一种小分子化合物SPAM1的制备方法与流程

一种小分子化合物spam1的制备方法
技术领域
1.本发明涉及化学与生物化学领域，具体地说，涉及有效上调神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，pacap)及其特异受体pac1-r表达的小分子化合物spam1：4-((4-(4-氧-3,4-二氢喹唑啉-2-基)丁酰)甲基苯甲酸及其衍生物，spam1的高效制备方法及其在预防与治疗与pacap及其特异受体pac1-r相关的神经系统、内分泌系统、与免疫系统的生理病理疾病和功能衰退的的应用。


背景技术：

2.最初从牛的下丘脑-垂体中分离得到的神经肽pacap属于血管活性肠肽/分泌素/生长激素释放激素/胰高血糖素超家族；pacap在进化过程中极其其保守的活性肽，青蛙和人的pacap只有一个氨基酸的差异【1】。pacap通过三个b类g蛋白偶联受体介导了发挥重要的调控神经系统、内分泌系统和免疫系统的功能：一个pacap特异受体pac1-r和两个和血管活性肠肽共享受体vpac1-r和vpac2-r。作为重要的神经递质和神经调质，pacap的随龄下调被认为是衰老的原因之一。
3.pacap及其受体，尤其其特异pac1-r不仅在下丘脑-垂体高密度分布，而且在垂体-肾上腺轴、垂体-性腺轴、松果体和胸腺等神经内分泌组织和腺体，包括肾上腺、睾丸和卵巢上高密度分布，介导了相关应激激素、性激素和免疫因子的分泌和调节；包括上调促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，crh)和肾上腺皮质酮(corticosterone，cor)，参与调节褪黑素和促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone，gnrh)释放，上调睾酮(testosterone，te)和雌二醇(estradiol,e2)；而pacap缺失的动物胸腺衰退，免疫功能下调。总而言之，现有细胞和动物研究均表明：pacap及pac1-r介导机体的应激调控、增强雄性和雌性的性功能和生殖能力、促进免疫功能、有效降低脓毒症死亡率。
4.虽然pacap具有潜在的抗衰老的药用开发价值，但鉴于pacap的体内稳定性极差，例如pacap38的体内半衰期少于2min，而且其穿越生物屏障的功能有限，因此直接把pacap开发成药被极大的限制。
5.小分子spam1(4-((4-(4-氧-3,4-二氢喹唑啉-2-基)丁酰)甲基苯甲酸)是我们通过靶向位于pac1-r的n端胞外域的别构调节位点，通过计算机虚拟筛选、并经过细胞水平和动物水平验证获得的pac1-r小分子别构调节剂。
6.我们最新的细胞学和动物学研究首次发现spam1可以正反馈地、浓度依赖地上调体内pacap及其靶器官中pacap特异受体pac1-r的表达，后续利用d-半乳糖诱导的小鼠衰老模型的动物实验首次确证spam1可以通过上调pacap/pac1-r信号通路发挥调控垂体-肾上腺轴、垂体-性腺轴和胸腺的功能，抵抗因pacap下调导致的机体衰退，具体作用包括：1)上调机体应激能力，2)增强性功能和繁殖能力，及3)抵抗免疫功能低下。


技术实现要素：

7.本发明的目的是在于提供一个能够有效上调体内pacap及其特异受体pac1-r表达的小分子spam1。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.上调神经肽pacap及其受体pac1-r的小分子化合物spam1，其结构如式(ⅰ)所示，其中r＝无或h20或hcl(无修饰或水合化修饰或盐酸化修饰)；
[0010][0011]
具有下述结构的化合物spam1-3(式(ⅱ)，a-c)；
[0012][0013]
上述小分子化合物spam1的制备方法，是分两步合成(式(ⅲ)i,ii)，包括如下步骤：
[0014]
