胞素亚型(“syn”程序，用seq id n
°
：14、15和16)的env基因或pol基因(“pol”程序，用seq id n
°
：23、24和25)的herv-w转录水平的定量选择程序对ms也具有特别的诊断价值。在此，“syn”和“pol”qpcr程序可用作herv-w相关疾病活性(疾病发展的进化性)的生物标记以用于临床分层化、追踪及治疗监测。这也可用于在进行性ms中用“syn”qpcr分层疾病“持续时间相对于活性”，在渐进性进化数年的患者(尤其是spms)中依据herv-w env“合胞素”的转录水平，产生对不同治疗策略的观点。
[0237]
6个月内herv-w相关的转录物水平
[0238]
对于研究中包括的每一位病患，在第1天(入组(inclusion))、第2天、第8天、第15天和第29天从血液样品分离pbmc。之后，患者接受5次额外的每月的gnbac1施用，并在每次输注抗体前从血液样品分离pbmc。因此，以下结果表示在gnc002研究的前6个月中各herv-w
相关转录物的变化。
[0239]
依病人而定，第二次施用gnbac1在从第1天起不同的时间点发生。因此，仅用每次施用gnbac1之前收集的血液样品评估herv-w相关转录物的平均变化。
[0240]
在2mg/kg组中，观察到当与入组时的基值相比，第6次施用gnbac1时所有herv-w转录物水平降低(图4)。这在6mg/kg组被确认(图4)。当将所有患者(2mk/kg和6mg/kg组)分组，贯穿gnc002研究的herv-w uno、uno2和pol qpcr程序更好地证明了这种降低(图4)。这也在所有患者第1次、第3次和第6次注射gnbac1前测量值的统计分布中说明(图5)。
[0241]
非常出乎意料地，这种降低对于pol mrna也是显著的。这种效果并非患有疾病相关herv-w表达的患者在6个月中每月注射1次后特异性结合至herv-w env蛋白质的抗体所预期产生的。对编码反转录酶、蛋白酶和整合酶的mrna的效果似乎对于抗env抗体诸如gnbac1是独特且新颖的。因此，其证明对整体herv-w表达本身的效果，以及通过其pol编码的产物对复制的反转录病毒的活性的效果。因此，着表明抗反转录病毒的效果，尤其是靶向herv-w家族的抗内源性反转录病毒效果。
[0242]
在图5中，为用于治疗性监测用gnbac1治疗或用任何干扰herv-w表达的药物治疗的患者群的qpcr程序选择的最精确的引物和探针是：herv-w env的“uno2”和编码herv-w酶的pol基因的“pol”。然而，用其他qpcr程序获得的数字之比的计算也可以显示令人感兴趣的诊断或预后。
[0243]
在该实验中，在gnc002研究包括的ms患者中herv-w相关的转录物水平通过实时定量pcr评估，使用不同组的扩增不同herv-w env基因代表的序列的引物和一组扩增herv-w pol序列(在反转录酶编码区内)的引物。此处研究的herv-w转录物称为msrv-env、herv-w-uno、herv-w-uno2、herv-w-syn和msrv-pol。
[0244]
结果清楚表明，这些生物标记可以为ms的诊断和herv-w相关疾病的治疗性监测提供灵敏的令人感兴趣的生物临床数据。
[0245]
此外，ppms患者中herv-w相关的转录物量似乎高于spms患者，这证实了本发明用不同引物组的定量pcr检测对患者的生物临床评价以及，除此以外，对ms进展形式(spms和ppms)之间的区别诊断目的的价值。
[0246]
由于在2mg/kg及6mg/kg两组中，gnc002前6个月的所有herv-w相关的转录物水平降低，这确认了本引物组和qpcr程序对病患的治疗性监测以及治疗效力的生物临床评价的生物临床价值。
[0247]
最后，这也提供生物证据证实在ms患者中抗herv-w env抗体治疗(诸如gnbac1)对herv-w表达有抑制效果，这对于env mrna水平并未被预期，更不用说对于pol mrna。这清楚表明该抗-env抗体治疗对与人类疾病相关的内源性反转录病毒的效果，这种效果在人外源性反转录病毒中从未被描述。
[0248]