(1)2-氨基苯甲酰胺(a)和戊二酸酐(b)聚合反应获得基础化合物4-(4-氧-3,4-二氢喹唑啉-2-基)丁酸(c)；
[0015]
(2)4-(4-氧-3,4-二氢喹唑啉-2-基)丁酸(c)再和苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇(d)、4-(氨甲基)苯甲酸(e)和三乙胺(f)缩合而成；
[0016][0017]
上述小分子化合物spam1在制备预防或治疗与神经肽pacap密切相关的，神经系统、内分泌系统或免疫系统功能衰老与紊乱的药物中的应用。
[0018]
上述小分子化合物spam1在制备预防或治疗下丘脑-垂体-肾上腺轴功能衰退和紊乱、下丘脑-垂体-性腺轴功能衰退和紊乱或胸腺功能衰退和紊乱的药物中的应用。
[0019]
上述小分子化合物spam1在制备预防或治疗在延长寿命、预防与治疗随龄的机体衰老、男女更年期综合征、男女性功能随龄衰退、男女生殖功能衰退、免疫功能失调与衰退或脓毒症的药物中的应用。
[0020]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0021]
(1)本发明的spam1分子量小，能高效穿越生物学屏障，包括血脑屏障、血睾屏障等；
[0022]
(2)本发明的spam1正反馈上调下丘脑-垂体分泌的神经递质/调质pacap及其特异受体pac1-r的表达，作用于性腺轴和肾上腺轴的下游腺体，因此其调控作用是全面的；
[0023]
(3)本发明的spam1特异靶向pac1-r1，仅作用于天然表达pac1-r神经系统与内分泌系统的细胞和组织，副作用较小。
[0024]
因此，spam1将成为有效治疗与预防与神经肽pacap密切相关的，神经系统、内分泌系统及免疫系统功能衰老与紊乱的新型小分子化合药物。
附图说明
[0025]
图1：小分子spam1合成工艺(两步法)；a：2-氨基苯甲酰胺；b：戊二酸酐；c：4-(4-氧-3,4-二氢喹唑啉-2-基)丁酸；d：苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇；e：4-(氨甲基)苯甲酸；f：三乙胺。
[0026]
图2：中间产物c的核磁共振检测；1hnmr(400mhz，dmso)：12.16(米，2h)，8.08(d，j＝5.8hz，1h)、7.79-7.76(米，1h)，7.60(d，j＝6.6赫兹，1h)，7.46(d，j＝6.0赫兹，1h)，2.64(t，j＝6.0赫兹，2h)，2.32(t，j＝5.6赫兹，2h)，2.00-1.96(米，2h)。
[0027]
图3：spam1的核磁共振检测；1hnmr(400mhz，dmso-d6)＝12.79(s，1h)，12.18(s，1h)，8.42(t，j＝6.0hz，1h)，8.09(d，j＝7.9hz，1h)，7.90(d，j＝7.9hz，2h)，7.78(t，j，1h)，7.78(t，j，1h)，j＝7.6hz，1h)，7.61(d，j＝8.2hz，1h)，7.47(t，j＝7.5hz，1h)，7.36(d，j＝7.9hz，2h)，4.33(d，j＝5.9hz，2h)，2.64(t，j＝7.4hz，2h)，2.27(t，j＝7.5hz，2h，2.09＝1.95(米，2h)。
[0028]
图4：spam1在体上调pacap的血浆浓度(*,p《0.01,spam1 vs.spam1-)。
[0029]
图5：westernblot检测spam1浓度依赖地上调pac1-r在神经细胞neuro2a的表达。
[0030]
图6：免疫荧光检测spam1有效上调pac1-r在神经细胞shsy-5y的表达。
[0031]
图7：酶联免疫法检测腹腔注射spam1浓度依赖地上调血清皮质酮水平(*,p《0.01,spam1vs.对照组)。
[0032]
图8：spam1有效上调雌二醇和黄体生成素，抵抗d-半乳糖诱导的卵巢衰退(*,p《0.01,衰老模型组vs.正常组；#,p《0.01,spam1干预组vs.衰老模型组)。