实施例2：对人内源性反转录病毒w型pol-基因编码的蛋白质(反转录酶)的抑制通过gnbac1抗体和azt的组合处理协同增强。
[0249]
a.自发表达herv-w gag、pol和env蛋白质的细胞培养的抗原性特征
[0250]
材料和方法
[0251]
自发表达herv-w gag、pol和env蛋白质的细胞培养
[0252]
在补充有10％胎牛血清(10270106；invitrogen)、1％青霉素/链霉素(p4333；
sigma)的imdm培养基(12440053；lifetech)中于37℃具5％co2中维持人ch2细胞。蛋白质提取
[0253]
蛋白质提取
[0254]
于4℃，将ch2细胞重悬于含有抗磷酸酶抑制剂鸡尾酒(04 693 132001；roche)和0.05％lpg(326495-22-1；avanti polar)的500μl ripa缓冲液(r0278,sigma)，于26℃的旋转平台上孵育2小时并于26℃以10000g离心20分钟。收集上清液并储存于-20℃。
[0255]
蛋白质免疫印迹
[0256]
将蛋白质提取物稀释于2x laemmli缓冲液(biorad)并在装载之前于100℃加热5分钟。用7.5％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(tgx,biorad)分离蛋白质。凝胶在电泳缓冲液(life technologies)中于120ma跑15分钟。将蛋白质转移至0.2μm硝基纤维素膜(biorad)上后，用含有0.05％tween20缓冲液(sigma)的1x pbs(biom
é
rieux)洗涤该膜2次，并在旋转平台上于室温下用starting block(thermo)封阻1小时。根据表1在1x pbs中使用一级抗体1小时。然后将此膜洗涤3次并用与hrp-偶联的山羊抗兔(g21234；lifetech,1/1000于1x pbs)或小鼠(115-035-146；jackson,1/1000于1x pbs)igg抗体孵育30分钟。根据所提供的程序，用比色反应(colometric reaction(opti 4-cn,biorad))检测目标蛋白质。
[0257]
具有靶标抗原的抗体和抗体稀释：1)兔多克隆pab1(sq09ak001,squarix),msrv-env,0.5μg/ml；2)兔多克隆330110j77血清(330110j77,incellart),msrv-pol多蛋白质，1/500；鼠科单克隆38e12(250510,squarix)；msrv-gag多蛋白质,1μg/ml。
[0258]
结果
[0259]
从图6可以看出，通过针对gag、pol和env-编码的蛋白质的特异性抗体检测，这些细胞表达所有的herv-w结构蛋白质。
[0260]
值得注意的是，抗-gag抗体检测herv-w gag-编码的多蛋白质及不同的裂解蛋白质，包括衣壳p30样蛋白质带的较强检测。通过抗-env抗体检测的模式似乎用herv-w env-编码的糖基化及非-糖基化单体、二聚体和三聚物以及约45和35kda的裂解的su或tm单元的检测更复杂。抗-pol抗体主要检测裂解的反转录酶，尽管在凝胶上部可见与未裂解的herv-w pol-编码的多蛋白质对应的高分子量条带(未用kda评估标示)。
[0261]
b.在暴露于gnbac1抗体和azt组合处理的细胞中不再能够检测到人内源性反转录病毒w型pol-基因编码的蛋白质(反转录酶)。
[0262]
材料及方法
[0263]
索脊瘤(chordomas)细胞培养
[0264]
将人ch1和ch2细胞(1：1)细胞共培养以优化ch2细胞的生长并于37℃，5％co2，以1.106个细胞/孔的密度在补充有10％胎牛血清(10270106；invitrogen)、1％青霉素/链霉素(p4333；sigma)的imdm培养基(12440053；lifetech)中将其维持于6孔板(cc7672-7506；cytoone)。用i)azt(1μg/ml,a21-69；sigma)、ii)gnbac1(300μg/ml,t950111-a；polymun)、iii)azt gnbac1或对应的gnbac1缓冲液对照[20mm his,5％蔗糖(w/v),0,01％tween 20(w/v)]处理细胞。