[0033]
图9：spam1有效上调睾酮，抵抗d-半乳糖诱导的睾丸衰退(*,p《0.01,衰老模型组vs.正常组；#,p《0.01,spam1干预组vs.衰老模型组)。
[0034]
图10：spam1有效上调胸腺指数，抵抗地塞米松诱导的胸腺衰退(*,p《0.01,衰老模型组vs.正常组；#,p《0.01,spam1干预组vs.衰老模型组)。
[0035]
图11：spam1有效降低lps诱导脓毒症的死亡率，提高生存率。
具体实施方式
[0036]
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
[0037]
实施例1：spam1的中试合成工艺(两步法)
[0038]
按图1所示，采用两步法合成。第一步：在装有冷凝器的150ml烧瓶中，苯甲酰胺a(5.45克、40.0毫摩尔、1.0等)和琥珀氢化物b(4.00克、40.0毫摩尔、1.0等)混合在50ml的甲苯中。悬架被大力回流3小时，然后冷却至室温。所得的产物c为白色固体被过滤，用et2o洗涤并干燥(8.833克，产量88.3％)。产物核磁共振检测如图2所示。
[0039]
第二步：按下列喂食比进行合成：
[0040][0041][0042]
在室温下，依次向500ml反应瓶中加入c和d，然后加入溶剂dcm和f，搅拌。分批添加收缩剂edci，继续对系统进行澄清，颜色为深棕色。将e添加到反应系统中，并继续反应，直到原材料e消失且反应结束。中央控制过程：展开剂dcm/meoh＝3/1样品1-2滴，用少量meoh完全溶解1滴薄hcl，点板控制原料e。反应24小时后，反应液直接浓缩去除反应溶剂，得到泥状灰色粗品。所得泥状粗品用dmf/h2o＝1/3(4ml/g，相对于粗品)室温搅拌打浆过夜，然后过滤，滤饼用etoh/ea＝1/1洗涤至类白色，烘干。结果：得产品6.4g，收率：40.6％，得白色固体粉末为spam1。spam1的核磁共振测定如图3。
[0043]
实施例2：spam1有效上调机体pacap的水平
[0044]
balb/c小鼠30只，spf级，周龄8-10周，体重22-27g，雌雄各半，随机分为3组，每组10只：1)spam1低剂量组，腹腔注射10umol/kg；2)spam1高剂量组，腹腔注射100umol/kg；3)正常对照组，腹腔注射生理盐水；注射后30min，眼眶采血，血清采用elisa试剂盒进行pacap检测。结果如图4所示，spam1有效上调血清中pacap的含量，而且上调作用具有浓度依赖性。
[0045]
实施例3：spam1有效上调pacap特异受体pac1-r的表达
[0046]
天然表达pac1-r的小鼠神经细胞neuro2a培养至融合率为80％以上，分别加入1um-100um的spam1，孵育1h后，破碎细胞；全细胞溶解液上清进行sds-page和应用抗pac1-r
的c端的抗体进行western blot检测。结果如图5所示，1um、10um和100um的spam1呈现浓度依赖的方式上调神经细胞中pac1-r的表达。
[0047]
天然表达pac1-r的人神经细胞shsy-5y培养至融合率为80％以上，100um spam1孵育1h后，进行免疫荧光共聚焦观察：细胞核dapi染色呈紫蓝色，而靶向pac1-r的红色荧光信号被spam1显著上调(图6)。
[0048]
实施例4：spam1有效在体上调皮质酮水平
[0049]
balb/c小鼠40只，spf级，周龄8-10周，体重22-27g，雌雄各半，随机分为3组，每组10只：1)spam1低剂量组，腹腔注射10umol/kg；2)spam1中剂量组，腹腔注射100umol/kg；2)spam1高剂量组，腹腔注射1000umol/kg；3)正常对照组，腹腔注射生理盐水；注射1h后，眼眶采血，固相夹心法酶联免疫吸附实验(elisa)检测血清中cor的水平，结果如图7所示：spam1以浓度依赖方式提高血清cor水平，显示spam1提高机体的应激能力。
[0050]
实施例5：spam1有效抵抗d-半乳糖诱导的卵巢衰退
[0051]
采用d-半乳糖诱导的衰老模型，balb/c雌性小鼠40只，spf级，周龄8-10周，体重22-27g，随机分为4组，每组10只：1)衰老模型组，颈背部皮下注射d-半乳糖(200mg/kg/d*42d)；2)spam1低剂量干预组，如组1)一样注射d-半乳糖，在第15天加入腹腔注射低剂量spam1(10umol/kg/d*28d)；3)spam1高剂量干预组，如组1)一样注射d-半乳糖，在第15天加入腹腔注射高剂量spam1(100umol/kg/d*28d)；4)正常对照组，用生理盐水替代d-半乳糖和spam1；在完成所有注射后的24h，眼眶采血，酶联免疫法(elisa)检测血清中雌二醇和黄体生成素的水平。结果如图8所示：d-半乳糖显著下调雌性小鼠血清中雌二醇和黄体生成素的水平，而低浓度和高浓度的spam1均有效上调衰老小鼠血清的雌二醇和黄体生成素的水平，并且高浓度组比低浓度组作用更为显著；结果显示spam1有效抵抗卵巢衰退。
[0052]
实施例6：spam1有效抵抗d-半乳糖诱导的睾丸衰退
[0053]
采用d-半乳糖诱导的衰老模型，balb/c雄性小鼠40只，spf级，周龄8-10周，体重22-27g，随机分为4组，每组10只：1)衰老模型组，颈背部皮下注射d-半乳糖(200mg/kg/d*42d)；2)spam1低剂量干预组，如组1)一样注射d-半乳糖，在第15天加入腹腔注射低剂量spam1(10umol/kg/d*28d)；3)spam1高剂量干预组，如组1)一样注射d-半乳糖，在第15天加入腹腔注射高剂量spam1(100umol/kg/d*28d)；4)正常对照组，用生理盐水替代d-半乳糖和spam1；在完成所有注射后的24h，眼眶采血，酶联免疫法(elisa)检测血清中睾酮的水平。结果如图9所示：d-半乳糖显著下调雄性小鼠血清中睾酮的水平，而低浓度和高浓度的spam1均有效上调衰老小鼠血清的睾酮的水平，并且高浓度组比低浓度组作用更为显著；结果显示spam1有效抵抗睾丸的衰退。
[0054]
实施例7：spam1有效抵抗胸腺衰退
[0055]
采用地塞米松诱导的胸腺衰退模型，balb/c小鼠40只，spf级，雌雄对半，周龄8-10周，体重22-27g，随机分为4组，每组10只：1)衰老模型组，腹腔注射地塞米松(25mg/kg/d*2d)；2)spam1低剂量干预组，如组1)一样注射地塞米松，同时加入腹腔注射低剂量spam1(10umol/kg/d*2d)；3)spam1高剂量干预组，如组1)一样注射地塞米松，同时加入腹腔注射高剂量spam1(100umol/kg/d*2d)；4)正常对照组，用生理盐水替代地塞米松和spam1；在完成最后注射后的24h，称取小鼠体重，颈椎脱臼法处死小鼠，取胸腺称重，计算胸腺指数＝胸腺重量(mg)/体重(g)。结果如图10所示，低浓度和高浓度的spam1均有效抑制地塞米松诱导
的胸腺指数下调。
[0056]
实施例8：spam1有效降低lps诱导脓毒症的死亡率
[0057]
采用lps诱导脓毒症模型，balb/c小鼠40只，spf级，雌雄对半，周龄8-10周，体重22-27g，随机分为4组，每组10只：1)脓毒症模型组，腹腔注射生理盐水，30min后，尾静脉注射15mg/kg lps；2)spam1低剂量干预组，腹腔注射低剂量spam1(10umol/kg)，30min后，尾静脉注射15mg/kg lps；3)spam1高剂量干预组，腹腔注射高剂量spam1(100umol/kg)，30min后，尾静脉注射15mg/kg lps；4)正常对照组，腹腔注射生理盐水，30min后，尾静脉注射生理盐水；每隔24h观察小鼠存活情况，记录各组小鼠8d的存活率。结果如图11所示，低浓度和高浓度的spam1均有效抑制lps诱导脓毒症导致的死亡，降低浓度症的死亡率。