[0265]
蛋白质提取
[0266]
于4℃，将ch1和ch2细胞重悬于含有抗磷酸酶抑制剂鸡尾酒(04 693 132001；roche)和0.05％lpg(326495-22-1；avanti polar)的200μl ripa缓冲液(r0278,sigma)，在26℃的旋转平台上孵育2小时并于26℃以10000g离心20分钟。收集上清液并储存于-20℃。
[0267]
蛋白质免疫印迹
[0268]
将蛋白质提取物稀释(2：1)于2x laemmli缓冲液(biorad)并在装载之前于100℃加热5分钟。用7.5％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(tgx,biorad)分离蛋白质。凝胶在电泳缓冲液(life technologies)中于120ma跑15分钟。将蛋白质转移至0.2μm硝基纤维素膜(biorad)上后，用含有0.05％tween20缓冲液(sigma)的1x pbs(biom
é
rieux)洗涤该膜2次，并在旋转平台上于室温下用starting block(thermo)封阻1小时。根据表1在1x pbs中使用一级抗体1小时。然后将此膜洗涤3次并用与hrp-偶联的山羊抗兔(g21234；lifetech,1/400于1x pbs)或小鼠(115-035-146；jackson,1/1000于1x pbs)igg抗体孵育30分钟。根据所提供的程序，用比色反应(opti 4-cn,biorad)检测目标蛋白质。抗体：兔多克隆330110j77血清(330110j77,incellart)，被产生来抗msrv-pol多蛋白质并以1/500稀释。
[0269]
从该实验的结果可以看出(如图7所示)，在gnbac1和azt组合的存在下培养的细胞(第1道)不再表现可检测量的herv-w反转录酶(rt)。当单独暴露于azt(第2道)，对应的抗-herv-w rt抗体染色信号的降低表面herv-w rt表达的清楚降低；然而，这仍然是部分效果。在第3道，如在本次体外条件下所检测，单独暴露于gnbac1似乎对herv-w pol-编码的反转录酶蛋白质具有较小的效果。作为并行的阳性对照，来自仅暴露于gnbac1稀释剂(稀释缓冲液)的细胞的herv-w rt蛋白质表达，作为模拟处理，在第4道中显示在这些细胞中表达的该rt条带的正常存在。
[0270]
因此，这表明，只有gnbac1抗herv-w env抗体和迭氮胸苷(azt)两者的组合具有完全抑制从表达herv-w gag、pol及env基因全部的该人细胞培养物产生herv-w rt的充分效果，而各单独的治疗分子对这种herv-w表达仅有部分或极少效果。即使这与体外细胞培养条件有关，然而这还是证明了通过中和herv-w env蛋白质的抗体和抗-反转录病毒的反转录酶药物的独特组合对herv-w rt表达的抑制效力明显地增加且具有重要的协同效果。并未预期这些治疗分子对内源性反转录病毒(例如herv-w)的rt表达有协同效果，正因为(i)它们特异性靶向完全不同的分子和蛋白质结构，(ii)它们具有完全不同的作用模式(通过特异性表位靶向的env中和和rt酶活性的抑制)和(iii)一者是一种抗体，而另一者是小的化学分子。
[0271]
实施例3：用于适合向人类个体静脉注射的gnbac1抗体制剂的缓冲溶液制剂
[0272]
如实施例1所述，gnbac1是一种针对多发性硬化症相关的反转录病毒包膜蛋白(msrv-env)的igg4单克隆抗体，该包膜蛋白是herv-w家族的内源性反转录病毒元件的一员，因此也称为herv-w env。gnbac1在健康自愿者中进行的i期临床试验中已显示良好的安全性概况和线性药物动力学。在10位ms患者中进行gnc002iia期临床试验以评估2和6mg/kg gnbac1的安全性概况和药物动力学。gnc002是12个月的纵向研究，其中每月施用gnbac1。
[0273]
为静脉(iv)施用gnbac1抗体的目的，特别适合其溶解、储存和向患者注射的缓冲液制剂如下：20mm组胺酸、5％蔗糖、0.01％聚山梨醇酯20，ph6.0。